CN117538539A - 一种新生儿肺炎的蛋白标志物组合及其应用 - Google Patents

一种新生儿肺炎的蛋白标志物组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，涉及一种新生儿肺炎的蛋白标志物组合及其应用。本发明提供一种检测蛋白标志物组合的试剂在制备新生儿肺炎辅助诊断试剂盒中的应用，蛋白标志物组合包括SAA4、SELL、APOM、CD6和CST5。本发明对40例脐带血样本中得到的184种发育相关蛋白进行检测，筛选出五种与新生儿肺炎高度相关的蛋白质，通过检测该蛋白标志物组合在样本中的表达量，可以辅助判断待测者是否患有新生儿肺炎，帮助患者得到及时的治疗。

Description

一种新生儿肺炎的蛋白标志物组合及其应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其是指一种新生儿肺炎的蛋白标志物组合及其应用。
背景技术
新生儿肺炎(neonatal pneumonia)指新生儿在出生后发生的肺部感染，通常由细菌、病毒或其他病原体引起，是新生儿时期最常见的一种严重呼吸道疾病，以弥漫性肺部病变及不典型的临床表现为其特点。新生儿肺炎可分为产前感染(包括宫内和产时)和出生后感染。产前感染是指孕妇在怀孕期间患上感染，并将感染传给胎儿，导致胎儿在出生后发生肺炎或其他感染性疾病的情况，这种感染通常通过血液或胎盘传播给胎儿，或因孕妇羊膜早破、产程过长，阴道中微生物上行感染所造成，产前感染的肺炎发病多在出生后3-7天内。由于新生儿呼吸器官和功能不成熟，如不及时治疗，就很容易引起呼吸衰竭、心力衰竭、败血症乃至死亡。如何更早地知道新生儿分娩后是否存在肺炎风险从而及时给予治疗，具有重大的临床意义。
检测新生儿肺炎的方法通常包括临床症状观察、胸部X射线检查、收集呼吸道分泌物和氧饱和度监测等，由于新生儿肺炎的症状常不典型，胎龄愈小症状愈不典型，体温正常者约占一半以上，其余则体温不稳，严重的病儿或早产儿体温常不升，因此临床症状观察方法极易耽误病程，对新生儿患者造成严重影响，亟待一种能够简单快速辅助判断新生儿是否患有肺炎的方法。
脐带是胎儿和胎盘之间的连接，胎儿与母体的供血和氧气通过脐带交换，这些脐带血管在胎儿的生长和发育中扮演关键的角色。脐带血直接反映了胎儿自身的生物学变化，可以提供更准确的胎儿发育状态和疾病状态。通过分析脐带血中的分子标记物，可以更准确地预测胎儿的是否存在肺炎的风险，更早地发现潜在的问题，并更好地监控胎儿的健康，从而采取及早干预措施。除此之外，脐带血采集是一个相对简单和无害的过程，通常在分娩时进行，将脐带内的血液收集到一个容器中。这种采集过程对母亲和胎儿都没有风险，而且不会对分娩本身造成干扰。
在脐带血中，血浆循环蛋白在存在明显差异，这表明脐带血循环蛋白有望作为胎儿肺炎的标志分子。在寻找新生儿肺炎的生物标志物的早期研究中，由于缺乏超高灵敏度以及高效覆盖炎症标志物的方法，阻碍了本领域的研究进程。因此目前还没有出现能够应用于辅助诊断新生儿肺炎的脐带血浆蛋白标志物。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种新生儿肺炎的蛋白标志物组合及其应用。本发明基于Olink靶向蛋白组学技术，对40例脐带血样本中得到的184种发育相关蛋白进行检测。
对于鉴定到的蛋白，分别计算测得的每种血浆蛋白水平在两组中是否存在统计学显著的差异，并且根据计算得到的差异倍数排序和统计学显著水平P值以及相应的生物学意义对蛋白进行筛选，得到五种与新生儿肺炎高度相关的蛋白质，分别为SAA4、SELL、APOM、CD6和CST5。
使用R语言中的glmnet包进行LASSO回归分析，确定解释模型中每个特征的系数大小和方向构建得到了一个基于蛋白表达水平的新生儿肺炎预测模型，最终用模型输出可能性预测值，再用计算得到的截断值作为判断新生儿肺炎与否的标准。因此通过检测蛋白标志物组合在样本中的表达量，可以初步判断待测者是否患有新生儿肺炎。
本发明的第一个目的是提供检测蛋白标志物组合的试剂在制备新生儿肺炎辅助诊断产品中的应用，其特征在于，所述蛋白标志物组合包括SAA4、SELL、APOM、CD6和CST5。
进一步地，检测的样本来自受试者的脐带血。
进一步地，收集脐带血后低速离心处理，离心结束收集上清液血浆。
血浆蛋白是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅具有稳定、微创、易于检测的优点，且能够进行精确定量。
进一步地，上述试剂检测蛋白标志物组合的表达量。
进一步地，上述试剂为SAA4、SELL、APOM、CD6和CST5的抗体。
本发明的第二个目的是一种新生儿肺炎辅助诊断试剂盒，试剂盒含有SAA4、SELL、APOM、CD6和CST5的抗体探针。
