CN117568188A - 一种提高爪哇虫草菌产孢量的液固双相培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术和生物防治领域，公开了一种提高爪哇虫草菌产孢量的液固双相培养方法。所述培养方法包括步骤：（1）采用正交最优组合的液体培养基发酵配方，培养72h得到液体发酵产物；（2）将液体发酵产物接入固体培养基（由液体培养基和固体发酵基质构成）进行固体发酵，固体发酵基质配方为棉籽和小麦胚芽。本发明采用液固双相发酵，对碳源、氮源、无机盐、pH等条件的优化，大大提高了产孢量，且在固体发酵中，生产原料价格低廉，显著提高了产孢量。实验表明，发酵7 d后产孢量可达5.37±0.21×109孢子/g。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术和生物防治领域，涉及一种提高爪哇虫草菌产孢量的液固双相培养方法。
背景技术
昆虫病原真菌资源丰富，对农林害虫具有良好的防治效果，据不完全统计，全球记载的昆虫病原真菌约100属1000多种(严森,任小云,王登杰等.昆虫病原真菌在害虫防治中对天敌生物的影响研究进展[J].中国生物防治学报,2023,39(01):221-230.DOI:10.16409/j.cnki.2095-039x.2022.01.014.)，昆虫病原真菌研究已经有了长足进展。迄今为止，已有170余种真菌杀虫剂产品被开发利用。国内已登记的昆虫病原真菌集中在球孢白僵菌Beauveria bassiana、金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae、淡紫拟青霉Paecilomyceslilacinus和爪哇虫草菌(又称爪哇棒束孢)Isariajavanica。其中爪哇棒束孢是棒束孢属中一种重要的昆虫病原真菌，在全球分布范围大，通常寄生于鳞翅目昆虫、地下害虫等，对同翅目、鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目和等翅目等8目40多种昆虫有致病力，具有广阔的利用前景。
有报道称，爪哇棒束孢菌株DMC01液体最佳培养条件为温度为26℃、pH为7、摇床转速为150r/min、装液量为摇瓶容量的1/4，其中固体培养基麦麸:谷壳为7:3时其产孢量达到5.5×109孢子/g(樊春丽.虫生真菌棒束孢的分离鉴定与应用基础研究[D].广西大学,2023.DOI:10.27034/d.cnki.ggxiu.2022.001614.)。目前对爪哇棒束孢的相关研究报道较少，为满足对该菌开发利用的要求，以提高其产孢量为目的，为后续研究的大力生产培养提供一种指导方法，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是补充现有技术中的不足，提供一种提高爪哇虫草菌产孢量的液固双相培养方法。
本发明提供一种提高爪哇虫草菌产孢量的液体培养基，其特征在于：由以下重量组分的水溶液制备而成：葡萄糖30-40g/L，酵母抽提物15-25g/L，KCl含量0.25-0.75g/L，初始pH为6.8-7.2；优选地，葡萄糖35g/L，酵母抽提物20g/L，KCl含量0.5g/L，初始pH为7。
本发明也提供一种提高爪哇虫草菌产孢量的固体培养基，其特征在于：由以下重量组分制成，原料重量份数为：棉籽:小麦胚芽3:1至1:1，营养液配比1:1至1:1.5；所述营养液为葡萄糖30-40g/L，酵母抽提物15-25g/L，KCl含量0.25-0.75g/L，初始pH为6.8-7.2；优选地，葡萄糖含量35g/L，酵母抽提物含量20g/L和KCl含量0.5g/L的水溶液。
本发明提供一种提高爪哇虫草菌产孢量的固体培养基的配制方法，其过程如下：称取小麦胚芽加入带塑料透气孔的玻璃瓶中，再称取棉籽加入，所称取的重量组分为，用玻璃棒稍微混匀后，加入液体培养基，充分搅拌混匀，最终得到固体培养基，放入高压灭菌锅121℃灭菌，冷却后备用。
本发明尤其提供一种提高爪哇虫草菌产孢量的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)液体培养阶段
