CN117567591A - 一种用于研究Tmem247蛋白的新型鼠源Tmem247抗体制备方法和应用 - Google Patents

一种用于研究Tmem247蛋白的新型鼠源Tmem247抗体制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于研究Tmem247蛋白的新型鼠源Tmem247抗体制备方法和应用。该新型鼠源Tmem247蛋白抗体是通过含有氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示多肽的Tmem247蛋白抗原制备得到的。发明人通过对Tmem247基因序列进行预测，发现上述多肽可作为Tmem247蛋白的抗原决定簇，采用上述多肽可用于筛选抗Tmem247蛋白抗体。由此，得到的上述抗体与Tmem247蛋白具有较强的结合能力，可用于检测Tmem247蛋白。

Description

一种用于研究Tmem247蛋白的新型鼠源Tmem247抗体制备方法 和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于研究Tmem247蛋白的新型鼠源Tmem247抗体制备方法和应用，更具体地涉及一种抗原决定簇多肽、Tmem247蛋白抗原、核酸分子、表达载体、重组细胞和它们的用途、抗Tmem247蛋白抗体及其用途、试剂盒。
背景技术
跨膜蛋白247（transmembrane protein 247，简称Tmem247）是由Tmem247基因编码的蛋白质。Tmem247是一种跨膜蛋白，横跨细胞膜。Tmem247蛋白具体功能和意义尚未被充分研究和描述，需要进一步的研究来阐明其具体作用、细胞定位以及与其他分子或途径的潜在相互作用。因此，为了研究Tmem247突变后对高原低氧适应性的影响，以及该蛋白的相关功能，亟需得到Tmem247蛋白的抗原决定簇及其抗体，以便进一步开展后续实验（例如动物实验）研究。
目前，尚无对鼠源Tmem247蛋白的抗原决定簇的研究，以及尚无鼠源Tmem247蛋白的抗体。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种Tmem247蛋白的抗原决定簇多肽，该多肽可作为抗原免疫动物，用于筛选相关抗体。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种多肽。根据本发明的实施例，所述多肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。发明人通过对Tmem247基因序列进行预测，发现上述多肽可作为Tmem247蛋白的抗原决定簇，采用上述多肽可用于筛选抗Tmem247蛋白抗体。由此，得到的抗Tmem247蛋白抗体与Tmem247蛋白具有较强的结合能力，可用于检测Tmem247蛋白。
GPGSVELPLPLETEHRNAMELEKVRMEFELTLLKYLHQENERQRQHEEVMEQLQQQQQQQQALPHQFSGSLQD（SEQ ID NO:1）。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种Tmem247蛋白抗原或融合蛋白。根据本发明的实施例，所述Tmem247蛋白抗原包括第一方面所述的多肽和载体蛋白；所述载体蛋白和多肽相连。由前可知，第一方面的多肽可作为Tmem247蛋白的抗原决定簇。由此，含有上述多肽的Tmem247蛋白抗原具有抗原性高等优点，可刺激抗原免疫动物发生免疫应答、产生特异性的抗体，可用于筛选抗Tmem247蛋白抗体。
根据本发明的实施例，所述Tmem247蛋白抗原或融合蛋白还可以进一步包括如下技术特征中的至少之一：
根据本发明的实施例，所述载体蛋白的C端与所述多肽N端相连，或所述载体蛋白的N端与所述多肽C端相连。
根据本发明的实施例，所述载体蛋白包括蛋白标签、血蓝蛋白（Keyhole limpethemacyanin，KLH）、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）和卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述载体蛋白选自血蓝蛋白、牛血清白蛋白和卵清蛋白中的至少之一。由此，可提高Tmem247蛋白抗原的免疫原性和免疫效果。
在本发明的一个可选实施例中，所述蛋白标签包括但不限His标签、Flag标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签和C-Myc标签等。
