CN117551219A - 一种改性葡聚糖、t1加权铁基造影剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种改性葡聚糖、T1加权铁基造影剂及其制备方法和应用。该改性葡聚糖模板具有通式(I)结构，其制备方法包括葡聚糖中的羟基与含有烯烃双键的二元羧酸、二元酰卤或二元羧酸酐于极性溶剂中发生酯化反应，生成含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物；将所述含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物与含巯基的一元羧酸通过巯基‑烯点击反应，生成具有二元羧酸官能团的所述改性葡聚糖。以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂，包括氧化铁纳米颗粒和上述的改性葡聚糖；其中，所述氧化铁纳米颗粒被所述改性葡聚糖包裹于内，且所述氧化铁纳米颗粒与改性葡聚糖之间通过化学螯合键连接。该T1加权铁基造影剂的毒副作用小且具有优异的磁共振造影性能。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种改性葡聚糖、T1加权铁基造影剂及其制备方法和应用。
背景技术
磁共振成像技术(Magnetic Resonance Imaging，MRI)相较于目前临床上使用的计算机X线断层扫描成像技术(Computed Tomography，CT)、正电子发射计算机断层显像技术(Positron Emission Tomography/Computed Tomography，PET-CT)和超声成像技术(Ultrasound，US)，兼具无电离辐射、无放射性辐射、成像分辨率高的优点，能对人体各器官进行无创和高对比度的清晰成像，已成为当代临床诊断中最有力的检测手段之一。为了提高磁共振成像中组织间的对比度，磁共振造影剂则经常被用于临床增强造影。按照磁共振造影剂的作用原理，可以将其分为纵向弛豫造影剂(T1加权造影剂)和横向弛豫造影剂(T2加权造影剂)。T1加权造影剂主要加速纵向弛豫并在T1加权图像中产生“亮”对比效果，T2加权造影剂主要增加横向弛豫速率并产生“暗”对比效果。
目前，临床上经常使用的磁共振T1加权造影剂主要是基于钆的小分子螯合物，如：钆特酸(Gd-DOTA)，钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)，钆塞酸二钠(Gd-EOB-DTPA)和钆二酰胺(Gd-DTPA-BMA)等。钆元素作为镧系稀土重金属，其离子具有较高的生物毒性，因此基于大极性分子螯合的临床钆剂在使用过程中也具有较高的使用风险。研究表明，钆基造影剂在使用过程中会泄露少量钆离子，具有较高的不良反应率，大量使用存在代谢组织纤维化的风险。临床上钆基造影剂对有严重肾损害、癫痫、低血压、哮喘及其他变态反应性呼吸道疾病患者及有过敏倾向者慎用。
为了克服这一局限性，研究报道已经使用多种方式制备新型的非钆基磁共振T1加权造影剂，如铁基、锰基、铜基造影剂等。目前，基于铁基的磁共振造影剂以被广泛报道，然而采用铁元素制备的T1加权造影剂其成像性能难以超过钆剂，且其制备方法复杂、难以量产及临床转化。至今仍未有任何一款纯T1加权铁基造影剂应用于临床T1加权磁共振造影。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂的制备方法，该T1加权铁基造影剂的内部为超小尺寸的氧化铁纳米颗粒，其外部修饰了一层改性葡聚糖模板材料。该制备T1加权铁基造影剂具有临床钆剂T1加权造影效果，且在血管造影优于临床的临床钆剂T1加权造影剂。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种改性葡聚糖，所述改性葡聚糖的结构如通式(I)：
在所述通式(I)中，代表葡聚糖主链；-OH代表葡聚糖分子中的羟基；m代表0～10；n代表0～10。
进一步地，所述葡聚糖主链的分子量为1000～100000 Da，且所述葡聚糖主链中1％～100％的羟基通过化学反应改性为含有二羧基结构的聚合物。因通式(I)中所述改性葡聚糖分子中含有二羧基结构，其二羧基结构具有较高的稳定氧化铁纳米颗粒的功能。
第二方面，本发明提供一种改性葡聚糖的制备方法，该制备方法包括：(1)葡聚糖中的羟基与含有烯烃双键的二元羧酸、二元酰卤或二元羧酸酐于极性溶剂中发生酯化反应，生成含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物；(2)将所述含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物与含巯基的一元羧酸通过巯基-烯点击反应，生成具有二元羧酸官能团的所述改性葡聚糖。
