CN117535281A - 一种氨基微球有序固定多酶的方法、其产物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种氨基微球有序固定多酶的方法、其产物和应用，属于基因工程、酶固定化和生物催化技术领域。所述方法包括：制备多孔氨基化固定化载体；制备融合蛋白QT‑PPK‑DC，SC‑FucT2‑DC，Fkp‑ST；往多孔氨基化固定化载体中加入QT‑PPK‑DC，并加入谷氨酰胺转胺酶MTG；将得到的产物重新分散到SC‑FucT2‑DC中；将得到的产物重新分散到Fkp‑ST中，得到三酶有序固定化氨基微球，并将微球用于合成2‑岩藻糖基乳糖中，最终在初步催化中即得到4.17g/L的2’‑岩藻糖基乳糖。本发明的优点：多酶固定化的方向以及顺序可控，参与级联反应的酶蛋白之间催化活性口袋距离较近，进一步提高催化效率；生物正交化学的固定方式中使用细胞破碎液上清，同步固定与纯化且自然温和，在很大程度上保留了酶蛋白的催化活性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程、酶固定化和生物催化技术领域，涉及一种氨基微球有序固定多酶的方法并应用于人乳寡糖合成，具体涉及一种氨基微球有序固定多酶的方法、其产物和应用。
背景技术
随着人类社会的发展，酶作为催化剂的重要性越发显著。越来越多的学者致力于研究酶催化剂，因为相比于传统的化学催化剂，酶催化剂介导的反应具有高效性、特异性、高选择性以及反应条件温和，反应体系绿色，对环境友好等优势。但游离酶催化反应存在着无法酶固定化是提高游离酶的稳定性和重复使用性的一个简单且有效的方法。迄今为止，物理吸附、包埋和共价交联是将酶固定化到载体上的常用方法。由于酶和载体间通过弱相互作用相连，物理吸附和包埋两种方式可以使酶保持较高的酶活，但是容易使酶从载体上脱落。共价交联是一种有效的酶固定化方法，由于酶和载体间引入了化学键，使酶和载体间的连接很稳定。目前，戊二醛活化是共价连接酶和载体的最普遍的方法之一，但戊二醛法的缺陷在于其与侧链氨基的反应(席夫碱反应)随机进行，以及由此引起酶蛋白的活性中心被掩埋或破坏，以致酶催化活力大大降低。另外由于其固定化的随机性，为了避免杂蛋白被固定，往往需要对酶蛋白进行纯化。
多酶级联反应在科学和工业应用中经历了快速增长，特别是在生物转化、生物传感器和生物医学工程中。此外，多酶催化工艺凭借其条件温和，反应专一，与绿色化学贴合，被认为是生产许多药物、生物燃料和精细化学品的替代路线。多种酶可以在一锅系统中介导复杂的化学反应，例如，使用三酶级联从商业核糖中产生冠状病毒Mlnupiravir(MK-4482)。在许多研究中，酶在载体上的共固定化已经显示出对观察到的活性有积极的影响。
2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)是人乳中含量最丰富的寡糖，也是研究最活跃的人乳寡糖(HMOs)之一，母乳的成分非常复杂，因为它包含许多生物分子。母乳对健康的促进作用主要是由于母乳中存在多种生物活性因子，母乳寡糖(HMOs)是母乳碳水化合物的关键成分，与母乳喂养对婴儿的营养和健康益处密切相关。目前在国内外合成2'-FL的研究有很多，也有许多不同种类合成路线。国外近年来，作为长期占据HMOs市场的寡头企业，杜邦公司、巴斯夫集团、荷兰皇家帝斯曼集团，以及丹麦科汉森等知名企业纷纷进军2’-FL产业，通过全细胞生物合成法进行规模化生产。国内由于缺乏成本较低、天然安全、可大量供应的糖基供体，目前酶法合成2'-FL仅限于实验室规模；化学合成法不仅步骤多、得率低，分离困难、成本高，同时会造成环境污染，目前尚处于千克级规模，因此我国对2’-FL的合成还处于研发阶段，目前还没有企业能够实现2’-FL规模化生产，未来仍需加速推进对2’-FL合成方法的研究。