CN117568313A - 基因编辑组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因治疗药物领域，特别是涉及一种基因编辑组合物及其用途。本发明的基因编辑组合物包含：1）碱基编辑器融合蛋白，或编码所述碱基编辑器融合蛋白的核酸；2）向导RNA，或编码所述向导RNA的核酸，其中向导RNA包含间隔序列片段和scaffold序列片段，编码所述间隔序列片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1‑71任一所示。本发明的基因编辑组合物可以在体外和体内高效编辑LPA基因，并可以在体内实现Apo(a)蛋白的部分或完全敲除。此外，本发明的基因编辑组合物可以在体外和体内高效编辑LPA基因的同时，没有发现脱靶效应，具备基因治疗的安全性。

Description

基因编辑组合物及其用途
技术领域
本发明涉及基因治疗药物领域，特别是涉及一种基因编辑组合物及其用途。
背景技术
心血管疾病是全球第一杀手和主要疾病负担，包括高胆固醇血症、冠心病、高血压、心肌梗死和中风等。长期以来，研究人员一直在寻找心血管疾病的危险因素，并努力找到降低患者风险的方法。在这方面，脂蛋白(a) [Lp(a)]引起了广泛的关注。长期以来，研究已明确高水平的Lp(a)是心血管疾病的遗传和独立危险因子。孟德尔随机化研究一致证明，血浆浓度 Lp(a)与心肌梗死、卒中、外周动脉疾病和心血管死亡风险之间存在因果关系。Lp(a)包含的3 种组分，即的低密度脂蛋白（LDL）样颗粒、载脂蛋白[Apo(a)]、氧化磷脂（OxPL），都是Lp(a)致病过程中不可或缺的因素，主要通过促动脉粥样硬化、促血栓形成、促炎导致局部的病理改变，继而引起疾病的发生（Kronenberg, F. (2016). Cardiovasc.Drugs Ther., 30(1):87-100）。
从安全性考虑，人群中低Lp(a)的个体不会出现明显的健康损害，所以Lp(a)是一个很好心血管干预靶点。不同于 LDL-C，目前尚无获批的降低Lp(a)的药物。传统的他汀类降脂药物，不会造成有Lp(a)水平的显著变化，甚至一些研究表明他汀类药物可导致Lp(a)升高。目前发现对降低 Lp(a)有效的药物包括：烟酸、PCSK9 抑制剂、雌激素、米泊美生、洛美他派，但考虑到降低Lp(a)的效果、经济、临床不良事件、临床可操作性及可推广性、以及心血管受益情况这些方法都不是最佳选择（漆晨璐等，Advances in Clinical Medicine,2022, 12(12), 11051-11056）。由于血液Lp(a)升高主要是由于编码Apo(a)的 LPA 基因的遗传变异所致（约90%），因此防止其有害影响的唯一方法是使LPA基因沉默。基于核酸的药物，如反义寡核苷酸（ASO）和小干扰RNA（siRNA），提供了一种通过沉默LPA基因来降低Lp(a)水平的策略，但它们需要多次注射，增加了患者的治疗不便和成本。因此，寻找一种有效的治疗方法，能够稳定或永久性地降低Lp(a)水平，是一项紧迫的任务。
基因编辑技术具有精确和永久修改人类患者中致病基因的潜力，一次基因编辑治疗可以在长期内产生效果，减少了患者的治疗负担。针对肝脏Lp(a)的基因编辑方法，如使用CRISPR-Cas9核酸酶系统对Apo(a)进行靶向敲除，已在动物模型中成功降低了Lp(a)水平。尽管这些研究证明了基因编辑在调控Apo(a)和Lp(a) 水平方面的潜力，但研究也发现存在严重脱靶编辑（Doerfler AM.et. Al, Mol Ther Methods Clin Dev., 2022 Oct 13:27:337-351.）。相较CRISPR-Cas9核酸酶系统，碱基编辑器拥有更高的精确性和安全性。利用碱基编辑器，通过靶向破坏蛋白质编码基因的起始密码子位点或剪接位点、或引入提前终止密码子的方式，可以实现基因敲除。本发明旨在提供一种创新的方法和组合物，利用碱基编辑技术来高效安全的敲除Apo(a)，以降低血浆中Lp(a)的水平，从而预防或治疗心血管疾病。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基因编辑组合物及其用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物包含：
1）碱基编辑器融合蛋白，或编码所述碱基编辑器融合蛋白的核酸；
2）向导RNA，或编码所述向导RNA的核酸，其中向导RNA包含间隔序列片段和scaffold序列片段，编码所述间隔序列片段包含核苷酸序列如SEQ ID No.1-71任一项或多项所示的核酸分子。
优选地，所述碱基编辑器融合蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID No.74-76任一所示的多肽。
本发明还提供一种碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID No.74所示的多肽。
本发明还提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码前述向导RNA、前述碱基编辑器融合蛋白或同时编码如前述向导RNA和前述碱基编辑器融合蛋白。
本发明还提供一种表达载体，所述表达载体包含前述核酸分子和质粒骨架。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含递送载体和前述基因编辑组合物、前述核酸分子或前述表达载体。