进一步地，在所述步骤(1)中，所述二元羧酸、二元酰卤或二元羧酸酐与葡聚糖中羟基基团的摩尔比为0.01～2；所述极性溶剂为二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(Dimethyl formamide，DMF)、水中的一种；反应温度为60℃～80℃，反应时间为6h～48h；在所述步骤(2)中，反应过程中通过氮气保护，反应温度为25℃～60℃，反应时间为6h～24h。
进一步地，该制备方法具体包括：按照马来酸酐与葡聚糖中羟基基团摩尔比为1:1的比例，将马来酸酐与葡聚糖溶于二甲基亚砜中60℃搅拌反应12h，得到反应液；将所述反应液滴入10倍体积乙酸乙酯溶液，析出沉淀，过滤干燥，得到含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物；将含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物与巯基丙酸置于25℃水浴搅拌，氮气保护并反应12h，得到反应产物；将所述反应产物通过透析方法除去小分子的巯基丙酸，冷冻干燥，得到白色粉末状的所述改性葡聚糖。
第二方面，本发明提供一种以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂，该T1加权铁基造影剂包括氧化铁纳米颗粒和如上述的改性葡聚糖；其中，所述氧化铁纳米颗粒被所述改性葡聚糖包裹于内，且所述氧化铁纳米颗粒与改性葡聚糖之间通过化学螯合键连接。
第三方面，本发明提供一种T1加权铁基造影剂的制备方法，该制备方法包括：将所述改性葡聚糖溶于水溶液中搅拌，之后按照二价铁离子与总铁元素占比例为0％～100％的比例将铁离子溶液加入所述改性葡聚糖溶液中，得到第一反应溶液；将所述第一反应溶液置于25℃～90℃恒温水浴中搅拌反应10min～60min，得到第二反应溶液；之后用无机碱调节所述第二反应溶液的pH至8～12，搅拌反应结束后，除去所述第二反应溶液中过量的所述无机碱，得到所述T1加权铁基造影剂；其中，总铁元素为二价铁离子与三价铁离子之和。
进一步地，该制备方法具体包括：将所述改性葡聚糖溶于水溶液中37℃恒温水浴搅拌，之后按照二价铁离子与三价铁离子摩尔比例为50％的比例将铁离子溶液加入所述改性葡聚糖溶液；将溶液置于37℃恒温水浴500转/分钟快速搅拌，之后用浓度为1M氢氧化钠溶液以2.5mL/s的流速将反应溶液pH至9；搅拌反应30min后，除去过量的氢氧化钠，最终制备得到以改性葡聚糖为模板制备的铁基磁共振造影剂。
进一步地，所述氧化铁纳米颗粒的粒径范围为2nm～10nm；调节pH使用的无机碱优选氢氧化钠、氢氧化钾的水溶液；除去溶液中过量无机碱的方法为透析或盐酸稀溶液酸碱中和。
第四方面，本发明提供如上述的T1加权铁基造影剂在磁共振中的血池造影和临床磁共振中T1加权增强造影以及作为临床补铁剂的应用。
本发明的效果如下：
1、本发明制备的T1加权铁基造影剂，其内部为超小的氧化铁纳米颗粒，外部修饰了一层改性葡聚糖分子。所制备的T1加权铁基造影剂相较于临床上常用的T1加权钆基磁共振造影剂具有更高的生物安全性，而且该制备所用到的原料为铁元素以及葡聚糖相较于临床使用的大环配合物螯合的钆剂，其制备过程绿色、便捷、无污染且造价低廉。
2、本发明采用的以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂可用于磁共振中T1加权组织增强造影以及T1加权血管增强造影。实施案例一中制备的以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂在磁共振T1加权造影性能上已经与临床上使用的Gd-DTPA相当，且尤其在Wister大鼠、新西兰兔和比格犬血管造影过程中其效果要优于临床上使用的Gd-DTPA。
3、本发明制备的以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂，在3.0T及以下的磁场下其T1加权光圈亮度要强于Gd-DTPA。目前，国内医院普遍使用的磁共振均为3.0T及以下磁共振设备，因此该造影剂具有较大的临床普遍适用性。
4、本发明制备的以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂，其粒径可控制在10nm以下，由此采用该方法制备的纳米造影剂可通过肾脏以及肝胆代谢出体外，因此具有更低的生物毒副作用。
5、本发明制备的以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂与目前常见的高温热裂解方法制备的T1加权铁基造影剂相比，采用本方法制备的造影剂不需要油相转水相的复杂步骤，且制备的T1加权铁基造影剂其纳米颗粒水溶性、溶液中稳定性以及抗生物大分子非特异性吸附更高，因此相较传统高温热裂解制备方法本发明制备的T1加权铁基造影剂更有利于临床应用。