进一步地，抗体探针由第一抗体-第一寡核苷酸探针和第二抗体-第二寡核苷酸探针组成，其中，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链互补。
进一步地，试剂盒中包含用于扩增第一寡核苷酸链和/或第二寡核苷酸链的引物。
进一步地，采用Olink Target 96Cardiometabolic/Inflammation面板对脐带血血浆中的蛋白标志物组合进行相对定量。
Olink靶向蛋白组学作为一项创新的蛋白检测技术，能够高度敏感地测量体液中的特定蛋白质分子，在预测个体发育过程中发挥着关键作用。这一技术基于PEA邻位延伸分析技术。
PEA邻位延伸分析技术检测蛋白含量的原理为，每个待检蛋白均有对应的一对抗体，抗体上偶联有特定的DNA单链，当这对抗体结合目标蛋白后，处于邻位的两条DNA单链互补结合并经酶延伸形成双链DNA模板，将蛋白质信号转换为DNA信号，最后利用荧光实时定量PCR技术进行定量检测。
进一步地，试剂盒中含有阳性对照和阴性对照。
进一步地，阳性对照为新生儿肺炎患者的脐带血样本，阴性对照为未患病新生儿的脐带血样本。
使用荧光实时定量PCR技术得到待测各样本的Ct值后，通过Fluidigm Real-TimePCR Analysis software软件计算Ct值，并利用阳性对照和阴性对照定量周期值归一化处理。通过Olink NPX Signature software软件进行样本蛋白表达量的定量，获得NPX蛋白表达矩阵，计算诊断得分，判断待测者是否患病。
进一步地，试剂盒中还含有包被缓冲液、洗涤液和稀释液。
进一步地，上述新生儿肺炎辅助斩断试剂盒采用以下步骤进行检测：
(1)收集待测脐带血样本，离心取血浆，加入稀释液得到血浆稀释液；
(2)在血浆稀释液中加入抗体探针混合均匀，孵育过夜；
(3)孵育后进行末端延伸和PCR预扩增反应，将蛋白信号转化为对应的DNA信号；
(4)取PCR产物加入抗体对应的检测引物，进行荧光实时定量PCR反应；
(5)通过Fluidigm Real-Time PCR Analysis software(v4.1.3)软件计算Ct值，并利用阳性对照和隐形对照定量周期值归一化处理；
(6)通过Olink NPX Signature software(v.1.6.0.0)软件进行样本蛋白表达量的定量，获得NPX蛋白表达矩阵，将各蛋白的NPX值代入以下公式得到Y值；
Y＝2.00826544×NPXCST5-0.35740726×NPXSAA4-1.12768942×NPXSELL-
2.65538813×NPXAPOM-0.03252991×NPXCD6+19.77444878
结果显示，待测血浆的Y值大于0.4861848，初步判定为疑似新生儿肺炎样品；待测血浆的Y值小于0.4861848，初步判定未患有新生儿肺炎。
本发明通过检测40例新生儿脐带血中的184种发育相关蛋白，筛选出五种与新生儿肺炎显著相关的蛋白，即SAA4、SELL、APOM、CD6和CST5组成的蛋白标志物组合。通过检测这五种新生儿肺炎相关蛋白标志物在样品中的表达量，能够辅助诊断待测者是否患有新生儿肺炎。本发明还提供了检测该蛋白标志物的试剂在制备新生儿肺炎蛋白辅助诊断试剂盒中的应用，促进血浆蛋白相关研究结果的临床转化，可使胎儿疾病状态的鉴别识别更加方便易行，为临床医生快速掌握胎儿的发育情况，为临床治疗提供基础。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是SAA4、SELL、APOM、CD6和CST5蛋白在新生儿肺炎病例组和健康对照组中表达量比较；
图2是新生儿肺炎病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：SAA4、SELL、APOM、CD6和CST5的表达量和新生儿肺炎相关性的研究
1.研究对象的选择
本研究共采用40例新生儿样本进行研究，结合这些胎儿的住院检查信息等详细健康状况，判定是否发生新生儿肺炎。
2.脐带血浆样本收集
(1)胎儿娩出后，使用无菌纱布及碘伏棉球擦拭脐带表面，减少母体血液污染。使用10mL针筒抽取脐带血5-7mL，立即转移至紫色抗凝采血管中，缓慢混匀5次后，置入4℃冰箱暂存，2小时内进行离心处理；
(2)将暂存于4℃冰箱的采血管配平放入低速离心机中，设置参数3000rpm(450g)，室温离心10min，分离后可见上层血浆、中间层棕黄色白细胞、最下层红细胞；
(3)将上一步骤分离出的全部上清液血浆(注意不要吸到中间层的白细胞)，用一次性吸管轻轻转移至新的1.5mL EP管中。配平后在低温离心机4℃16000g再次离心10min去除沉淀残余细胞碎片；
(4)吸取上清液转移至1.5mL血浆冻存管中，贴上标签保存至-80℃冰箱；
(5)将采血管中剩余血样丢弃至标记生物危害的垃圾桶；
(6)血浆转运过程中使用干冰保存。