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种使用Tag/Catcher以及QTag/MTG两种生物正交方法将三酶进行有序固定到氨基微球载体上的方法，为了实现氨基载体对酶的精准捕捉和可控固定，通过对QTag与酶蛋白进行融合表达，使得酶蛋白带有QTag可以用于后续氨基载体的靶向共价固定，而MTG可以实现在温和条件下完成氨基载体对第一个酶蛋白的固定；通过在三个酶蛋白上分别的融合对应的SpyCatcher/SpyTag与DogCatcher/DogTag，使三种酶之间可以快速特异性连接，实现了从细胞裂解液直接进行固定目标蛋白，实现了三酶的精确有序固定，实现了催化反应中的能量循环，降低了经济成本，制备得到的三酶有序固定化微球运用于后续的2‘-岩藻糖基乳糖的催化合成。
本发明的第一个目的是公开了一种氨基微球有序固定多酶的方法。
本发明的第二个目的是公开了一种氨基微球有序固定多酶的方法所得的产物。
本发明的第三个目的是公开了一种氨基微球有序固定多酶的方法所得产物的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种氨基微球有序固定多酶的方法，包括以下几个步骤：
(1)、制备多孔氨基化固定化载体；
(2)、在聚磷酸激酶PPK上分别融合DogTag与QTag、在岩藻糖基转移酶FucT2上分别融合DogCatcher与SpyCatcher、在GDP-岩藻糖焦磷酸化酶Fkp上融合SpyTag，得到融合蛋白QT-PPK-DT，SC-FucT2-DC，Fkp-ST；
(3)、往步骤(1)的多孔氨基化固定化载体中加入步骤(2)的QT-PPK-DC融合蛋白，并加入谷氨酰胺转胺酶MTG，使QT-PPK-DT融合酶蛋白上的QTag与多孔氨基化固定化载体上的氨基树脂发生反应进行特异性固定；
(4)、将步骤(3)得到的产物重新分散到步骤(2)的SC-FucT2-DC融合蛋白中，使QT-PPK-DT上的DogTag和SC-FucT2-DC上的DogCatcher进行生物正交，实现对第二个酶蛋白的固定；
(5)、将步骤(4)得到的产物重新分散到步骤(2)中得到的Fkp-ST融合蛋白中，使SC-FucT2-DC上的SpyCatcher与Fkp-ST上的SpyTag进行生物正交，实现在固定化载体上形成三酶有序固定涂层；
其中：所述的聚磷酸激酶来源于土拉伦氏弗朗西斯菌(Francisellatularensis)，更优选的，所述聚磷酸激酶的编码基因序列如SEQ ID No.1所示；
所述的岩藻糖基转移酶来源于嗜热链球菌(Thermosynechococcus vestitus)，更优选的，所述岩藻糖基转移酶的编码基因序列如SEQ ID No.3所示；
所述的GDP-岩藻糖焦磷酸化酶来源于脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，更优选的，所述GDP-岩藻糖焦磷酸化酶的编码基因序列如SEQ ID No.2所示；
所述的谷氨酰胺转氨酶来源于茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)，更优选的，所述谷氨酰胺转氨酶的编码基因序列如SEQ ID No.4所示；
所述的DogCatcher，DogTag，SpyCatcher，SpyTag和Qtag编码基因序列分别如SEQID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示。
上述技术方案所述的方法，其中：步骤(1)中的多孔氨基化固定化载体为表面富含氨基的多孔聚合物微球。