将爪哇虫草菌的孢子悬浮液，加入所述的液体发酵培养基内震荡培养后得到液体发酵产物；
(2)固体培养阶段
用移液枪将液体发酵产物作为种子液接入所述的固体培养基，充分搅拌均匀，培养得到粗产物；
(3)产品收集处理
将粗产物烘干，获得终产物孢子粉。
优选地，所述第(1)步中，其是在26-30℃、180-220rpm恒温摇床震荡条件下培养；优选地，其是在28℃、200rpm恒温摇床震荡条件下培养。
另外优选地，所述第(2)步中，其是置于26-30℃(优选28℃)恒温恒湿培养箱中黑暗条件下培养。
具体地，在所述第(1)步的液体培养阶段的具体操作如下：将爪哇虫草菌接种于PDA平板，培养至长满平板并充分产孢，利用无菌枪头吸取灭菌水溶液清洗菌落，对孢子进行洗脱，置于磁力搅拌器上搅拌制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液的浓度调整为1×105-1×107孢子/mL，加入所述液体发酵培养基内，恒温摇床震荡培养后得到液体发酵产物。
优选地，在所述第(1)步的液体培养阶段的具体操作如下：将爪哇虫草菌接种于PDA平板，28℃培养至长满平板并充分产孢，利用无菌枪头吸取灭菌0.1％ Tween-80水溶液清洗菌落，对孢子进行洗脱，移入烧杯后置于磁力搅拌器上搅拌20～30min，制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液的浓度调整为0.5×106-1.5×106孢子/mL，加入所述液体发酵培养基内，在28℃、200rpm恒温摇床震荡培养72h后得到液体发酵产物。
另外优选地，在所述(2)步的固体培养阶段，种子液接种量为15-25％。
具体地，在所述第(3)步中具体操作是将粗产物放入烘箱，24～36h，100目过筛得到终产物孢子粉。
特别优选地，所述爪哇虫草菌是爪哇虫草菌(Cordyceps javanica)CJ01，其保藏编号为CCTCC No：M 20221721。所述的爪哇虫草菌CJ01分离自扶桑花叶片上罹病死亡的烟粉虱成虫虫体，保藏编号为CCTCC No：M 20221721，保藏日期为2022年11月10日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其已经公开在CN115948251A中。
本发明具有如下增益效果：
1、本发明全部发酵培养周期在17d左右，结合真菌生长周期较长的发酵特点，属于正常时间范畴，收获的孢子粉产量与质量均非常高，能够为爪哇虫草菌大规模生产提供依据，为其产业化应用奠定基础。
2、首先利用液体发酵快速生产大量的菌体作为固体发酵的接种体，然后将液体菌液按特定的接种量混合到固体基质中，迅速形成优势菌群，从而缩短了发酵周期，提高了产率，减少了杂菌污染几率，节约了资源。具有工艺简单、生产成本较低、节省动力、易于控制管理、活菌率高、后处理简单等优势，使得生产的耗能显著降低，有利于开发微生物杀虫剂的应用与推广。
3、根据培养基优化原则，采用液固双相发酵，对碳源、氮源、无机盐、pH等条件的优化，明确了更适合爪哇虫草菌生长繁殖的营养环境，并优选来源容易、价格低廉、利于生长且产孢率高的培养基成分用于发酵生产，确定了最适的发酵培养基最终配比，实现了高产孢的目的。
4、固体发酵培养基配方直接以小麦胚芽、棉籽作为主要固体发酵培养基原料，并添加特定配方的营养液(优选的实例中为：葡萄糖35g/L，酵母抽提物20g/L，KCl含量0.5g/L)作为外源成分。小麦胚芽、棉籽是农产品加工副产物，将其作为培养基营养物质，不仅可以降低生产成本，增加经济效益，还可以提高农业资源的综合利用水平，减少环境污染。其中小麦胚芽、棉籽能够为菌种提供较好的营养物质，但是单独利用其生长繁殖还是存在很大局限性，所以当在固体底物之中添加适量的外源碳源(葡萄糖)、氮源(酵母抽提物)、无机盐(KCl)可加快爪哇虫草菌生长繁殖，扩大菌体数量、诱导孢子形成，进而提高了孢子的产量。