在本发明的一个可选实施例中，所述载体蛋白为His标签。由此，有利于蛋白的纯化，促进蛋白的可溶性。
根据本发明的实施例，所述载体蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
MGSSHHHHHHSSG（SEQ ID NO:2）。
根据本发明的实施例，所述Tmem247蛋白抗原进一步包括连接肽。
根据本发明的实施例，所述载体蛋白的C端与所述连接肽的N端相连、所述连接肽的C端与所述多肽的N端相连，或所述多肽的C端与所述连接肽的N端相连、所述连接肽的C端与所述载体蛋白的N端相连。
在本发明的一个可选实施例中，所述连接肽为裂解肽。
需要说明的是，“裂解肽”是指可在动物机体内被特定酶裂解，即包含特定酶的识别位点，从而释放多肽。
在本发明的一个可选实施例中，所述连接肽为3C酶识别位点识别位点。
根据本发明的实施例，所述连接肽具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
LEVLFQ（SEQ ID NO:3）。
根据本发明的实施例，所述Tmem247蛋白抗原具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
MGSSHHHHHHSSGLEVLFQGPGSVELPLPLETEHRNAMELEKVRMEFELTLLKYLHQENERQRQHEEVMEQLQQQQQQQQALPHQFSGSLQD（SEQ ID NO:4）。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码第一方面所述的多肽或第二方面所述的Tmem247蛋白抗原。根据本发明实施例的核酸分子所编码前述的多肽、前述的Tmem247蛋白抗原。
根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。
需要说明的是，对于本文中所提及的核酸分子，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带第三方面所述的核酸分子。在将上述核酸分子连接到表达载体上时，可以将所述核酸分子与表达载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于表达载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于表达载体本身。当然，所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。
本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到表达载体上，使得表达载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的表达载体例如可以为质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前述的多肽、前述的Tmem247蛋白抗原的表达，进而实现多肽或Tmem247蛋白抗原的体外大量获得。
根据本发明的实施例，所述表达载体包括原核表达载体或真核表达载体。
根据本发明的实施例，所述表达载体包括选自质粒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体中的至少之一。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞包括：携带第三方面所述的核酸分子或第四方面所述的表达载体；或表达第一方面所述的多肽或第二方面所述的Tmem247蛋白抗原。利用该重组细胞在适合条件下，能够在细胞内有效地表达前述的多肽或Tmem247蛋白抗原。
需要说明的是，本文中所述的“适合条件”，是指适合本发明所述多肽或Tmem247蛋白抗原表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合所述多肽或Tmem247蛋白抗原表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的受体细胞状态、合适的受体细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述多肽或Tmem247蛋白抗原表达的条件。
根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将所述表达载体导入至受体细胞中得到的。
