CN117538471A - 一种氨基三乙酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种氨基三乙酸的检测方法。该检测方法，包括以下步骤：将待测样品和硝酸铜溶液混合，得到待测液；将待测液和氨基三乙酸的对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，通过外标法，计算得到氨基三乙酸的含量；高效液相色谱的检测条件包括：流动相为四丁基氢氧化铵的水溶液‑甲醇体系；进样量为5μL；色谱柱为C8色谱柱；所述流动相体系的流速为1.2mL/min；洗脱方式为等度洗脱；检测条件包括：检测器为紫外检测器，检测波长为254nm。本发明提供的方法无需每次都制备相应的对照品溶液，方法简便。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种氨基三乙酸的检测方法。
背景技术
氨基三乙酸是依地酸二钠合成工艺中原料依地酸中含有的杂质，该杂质有一定的致癌性、致畸性，易造成皮肤、眼睛、呼吸系统的不适，易导致过敏性皮炎，美国环境署规定成年人氨基三乙酸的暴露量为每天小于1μg/kg，因本品在注射剂中使用较广泛，尤其需要控制该成分的含量。在USP40、EP9.0均有“氨基三乙酸”控制项，限度为0.1％。
在美国药典USP40标准“氨基三乙酸”项目，采用的HPLC法，作为杂质限量检查项，规定取供试品制备供试品溶液，另取等量的供试品，加入限度量的待测杂质，制成对照品溶液；依法操作，设对照品溶液的峰面积为a，供试品溶液的峰面积为b，b值应小于(a-b)。该方法的优点是不需要计算，但每测一份样品，均需制备相应的对照品溶液，在进行多批次测定，增加了操作步骤，比较繁琐。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种氨基三乙酸的检测方法，本发明提供的氨基三乙酸的检测方法简便且准确。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种氨基三乙酸的检测方法，包括以下步骤：
将待测样品和硝酸铜溶液混合，得到待测液；
将待测液和氨基三乙酸的对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，通过外标法，计算得到氨基三乙酸的含量；
高效液相色谱的检测条件包括：流动相为四丁基氢氧化铵的水溶液-甲醇体系；进样量为5μL；色谱柱为C8色谱柱；
所述流动相体系的流速为1.2mL/min；洗脱方式为等度洗脱；
检测条件包括：检测器为紫外检测器，检测波长为254nm。
优选地，所述高效液相色谱的检测的色谱柱为AgelaC8色谱柱；色谱柱的柱温为30℃。
优选地，所述四丁基氢氧化铵的水溶液中四丁基氢氧化铵的浓度为0.01mol/L。
优选地，所述四丁基氢氧化铵的水溶液和甲醇的体积比为90:10。
优选地，所述硝酸铜溶液的质量浓度为1％。
本发明提供了一种氨基三乙酸的检测方法，包括以下步骤：将待测样品和硝酸铜溶液混合，得到待测液；将待测液和氨基三乙酸的对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，通过外标法，计算得到氨基三乙酸的含量；高效液相色谱的检测条件包括：流动相为四丁基氢氧化铵的水溶液-甲醇体系；进样量为5μL；色谱柱为C8色谱柱；所述流动相体系的流速为1.2mL/min；洗脱方式为等度洗脱；检测条件包括：检测器为紫外检测器，检测波长为254nm。本发明提供的方法每次都制备相应的对照品溶液，方法简便，而且由于氨基三乙酸本身的紫外吸收非常弱，在测定过程中，加入硝酸铜后，氨基三乙酸与硝酸铜能形成稳定的蓝色的络合物，大大增加了增加氨基三乙酸的紫外吸收，提高了灵敏度和准确性。
附图说明
图1为标准曲线图；
图2为空白溶液的色谱图；
图3为系统适用性溶液的色谱图；
图4为供试品溶液的色谱图；
图5为对照品溶液的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种氨基三乙酸的检测方法，包括以下步骤：
将待测样品和硝酸铜溶液混合，得到待测液；
将待测液和氨基三乙酸的对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，通过外标法，计算得到氨基三乙酸的含量；
高效液相色谱的检测条件包括：流动相为四丁基氢氧化铵的水溶液-甲醇体系；进样量为5μL；色谱柱为C8色谱柱；
所述流动相体系的流速为1.2mL/min；洗脱方式为等度洗脱；
检测条件包括：检测器为紫外检测器，检测波长为254nm。
在本发明中，若没有特殊说明，所采用的试剂均为本领域技术人员所熟知的市售商品。
本发明将待测样品和硝酸铜溶液混合，得到待测液。
在本发明中，所述硝酸铜溶液的质量浓度优选为1％。
本发明将待测液和氨基三乙酸的对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，通过外标法，计算得到氨基三乙酸的含量。
在本发明中，所述高效液相色谱的检测条件包括：流动相为四丁基氢氧化铵的水溶液-甲醇体系，所述四丁基氢氧化铵的水溶液的浓度优选为0.01mol/L；所述四丁基氢氧化铵的水溶液的pH优选为7.4～7.6；更优选为7.5；所述四丁基氢氧化铵的水溶液的pH调节试剂优选为磷酸；所述四丁基氢氧化铵的水溶液和甲醇的体积比优选为90:10。