5、相比其他微生物发酵方式，本发明采用的液固双相发酵中液体发酵快速产生大量的菌丝体或者芽生孢子，一般情况下仅需72h，这缩短其菌丝的生长周期，避免了前期容易污染的问题，同时固相发酵具有稳定性，可广泛运用于真菌的批量生产。
附图说明
图1为液体培养正交试验产孢量的测定结果。
图2为十一种固体发酵基质产孢量的测定结果。
图3为不同固体发酵基质比产孢量的测定结果。
图4为不同固体培养基组分产孢量的测定结果。
图5为不同接种量产孢量的测定结果。
具体实施方式
以下所述实施例结合本发明的原理和技术效果做进一步的详细阐述，便于更好地理解本发明的目的和使用方式，但不限定于本发明。下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到相关的试剂和材料。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取其平均值。实施例中采用菌株是爪哇虫草菌CJ01。
实施例1：液体培养单因素条件优化
1、试验材料：
(1)碳源：甘露糖、白糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖。
(2)氮源：牛肉膏、酵母抽提物、蛋白胨。
(3)微量元素：MnSO4、MgSO4、NaCl、KCl、ZnSO4。
(4)基础培养基：葡萄糖(40g/L)+蛋白胨(10g/L)。
2、培养条件：恒温摇床28℃，200rpm培养72h。
3、试验方法：
(1)碳源：以250mL锥形瓶为容器，以蛋白胨为氮源加入不同的碳源，将各培养基处理后分别接种孢子悬浮液3mL，孢子悬浮液浓度为1×106孢子/mL。每种培养基设置三个重复，装液量为100mL。置于恒温摇床培养72h后，吸取1mL的菌液于100mL离心管中，使用离心机得到沉淀，依次进行梯度稀释，使用血球计数板计算每mL的含孢量。结果显示葡萄糖促进菌株生长效果最好，产孢量达2.01±0.80×108孢子/mL。
(2)氮源；以葡萄糖为碳源加入不同的氮源，其余培养条件保持不变，酵母抽提物促进菌株生长效果最好，产孢量达1.29±0.25×108孢子/mL。
(3)无机盐：在基础培养基中加入0.5g/L的微量元素，其余培养条件不变，KCl促进菌株生长效果最好，产孢量达2.31±0.47×1010孢子/mL。
(4)pH：在基础培养基中，使用浓硫酸与氢氧化钠溶液，将pH调制成6、6.5、7、7.5，其余培养条件保持不变，pH＝7促进菌株生长效果最好，产孢量达1.89±0.27×109孢子/mL。
(5)装液量：培养瓶中盛100mL液体培养基，产孢量为2.90±0.48×109孢子/mL。结合参见表1。
表1本发明单因素条件对CJ01菌株生长的生物量测定
| 不同的液体发酵培养基 | 产孢量 |
| 40g/L葡萄糖 | 2.01±0.80×108孢子/mL |
| 10g/L酵母抽提物 | 1.29±0.25×108孢子/mL |
| 0.5g/L微量元素KCl | 2.31±0.47×1010孢子/mL |
| pH＝7 | 1.89±0.27×109孢子/mL |
| 100mL装液量 | 2.90±0.48×109孢子/mL |
实施例2：液体培养正交试验
在前期单因素试验的基础上，以最适碳源、最适氮源、培养基初始pH值、微量元素以及接种量五个条件为主要研究因素，采用L25的正交表(表2)，将各效果最好的单因素值定为最佳参数值，再加上前两个和后两个共5个参数进行五因素五水平的正交试验，每组试验重复3次。
表2正交因素水平表
以250mL锥形瓶为容器，改变每组液体培养基中蔗糖、酵母抽提物、KCl、装液量的不同水平，调配成实验设计中的比例，将配置好的溶液分装三组250mL锥形瓶中，即为三个重复。将各培养基处理后分别接种孢子悬浮液3mL，孢子悬浮液浓度为1×106孢子/mL。每种培养基设置三个重复，装液量为100mL。置于恒温摇床培养72h后，吸取1mL的菌液于100mL离心管中，使用离心机得到沉淀，依次进行梯度稀释，使用血球计数板计算每mL的含孢量。结果如表3和图1所示。结果表明，液体发酵的最优配方为：葡萄糖35g/L，酵母抽提物20g/L，KCl含量0.5g/L，初始pH为7，装液量为120mL，产孢量达到2.07±0.07×108孢子/mL。