根据本发明的实施例，所述受体细胞包括真核细胞或原核细胞。
根据本发明的实施例，所述原核细胞为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌。
根据本发明的实施例，所述真核细胞为真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
根据本发明的实施例，所述真菌为巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母或木霉。
根据本发明的实施例，所述昆虫细胞为草地粘虫细胞；根据本发明的实施例，所述植物细胞是烟草植物细胞；根据本发明的实施例，所述哺乳动物细胞为BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞或人胚肾293细胞；且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
根据本发明的实施例，所述细胞是哺乳动物细胞。
根据本发明的实施例，所述细胞是BHK细胞、CHO细胞、COS细胞或NSO细胞。
在本发明的第六方面，本发明提出了第一方面所述的多肽、第二方面所述的Tmem247蛋白抗原、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞在制备抗Tmem247蛋白抗体中的用途。由此，含有上述多肽的Tmem247蛋白抗原具有抗原性高等优点，可刺激抗原免疫动物发生免疫应答、产生特异性的抗体，可用于筛选抗Tmem247蛋白抗体。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种抗Tmem247蛋白抗体。根据本发明的实施例，所述抗Tmem247蛋白抗体是通过第一方面所述的多肽、第二方面所述的Tmem247蛋白抗原、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞制备得到的。根据本发明实施例的抗Tmem247蛋白抗体与Tmem247蛋白具有较强的结合能力，可用于检测Tmem247蛋白。
在本发明的一个可选实施例中，所述抗Tmem247蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
在本发明的一个可选实施例中，所述抗Tmem247蛋白抗体为多克隆抗体。
在本发明的第七方面，本发明提出了第六方面所述的抗Tmem247蛋白抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测Tmem247蛋白。由前可知，第六方面所述的抗Tmem247蛋白抗体与Tmem247蛋白具有较强的结合能力。由此，本发明的试剂盒可特异性的检测Tmem247蛋白。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括第六方面所述的抗Tmem247蛋白抗体。由前可知，第六方面所述的抗Tmem247蛋白抗体与Tmem247蛋白具有较强的结合能力。由此，本发明的试剂盒可特异性的检测Tmem247蛋白。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1中Tmem247蛋白有两段跨膜结构域；
图2为本发明实施例2中Tmem247过表达质粒电泳图；
图3为本发明实施例2中Tmem247过表达株蛋白电泳图；
图4为本发明实施例2中Tmem247蛋白纯化结果图；
图5为本发明实施例3中Tmem247抗体WB检测结果；
图6为本发明实施例4中小鼠组织样本和人源细胞样本的Tmem247蛋白检测结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明详细说明
定义及一般术语
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“融合蛋白”通常指由两个或更多个蛋白或多肽融合得到的蛋白。编码所述两个或更多个蛋白或多肽的基因或核酸分子可彼此连接而形成融合基因或融合的核酸分子，该融合基因或融合的核酸分子可编码所述融合蛋白。所述融合基因的翻译产生单一多肽，其具有融合前的所述两个或更多个蛋白或多肽中至少一个、甚至每一个的性质。重组融合蛋白通过用于生物学研究或治疗的重组DNA技术人工创造。重组融合蛋白是通过融合基因的遗传工程创造的蛋白质。本发明涉及重组融合蛋白，并且术语融合蛋白和重组融合蛋白在本文以相同含义使用。本文描述的融合蛋白通常包含至少两个结构域(A和C)，并且任选地包含第三组分，介于所述两个结构域之间的接头。重组融合蛋白的生成是本领域已知的，并且通常涉及自编码第一蛋白或多肽的cDNA序列去除终止密码子，然后通过连接或重叠延伸PCR以符合读框的方式附接第二蛋白的cDNA序列。该DNA序列然后会由细胞表达成为单一蛋白质。该蛋白质可以经工程化以包括两种原始蛋白质或多肽的完整序列，或仅仅为其中的一部分。