本发明还提供前述基因编辑组合物、前述核酸分子、前述表达载体或前述药物组合物在制备以下任一产品中的用途：
1）体外编辑LPA基因的产品；
2）降低载脂蛋白(a)和脂蛋白(a)的产品；
3）心血管疾病治疗药物。
本发明还提供一种体外编辑LPA基因的方法所述方法为：将前述基因编辑组合物、前述核酸分子或前述表达载体导入分离的细胞，使所述细胞的LPA基因发生碱基突变。
如上所述，本发明的一种基因编辑组合物及其用途，具有以下有益效果：
本发明的基因编辑组合物可以在体内和体外高效编辑LPA基因，并可以在体内外实现Apo(a)蛋白的部分或完全敲除。此外，本发明的基因编辑组合物可以在体内高效编辑LPA基因的同时，没有发现脱靶效应，具备基因治疗的安全性。
附图说明
图1显示为本发明的基因编辑组合物在体内编辑LPA基因的结果示意图。
图2显示为本发明的基因编辑组合物在体内编辑引起的载脂蛋白降低的结果示意图。
图3显示为本发明的体内编辑LPA基因后全基因组水平的脱靶分析结果示意图。
图4显示为本发明的LPA基因敲除的gRNA及其原间隔序列SEQ ID No.1-35，以及在人肝癌细胞系HepG2中评估sgRNA和对应碱基编辑器的体外编辑结果。
图5显示为本发明的LPA基因敲除的gRNA及其原间隔序列SEQ ID No.36-71，以及在人肝癌细胞系HepG2中评估sgRNA和对应碱基编辑器的体外编辑结果。
图6显示为本发明的在人肝癌细胞系HepG2中评估前31个高效gRNA靶点和对应碱基编辑器在潜在脱靶位点处的脱靶编辑结果。
图7显示为本发明的在人LPA转基因小鼠内评估gRNA (SG057、SG063和SG067)和其对应碱基编辑器的体内碱基编辑结果。
图8显示为本发明的在基因编辑组合物注射前后转基因小鼠血浆中载脂蛋白的浓度。
图9显示为本发明的LPA靶点gRNA (SG001-SG020)联合其它碱基编辑器在人肝癌细胞系HepG2中的体外编辑评估结果。
图10显示为本发明的LPA靶点gRNA (SG021-SG058)联合其它碱基编辑器在人肝癌细胞系HepG2中的体外编辑评估结果。
图11显示为本发明的LPA靶点gRNA (SG059-SG071)联合其它碱基编辑器在人肝癌细胞系HepG2中的体外编辑评估结果。
具体实施方式
本发明提供一种基因编辑组合物，所述基因编辑组合物包含：
1）碱基编辑器融合蛋白，或编码所述碱基编辑器融合蛋白的核酸；
2）向导RNA，或编码所述向导RNA的核酸，其中向导RNA包含间隔序列片段和scaffold序列片段，编码所述间隔序列片段包含核苷酸序列如SEQ ID No.1-71的任一项或多项所示的核酸分子。
在一些具体实施方式中，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域片段和脱氨酶结构域片段。具体地，所述可编程DNA结合结构域片段选自CRISPR/Cas系统的Cas蛋白的结构域片段。更具体地，所述可编程DNA结合结构域片段为Cas9蛋白及其变体的结构域片段。优选地，所述Cas9蛋白选自SpCas9蛋白及其变体或SaCas9蛋白及其变体。
在一些具体实施方式中，所述基因编辑组合可以为碱基编辑器融合蛋白和向导RNA的组合；或，碱基编辑器融合蛋白和编码所述向导RNA的核酸的组合；或，编码所述碱基编辑器融合蛋白的核酸和向导RNA的组合；或，编码所述碱基编辑器融合蛋白的核酸和编码所述向导RNA的核酸的组合。进一步地，所述Cas9蛋白变体包含对DNA双链单边剪切的Cas9切口酶（nCas9）或核酸酶活性丧失的Cas9（dCas9）。
在一些具体实施方式中，所述脱氨酶结构域片段选自胞嘧啶脱氨酶片段或腺嘌呤脱氨酶片段。更具体的，所述胞嘧啶脱氨酶选自APOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、AID或pmCDA1中的一种或多种；或，所述腺嘌呤脱氨酶选自ecTadA或其变体。
在一些具体实施方式中，所述碱基编辑器融合蛋白选自申请号为202010163058.3的专利说明书实施例1中的CE-A3A1048-1063其氨基酸序列如SEQ ID No.75所示、申请号为202310186267.3的专利中的CE-SaABE8e-744其氨基酸序列如SEQ ID No.76所示或氨基酸序列如SEQ ID No.74所示的CE-ABE8e。
进一步地，当所述向导RNA中编码所述间隔序列片段的核苷酸序列如SEQ IDNo.1-60任一所示时，所述碱基编辑器融合蛋白为申请号为202010163058.3的专利说明书实施例1中的CE-A3A1048-1063；或，当所述向导RNA中编码所述间隔序列片段的核苷酸序列如SEQ ID No.57-68任一所示时，所述碱基编辑器融合蛋白为包含氨基酸序列如SEQ IDNo.74所示的CE-ABE8e；或，当所述向导RNA中编码所述间隔序列片段的核苷酸序列如SEQID No.69-71任一所示时，所述碱基编辑器融合蛋白为申请号为202310186267.3的专利中的CE-SaABE8e-744。
在一些具体实施方式中，所述scaffold序列片段的核苷酸序列包含SEQ IDNo.72-73任一所示的核酸分子。
在一些具体实施方式中，所述向导RNA如果是RNA形式，可以包含一个或多个经修饰的碱基、核苷或核苷酸。所述经修饰的碱基、核苷或核苷酸能使RNA在细胞中缓减降解趋势。
本发明还提供一种碱基编辑器融合蛋白，所述碱基编辑器融合蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID No.74所示的多肽。