表3正交因素水平表
实施例3：固体单一培养基质的筛选
选取玉米芯、稻壳粉、豆饼、稻壳、米糠、熟燕麦片、豆粕、麦麸、小麦胚芽、棉籽、玉米粉十一种农副产品作为固体培养基质，添加液体培养的营养液配方：葡萄糖35g/L，酵母抽提物20g/L，KCl含量0.5g/L，其余为水。
(1)一级平板菌种培养
将爪哇虫草菌CJ01接种于PDA平板，28℃培养至长满平板并充分产孢(通常为7～9天)。
(2)液体发酵产物
利用无菌枪头吸取15mL灭菌0.1％ Tween-80水溶液清洗菌落，对孢子进行洗脱，移入烧杯后置于磁力搅拌器上搅拌20～30min，制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液的浓度调整为1×106孢子/mL，加入配方为葡萄糖35g/L，酵母抽提物20g/L，KCl含量0.5g/L，初始pH为7，装液量为120mL的液体发酵培养基内，在28℃、200rpm恒温摇床震荡培养72h后得到液体发酵产物。
(3)固态发酵阶段
将上述液体发酵产物分别接入十一种不同的固体培养基(表4)，充分搅拌均匀，置于28℃恒温恒湿培养箱中黑暗培养7d后得到粗产物。
(4)产品收集处理
将粗产物放入烘干箱，恒温30℃烘干24～36h，100目过筛得到终产物。
(5)产孢量测定方法
称取培养好的带菌初产物1g，放入装有无菌水的100mL三角瓶中，加入一滴Tween-80，震荡30min，待孢子充分溶于水后得到孢子悬浮液，吸取1mL的菌液于100mL离心管中，依次进行梯度稀释，使用血球计数板计算每1g固体培养物中的孢子含量。实施例3中产孢量最高的固体培养基质是棉籽，其产孢量为26.04±0.49×107孢子/g，结合参见表4和图2。
表4十一种固体培养基质产孢量的测定结果
| 不同固体培养基质 | 产孢量 |
| 玉米芯 | 2.71±0.12×107孢子/g |
| 熟燕麦片 | 2.97±0.44×107孢子/g |
| 小麦麸皮 | 13.03±1.10×107孢子/g |
| 膨化豆粕 | 5.76±0.51×107孢子/g |
| 米糠 | 1.63±0.10×107孢子/g |
| 玉米粉 | 17.73±3.01×107孢子/g |
| 豆饼 | 0.10±0.02×107孢子/g |
| 小麦胚芽 | 32.32±0.94×107孢子/g |
| 棉籽 | 26.04±0.49×107孢子/g |
| 稻壳粉 | 1.81±0.10×107孢子/g |
| 稻壳 | 7.05±0.34×107孢子/g |
实施例4：固体发酵基质比的确定
本实施例采用实施例3中的棉籽和小麦胚芽为主要固体培养基质，按1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4重量比配置(表五)，其他工艺操作同实施例3。结果如表5和图3所示，由此可知产孢量最高的固体发酵基质比是棉籽:小麦胚芽为1:3，其产孢量为8.79±0.91×108孢子/g。
表5不同固体发酵基质比产孢量的测定结果
| 固体发酵基质比(棉籽:小麦胚芽) | 产孢量 |
| 1:0.25 | 4.40±1.51×108孢子/g |
| 1:0.5 | 5.30±2.02×108孢子/g |
| 1:1 | 4.03±0.98×108孢子/g |
| 1:2 | 5.65±0.56×108孢子/g |
| 1:3 | 8.79±0.91×108孢子/g |
| 1:4 | 7.49±0.71×108孢子/g |
实施例5：固体培养条件优化一
本实施例营养液成分为葡萄糖35g/L，酵母抽提物20g/L，KCl含量0.5g/L，其余为水，营养液添加量与固体培养基按1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4质量比配置(表6)，其他工艺操作同实施例3。结果如表6和图4所示，由此可知产孢量最高的液体培养基：固体基质比为1:0.5，其产孢量为1.01±2.30×109孢子/g。
表6不同固体培养基组分产孢量的测定结果