本发明融合蛋白通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
在本文中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体。所述表达载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述表达载体的合适的宿主细胞，所述表达载体可以产生期望的表达产物。
在本文中，术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中，术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸（例如载体）引入细胞。合适的宿主细胞可以用本发明的DNA序列转化或转染，并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。可用于本发明的合适宿主细胞的例子包括永生化杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、Cap细胞（人羊水来源的细胞）和CoS细胞。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一般实验
相关试剂配方
（1）1M Tris-HCl（pH6.8）：Tris称取121.14g加水溶解后HCl调pH至6.8，最后加水定容至1L。
（2）非还原 5X Loading Buffer（1L）：250mL 1M Tris-HCl（pH6.8）、80g SDS、5g溴酚蓝（BPB）、500mL甘油，加水定容到1L。注：还原性 Loading Buffer还需加5% β-巯基乙醇。
（3）2×YT 培养基（1L）：16g蛋白胨、10g酵母提取物、5gNaCl，加纯水定容至1L，在121℃条件下灭菌15min。
（4）Amp (100mg/mL) ：称取0.1g Amp抗生素溶解于1mL ddH2O中，过滤除菌。
（5）Kan (50mg/mL) ：称取0.05g Kan抗生素溶解于1mL ddH2O中，过滤除菌。
（6）1M IPTG： 称取11.91g IPTG溶解于50mL水中，过滤除菌。
（7）10×PBS 缓冲液：80g NaCl+2g KCl+36.3g Na2HPO4·12H2O+2.4g KH2PO4，定容到1L。
（8）10×PBS（8M尿素） 缓冲buffer：配方同10×PBS 缓冲buffer，往其中多加480g尿素。
（9）5×Tris-Gly buffer:15.1g Tris碱＋94g 甘氨酸+5gSDS加水溶解，定容至1L。
（10）1.5M Tris-HCl(PH8.8):18.171g Tris碱加水溶解，HCl调pH至8.8，定容至100mL。
（11）1×电泳buffer:5× Tris-Gly buffer 200mL加水定容至1L。
（12）10×转膜储存液: 30.3 g Tris碱＋144 g 甘氨酸加水溶解，定容至1L。
（13）转膜Buffer：10× 转膜储存液100 ml＋甲醇200 ml定容至1L。
（14）PBST：10×PBS 缓冲buffer 100 ml加水定容至1 L＋500 μl 吐温20。
（15）封闭液：称取脱脂奶粉（5%），用PBST溶解。
（16）标签一抗：用1×PBS按1:5000比例稀释(具体根据抗体效价)。
（17）二抗：用1×PBS按1:10000比例稀释(具体根据抗体效价)。
实施例1：Tmem247蛋白抗原表位簇的筛选
利用生物信息学方法对tmem247基因序列（Gene ID: 78469，NCBI ReferenceSequence: NC_000083.7，Tmem247 transmembrane protein 247 [Mus musculus (housemouse)]-Gene-NCBI (nih.gov)）进行预测和分析，识别到Tmem247两段跨膜结构域（如图1所示）。发明人通过分析序列特征、以及进一步参考同源蛋白信息和，同时避开跨膜结构域，最终截取Val90-Asp158序列作为抗原表位，确定抗原决定簇区域（即氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示），为后续蛋白质表达和免疫实验提供依据。