本发明还提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码前述基因编辑组合物向导RNA、碱基编辑器融合蛋白或同时编码基因编辑组合物向导RNA和碱基编辑器融合蛋白。
本发明还提供一种表达载体，所述表达载体包含前述核酸分子和质粒骨架。
在一些具体实施方式中，所述质粒骨架为一种环状DNA分子或线性DNA分子，可以在细胞内自主复制和表达插入的目的基因。所述骨架质粒上可以含有调节序列，如启动子、复制子、增强子、转录和翻译起始和终止密码子。质粒骨架通常与目的基因连接形成完整的可于细胞中表达特定产出的表达载体。
在一些具体实施方式中，所述质粒骨架可以选自pAAV-CAG、pAAV-TRE、pAAV-EF1a、pAAV-GFAP、pAAV-Lgr5、pAAV-Sox2、pAAV-Syn或pAAV-CMV骨架中的任意一种或多种。
本发明还提供一种细胞，所述细胞含有前述核酸分子或前述表达载体。
在一些具体实施方式中，所述细胞选自动物细胞（如CHO、COS、N2A、人宫颈癌细胞如HELA或人胚胎肾细胞如HEK293T）、植物细胞、细菌细胞（如大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌）、真菌细胞（如酵母）、昆虫细胞（如Sf9）中任一种。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含递送载体和前述基因编辑组合物、前述核酸分子或前述表达载体。
在一些具体实施方式中，所述递送载体选自聚合物纳米颗粒、脂质体、脂质纳米颗粒、病毒载体或细胞外囊泡中的一种或多种。
在一些具体实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料。所述可接受的辅料可以为无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂（抗坏血酸）、缓冲剂（磷酸、枸橼酸、其它的有机酸）、防腐剂、表面活性剂（PEG、Tween）、螯合剂（EDTA）、粘合剂等。而且，也可含有低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；多糖或单糖；甘露糖醇或山梨糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、 D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇（乙醇）、多元醇（丙二醇，PEG）、非离子表面活性剂（吐温80，HCO-50）。
本发明还提供前述基因编辑组合物、前述核酸分子、前述表达载体或前述药物组合物在制备以下任一产品中的用途：
1）体外编辑LPA基因的产品；
2）降低载脂蛋白(a)和脂蛋白(a)的产品；
3）心血管疾病治疗药物。
在一些具体实施方式中，所述心血管疾病选自高胆固醇血症、冠心病、高血压、心肌梗死、中风、周围血管疾病或主动脉粥硬化中的一种或多种。
本发明还提供一种体外编辑LPA基因的方法，所述方法为：将前述基因编辑组合物、前述核酸分子或前述表达载体导入分离的细胞，使所述细胞的LPA基因发生碱基突变。
在一些具体实施方式中，所述导入的方法选自电穿孔法、脂质体转染、病毒转导、显微注射法、粒子轰击法或基因枪转化法中的一种或多种。
本发明还提供一种体内编辑LPA基因的方法，所述方法为：将前述基因编辑组合物、前述核酸分子或前述表达载体导入哺乳动物体内，使所述哺乳动物细胞中LPA基因发生碱基突变。
在一些具体实施方式中，所述哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物和外源转入人LPA基因的小鼠、大鼠等。
在一些具体实施方式中，所述碱基突变为C•G至T•A的突变；或，所述碱基突变为A•T至G•C的突变。具体地，当前述基因编辑组合物中脱氨酶结构域片段为胞嘧啶脱氨酶片段时，所述碱基突变为C•G至T•A的突变；或，当前述基因编辑组合物中脱氨酶结构域片段为腺嘌呤脱氨酶片段时，所述碱基突变为A•T至G•C的突变。
进一步地，所述碱基突变为功能丧失突变或非编码突变。具体的，所述功能丧失突变为在LPA基因中引入提前终止密码子或使内含子的剪接位点突变，其导致截短或非功能性的Apo(a)蛋白产生；或所述非编码突变是通过使LPA基因的起始密码子ATG突变，其导致消除LPA基因表达。
进一步地，前述提前终止密码子为TAA，TAG，TGA或者TGA。例如，所述提前终止密码子经由编码链上的第一个C的脱氨基从CAA至TAA转化生成；所述提前终止密码子经由编码链上的第一个C的脱氨基从CAG至TAG转化生成；所述提前终止密码子经由编码链上的第一个C的脱氨基从CGA至TGA转化生成；所述提前终止密码子经由互补链上的第三个C的脱氨基从TGG至TGA转化生成；所述起始密码子突变经由互补链上的第三个C的脱氨基从ATG至ATA转化生成；所述起始密码子突变经由互补链上的第二个A的脱氨基从ATG至ACG转化生成；所述起始密码子突变经由编码链上的第一个A的脱氨基从ATG至GTG转化生成；所述内含子剪接位点突变由互补链上的C的脱氨基从CA转变成TA或TC转变为TT；所述内含子剪接位点突变由互补链上的A的脱氨基从CA转变成CG；所述内含子剪接位点突变由编码链上的A的脱氨基从AG转变成GG。
在一些具体实施方式中，LPA基因的碱基突变个数为1-20个。更具体的， 所述突变的碱基个数为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个。