6、本发明制备以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂与目前常见的高温热裂解方法制备的铁基磁共振造影剂相比，采用该方法制备的T1加权铁基造影剂其氧化铁纳米颗粒内部结晶性要弱于采用高温热裂解方法制备的T1加权铁基造影剂，较低的氧化铁纳米颗粒的结晶性更利于氧化铁纳米颗粒T1加权磁共振造影。
7、目前，已报道的T1加权型氧化铁制备的磁共振纳米颗粒在磁共振造影性能上极少能够强于临床钆基，且临床上仍未有任何一款氧化铁基磁共振用于临床T1加权增强造影，然而本发明以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂在磁共振增强造影效果要强于临床钆基造影剂。因此该发明专利制备的一种以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂具有显著创新优势以及临床转化优势。
8、本发明制备以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂其表面修饰大量二羧基结构，丰富的羧基官能团有利于通过与氨基的偶联反应赋予磁共振造影剂相应的靶向性和响应性功能，这些是其他氧化铁基磁共振纳米颗粒难以实现的。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。
图1为本发明中T1加权铁基造影剂的结构通式示意图；
图2为本发明中改性葡聚糖的制备过程的反应通式步骤图；
图3为本发明中T1加权铁基造影剂的制备流程通式图；
图4为本发明实施例1中以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂(iDMMA)的合成步骤；
图5为本发明实施例1中原料葡聚糖(Dextran)、含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物(D-MAH)和改性葡聚糖(DMMA)的核磁共振氢谱图；
图6为本发明实施例1中iDMMA的高分辨透射电镜图；
图7为本发明实施例1中iDMMA的高分辨透射电镜粒径分布直方图；
图8为本发明实施例1中iDMMA在球差电镜中高角度环形暗场扫描透射电子显微镜(HAADF-STEM)图；
图9为本发明实施例1中iDMMA的水合粒径分布直方图；
图10为本发明实施例1中Dextran、DMMA和iDMMA的红外谱图；
图11为本发明实施例1中制备的iDMMA与Gd-DTPA在1.0T磁共振下纵向弛豫率和横向弛豫率对比图；
图12为本发明实施例1中制备的iDMMA与Gd-DTPA在1.47T磁共振下纵向弛豫率和横向弛豫率对比图；
图13为本发明实施例1中制备的iDMMA与Gd-DTPA在临床3.0T磁共振下纵向弛豫率和横向弛豫率对比图；
图14为本发明实施例为本发明实施例2中5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)、以5-羟色胺修饰的T1加权铁基造影剂(iDMMA-HT)和iDMMA的紫外数据对比图；
图15为本发明实施例3中制备的实施例2中以c(RGDfK)多肽修饰的T1加权铁基造影剂(iDMMA-c(RGDfK))、iDMMA和Gd-DTPA在1.0T磁共振下T1加权光圈亮度对比图；
图16本发明实施例3中制备的实施例2中制备的iDMMA-c(RGDfK)、iDMMA和Gd-DTPA在临床3.0T磁共振临床T1加权序列下T1加权光圈亮度对比图；
图17为本发明实施例3中制备的实施例2中制备的iDMMA-c(RGDfK)、iDMMA和Gd-DTPA在临床3.0T磁共振血管造影3D Trick序列下T1加权光圈亮度对比图；
图18为本发明实施例1中制备的iDMMA在注射浓度0.1mmol/kg临床3.0T磁共振下小鼠膀胱注射造影剂后代谢情况；
图19为本发明实施例1中制备的iDMMA与Gd-DTPA在注射浓度0.1mmol/kg临床3.0T磁共振下Wister大鼠的血管造影对比图；
图20为本发明实施例1中制备的iDMMA与Gd-DTPA在注射浓度0.1mmol/kg临床3.0T磁共振下新西兰兔的血管造影对比图；
图21为本发明实施例1中制备的iDMMA与Gd-DTPA在注射浓度0.1mmol/kg临床3.0T磁共振下比格犬的血管造影对比图。
具体实施方式
由背景技术可知，至今仍未有任何一款纯铁基T1加权造影剂应用于临床磁共振造影。有鉴于此，本发明利用改性葡聚糖为模板、利用超小氧化铁纳米颗粒，制备得到的T1加权铁基造影剂，该造影剂具有临床钆剂T1加权造影效果，且在血管造影中优于临床的钆剂。
具体的，第一方面，本发明提供一种改性葡聚糖，所述改性葡聚糖的结构如通式(I)：
通式(I)
在所述通式(I)中，代表葡聚糖主链；-OH代表葡聚糖分子中的羟基；m代表0～10；n代表0～10。需要说明的是，式中的葡聚糖主链为完整的一条。其中，m和n可以是相同的数字，也可以是不同的。
第二方面，本发明提供一种以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂，如图1所示，该T1加权铁基造影剂包括氧化铁纳米颗粒和如上述的改性葡聚糖；其中，所述氧化铁纳米颗粒被所述改性葡聚糖包裹于内，且所述氧化铁纳米颗粒与改性葡聚糖之间通过化学螯合键连接。