血浆蛋白是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅具有稳定、微创、易于检测的优点，且能够进行精确定量。而脐带血作为胎儿最直接的样品来源，直接反映了胎儿自身的生物学变化，可以提供更准确的胎儿发育状态和疾病状态。
3.使用Olink Target 96Cardiometabolic/Inflammation进行靶向蛋白质检测
(1)血浆解冻后，取1μL血浆加入99μL血浆稀释液，混匀备用；
(2)取1μL血浆稀释液与3μL抗体探针混合均匀，4℃条件下孵育过夜(16-22h)；
(3)孵育后，进行末端延伸和PCR预扩增反应，将蛋白信号转化为对应的DNA序列信号；
(4)在Fluidigm Biomark平台上，使用Microfluidic real-time PCR chip(96.96Dynamic Array IFC,Fluidigm Biomark)进行96×96的大规模平行qPCR检测。具体如下：取2.8μL PCR产物，加入7.2μL检测缓冲液，混合均匀。随后取5μL的混合液，加样至96.96Dynamic Array IFC芯片中，同时加入5μL抗体对应的检测引物(Assay Plate,OlinkBioscience)。最后芯片在Biomark上运行检测，程序如下：热混合Thermal mix(50℃,2min；70℃,30min；25℃；10min)，热启动Hot-start(95℃,5min)，PCR Cycle 40cycles(95℃,15s；60℃,1min)(http://www.fluidigm.com/biomark-hd-system.html))；
(5)通过Fluidigm Real-Time PCR Analysis software(v4.1.3)软件计算Ct值，并利用阳性对照和隐形对照定量周期值归一化处理，阳性对照为新生儿肺炎患者的脐带血样本，阴性对照为未患病新生儿的脐带血样本；
(6)通过Olink NPX Signature software(v.1.6.0.0)软件进行样本蛋白表达量的定量，获得NPX蛋白表达矩阵；
(7)通过生信分析，筛选脐带血血浆循环蛋白中与新生儿肺炎发生相关的蛋白质。
Olink靶向蛋白组学作为一项创新的蛋白检测技术，具有高度特异性、高通量、适用于小样本等优点，能够高度敏感地测量体液中的特定蛋白质分子，在预测个体发育过程中发挥着关键作用。采用Olink Target 96Cardiometabolic/Inflammation面板对脐带血血浆中的蛋白质进行研究，帮助识别和验证与新生儿肺炎相关的潜在生物标志物，并将其运用于新生儿肺炎的辅助诊断中。
4.相关蛋白筛选
本实验采集了40例新生儿脐带血，经Olink的(PEA)邻位延伸技术，使用Target96Cardiometabolic/Inflammation面板共鉴定了184种血浆蛋白。对于鉴定到的蛋白，分别计算测得的每种血浆蛋白水平在两组中是否存在统计学显著的差异。并且根据计算得到的差异倍数(vg_log2FC)排序和统计学显著水平P值(P value<0.01)以及相应的生物学意义对蛋白进行筛选。最终选定5种和新生儿肺炎高度相关的蛋白：SAA4、SELL、APOM、CD6和CST5。
表1各蛋白表达情况
5.预测模型构建
使用R语言(version 4.0.4)中的glmnet包(lmnet_4.1-2)进行LASSO回归分析。LASSO回归通过加入L1正则化项，能够将不重要的特征系数缩减为零，从而实现特征选择。根据LASSO回归结果，确定解释模型中每个特征的系数大小和方向。经过LASSO回归，构建得到了一个基于5个血浆蛋白表达水平的新生儿肺炎预测模型。该模型输出新生儿肺炎从0到1的可能性，根据随机抽取的训练集数据生成可能性预测，并用cutoff包(utoff_1.3)的linear()函数寻找disp的显著截断值，以Bonferroni方法为调整方法。最终用模型输出可能性预测值，再用计算得到的截断值作为判断新生儿肺炎与否的标准，得到以下公式计算Y值：
Y＝2.01×NPXCST5-0.36×NPXSAA4-1.13×NPXSELL-2.66×NPXAPOM-
0.03×NPXCD6+19.78
结果显示，待测血浆的Y值大于0.50，初步判定为疑似新生儿肺炎样品；待测血浆的Y值小于0.50，初步判定未患有新生儿肺炎。
实施例2：新生儿肺炎辅助诊断试剂盒的使用
(1)胎儿娩出后，使用无菌纱布及碘伏棉球擦拭脐带表面，减少母体血液污染。10mL针筒抽取脐带血5-7mL，立即转移至紫色抗凝采血管中，缓慢混匀5次后，置入4℃冰箱暂存，2小时内离心；
(2)将暂存于4℃冰箱的采血管配平放入低速离心机中，设置参数3000rpm(450g)，室温离心10min，分离后可见上层血浆、中间层棕黄色白细胞、最下层红细胞；