上述技术方案所述的方法，其中：步骤(3)中使QT-PPK-DT融合酶蛋白上的QTag与多孔氨基化固定化载体上的氨基树脂发生反应进行特异性固定的方法为：在谷氨酰胺转胺酶MTG的作用下，氨基树脂上富含的氨基与QTag上的酰胺发生反应，从而实现氨基载体对第一个酶蛋白聚磷酸激酶的固定；QT-PPK-DT通过MTG固定到氨基微球上时，混合的QT-PPK-DC与MTG的比例为5～10:1，反应时间为1～10h。
上述技术方案所述的方法，其中：步骤(4)中SC-FucT2-DC上的DogCatcher与QT-PPK-DT上的DogTag交联，混合酶蛋白的比例为3:1～8，在160～220rpm下摇晃2～8h，交联温度控制在10-35℃。
上述技术方案所述的方法，其中：步骤(5)中SC-FucT2-DC上的SpyCatcher与Fkp-ST上的SpyTag交联时，混合酶蛋白的比例为3:1～3，在160～220rpm下摇晃2～4h，交联温度控制在10-35℃。
上述技术方案所述的方法，其中：步骤(3)、步骤(4)与步骤(5)中所得到的固定化氨基微球均使用离心进行收集，离心的转速为8000～12000rpm，时间为5min，并用0.02mol·L-1、pH 8.0的Tris-HCl重复洗涤三次，并使用Bradford法进行检测直到上清液中未检测到蛋白质。
上述技术方案所述的方法制备所得的产物，其中：所述产物为三酶有序固定化氨基微球。
上述技术方案所述的三酶有序固定化氨基微球的应用，其中：所述应用为用于2’-岩藻糖基乳糖催化合成的应用。
上述技术方案所述的应用，其中：将三酶有序固定化氨基微球与底物L-岩藻糖、乳糖、GDP、ADP和Poly-p混合并悬浮于20mM、pH 7.0的含有Mg2+的Tris-HCl缓冲液中，在20-40℃下反应12-48h生成2’-岩藻糖基乳糖。
本发明的重点是使用表面富含氨基的多孔聚合物树脂作为载体，在谷氨酰胺转胺酶MTG作为催化剂的辅助下，实现在较为温和的条件下，快速靶向固定融合表达了QTag目标酶蛋白，在树脂表面固定化第一层酶蛋白。然后，将第二种酶蛋白与固定了第一种酶蛋白的固定化载体混合，在自然温和的条件下，DogTag与DogCatcher会自发进行特异性反应，从而实现第二个酶蛋白的捕捉固定。相同的，将第三种酶蛋白与固定化双酶的载体进行混合，自然条件下通过SpyTag与SpyCatcher的特异性反应进行快速连接，从而获得三酶精确有序固定化树脂。
对于固定方法，本发明选择了Tag/Catcher以及QTag/MTG两种生物正交方法。通过三种互不影响的特异性固定方式，以氨基树脂载体作为起点，通过三步固定方式，获得三酶精确有序固定化树脂。相较于传统的固定方式，此方法避开了纯化这一固定化酶中最麻烦的问题，谷氨酰胺转胺酶MTG的引入，通过氨基树脂与QTag进行特异性反应，使得复杂的固定条件变得简单温和，只需要在室温或者低温的条件下即可进行快速精确的固定，该方法将纯化与固定化相结合，在保证固定化酶高比活的同时，将双单元操作简化为单一操作。本发明中提到的另一种生物正交方式Tag/Catcher可以在自然环境下，室温或者低温(甚至是较高的温度)下都能够发生特异性连接，通过生成异肽键的方式进行共价连接，生成的异肽键具有结构稳定，连接反应不可逆，反应条件温和等诸多优点，在保证酶活力的同时实现稳定快速的交联，因此被广泛应用于酶蛋白的连接。因此，我们在聚磷酸激酶和岩藻糖基转移酶以及GDP-岩藻糖焦磷酸化酶上分别融合DogTag；DogCatcher与SpyCatcher；SpyTag，并用于第二种与第三种酶蛋白的固定化。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明使用Tag/Catcher以及QTag/MTG两种生物正交方法，通过三酶的有序固定，在树脂上形成三层酶蛋白，并且级联酶的固定化顺序精确可控。与传统的固定化相比，本发明多酶固定化的方向以及顺序可控，操作简单，且参与级联反应的酶蛋白之间催化活性口袋距离较近，有利于底物流效应，从而进一步提高催化效率；并且固定方式自然温和，反应条件简单，在很大程度上保留了酶蛋白的催化活性。