| 固体培养基组分(液体培养基:固体发酵基质) | 产孢量 |
| 1:0.25 | 6.11±0.23×108孢子/g |
| 1:0.5 | 10.10±0.23×108孢子/g |
| 1:1 | 6.78±0.31×108孢子/g |
| 1:2 | 3.58±0.82×108孢子/g |
| 1:3 | 3.67±0.68×108孢子/g |
| 1:4 | 3.40±0.53×108孢子/g |
实施例6：固体培养条件优化二
本实施例将液体发酵产物的接种量控制为固体培养基的5％、10％、15％、20％、25％、30％(表7)，其他工艺操作同实施例3。结果如表7和图5所示，由此可知产孢量最高的液体发酵产物接种量为20％，其产孢量为5.37±0.21×109孢子/g。
表7不同接种量产孢量的测定结果
| 不同接种量 | 产孢量 |
| 5％ | 3.54±0.22×109孢子/g |
| 10％ | 3.20±0.38×109孢子/g |
| 15％ | 4.51±0.31×109孢子/g |
| 20％ | 5.37±0.21×109孢子/g |
| 25％ | 3.94±0.20×109孢子/g |
| 30％ | 3.33±0.41×109孢子/g |
实施例7：性能测试
孢子萌发率的测定：
(1)一级平板菌种培养
将爪哇虫草菌CJ01接种于PDA平板，28℃培养至长满平板并充分产孢(通常为7～9天)。
(2)液体发酵产物
利用无菌枪头吸取15mL灭菌0.1％ Tween-80水溶液清洗菌落，对孢子进行洗脱，移入烧杯后置于磁力搅拌器上搅拌20～30min，制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液的浓度调整为1×106孢子/mL，加入配方为葡萄糖35g/L，酵母抽提物20g/L，KCl含量0.5g/L，初始pH为7，装液量为120mL的液体发酵培养基内，在28℃、200rpm恒温摇床震荡培养72h后得到液体发酵产物。
(3)固态发酵阶段
用移液枪吸取液体发酵产物接入灭菌后的固体培养基，接种量为灭菌后的固体培养基重量的20％，充分搅拌均匀，培养得到固体发酵产物；所述固体培养基由固体发酵基质与液体培养基制成，重量组分如下，固体发酵基质重量份数为：“棉籽:小麦胚芽”＝1:3，液体培养基:固体发酵基质＝1:0.5。置于28℃恒温恒湿培养箱中黑暗培养7d后得到粗产物。
(4)产品收集处理
将粗产物放入烘干箱，恒温30℃烘干24～36h，100目过筛得到终产物。
取终产物得来的孢子粉配成孢子悬浮液，取1mL加入100mL SDA液体培养基中。在28℃，220r/min条件下培养24h。吸取适量菌液滴在载玻片上采用革兰氏染色法，置于显微镜下，观察并记录孢子的萌发情况，芽管长度大于等于孢子直径的孢子视为萌发。每处理单次镜检不少于50个孢子，重复镜检5次。发现其孢子萌发率可达78.7％，说明采用该种培养方法，孢子存活率高，便于后续大规模的生长培养。
综上，本发明提供一种提高爪哇虫草菌产孢量的液固双相培养方法。本发明提供的培养方法将液体发酵方法和固体发酵方法相结合，先利用液体培养快速生长的大量孢子、菌丝体，随后转接到固体营养基质上产生分生孢子，具有促生长作用。
本发明所述的培养方法不仅大大提高了产孢量，且其孢子萌发率可达80％以上，为探究其大规模培养应用提供条件，其次，采用液固双相发酵，对碳源、氮源、无机盐、pH、装液量等条件的优化，产孢量高，且在固体发酵中，生产原料价格低廉，不污染环境。本发明提供的培养方法具有工艺简单、生产成本较低、节省动力、易于控制管理、活菌率高、后处理简单等优势，使得生产的耗能显著降低，增加经济效益，有利于开发微生物杀虫剂的应用与推广，提高农业资源的综合利用水平。
虽然本发明已经参照具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本发明的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本发明的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物和方法。所有的这些改变均包括在本发明的权利要求的范围内。