本发明还提供一种预防和/或治疗病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的前述基因编辑组合物、前述核酸分子、前述表达载体或前述药物组合物；所述病症选自以下一项或多种：高胆固醇血症、冠心病、高血压、心肌梗死、中风、周围血管疾病或主动脉粥硬化。
本发明中，前述基因编辑组合物、前述核酸分子、前述表达载体或前述药物组合物还可以与其他药物联用。
本发明所提供的组合物或用途中，前述基因编辑组合物、前述核酸分子、前述表达载体或前述药物组合物为单一有效成分或与其他活性组分进行组合，构成联合制剂。所述其他活性组分可以是其他各种可以用于治疗高胆固醇血症、冠心病、高血压、心肌梗死、中风、周围血管疾病或主动脉粥硬化的药物。组合物中活性组分的含量通常为安全有效量，所述安全有效量对于本领域技术人员来说应该是可以调整的，例如，所述活性成分的施用量通常依赖于患者的体重、应用的类型、疾病的病情和严重程度，例如，作为活性成分的前述基因编辑组合物、前述核酸分子、前述表达载体或前述药物组合物的施用量通常可以为1~1000 mg/kg/day、20~200mg/kg/day、1~3 mg/kg/day、3~5 mg/kg/day、5~10 mg/kg/day、10~20 mg/kg/day、20~30 mg/kg/day、30~40 mg/kg/day、40~60 mg/kg/day、60~80 mg/kg/day、80~100 mg/kg/day、100~150 mg/kg/day、150~200 mg/kg/day、200~300 mg/kg/day、300~500 mg/kg/day、或500~1000 mg/kg/day。
本发明中，术语“表达载体”是能使携带编码蛋白质的核酸分子表达蛋白质的一种核酸运载工具。表达载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。表达载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。表达载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，表达载体还可含有复制起始位点。表达载体可以包含本发明的核酸以便于导入细胞进行表达。表达载体可以包含与所述核酸可操作连接的表达控制元件，如启动子、终止子和/或增强子。
本发明中，所述药物组合物的剂型选自：注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，适合于口服给药的制剂形式可以是包括但不限于丸剂、片剂、咀嚼剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、滴剂、糖浆、气雾剂或粉雾剂等。
本发明所述方法和用途中，当所述活性成分与其他治疗剂联用时，所述活性成分与其他治疗剂共同给予。“共同给予”表示在同一制剂中或在两种不同制剂中经由相同或不同途径同时给予，或通过相同或不同途径顺次给予。“顺次”给予表示在两种或多种不同化合物的给药之间具有以秒、分钟、小时或天计的时间差异。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
如本文所用，“包含”、“含有”等应理解为是包括性的意思，而没有排他性或穷尽的意思；即“包括但不限于”的意思。
如本文所用，“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。
如本文所用，“治疗性”和“预防性”应理解为其最宽的意义。术语“治疗性” 不一定暗示哺乳动物接受治疗直至完全恢复。类似地，“预防性”不一定表示对象最终不会感染疾病病症。因此，治疗和预防包括缓解具体病症的症状或防止或降低具体病症产生的风险。术语“预防”可理解为降低具体病症发作的严重程度。治疗也可降低已有病症的严重程度或急性发作的频率。
如本文所用，进行治疗性或预防性治疗的对象或个体优选哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、牲畜（如绵羊、牛、马、驴、猪）、宠物（如狗、猫）、实验室试验动物（如小鼠、家兔、大鼠、豚鼠、仓鼠）或被捕获的野生动物（如狐狸、鹿）。所述对象优选灵长类。所述对象最优选人。
如本文所用，术语“核酸分子”和“核酸组分”可互换使用，其指具有核碱基和酸性部分的化合物，例如核苷、核苷酸或核苷酸的聚合物。在一些实施方式中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方式 中，“核酸分子”是指包含三个或更多个核苷酸残基的寡核苷酸链。本文中所用术语“核酸分子”和“多核苷酸”可互换使用以指核苷酸的聚合物(例如，一串至少三个核苷酸)。在一些实施方式中，“核酸”包括RNA以及单链和/或双链DNA。核酸可以是天然产生的或是非天然产生的分子。