第三方面，本发明提供一种T1加权铁基造影剂的制备方法，如图3所示，该制备方法包括：将所述改性葡聚糖溶于水溶液中搅拌，之后按照二价铁离子与总铁元素占比例为0％～100％的比例加入所述改性葡聚糖溶液中，得到第一反应溶液；将所述第一反应溶液置于25℃～90℃恒温水浴中搅拌反应10min～60min，得到第二反应溶液，如图2中的步骤(I)；之后用无机碱调节所述第二反应溶液的pH至8～12，搅拌反应结束后，除去所述第二反应溶液中过量的所述无机碱，得到所述T1加权铁基造影剂，如图2中的步骤(II)；其中，总铁元素为二价铁离子与三价铁离子之和。
此外，本发明制备的氧化铁纳米颗粒(如：实施例1)其表面覆盖的模板原料(如：葡聚糖---血浆体积的扩充剂(又称代血浆)；马来酸酐---水解后为顺丁烯二酸(又称失水苹果酸，食品、饮料中酸味剂)；巯基丙酸---医药芬那露的医药中间体)均为绿色安全且被食品药品监督管理局(Food and DrugAdministration，FDA)认证可用于人体的安全材料。因此，本发明的一种以改性葡聚糖为模板制备的高性能T1加权铁基造影剂有望替代临床上普遍使用钆基磁共振造影剂，具有较高的安全性以及临床转化前景。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种改性葡聚糖的制备方法，以及以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂，制备步骤如图4所示，具体包括：
(1)选用分子量为20000Da的葡聚糖和马来酸酐为原料，按葡聚糖中羟基与马来酸酐摩尔比值1：1的比值，将5g的葡聚糖与9.08g马来酸酐溶于50mLDMSO溶液中60℃搅拌反应12h。反应结束后将含DMSO的反应溶液滴加到10倍体积的快速搅拌的乙酸乙酯溶剂中，得到白色粘稠状的粗产物。随后，将得到的白色粘稠状的粗产物置于快速机械搅拌的乙酸乙酯溶剂中打浆纯化除去粗产物中的DMSO溶剂以及未反应的马来酸酐，过滤，真空干燥得到纯白色粉末状的含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物，即D-MAH。
(2)以上一步制备的D-MAH与巯基丙酸为原料，按照D-MAH中双键与巯基丙酸摩尔比为1:1.5的比值，将4g的D-MAH与8mL巯基丙酸在氮气保护的环境中混合搅拌，随后用6MNaOH调节反应溶液至pH中性(加入6M NaOH约12mL)，氮气保护下室温25℃搅拌反应12h。反应结束后通过透析的方法除去过量未反应的巯基丙酸原料，透析液冷冻干燥得到改性葡聚糖，即DMMA。
采用该方法制备的DMMA、D-MAH以及葡聚糖原料的核磁共振氢谱图如图5所示，图5中D-MAH 6.0-7.0ppm化学位移处所属马来酸分子双键上氢的两个化学位移峰的出现表明马来酸酐成功与葡聚糖上的羟基发生酯化反应，证明D-MAH的成功合成。此外，D-MAH中的烯烃双键与巯基丙酸发生巯基-烯点击反应，图5中DMMA产物中6.0-7.0ppm处“烯烃双键”中两个氢化学位移峰的消失表明D-MAH中的双键被过量的巯基丙酸反应完全，证明DMMA的成功合成。
(3)以上一步合成的DMMA和为原料，取8g DMMA溶于800mL去离子水中，37℃水浴搅拌10min。之后按照Fe2+与Fe3+摩尔比1：1的比例，向搅拌溶液中依次加入100mL浓度为9.9mg/mL的四水合氯化亚铁溶液以及100mL浓度为13.46mg/mL的六水合三氯化铁溶液，随后向反应溶液中以2mL/s的流速加入50mL 1M NaOH调节溶液pH至碱性，快速搅拌反应30min。将反应溶液置于截留分子量为14000Da的透析袋中透析，最终制备得到以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂，即iDMMA。
对所制备的iDMMA进行表征，如图3-7所示：
图6为本发明实施例1中iDMMA的高分辨透射电镜图，图7为图6的粒径分布直方图。根据图6与图7，可以看出采用该发明专利制备的氧化铁纳米颗粒具有2.52±0.06nm的粒径，制备的纳米颗粒极小且粒径分布均匀，颗粒分散性好。
图8为本发明实施例1中iDMMA在球差电镜中高角度环形暗场扫描透射电子显微HAADF-STEM图。根据图8，可以看出所制备的iDMMA纳米颗粒具有较多的晶格缺陷，结晶性低。因此，随着晶体结构的中断，纳米颗粒表面的自旋变得无序，由于这些表面自旋与纳米粒子的整体自旋不完全对齐，它们在粒子表面形成一个磁死区。随着磁芯尺寸的减小，磁死区在粒子体积中所占的比例增大，更有利于T1加权增强磁共振造影。
图9为本发明实施例1中iDMMA的水合粒径分布直方图。根据图9，可以看出所制备的iDMMA纳米颗粒水合粒径介于5-20nm。