在本发明中，所述高效液相色谱的进样量为5μL；色谱柱为C8色谱柱，优选为AgelaC8色谱柱(250mm*4.6mm，5μm)；所述流动相的流速为1.2mL/min；色谱柱的柱温优选为30℃，洗脱方式为等度洗脱。
检测条件包括：检测器为紫外检测器，优选为SPD-20A紫外检测器；检测波长为254nm。
在本发明中，所述外标法为：根据检测后得到的氨基三乙酸的标准溶液的色谱图和氨基三乙酸的标准溶液的浓度，得到氨基三乙酸对照品的标准曲线，然后，根据待测液的色谱图，将峰面积代入上述标准曲线，得到氨基三乙酸的含量。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的实施例中，具体仪器、试剂以及待测样品的规格如下所示：
氨基三乙酸对照品：USP药典委员会；批号：F01315
甲醇(色谱纯)：默克公司批号：2017/04/30
25％四丁基氢氧化铵：天津市光复精细化工研究院批号：2016年12月10日
氢氧化铵：国药集团化学试剂有限公司批号：20150106
磷酸：国药集团化学试剂有限公司批号：20140725
硝酸铜：天津市福晨化学试剂厂批号：20170102；
水：超纯水(自制)
依地酸二钠：3批，包括国抽2批样品及自购化学试剂1批
高效液相色谱仪(岛津公司)，型号：LC-20A；
高效液相色谱检测的条件为：色谱柱为AgelaC8色谱柱(250mm*4.6mm,5μm)；柱温为30℃；进样量为5μL；流动相为四丁基氢氧化铵的水溶液-甲醇体系；四丁基氢氧化铵的水溶液的浓度为0.01mol/L，pH为7.5；所述四丁基氢氧化铵的水溶液和甲醇的体积比优选为90:10。
检测的条件包括优选包括：SPD-20A紫外检测器；检测波长为254nm。
实施例1
一、溶液的配制
1、供试品溶液：取国抽样品(依地酸二钠样品)l.0g，精密称定，置100mL量瓶中，加1wt％硝酸铜溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
对照品贮备液：取氨基三乙酸对照品10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加氢氧化铵溶液0.1mL，加水适量使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液1：取国抽样品(依地酸二钠样品)1.0g，精密称定，置100mL量瓶中，精密加对照品贮备液1mL，用1％硝酸铜溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液2：取对照品贮备液1mL，置100mL量瓶中，用1％硝酸铜溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
空白溶液：以1％的硝酸铜溶液为空白溶液。
系统适用性溶液：取供试品10mg，置100mL量瓶中，加对照品贮备液1mL，用1％硝酸铜溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
2、标准曲线：
分别精密量取对照品贮备液10μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL，至100mL容量瓶中，作为线性溶液。精密量取上述溶液5μL注入液相色谱仪，以浓度和相应的峰面积计算回归方程，结果见表1，图1。
表1线性关系测定结果
结论：氨基三乙酸在1.0～50.0μg/mL的浓度范围内，浓度与峰面积的线性关系良好。
3、测定方法摸索：
测定法1：精密量取供试品溶液、对照品溶液1、空白溶液、系统适用性溶液5μL注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱检测的条件进行检测，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有与氨基三乙酸保留一致的色谱峰，其峰面积不得大于对照品溶液与供试品溶液中氨基三乙酸峰面积的差值(0.1％)。
测定法2：精密量取供试品溶液(Yc、Y3和Y25)、对照品溶液2、空白溶液、系统适用性溶液5μl注入高效液相色谱仪，按照高效液相色谱检测的条件进行检测，记录色谱图，系统适用性溶液中，氨基三乙酸与其他峰之间的分离度大于1.5。供试品溶液如出现与对照品溶液相应的峰，按外标法以峰面积计算，含氨基三乙酸不得过0.1％。将以上两种方法的测定计算结果和美国药典的中的供试品溶液的计算结果进行比较，见表2。
表2供试品溶液中氨基三乙酸测定结果表(％)
从两种方法的结果中，我们可以看出，两种方法的测试结果并无差异，为了简化操作步骤，拟采用外标法。
实施例2
检出限及定量限
精密量取对照品溶液适量，按照高效液相色谱检测的条件进行检测，以被测组分信号(S)和基线噪音(N)的比值≥10(S/N≥10)的相应浓度确定定量限，S/N≥3的相应浓度确定检出限。检出限及定量限结果见表3。
表3方法检出限及定量限
实施例3
取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液，系统适用性溶液各5μL，注入液相色谱仪记录色谱图，其中空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液和对照品溶液的色谱图见图2～5，从图2～5可知：供试品溶液色谱图中，在与对照品色谱图中相应位置出现色谱峰，空白溶液无干扰，系统适用性符合要求。
实施例4
取研究用样C(SIBP9911V，SIGMA-AIDRICH)适量，按照实施例1供试品溶液的配置，配置得到供试品C溶液后精密量取5μL，注入液相色谱仪，按照高效液相色谱检测的条件，连续进样6次，以氨基三乙酸主峰的峰面积为考察指标，测定结果见表4。