如本文所用，术语“表达”指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。基因的表达水平可以通过测量细胞或组织样品内mRNA或蛋白质的量予以确定。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用并以其最广泛的含义使用，是指两个或更多个亚基的氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一方面中，亚基可以通过其他键连接，例如，酯、醚等。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数没有限制。已知蛋白质和肽具有C-末端和N-末端，所述C-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合羧基的末端，所述N-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合氨基的末端。本文所用术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸，以及D和L光学异构体，氨基酸类似物和肽模拟物。术语“融合”在蛋白质或多肽上下文中是指两个或更多个蛋白质或多肽（或其结构域）末端之间形成融合蛋白的连接。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1 LPA基因靶点gRNA的设计
使用本发明公开的组合物和方法修饰的靶基因是编码载脂蛋白a [apo(a)]的LPA基因(别名AK38、APOA和LP)，人类的LPA基因定位于人类染色体6q25.3-q26，基因位置为NC_000006.12 (160531482..160664275,complement)。LPA基因仅存在于在人类和其他灵长类动物的基因组中。
本实施案例中使用的碱基编辑器为专利202010163058.3实施例1中的CE-A3A1048 -1063（其氨基酸序列如SEQ ID No.75所示）。该编辑器可以识别DNA上有NGG序列的PAM位点（NGG PAM）前的20-nt 原间隔序列，将其编辑窗口内（原间隔序列上大致第3-11位置上）的胞嘧啶（C）编辑为胸腺嘧啶（T），即C>T。人类LPA基因上所有能被ceBE-A3A（或包含可以使用NGG PAM的Cas核酸酶的BE变体）引入终止密码子或破坏起始密码子或破坏剪接位点的原间隔序列都被识别出（例如，见图4、图5，SEQ ID NO：1-60）。
SEQ ID NO: 75
MKRTADGSEFESPKKKRKVDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKSGSETPGTSESATPESGSMEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIFDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSGSETPGTSESATPESETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSGGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSGGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSMKRTADGSEFESPKKKRKVENLYFQSHHHHHHHHHHHHH*
本实施案例中使用了两个腺苷碱基编辑器，包括ABE和SaABE。其中，ABE通常指代碱基编辑器蛋白的DNA结合结构域来自SpCas9或其变体的腺苷碱基编辑器，而SaABE则指代碱基编辑器蛋白的DNA结合结构域来自SaCas9或其变体的腺苷碱基编辑器。本实施案例使用的ABE是氨基酸序列为SEQ ID NO: 74所示，名为CE-ABE8e的碱基编辑器。CE-ABE8e编辑器携带的gRNA能够识别DNA上有NGG PAM的20-nt 原间隔序列，将其编辑窗口（原间隔序列上大致第3-15位置）内的腺嘌呤（A）编辑为鸟嘌呤（G），即A>G。所有能被CE-ABE8e（或包含可以使用NGG PAM的Cas核酸酶的ABE变体）破坏起始密码子或剪接位点的原间隔序列都被识别出（例如，见图4、图5，SEQ ID NO：57-68）。
SEQ ID NO: 74
MKRTADGSEFESPKKKRKVSSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSINSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSKRTADGSEFEPKKKRKV*
本实施案例使用的SaABE是现有专利202310186267.3中公布的CE-SaABE8e-744（其氨基酸序列如SEQ ID No.76所示）。CE-SaABE8e-744携带的gRNA能够识别DNA上有NNGRRT PAM的22-nt 原间隔序列，将其编辑窗口内（原间隔序列上大致第3-16位置）内的腺嘌呤（A）编辑为鸟嘌呤（G），即A>G。所有能被CE-SaABE8e-744（或包含可以使用NNGRRT PAM的Cas核酸酶的SaABE变体）破坏剪接位点的原间隔序列都被识别出（例如，见图5，SEQ IDNO：69-71）。
SEQ ID No.76
MKRTADGSEFESPKKKRKVKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEISGSETPGTSESATPESGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSINSGSGSETPGTSESATPESETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGSGGSKRTADGSEFEPKKKRKV*