图10为本发明实施例1中葡聚糖、DMMA和iDMMA的红外谱图。红外谱图中1730cm-1、1582cm-1和1400cm-1所属羧基官能团特征峰进一步证明改性葡聚糖的成功合成，此外1640cm-1和1346cm-1所属羧基与铁元素结合的特征峰表明改性葡聚糖与氧化铁纳米颗通过螯合键稳定结合。
图11-13为本发明实施例1中制备的iDMMA与Gd-DTPA分别在1.0T，1.47T和3.0T磁共振下纵向弛豫率(r1)和横向弛豫率(r2)对比图。iDMMA在1.0T，1.47T和3.0T的纵向弛豫率(r1)分别为10.22mM-1·S-1，8.22mM-1·S-1和6.41mM-1·S-1均高于Gd-DTPA在1.0T，1.47T和3.0T的纵向弛豫率(r1)4.09mM-1·S-1，3.30mM-1·S-1和3.32mM-1·S-1。
实施例2
本实施例提供一种利用以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂表面的羧基基团与含氨基的5-羟色胺进行纳米颗粒表面功能化过程，具体地包括：
取实施例1制备的iDMMA 60mL(浓度5mM)，加入4mL浓度为8.5mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌活化2h。随后加入4mL浓度为14.2mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)以及4mL浓度为11.19mg/mL的5-HT，室温搅拌反应24h。最后，通过透析的方法除杂，得到以5-羟色胺修饰的T1加权铁基造影剂，即iDMMA-HT。
图14为本发明实施例2中iDMMA-HT，5-HT和iDMMA的紫外数据对比图。从图11中iDMMA-HT紫外吸收250-300nm所属5-HT的特征吸收峰，证明含氨基的5-羟色胺成功修饰到含羧基官能团的以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂表面。
实施例3
本实施例提供一种利用以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂表面的羧基基团与含氨基的肿瘤靶向环肽c(RGDfK)进行纳米颗粒表面功能化过程，具体地包括：
取实施例1制备的iDMMA 60mL(浓度5mM)，加入4mL浓度为8.5mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌活化2h。随后加入4mL浓度为14.2mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)以及4mL浓度为10mg/mL的含氨基的肿瘤靶向环肽c(RGDfK)，室温搅拌反应24h。最后，通过透析的方法除杂，得到以c(RGDfK)多肽修饰的T1加权铁基造影剂，即iDMMA-c(RGDfK)。
图15-16为临床Gd-DTPA以及本发明实施例1和实施例3中制备的iDMMA，iDMMA-c(RGDfK)分别在1.0T，3.0T下材料的光圈亮度。图15为1.0T下采用自旋回波SE序列下的光圈亮度，可以看出iDMMA和iDMMA-c(RGDfK)在增强造影过程中要强于临床的Gd-DTPA，且iDMMA在表面修饰了c(RGDfK)后其造影效果并未显著降低。图16为3.0T下采用自旋回波SE序列下的光圈亮度，可以看出iDMMA和iDMMA-c(RGDfK)在普通临床3.0T的T1加权增强造影过程中与Gd-DTPA亮度相当。图17为3.0T下采用3D Trick血管造影序列下的光圈亮度，可以看出iDMMA和iDMMA-c(RGDfK)的光圈亮度显著高于临床使用的Gd-DTPA，表明iDMMA和iDMMA-c(RGDfK)在血管造影中要显著优于临床上使用的Gd-DTPA。
实施例4
本实施例提供一种改性葡聚糖的制备方法，以及以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂，具体地包括：
(1)选用分子量为1000Da的葡聚糖和富马酰氯为原料，按葡聚糖中羟基与富马酰氯摩尔比值99：1的比值，将5g的葡聚糖与0.127g富马酰氯和0.053g的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)溶于50mLDMF溶液中25℃搅拌反应6h。反应结束后将含DMF的反应溶液滴加到10倍体积的快速搅拌的乙酸乙酯溶剂中，得到白色粘稠状的粗产物。随后，将得到的白色粘稠状的粗产物置于快速机械搅拌的乙酸乙酯溶剂中打浆纯化除去粗产物中的DMF溶剂以及未反应的富马酰氯，过滤，真空干燥得到纯白色粉末状的富马酰氯修饰的含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物，即D-FC。
(2)以上一步制备的D-FC与巯基乙酸为原料，将4g的D-FC与4mL巯基乙酸在氮气保护的环境中混合搅拌，随后用6M KOH调节反应溶液至pH中性，氮气保护下室温25℃搅拌反应24h。反应结束后通过透析的方法除去过量未反应的巯基乙酸原料，透析液冷冻干燥得到以富马酰氯巯基乙酸为原料制备得到的改性葡聚糖。