实施例2：Tmem247蛋白抗原的制备
根据实施例1中预测的抗原决定簇区域，并在其N端带有His标签，具体氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。然后根据该氨基酸序列合成目的基因序列，将合成好的目的基因与表达载体连接，电转至大肠杆菌中，进行质量检测。然后进行Tmem247蛋白表达的检测，确认蛋白有表达后进一步进行放大培养，最后进行蛋白纯化。具体步骤如下：
1、Tmem247过表达质粒的构建：采用pET-28b-3C 表达载体，将编码抗原决定簇区域（氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示）的核苷酸序列连接至pET-28b-3C 表达载体中，酶切位点为BamHI-HindIII，得到构建好的Tmem247过表达质粒。
2、Tmem247蛋白表达及SDS-PAGE检测
1）将构建好的Tmem247过表达质粒电转入大肠杆菌感受态中。
2）按照1:50-1:100比例取上述活化菌液转接至1.5mL的含相应抗性（Amp或Kan，同下）的培养基，写好相对应的标识（蛋白名，抗性，温度等条件），放置于37℃摇床中200rpm培养生长。
3）待OD(600nm)=0.6-0.8后（大约2个多小时），按1:1000的比例添加诱导剂1MIPTG（终浓度1mM）后，分别放置于不同条件下（30℃1h、30℃4h、37℃1h、37℃4h，16℃过夜）200rpm摇床培养使其表达蛋白，菌种活化成功后，接入37℃条件菌液进行培养。
4）收集表达后的菌液（放大样品取3mL即可），每3mL分两个1.5mLEP管装（离心条件：12000rpm，1min）。
5）将菌体加入1mL1×PBS混匀后，超声。
6）超完后离心(12000rpm,1min)，吸200μL上清至新的EP管中，标记为“NPE”，沉淀加入200μL 1×PBS（含8M尿素），混匀，标记为“DPE”；分别往NPE、DPE样品中加入50μL还原性5×loading buffer，轻摇混匀，勿上下颠倒，然后煮样，（放到设置好条件的金属浴上，98℃，5min），待电泳检测。
7）安装夹心式垂直版电泳槽。
8）配胶：根据所测蛋白质分子量的范围，选择合适的分离胶浓度。
9）检查做胶台面，垂直电泳槽，制胶板、制胶容器是否洁净干燥。
10）在电泳槽上装配好制胶板，压实，确保制胶板底部平整，并用夹具夹紧。
11）根据实验主要分离蛋白的大小，选择合适的凝胶浓度。
12）配制分离胶（如表1所示）和浓缩胶（如表2所示）。
表1：分离胶各成分所需体积
表2：浓缩胶各成分所需体积
13）SDS-PAGE检测：
上样：大肠杆菌表达测试和放大检测样品取15μl；
电泳：开始120V电泳，待跑到浓缩胶下面再调为200V直至电泳完毕；
染色：切去浓缩胶后，小心取下剩下分离胶，置于染色缸中，可用微波炉稍微加热下，在置于摇床上进行染色；
脱色：将染好的胶块取出置于平皿中，用清水洗涤，再换清水放摇床上，直至颜色变浅，条带清晰；将脱好的胶块放到扫描仪上进行扫描，编辑，保存。
3、大肠杆菌放大培养
（1）挑选出步骤2中已表达并表达量较高的阳性菌株，活化菌种：5mL (LB/2× YT培养基) + 相应抗生素+ 50μL 菌液，37℃培养过夜。
（2）转接，将过夜活化的5mL菌液接至200mL培养基中，并加入对应抗生素，然后37℃ 220rpm摇床培养约3-4h。
（3）打开UV 600nm 测量OD值 0.8～1.0 的范围内，按项目要求加入IPTG后继续37℃ 220rpm摇床诱导表达4h（取最佳表达条件），表达完后收样，离心条件8500rpm，5 min。
4、蛋白纯化
（1）将步骤3中收集的样品进行纯化，纯化样品预处理参照《大体积培养基样品预处理标准操作规程》完成，取80 μL小样（IN）以备SDS-PAGE检测用；
（2）纯化填料用量按照载量10 mg/mL计算；
（3）将纯化填料加入重力柱中，待保存液20%乙醇滴完，加入10倍柱体积超纯水，将乙醇冲洗干净，最后加入10倍柱体积PBS pH 7.5平衡重力柱；
（4）用堵头堵住重力柱的下端，并用待纯化样品将填料悬匀后，与样品混合，放入结合摇床，并将结合摇床置于4℃冰箱中，结合时间不得小于30 min；
（5）将结合好的样品从结合摇床取下，于4℃冰箱静置5-10min，再用移液器将样品与填料的混合物加入到空柱中，并收集流穿样品（FT），取40 μL样品（FT）以备SDS-PAGE检；