Claims (10)
1.一种提高爪哇虫草菌产孢量的液体培养基，其特征在于：由以下重量组分的水溶液制备而成：葡萄糖30-40g/L，酵母抽提物15-25g/L，KCl含量0.25-0.75g/L，初始pH为6.8-7.2；优选地，葡萄糖35g/L，酵母抽提物20g/L，KCl含量0.5g/L，初始pH为7。
2.一种提高爪哇虫草菌产孢量的固体培养基，其特征在于：由以下重量组分制成，原料重量份数为棉籽:小麦胚芽3:1至1:1，营养液配比1:1至1:1.5；所述营养液为葡萄糖30-40g/L，酵母抽提物15-25g/L，KCl含量0.25-0.75g/L，初始pH为6.8-7.2；优选地，葡萄糖含量35g/L，酵母抽提物含量20g/L和KCl含量0.5g/L的水溶液。
3.根据权利要求2所述的提高爪哇虫草菌产孢量的固体培养基的配制方法，其特征在于：称取小麦胚芽加入带塑料透气孔的玻璃瓶中，再称取棉籽加入，所称取的重量组分为，用玻璃棒稍微混匀后，加入液体培养基，充分搅拌混匀，最终得到固体培养基，放入高压灭菌锅121℃灭菌，冷却后备用。
4.一种提高爪哇虫草菌产孢量的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）液体培养阶段
将爪哇虫草菌的孢子悬浮液，加入如权利要求1所述的液体发酵培养基内震荡培养后得到液体发酵产物；
（2）固体培养阶段
用移液枪将液体发酵产物作为种子液接入如权利要求2所述的固体培养基，充分搅拌均匀，培养得到粗产物；
（3）产品收集处理
将粗产物烘干，获得终产物孢子粉。
5.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于：所述第（1）步中，其是在26-30℃、180-220rpm恒温摇床震荡条件下培养；优选地，其是在28℃、200rpm恒温摇床震荡条件下培养；所述第（2）步中，其是置于26-30℃（优选28℃）恒温恒湿培养箱中黑暗条件下培养。
6.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于：在所述第（1）步的液体培养阶段的具体操作如下：将爪哇虫草菌接种于PDA平板，培养至长满平板并充分产孢，利用无菌枪头吸取灭菌水溶液清洗菌落，对孢子进行洗脱，置于磁力搅拌器上搅拌制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液的浓度调整为1×105-1×107孢子/mL，加入所述液体发酵培养基内，恒温摇床震荡培养后得到液体发酵产物。
7.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于：在所述第（1）步的液体培养阶段的具体操作如下：将爪哇虫草菌接种于PDA平板，28℃培养至长满平板并充分产孢，利用无菌枪头吸取灭菌0.1% Tween-80水溶液清洗菌落，对孢子进行洗脱，移入烧杯后置于磁力搅拌器上搅拌20 ~ 30 min，制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液的浓度调整为0.5×106-1.5×106孢子/mL，加入所述液体发酵培养基内，在28℃、200rpm恒温摇床震荡培养72h后得到液体发酵产物。
8.如权利要求6或7所述的培养方法，其特征在于：在所述（2）步的固体培养阶段，种子液接种量为20-25%。
9.如权利要求6或7所述的培养方法，其特征在于：在所述第（3）步中具体操作是将粗产物放入烘箱，24~36h，100目过筛得到终产物孢子粉。
10.如权利要求4至9任一项所述的培养方法，其特征在于：所述爪哇虫草菌是爪哇虫草菌CJ01，其保藏编号为CCTCC No：M 20221721。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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