(3)以上一步合成的DMMA和为原料，取8g DMMA溶于800mL去离子水中，37℃水浴搅拌10min。之后按照Fe3+与Fe2+摩尔比1：0的比例，向搅拌溶液中加入200mL浓度为13.46mg/mL的六水合三氯化铁溶液，随后向反应溶液中以2mL/s的流速加入1M KOH调节溶液pH至碱性，快速搅拌反应30min。将反应溶液置于截留分子量为14000Da的透析袋中透析，最终制备得到以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂。
实施例5
本实施例提供一种改性葡聚糖的制备方法，以及以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂，具体地包括：
(1)选用分子量为100000Da的葡聚糖和富马酸为原料，按葡聚糖中羟基与富马酸摩尔比值1：1的比值，将5g的葡聚糖与3.22g富马酸、5mL浓硫酸溶于50mL DMSO溶液中100℃搅拌反应24h。反应结束后透析除去硫酸以及富马酸等杂质。透析液冷冻干燥后得到纯白色粉末状的富马酸修饰的含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物(D-FMC)。
(2)以上一步制备的D-FMC与11-巯基正癸酸为原料，将4g的D-FMC与4.85mg的11-巯基正癸酸在氮气保护的环境中混合搅拌，随后用6M NaOH调节反应溶液至pH中性，氮气保护下室温25℃搅拌反应24h。反应结束后通过透析的方法除去过量未反应的11-巯基正癸酸原料，透析液冷冻干燥得到以富马酸和11-巯基正癸酸为原料制备得到的改性葡聚糖。
(3)以上一步合成的DMMA和为原料，取8g DMMA溶于800mL去离子水中，37℃水浴搅拌10min。之后按照Fe3+与Fe2+摩尔比0：1的比例，向搅拌溶液中加入200mL浓度为9.9mg/mL的的四水合氯化亚铁溶液，随后向反应溶液中以2mL/s的流速加入1M NaOH调节溶液pH至碱性，快速搅拌反应30min。将反应溶液置于截留分子量为14000Da的透析袋中透析，最终制备得到以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂。
实施例6
本实施例提供一种改性葡聚糖的制备方法，以及以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂，具体地包括：
(1)选用分子量为1000Da的葡聚糖和富马酰氯为原料，按葡聚糖中羟基与富马酰氯摩尔比值99：1的比值，将5g的葡聚糖与0.127g富马酰氯和0.053g的DIPEA溶于50mL DMF溶液中25℃搅拌反应6h。反应结束后将含DMF的反应溶液滴加到10倍体积的快速搅拌的乙酸乙酯溶剂中，得到白色粘稠状的粗产物。随后，将得到的白色粘稠状的粗产物置于快速机械搅拌的乙酸乙酯溶剂中打浆纯化除去粗产物中的DMF溶剂以及未反应的富马酰氯，过滤，真空干燥得到纯白色粉末状的富马酰氯修饰的含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物(D-FC)。
(2)以上一步制备的D-FC与巯基乙酸为原料，将4g的D-FC与4mL巯基乙酸在氮气保护的环境中混合搅拌，随后用6M KOH调节反应溶液至pH中性，氮气保护下室温25℃搅拌反应24h。反应结束后通过透析的方法除去过量未反应的巯基乙酸原料，透析液冷冻干燥得到以富马酰氯巯基乙酸为原料制备得到的改性葡聚糖。
(3)以上一步合成的DMMA和为原料，取8g DMMA溶于800mL去离子水中，37℃水浴搅拌10min。之后按照Fe3+与Fe2+摩尔比1：0的比例，向搅拌溶液中加入200mL浓度为13.46mg/mL的六水合三氯化铁溶液，随后向反应溶液中以2mL/s的流速加入1M KOH调节溶液pH至碱性，快速搅拌反应30min。将反应溶液置于截留分子量为14000Da的透析袋中透析，最终制备得到以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂。
实施例7
本实施例提供一种改性葡聚糖的制备方法，以及以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂，具体地包括：
(1)选用分子量为10000Da的葡聚糖和(E)-十四烷基-2-烯二酰氯为原料，按葡聚糖中羟基与(E)-十四烷基-2-烯二酸摩尔比值1：1的比值，将5g的葡聚糖与7.12g的(E)-十四烷基-2-烯二酰氯、2.65g的DIPEA溶于50mLDMF溶液中25℃搅拌反应12h。反应结束后将含DMF的反应溶液滴加到10倍体积的快速搅拌的乙酸乙酯溶剂中，得到白色粘稠状的粗产物。随后，将得到的白色粘稠状的粗产物置于快速机械搅拌的乙酸乙酯溶剂中打浆纯化除去粗产物中的溶剂以及未反应的(E)-十四烷基-2-烯二酰氯，过滤，真空干燥得到纯白色粉末状的(E)-十四烷基-2-烯二酰氯修饰的含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物(D-TEC)。