表4精密度测定结果
实施例5
溶液稳定性
将实施例4制备得到的供试品C溶液，于室温放置0、2、4、8、10、12小时分别取样5μL测定，以氨基三乙酸主峰面积为考察指标，测定结果见表5。
表5供试品溶液稳定性测定结果
结论：峰面积的RSD为0.38％，说明供试品溶液在配制后12小时内稳定。
实施例6
重复性试验
取6份研究用样C(SIBP9911V，SIGMA-AIDRICH)各1g，按照实施例1的供试品溶液的配置方法制备6份供试品溶液后，按照高效液相色谱检测的条件进行测定并计算，测定结果见表6。
表6重复性测定结果
结论：含量的RSD为0.75％，说明本法重复性较好。
实施例7
分别取样品C0.4g，0.5g，0.6g各3份，各精密称定，然后再依次加入对照品各适量(见表7)，然后按照供试品溶液的配置方法配置得到待测液后按照高效液相色谱检测的方法测定并计算回收率，测定结果见表7。
表7回收率测定结果
结论：低、中、高水平的回收率的RSD依次为101.7％、100.6％、102.2％，说明本法准确度较好。
实施例8
取研究用样C(SIBP9911V，SIGMA-AIDRICH)按照实施例1供试品溶液的配置方法配置得到待测液后，分别考察柱温变化±5℃、流动相比例及三根不同品牌的色谱柱，测定结果见表8。
表8耐用性试验结果
结论：上述液相色谱条件的微小变化后，发现色谱峰有较好的分离，且不同柱温和不同色谱柱之间的差异较小。本方法耐受性较好。在流动相比例调整范围考察时，也考察过甲醇-四丁基氢氧化铵溶液比例分别为(8:92)、(7:93)等两种比例。结果显示，目标峰与溶剂峰分离度达不到要求。因此，该方法如果列入质量标准，建议限制甲醇百分比在9～12范围内变化。
实施例9
按高效液相色谱检测的条件的方法对59批抽样样品和4批研究用样进行测试，结果见表9。
表9样品含量测定结果
USP40、EP9.0中，该项目限度为0.1％，从表9可知，以上63批样品中，有38批不符合该限度规定。在国抽样品及进口化学试剂样品均出现不合格样品。该项目为控制本品工艺中的有毒杂质，应列入质量标准中加以控制。
拟定的正文如下：
色谱条件与系统适用性试验用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.01mol/L四丁基氢氧化铵的水溶液(用磷酸调节pH值至7.5±0.1)—甲醇(90:10)为流动相；检测波长为254nm。取供试品10mg，置100ml量瓶中，精密加入加对照品贮备液1mL，用1％硝酸铜溶液稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。精密量取5μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，氨基三乙酸峰理论塔板数应不小于4000，氨基三乙酸峰与其它峰的分离度应不小于1.5。
测定法取本品l.0g，精密称定，置100mL量瓶中，加1％硝酸铜溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取氨基三乙酸对照品约l0mg，精密称定，置10ml量瓶中，加氢氧化铵溶液0.1mL，加水适量使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液，精密量取1mL置100mL量瓶中，用1％硝酸铜溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。以1％的硝酸铜溶液为空白溶液。精密量取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中，如出现与对照品溶液相应的峰，按外标法以峰面积计算，本品含氨基三乙酸不得过0.1％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种氨基三乙酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测样品和硝酸铜溶液混合，得到待测液；
将待测液和氨基三乙酸的对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，通过外标法，计算得到氨基三乙酸的含量；
高效液相色谱的检测条件包括：流动相为四丁基氢氧化铵的水溶液-甲醇体系；进样量为5μL；色谱柱为C8色谱柱；
所述流动相体系的流速为1.2mL/min；洗脱方式为等度洗脱；
检测条件包括：检测器为紫外检测器，检测波长为254nm。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测的色谱柱为Agela C8色谱柱；色谱柱的柱温为30℃。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述四丁基氢氧化铵的水溶液中四丁基氢氧化铵的浓度为0.01mol/L。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述四丁基氢氧化铵的水溶液和甲醇的体积比为90:10。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述硝酸铜溶液的质量浓度为1％。
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