(3)将上一步骤分离出的全部上清液血浆(注意不要吸到中间层的白细胞)，用一次性吸管轻轻转移至新的1.5mL EP管。配平后在低温离心机4℃16000g再次离心10min去除沉淀残余细胞碎片；
(4)取1μL血浆加入99μL血浆稀释液，混匀备用；
(5)取1μL血浆稀释液与3μL抗体探针混合均匀，4℃孵育过夜(16-22h)；
(6)孵育后，进行末端延伸和PCR预扩增反应，将蛋白信号转化为对应的DNA序列信号；
(7)在Fluidigm Biomark平台上，使用Microfluidic real-time PCR chip(96.96Dynamic Array IFC,Fluidigm Biomark)进行96x96的大规模平行qPCR检测。具体如下：取2.8μL上一步PCR产物，加入7.2μL检测缓冲液，混合均匀。随后取5μL的混合液，加样至96.96Dynamic Array IFC芯片中，同时加入5μL抗体对应的检测引物(Assay Plate,OlinkBioscience)。最后芯片在Biomark上运行检测，程序如下：热混合Thermal mix(50℃,2min；70℃,30min；25℃；10min)，热启动Hot-start(95℃,5min)，PCR Cycle 40cycles(95℃,15s；60℃,1min)(http://www.fluidigm.com/biomark-hd-system.html)；
(8)通过Fluidigm Real-Time PCR Analysis software(v4.1.3)软件计算Ct值，并利用阳性对照和隐形对照定量周期值归一化处理，阳性对照为新生儿肺炎患者的脐带血样本，阴性对照为未患病新生儿的脐带血样本；
(9)通过Olink NPX Signature software(v.1.6.0.0)软件进行样本蛋白表达量的定量，获得NPX蛋白表达矩阵，将各蛋白的NPX值代入以下公式得到Y值；
Y＝2.01×NPXCST5-0.36×NPXSAA4-1.13×NPXSELL-2.66×NPXAPOM-
0.03×NPXCD6+19.78
结果显示，待测血浆的Y值大于0.50，初步判定为疑似新生儿肺炎样品；待测血浆的Y值小于0.50，初步判定未患有新生儿肺炎。
本实施例的方法测定的结果只能作为中间结果的信息，不能直接判定患者是否患有新生儿肺炎，因此后续还需要结合临床症状、影像学及组织病理学等信息，最终判定患者的患病情况。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.检测蛋白标志物组合的试剂在制备新生儿肺炎辅助诊断产品中的应用，其特征在于，所述蛋白标志物组合包括SAA4、SELL、APOM、CD6和CST5。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测的样本来自受试者的脐带血。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂检测蛋白标志物组合的表达量。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括SAA4、SELL、APOM、CD6和CST5的抗体。
5.一种新生儿肺炎辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有SAA4、SELL、APOM、CD6和CST5的抗体探针。
6.根据权利要求5所述的新生儿肺炎辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述抗体探针由第一抗体-第一寡核苷酸探针和第二抗体-第二寡核苷酸探针组成，其中，第一寡核苷酸链和第二寡核苷酸链互补。
7.根据权利要求6所述的新生儿肺炎辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含用于扩增第一寡核苷酸链和/或第二寡核苷酸链的引物。
8.根据权利要求5所述的新生儿肺炎辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为新生儿肺炎患者的样本，所述阴性对照为未患病新生儿的样本。
9.根据权利要求5所述的新生儿肺炎辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有包被缓冲液、洗涤液和稀释液。
10.根据权利要求5所述的新生儿肺炎辅助诊断试剂盒，其特征在于，采用以下步骤进行检测：
(1)收集待测脐带血样本，离心取血浆，加入稀释液得到血浆稀释液；
(2)血浆稀释液中加入抗体探针，检测样本中蛋白标志物组合的表达量，
判断待测者是否患病。
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