(2)以上一步制备的D-TEC与巯基丙酸为原料，将4g的D-TEC与2.36g的巯基丙酸在氮气保护的环境中混合搅拌，随后用6M NaOH调节反应溶液至pH中性，氮气保护下室温25℃搅拌反应12h。反应结束后通过透析的方法除去过量未反应的巯基丙酸原料，透析液冷冻干燥得到以(E)-十四烷基-2-烯二酰氯和巯基丙酸为原料制备得到的改性葡聚糖。
(3)以上一步合成的DMMA和为原料，取8g DMMA溶于800mL去离子水中，37℃水浴搅拌10min。之后按照Fe3+与Fe2+摩尔比1：1的比例，向搅拌溶液中加入100mL浓度为9.9mg/mL的的四水合氯化亚铁溶液和100mL浓度为13.46mg/mL的六水合三氯化铁溶液，随后向反应溶液中以0.5mL/s的流速加入1M NaOH调节溶液pH至碱性，快速搅拌反应30min。将反应溶液置于截留分子量为14000Da的透析袋中透析，最终制备得到以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂。
第四方面，本发明提供如上述的T1加权铁基造影剂在磁共振中的血池造影和临床磁共振中T1加权增强造影以及作为临床补铁剂的应用。
下面以实施例1制备的以改性葡聚糖为模板制备的T1加权铁基造影剂为例，进行各项实验，以进一步说明该造影剂的性能。
实验例1iDMMA磁共振膀胱造影成像
一、实验方法
取成年Balb/c雌鼠，体重约20g，利用1％戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，之后将小鼠置于临床飞利浦3.0T磁共振下对小鼠膀胱部位进行造影成像，iDMMA给药剂量0.1mmol/Kg(铁元素)。成像参数：TR＝600ms；TE＝20ms；切面厚度2mm。iDMMA注射前以及iDMMA注射后4min、12min、16min和50min对小鼠膀胱进行扫描。
二、实验结果
图18为本发明实施例1中制备的iDMMA在注射浓度0.1mmol/kg临床3.0T磁共振下小鼠膀胱注射造影剂后代谢情况。图18可以看出在iDMMA注射4min后膀胱开始被点亮，12min后膀胱半充满，50min后膀胱被完全点亮。实验结果表明iDMMA可以通过肾代谢通过尿液代谢出体外。
实验例2Wister大鼠血管造影成像
一、实验方法
取成年Wister大鼠，体重约250g，利用1％戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，之后将Wister大鼠置于临床GE 3.0T磁共振头部线圈中使用3D Trick序列对Wister大鼠血管进行造影成像，iDMMA和Gd-DTPA给药剂量0.1mmol/Kg(铁或钆元素)。成像参数：3D Trick序列；TR＝3.3ms；TE＝1.2ms；切面厚度1mm；30期。
二、实验结果
图19为本发明实施例1中制备的iDMMA与Gd-DTPA在注射浓度0.1mmol/kg临床3.0T磁共振下Wister大鼠的血管造影对比图。图中可以看出iDMMA在大鼠动脉血管具有较长的成像窗口，且头颈部血管成像效果要优于临床上的Gd-DTPA。在造影剂注射110s后，Gd-DTPA在大鼠头颈部血管成像显著降低，而iDMMA依旧保持良好的血管成像效果。综上，iDMMA在小动物血管T1加权造影性能要优于Gd-DTPA。
实验例3新西兰兔血管造影成像
一、实验方法
取成年新西兰兔，体重约2.5kg，利用舒泰50对新西兰兔进行麻醉，之后将新西兰兔置于临床GE 3.0T磁共振头部线圈中使用3D Trick序列对新西兰兔头颈部血管进行造影成像，iDMMA和Gd-DTPA给药剂量0.1mmol/kg(铁或钆元素)，高压注射器给药。成像参数：3DTrick序列；TR＝3.0ms；TE＝1.1ms；切面厚度1mm；48期。
二、实验结果
图20为本发明实施例1中制备的iDMMA与Gd-DTPA在注射浓度0.1mmol/kg临床3.0T磁共振下新西兰兔的血管造影对比图。图中可以看出iDMMA在新西兰兔动脉血管具有较长的成像窗口，且新西兰兔上半身血管成像效果要优于临床上的Gd-DTPA。在造影剂注射217s后，Gd-DTPA在新西兰兔血管成像显著降低，而iDMMA依旧保持良好的血管成像效果。综上，iDMMA在新西兰兔中等体型的动物血管T1加权造影性能要优于Gd-DTPA。
实验例4比格犬血管造影成像
一、实验方法
取成年比格犬，体重约20kg，利用阿托品镇定剂进行镇定，随后使用舒泰50与盐酸赛拉嗪复合麻药对比格犬进行麻醉，之后将比格犬置于临床GE 3.0T磁共振头部线圈中使用3D Trick序列对比格犬头部血管进行造影成像，iDMMA和Gd-DTPA给药剂量0.1mmol/kg(铁或钆元素)，高压注射器给药。成像参数：3D Trick序列；TR＝3.5ms；TE＝1.3ms；切面厚度1mm；48期。