为了进行LPA靶点的碱基编辑，每条配对图4、图5中原间隔序列且3’端连接scaffold支架序列（SEQ ID NO：72 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU或SEQ ID NO：73 GUUUUAGUACUCUGUAAUGAAAAUUACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUU）的约100-nt 向导RNA（gRNA）被合成。并且每条合成的gRNA都进行了特定的化学修饰，以减少核酸酶对RNA的降解。
实施例2 体外碱基编辑评估靶点gRNA
为了验证每个gRNA影响靶向碱基编辑的能力，在实验中通过体外转录方法合成了三个碱基编辑器CE-A3A1048-1063、 CE-ABE8e、 CE-SaABE8e-744的mRNA，与实施案例1中对应的71个sgRNA (SG001-SG071)共同递送到人肝癌细胞系HepG2中评估碱基编辑效率。所有合成的mRNA都在转录过程中加入了N1甲基假尿嘧啶修饰，并在转录结束后进行加帽加尾，以防止降解并促进其在真核细胞中的翻译。为了递送碱基编辑组分，将合成的gRNA与对应碱基编辑器的mRNA，按照重量比1：1，共同包裹到脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle，LNP）中，获得浓度为0.3 mg RNA/mL的核酸纳米脂质体（mRNA/gRNA_LNP）溶液。本实施案例实验中采用的LNP为申请号为202310557830.3中的LNP，LNP中各组分及比例如下：胆固醇，37.00%；DSPC，10.00%； SM-102，41.50%；DOTAP，10.00%；DMG-PEG，1.50%。
将培养在含10%FBS的DMEM培养基中的人肝癌细胞系HepG2，以每孔3.0×105个细胞的密度接种在24孔板（Thermo，货号142485）中，转染前在5% CO2和37℃条件下培养24h。细胞汇合度在80%时可以用于细胞转染。将提前制备好的mRNA/gRNA_LNP以3.5 uL/孔转染细胞。次日上午，更换新鲜的培养基。转染45h后离心收集细胞沉淀，用裂解液重悬后于65℃裂解30 min，获得的裂解产物直接作为DNA模板进行LPA基因鉴定。利用PCR技术扩增靶位点所在区域的约500bp基因片段，退火温度均设置58℃。利用对应上游扩增引物对PCR产物进行sanger测序，并在EditR网站分析Sanger 测序中gRNA对应LPA基因原间隔序列区域内潜在的碱基编辑（Kluesner M, et al. The CRISPR Journal 2018 1:3, 239-250.）。每个靶点处目标碱基的A>G或C>T编辑效率统计数据如图4、图5。
如图4、图5所示，在原间隔序列中，小写核苷酸（a、g、c和t）分别表示2'-脱氧核糖核苷酸：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，大写核苷酸表示被碱基编辑破坏的LPA基因的起始密码子（Star codon）、剪切位点（Splice site）和外显子（exon）上的密码子（编辑后变成终止密码子），而加粗的字母（C或A）则表示编辑的目标碱基。
从图4、图5可以看到，71个gRNA与其碱基编辑器在靶点处实现的LPA基因目标碱基编辑效率在29%-99%之间，其中共有51个gRNA靶点处实现了不低于50%的碱基编辑效率。
选择靶点时虽然可以利用在线网站预测gRNA可能导致的脱靶位点，但体内真实编辑数据更为可靠。为了评估靶点gRNA在细胞中导致的脱靶编辑事件，我们从图4、图5中选择了靶点编辑效率最高的31个gRNA（如图6所示），碱基编辑效率在65%-99%之间，进行gRNA依赖性DNA脱靶编辑分析。利用在线网站获得候选脱靶位点，从中挑选错配碱基数最少的前3个作为候选脱靶位点。以对应gRNA在人肝癌细胞系HepG2编辑后获得的DNA作为模板，扩增获得候选脱靶位点附近500bp的基因片段，进行一代测序分析。从图6可以看出，测试的gRNA中有9个在候选脱靶位点处发生了脱靶编辑，而其它22个，即SG004、SG007、SG008、SG021、SG027、SG037、SG038、SG040、SG045、SG047、SG049、SG052、SG054、SG056、SG057、SG058、SG063、SG066、SG067、SG068、SG069、SG071，并未观察到脱靶编辑。
在上述未发生脱靶的gRNA中，LPA基因靶点处碱基编辑效率最高的3个分别是SG057、SG063和SG067，均通过引导碱基编辑器CE-ABE8e在LPA基因靶点处实现了A>G编辑，碱基编辑效率分别是98%、95%、99%。上述3个靶点的碱基编辑均破坏了LPA基因的剪切位点，从而导致了异常转录本，最终影响蛋白的翻译。
实施例3 LPA基因的体内碱基编辑
由于LPA基因仅存在于人类和古世界猴子（如食蟹猴）的基因组中，而啮齿动物（如小鼠和大鼠）缺乏LPA基因，因此不产生apo(a)蛋白。为此，从GemPharmatech购买了人LPA转基因小鼠（C57BL/6JGpt-Tg(hLPA)17/Gpt）作为评估体内碱基编辑和apo(a)敲低的模型。同时，仍然以LNP作为碱基编辑系统的递送载体。
按照实施案例1中的方法重新配制浓度为0.3 mg/mL的mRNA/gRNA_LNP溶液，包括含有重量比为1:1的CE-ABE8e mRNA和LPA基因靶向gRNA (SG057、SG063和SG067)的LNP溶液。以3 mg/kg（小鼠每千克3 mg）总RNA剂量向人LPA转基因小鼠给药LNP测试。