（6）使用10倍柱体积的PBS pH 7.5冲洗柱子，以将那些非特异性结合的宿主蛋白洗脱掉，收集样品（W1），取40 μL样品（W1）以备SDS-PAGE检测用；
（7）不同浓度梯度的咪唑溶液梯度淋洗；
（8）再用PBS pH 7.5+高浓度咪唑每一个柱体积洗一管，总共洗9管，每管取40μL小样，并记为E1-E9，以备SDS-PAGE检测用；
（9）根据SDS-PAGE结果收集目标蛋白。
其中，图2的Tmem247过表达质粒（即Plasmid Digested with Mlul-Xhol）电泳图结果显示，插入片段大小与目的序列相符，且测序验证序列与目的序列一致。目的蛋白预测大小为10.84kd，根据图3的Tmem247过表达株蛋白电泳图（其中，Strain NO.1（类型 NO.1）为BL21(DE3) strain；Strain NO.2（类型 NO.2）为T7Estrain）显示，Tmem247蛋白有过表达。图4的Tmem247蛋白纯化结果图结果显示，蛋白纯化后得到抗原。
综上结果可知，成功构建Tmem247蛋白表达载体，并经测序验证与目标序列一致，成功过表达Tmem247蛋白并提取纯化，可进行后续免疫实验。
实施例3：Tmem247蛋白抗体的制备
1、动物免疫
按如下要求用实施例2中得到的Tmem247蛋白抗原免疫2只新西兰大白兔（常规免疫4次，可加免1-2次）：
具体免疫步骤为：
露出大白兔的颈背部。在颈背部要免疫的点喷上75%酒精，在喷好酒精的地方，一手提起皮肤，另一只手持免疫的针，针沿着提着皮肤的手的拇指方向进针，进入约0.5 cm，注射。共注射6-8点。免疫好之后将兔子放回。
2、抗体效价检测
第3/4次免疫后一周取血检测，用间接ELISA方法检测第3/4次免疫后抗血清效价，要求抗血清效价>1:32000。若效价达不到要求，则增加 1-2 次免疫。
2.1 ELISA检测抗体效价
（1） 包被：计算所需的抗原体积，包被液体积，蛋白包被浓度为1-2 μg/ml，多肽包被浓度为1-5μg/ml。
（2） 封闭：从37℃温箱中或从4℃冰箱中取出包被好的酶标板将其中的包被液甩入水池内，然后将5% Milk以每孔300μl的量依次加入，盖上盖子放入37℃温箱温育1小时，如果封闭是在下午四点后进行，则孵育为4℃冰箱过夜。
（3） 洗涤：从37℃温箱中或从4℃冰箱中取出包被和封闭好的酶标板，将封闭液甩入水池，用PBST洗涤3次。依照项目号、顺序号的顺序整理好，将板进行装袋。放入-20℃备用，保质期2个月，超过2个月应丢弃。如果需要马上加一抗，则直接加一抗孵育，无需放入冰箱-20℃保存。
（4） 一抗孵育：根据实验需求加入一抗，每孔100 μl，盖上盖子放入37℃温箱温育60分钟后取出，甩去一抗用PBST洗涤3次，在吸水纸巾上拍干。
（5） 二抗孵育：根据实验需求加入对应种属二抗，每孔100 μl，盖上盖子放入37℃温箱温育 30分钟后取出，甩去二抗，用PBST洗涤3次，在吸水纸巾上拍干。
（6） TMB显色：将准备好的TMB显色液倒入一个套有PE手套的干净加样槽中，用排枪以每孔100 μl的量依次加入酶标板孔中，盖上盖子放入温箱5-10分钟，观察显色情况。
（7）终止：打开酶标仪，预热１分钟，从温箱取出酶标板，将2 M HCl以每孔50 μl的量依次加入酶标板孔中。
（8）读数: 打开Thermo酶标仪软件，选择450-620 nm波长，将酶标板底部用吸水毛巾擦净后放进酶标仪卡槽内，点击start读数。
抗体间接ELISA效价检测结果如下表所示，其中，阴性对照为免疫前血清，空白对照为 PBS。
2.2 WB验证纯化的抗体是否识别重组蛋白
（1）SDS-PAGE电泳：刚开始采用120V进行电泳，待蛋白跑到浓缩胶下面再调为200V，直至电泳完毕；
（2）转膜：电泳完毕，小心取下凝胶，切掉琼脂糖凝胶和浓缩胶后将胶置于电泳Buffer中，打开转移夹（黑面朝下），先放一个湿润的滤纸，将凝胶放在滤纸上面，再将膜覆盖于凝胶之上，然后再盖上另一块滤纸，最后盖上转移夹置于电泳Buffer中夹紧。安装好转移槽，在冰水浴中电泳，恒流200 mA电泳（时间根据蛋白大小决定：＜70 kDa转40min，70kDa-100 kDa转50 min；100 kDa-130 kDa转80 min）。（注：转移夹黑面为阴极，蛋白从阴极向阳极移动；每叠加一层都要用少量电泳Buffer湿润，并且不能产生气泡；若想过夜转膜就选择冰水浴35V电泳15:30h）；
（3）封闭：塑料盒中倒入一部分已配好的封闭液，电泳完毕取出PVDF膜，用PBST快速洗涤2-3次，将膜放入塑料盒中，再将塑料盒置于摇床上室温缓慢封闭1h；