二、实验结果
图21为本发明实施例1中制备iDMMA与Gd-DTPA在注射浓度0.1mmol/kg临床3.0T磁共振下比格犬的血管造影对比图。图中可以看出iDMMA在比格犬头部动脉血管具有较长的成像窗口，且头颈部血管成像效果要优于临床上的Gd-DTPA。在造影剂注射254s后，Gd-DTPA在比格犬血管成像效果显著降低，而iDMMA依旧保持良好的血管成像效果。综上，iDMMA在比格犬大型动物体内依旧保持较好的成像效果，且T1加权造影性能要优于临床Gd-DTPA。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种改性葡聚糖，其特征在于，所述改性葡聚糖的结构如通式(I)：
在所述通式(I)中，代表葡聚糖主链；-OH代表葡聚糖分子中的羟基；m代表0～10；n代表0～10。
2.根据权利要求1所述的改性葡聚糖，其特征在于，所述葡聚糖主链的分子量为1000～100000Da，且所述葡聚糖主链中1％～100％的羟基通过化学反应改性为含有二羧基结构的聚合物。
3.根据权利要求1或2所述的改性葡聚糖的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：
(1)葡聚糖中的羟基与含有烯烃双键的二元羧酸、二元酰卤或二元羧酸酐于极性溶剂中发生酯化反应，生成含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物；
(2)将所述含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物与含巯基的一元羧酸通过巯基-烯点击反应，生成具有二元羧酸官能团的所述改性葡聚糖。
4.根据权利要求3所述的改性葡聚糖的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述二元羧酸、二元酰卤或二元羧酸酐与葡聚糖中羟基基团的摩尔比为0.01～2；
所述极性溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、水中的一种；
反应温度为60℃～80℃，反应时间为6h～48h；
在所述步骤(2)中，反应过程中通过氮气保护，反应温度为25℃～60℃，反应时间为6h～24h。
5.根据权利要求3所述的改性葡聚糖的制备方法，其特征在于，该制备方法具体包括：按照马来酸酐与葡聚糖中羟基基团摩尔比为1:1的比例，将马来酸酐与葡聚糖溶于二甲基亚砜中60℃搅拌反应12h，得到反应液；将所述反应液滴入10倍体积的乙酸乙酯溶液，析出沉淀，过滤干燥，得到含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物；
将含烯烃双键的羧基葡聚糖衍生物与巯基丙酸置于25℃水浴搅拌，氮气保护并反应12h，得到反应产物；将所述反应产物通过透析方法除去小分子的巯基丙酸，冷冻干燥，得到白色粉末状的所述改性葡聚糖。
6.一种T1加权铁基造影剂，其特征在于，该T1加权铁基造影剂包括氧化铁纳米颗粒和如权利要求1或2所述的改性葡聚糖；
其中，所述氧化铁纳米颗粒被所述改性葡聚糖包裹于内，且所述氧化铁纳米颗粒与改性葡聚糖之间通过化学螯合键连接。
7.根据权利要求6所述的T1加权铁基造影剂的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：将所述改性葡聚糖溶于水溶液中搅拌，之后按照二价铁离子与总铁元素占比例为0％～100％的比例将铁离子溶液加入所述改性葡聚糖溶液中，得到第一反应溶液；将所述第一反应溶液置于25℃～90℃恒温水浴中搅拌反应10min～60min，得到第二反应溶液；之后用无机碱调节所述第二反应溶液的pH至8～12，搅拌反应结束后，除去所述第二反应溶液中过量的所述无机碱，得到所述T1加权铁基造影剂；
其中，总铁元素为二价铁离子与三价铁离子之和。
8.根据权利要求7所述的T1加权铁基造影剂的制备方法，其特征在于，该制备方法具体包括：将所述改性葡聚糖溶于水溶液中37℃恒温水浴搅拌，之后按照二价铁离子与三价铁离子摩尔比例为50％的比例将铁离子溶液加入所述改性葡聚糖溶液；将溶液置于37℃恒温水浴500转/分钟快速搅拌，之后用浓度为1M氢氧化钠溶液以2.5mL/s的流速将反应溶液pH至9；搅拌反应30min后，除去过量的氢氧化钠，最终制备得到以改性葡聚糖为模板制备的铁基磁共振造影剂。
9.根据权利要求8所述的T1加权铁基造影剂的制备方法，其特征在于，所述氧化铁纳米颗粒的粒径范围为2nm～10nm；
调节pH使用的无机碱优选氢氧化钠、氢氧化钾的水溶液；
除去溶液中过量无机碱的方法为透析或盐酸稀溶液酸碱中和。
10.如权利要求6所述的T1加权铁基造影剂在磁共振中的血池造影和临床磁共振中T1加权增强造影以及作为临床补铁剂的应用。
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