将转基因小鼠随机分配到不同的3个实验组（每组3只）并设置对照组小鼠。在尾静脉注射前一周收集所有转基因小鼠100uL血液，在4℃下以2000g转速离心10 min，收集上层血浆作为注射前样本冻存于-20℃冰箱。小鼠6周龄时称重，将配制好的6个不同LNP溶液，以3 mg/kg（每公斤3 mg总RNA）剂量注射至对应实验组的小鼠尾部静脉。而对照组小鼠注射200uL的1×PBS溶液。注射后7天，给小鼠吸入二氧化碳实施安乐死，收集300uL血液并离心吸取上层血浆作为注射后样本冻存于-20℃冰箱，并收集全肝脏组织切碎。首先，采用基因组 DNA 提取试剂盒（Tiangen，货号：DP304），按照其说明书，裂解上述采集肝脏组织，并提取基因组DNA样本。然后用sanger测序方法评估每个靶点处的碱基编辑 (见图7和图1)。
由图7和图1可知，3组LNP在其对应LPA靶点处的平均碱基编辑效率在76.8%~83.9%间，其中LNP1对应的gRNA (SG057)引导的碱基编辑效率最高，平均为83.9%（N=3）。
为了选择最有效的用于治疗用途的gRNA，最重要的一个评估标准是碱基编辑后导致的apo(a)蛋白的降低幅度。采用特异性性识别人源LPA的ELISA试剂盒（Abcam，货号：ab212165），按照其说明书，分别对注射前和注射后的血浆样本进行apo(a)蛋白的ELISA鉴定。根据ELISA鉴定结果，计算和评估注射前后apo(a)蛋白浓度（图8）及注射后蛋白浓度的降低比例（如图8和图2）。
由图8可知，本实施例测试的3个LNP试剂在转基因小鼠体内的碱基编辑都实现了很高的apo(a)蛋白敲除，其中，SG057 和SG067号gRNA引导CE-ABE8e（对应LNP1和LNP3）在体内实现了apo(a)蛋白的完全敲除，即注射药物后部分小鼠的血浆apo(a)下降比例为100%。
实施例4 gRNA介导的全基因组脱靶编辑
选择用于治疗用途的gRNA，另一个需要评估的标准是在全基因组范围内的脱靶编辑频率。为了评价mRNA/gRNA LNP介导的脱靶编辑，本实验采用全基因组测序方法，鉴定LNP在人肝癌细胞系HepG2中全基因组水平上的脱靶编辑事件。
将培养在含10%FBS的DMEM培养基中的人肝癌细胞系HepG2，以每孔1×106个细胞的密度接种在6孔板（Thermo，货号140685）中，转染前在5% CO2和37℃条件下培养18-24h。当细胞汇合度在80%左右时进行转染，转染前两个小时换新鲜培养基。将此前实施案例3中制备好的LNP1溶液（浓度为0.3 mg/mL）以10 uL/孔转染细胞。次日上午，更换新鲜的培养基。在转染45h后胰蛋白酶消化并收集细胞提取基因组DNA。随后，对LNP1转染相对未转染的细胞基因组DNA样品分别进行全基因组测序分析碱基编辑事件，结果如图3所示。
由图3可知，在LNP转染细胞中，除了在LPA原间隔序列所在位置发现碱基编辑外，在全基因组上没有观察到脱靶编辑。
实施例5 其他碱基编辑器在靶点gRNA处的编辑效果评估
本实施案例是为了展示三种在领域内常用的碱基编辑器如何被应用于编辑我们所设计的71个靶点，实现LPA基因的敲除，以证明这些靶点的普适性。
本实施例中，我们选择了三个得到了广泛应用的代表性碱基编辑器，即AncBE4max（可由专利US20210198330中的SEQ ID NO: 13的氨基酸序列通过反向编译后，再通过同源重组或化学合成获得）、ABEmax（可由专利US20210198330中的SEQ ID NO: 210的氨基酸序列通过反向编译后，再通过同源重组或化学合成获得)和SaABEmax（可由专利US20220315906中的SEQ ID NO. 70的氨基酸序列通过反向编译后，再通过同源重组或化学合成获得），进行LPA基因靶点的体外编辑验证。其中，AncBE4max是能实现NGG PAM靶点上碱基C>T编辑的胞嘧啶碱基编辑器，ABEmax是能实现NGG PAM靶点上碱基A>G编辑的腺苷碱基编辑器，而SaABEmax则是能实现NNGRRT PAM靶点上碱基A>G编辑的腺苷碱基编辑器。通过体外转录方法合成了三个碱基编辑器的mRNA，与实施案例1中对应靶点的sgRNA 共同递送到人肝癌细胞系HepG2中评估碱基编辑效率（如图9、图10、图11）。
如图9、图10和图11所示，在原间隔序列中，小写核苷酸（a、g、c和t）分别表示2'-脱氧核糖核苷酸：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶，大写核苷酸表示被碱基编辑破坏的LPA基因的起始密码子（Star codon）、剪切位点（Splice site）和外显子（exon）上的密码子（编辑后变成终止密码子），而加粗的字母（C或A）则表示编辑的目标碱基；N/A表示没有对该靶点进行脱靶编辑验证的数据。
为了递送碱基编辑组分，将合成的gRNA与对应碱基编辑器的mRNA，按照重量比1：1，共同包裹到LNP中，获得浓度为0.3 mg RNA/mL的核酸纳米脂质体（mRNA/gRNA_LNP）溶液，并以3.5 uL/孔转染人肝癌细胞系HepG2细胞。转染48h后收集细胞，提取基因组DNA进行LPA基因鉴定。通过PCR扩增靶位点所在区域约500bp片段，并进行sanger测序。在EditR网站分析每个靶点处目标碱基A>G或C>T的编辑效率如图9、图10、图11。结果可见，SG001-SG060与AncBE4max在LPA基因靶点处的目标碱基编辑效率在19%-81%间，SG057-SG068与ABEmax在LPA基因靶点处的目标碱基编辑效率在34%-72%间，而SG069-SG071与SaABEmax在LPA基因靶点处的目标碱基编辑效率在46%-55%间。由此可见，三个碱基编辑器在对应靶点处均能实现有效的目标碱基编辑，这表明了本申请提供的71个靶点sgRNA也可以组合其它常用碱基编辑器实现LPA基因的敲除。