2、本发明将聚磷酸激酶PPK引入了2’-岩藻糖基乳糖的催化体系中，实现了一酶同时再生GTP与ATP，实现了催化反应中的能量循环，大大降低了成本，提高了经济效益。
3、本发明是基于载体的固定化，相较于无载体交联酶聚集体，本发明的固定化酶更适用于工业化生产，有着更加广泛的应用范围，有更好的刚性和稳定性。
4、本发明方法安全可靠且环境污染少，很大程度节约了纯化所耗的时间和成本，适合于工业化生产。
附图说明：
图1为本发明的多孔聚合物树脂SEM图。
图2为聚磷酸激酶融合蛋白QT-PPK-DT，岩藻糖基转移酶融合蛋白SC-FucT2-DC和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶融合蛋白Fkp-ST的电泳检测分析图；其中a为融合蛋白QT-PPK-DT，b为融合蛋白SC-FucT2-DC，c为融合蛋白Fkp-ST；图2说明了聚磷酸激酶融合，岩藻糖基转移酶融合蛋白以及GDP-岩藻糖焦磷酸化酶融合蛋白的成功构建与表达。
图3为三酶顺序固定化催化2’-岩藻糖基乳糖示意图。
图4为MTG将融合蛋白QT-PPK-DT固定化至氨基树脂的CLSM分析图。
图5为三酶有序固定化树脂催化L-岩藻糖还原生成2’-岩藻糖基乳糖液相分析图。
图6为聚磷酸激酶PPK再生GTP与ATP示意图。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种氨基微球有序固定多酶的方法、其产物和应用作进一步的说明。以下结合实施例更加详细说明本发明的内容，以下实施例中所使用的质粒、内切酶、连接酶、PCR酶、柱式DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒等采用商用产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。PCR、核酸琼脂糖凝胶电泳、蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳、热激转化、感受态细胞的制备和细菌基因组的提取保存等常规操作方法根据Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Fourth Edition)进行。质粒和DNA产物的测序工作以及基因合成工作均交予北京擎科生物科技股份有限公司完成。
一、原料的制备：
氨基化微球的制备：1g环氧树脂加入到20mL甲苯中，加入丙二胺，80℃反应24h；所得微球用二氯甲烷、乙醇和水按照顺序反复冲洗，抽滤收集微球，所得的微球即为氨基化微球，为白色粉末状。图1表明制备的氨基化微球是比较规整的球状结构，其表面含有大量孔道结构。
实施例1：融合蛋白QT-PPK-DT，融合蛋白SC-FucT2-DC，融合蛋白Fkp-ST重组表达载体构建：
(1)融合蛋白QT-PPK-DT基因片段获取：以PPK作为模板，QT-PPK-DT-F/R为引物，多次PCR得到带有酶切位点NcoI与XhoI的QT-PPK-DT基因片段(所涉及到的引物序列见表1)
表1：融合蛋白QT-PPK-DT基因片段构建引物
(2)融合蛋白SC-FucT2-DC基因片段获取：以FucT2作为模板，SC-FucT2-DC-F/R为引物，PCR得到带有酶切位点NdeI与HindIII的FucT2基因片段，以DogCatcher作为模板，Dogcatcher-F/R作为引物，PCR得到带有酶切位点HindIII与XhoI的DogCatcher，以SpyCatcher作为模板，SpyCatcher-F/R作为引物，PCR得到带有酶切位点NcoI与NdeI的SpyCatcher(所涉及到的引物序列见表2)