（4）孵育一抗：封闭好的膜用PBST快速洗涤3次，每次1min，尽可能倒尽封闭液，再将提前配好的一抗稀释液加入，置于摇床上室温缓慢孵育1h；
（5）洗涤：一抗孵育完成后，用PBST快速洗涤3次，每次3 min；
（6）孵育二抗：倒尽洗涤液，再将提前配好的二抗稀释液加入，置于摇床上室温缓慢孵育1 h；
（7）洗涤：二抗孵育完成后，用PBST快速洗涤4次，每次3 min；
（8）曝光：洗涤完毕后将膜的水倒干，再配制500 μl显色液（显色A液B液各250 μl），然后用凝胶成像系统进行曝光显色。
结果如图5所示，结果发现抗体稀释1:16000倍以上可以有效检测Tmem247蛋白。
综上可知，经过免疫新西兰大白兔后，得到含Tmem247抗体的血清。经ELISA检测抗体效价大于1:128000，经WB检测，稀释1:16000倍仍能识别重组蛋白。
实施例4：使用实施例3所得的抗体检测Tmem247蛋白
利用小鼠组织样本和人源细胞样本验证Tmem247蛋白检测效果。具体实验步骤如下：
小鼠组织使用不同批次小鼠的睾丸、肾 、肺 、脑、心，人源细胞系使用了293T细胞，PBS作为空白对照组，重组蛋白作为阳性对照组，未免疫的血清作为阴性对照组。抗体稀释比例为1:2000，蛋白上样量为20μg，最终在小鼠睾丸组织中检出Tmem247蛋白（结果参见图6），与Uniprot数据库现实的组织特异性一致。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (13)

1. 一种多肽，其特征在于，所述多肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.一种Tmem247蛋白抗原，其特征在于，包括权利要求1所述的多肽和载体蛋白；
所述载体蛋白和多肽相连。
3.根据权利要求2所述的Tmem247蛋白抗原，其特征在于，所述载体蛋白包括蛋白标签、血蓝蛋白、牛血清白蛋白和卵清蛋白中的至少之一；
所述载体蛋白的C端与所述多肽N端相连，或所述载体蛋白的N端与所述多肽C端相连。
4. 根据权利要求2或3所述的Tmem247蛋白抗原，其特征在于，所述载体蛋白具有如SEQID NO:2所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求2或3所述的Tmem247蛋白抗原，其特征在于，所述Tmem247蛋白抗原进一步包括连接肽；
所述载体蛋白的C端与所述连接肽的N端相连、所述连接肽的C端与所述多肽的N端相连，或所述多肽的C端与所述连接肽的N端相连、所述连接肽的C端与所述载体蛋白的N端相连；
所述连接肽具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
6. 根据权利要求2所述的Tmem247蛋白抗原，其特征在于，所述Tmem247蛋白抗原具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的多肽或权利要求2~6任一项所述的Tmem247蛋白抗原。
8.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求7所述的核酸分子。
9. 一种重组细胞，其特征在于，包括：
携带权利要求7所述的核酸分子或权利要求8所述的表达载体；或
表达权利要求1所述的多肽或权利要求2~6任一项所述的Tmem247蛋白抗原。
10.权利要求1所述的多肽、权利要求2~6任一项所述的Tmem247蛋白抗原、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的表达载体或权利要求9所述的重组细胞在制备抗Tmem247蛋白抗体中的用途。
11.一种抗Tmem247蛋白抗体，其特征在于，所述抗Tmem247蛋白抗体是通过权利要求1所述的多肽、权利要求2~6任一项所述的Tmem247蛋白抗原、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的表达载体或权利要求9所述的重组细胞制备得到的。
12.权利要求11所述的抗Tmem247蛋白抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测Tmem247蛋白。
13.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求11所述的抗Tmem247蛋白抗体。
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