此外，同样对实施案例2中验证过的31个sgRNA的潜在脱靶位点进行了脱靶编辑评估。以人肝癌细胞系HepG2编辑后获得的DNA作为模板，扩增获得潜在脱靶位点附近500bp的基因片段，通过一代测序鉴定和分析脱靶编辑效率，结果如图9、图10、图11。
由结果可见，即使使用不同的碱基编辑器，发生脱靶编辑仍然只有实施案例2中鉴定到的有9个gRNA，脱靶编辑效率在16%-64%间，而其它测试的21个gRNA并未观察到脱靶位点的编辑（如图9、图10、图11）。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (19)

1.一种基因编辑组合物，其特征在于，所述基因编辑组合物包含：
1）碱基编辑器融合蛋白，或编码所述碱基编辑器融合蛋白的核酸；
2）向导RNA，或编码所述向导RNA的核酸，其中向导RNA包含间隔序列片段和scaffold序列片段，编码所述间隔序列片段包含核苷酸序列如SEQ ID No.1-71任一项或多项所示的核酸分子。
2.根据权利要求1所述的基因编辑组合物，其特征在于，所述碱基编辑器融合蛋白包含可编程DNA结合结构域片段和脱氨酶结构域片段。
3.根据权利要求2所述的基因编辑组合物，其特征在于，所述可编程DNA结合结构域片段选自CRISPR/Cas系统的Cas蛋白的结构域片段。
4.根据权利要求3所述的基因编辑组合物，其特征在于，所述可编程DNA结合结构域片段为Cas9蛋白及其变体的结构域片段。
5.根据权利要求2所述的基因编辑组合物，其特征在于，所述脱氨酶结构域片段选自胞嘧啶脱氨酶片段或腺嘌呤脱氨酶片段。
6.根据权利要求5所述的基因编辑组合物，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶选自APOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、AID或pmCDA1中的一种或多种；或，所述腺嘌呤脱氨酶选自ecTadA或其变体。
7.根据权利要求1所述的基因编辑组合物，其特征在于，所述碱基编辑器融合蛋白选自CE-A3A1048-1063、CE-SaABE8e-744或氨基酸序列如SEQ ID No.74所示的碱基编辑器融合蛋白中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的基因编辑组合物，其特征在于，所述scaffold序列片段包含核苷酸序列如SEQ ID No.72-73任一所示的核酸分子。
9.根据权利要求1所述的基因编辑组合物，其特征在于，所述基因编辑组合物能破坏LPA基因起始密码子，或诱导LPA基因产生提前终止密码子，或破坏LPA基因可变剪切位点。
10.一种碱基编辑器融合蛋白，其特征在于，所述碱基编辑器融合蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID No.74所示的多肽。
11.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-9任一所述基因编辑组合物中的向导RNA、碱基编辑器融合蛋白或同时编码如权利要求1-9任一所述基因编辑组合物中的向导RNA和碱基编辑器融合蛋白。
12.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求11所述的核酸分子和质粒骨架。
13.一种细胞，其特征在于，所述细胞含有如权利要求11所述的核酸分子或如权利要求12所述的表达载体。
14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含递送载体和如权利要求1-9任一所述的基因编辑组合物、如权利要求11所述的核酸分子或如权利要求12所述的表达载体。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述递送载体选自聚合物纳米颗粒、脂质体、脂质纳米颗粒、病毒载体或细胞外囊泡中的一种或多种。
16.如权利要求1-9任一所述的基因编辑组合物、如权利要求11所述的核酸分子、如权利要求12所述的表达载体或如权利要求14-15任一所述的药物组合物在制备以下任一产品中的用途：
1）体外编辑LPA基因的产品；
2）降低载脂蛋白(a)和脂蛋白(a)的产品；
3）心血管疾病治疗药物。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述心血管疾病选自高胆固醇血症、冠心病、高血压、心肌梗死、中风、周围血管疾病或主动脉粥硬化中的一种或多种。
18.一种体外编辑LPA基因的方法，其特征在于，所述方法为：将如权利要求1-9任一所述的基因编辑组合物、如权利要求11所述的核酸分子或如权利要求12所述的表达载体导入分离的细胞，使所述细胞的LPA基因发生碱基突变。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述导入的方法选自脂质体转染、电穿孔法、病毒转导、显微注射法、粒子轰击法或基因枪转化法中的一种或多种。
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