表2融合蛋白SC-FucT2-DC基因片段构建引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| SC-FucT2-DC-F1 | ATGGTTGATACCCTGAGCG |
| SC-FucT2-DC-F2 | CATGCCATGGCTATGGTTGATACCCTGAGCG |
| SC-FucT2-DC-R1 | CAGCACGATCCAACCTGGA |
| SC-FucT2-DC-R2 | CCCAAGCTTCAGCACGATCCAACCTGGA |
| Dogcatcher-F | CCCAAGCTTAAACTGGGTGAAATTGAATTTA |
| Dogcatcher-R | CCGCTCGAGTTACTGCGGCACAATGCTGGTA |
| SpyCatcher-F | CATGCCATGGCTATGGTTG |
| SpyCatcher-R | GGAATTCCATATGTAAAACCTGGATCGGATCGATG |
(3)融合蛋白Fkp-ST基因片段获取：以Fkp作为模板，Fkp-ST-F/R为引物，多次PCR得到带有酶切位点NcoI与XhoI的Fkp-ST基因片段(所涉及到的引物序列见表3)
(4)采用NcoI限制性内切酶和XhoI限制性内切酶将QT-PPK-DT，SC-FucT2-DC和Fkp-ST基因片段分别进行单酶切处理后，插入到经相同酶切处理的质粒pET28a中，T4连接酶过夜连接，从而构建pET28a-QT-PPK-DT,pET28a-SC-FucT2-DC,pET28a-Fkp-ST表达载体。
实施例2：重组质粒的转化表达
1、取10μL实例1中得到的重组表达载体pET28a-QT-PPK-DT,pET28a-SC-FucT2-DC,pET28a-Fkp-ST分别加入到100μL的E.coli BL21感受态细胞中，在冰上静置20-40min
2、将步骤1中静置后的BL21感受态细胞，置于42℃的水浴中，热激45-90s后，置于4℃冷却后，加入LB培养基至1mL，置于37℃的摇床中摇晃40-60min
其中：LB培养基的配方是：10g/L NaCl；10g/L胰蛋白胨；5g/L酵母提取物
3、将其涂布到含有相应K+抗性的平板上，挑取单菌落至LB培养基中进行扩大培养，在37℃恒温培养箱中220rpm转速下摇晃培养大肠杆菌生长，至其OD600＝0.6-0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG进行诱导表达，将菌种置于23℃恒温摇床诱导表达16h；其中IPTG工作浓度为0.1mM，
4、诱导得到菌落后，用PBS缓冲液进行重悬后，用超声波细胞破碎机进行细胞破碎，得到细胞破碎液对细胞破碎液上清进行电泳检测，检测结果如图2所示，图2为三种融合蛋白的蛋白胶示意图，其中a为融合蛋白QT-PPK-DT；b为融合蛋白SC-FucT2-DC；c为融合蛋白Fkp-ST。图2说明了三种融合蛋白的成功构建与表达；对破碎液离心后即可得到相应的QT-PPK-DT，SC-FucT2-DC，Fkp-ST融合蛋白溶液。
实施例3：三酶有序固定化氨基微球的制备与应用：
本发明的制备过程以及三酶有序固定化氨基微球催化合成2‘-岩藻糖基乳糖示意图如图3所示，具体步骤如下：
1.取100mg氨基化树脂，加入含有2mg的QT-PPK-DT融合蛋白细胞破碎液上清，加入0.4mg的MTG作为催化剂，然后将反应液置于摇床里摇晃1.5h，使氨基树脂充分固定QT-PPK-DT；反应结束后在4℃下10000rpm离心5min收集树脂，用pH 8Tris-HCl缓冲液进行洗涤直至上清液中无残余未固定蛋白；
为了证明MTG能够将QT-PPK-DT融合蛋白固定化在氨基树脂上，使用Cy5-BisNTA-Ni对氨基树脂上的QT-PPK-DT融合蛋白上的6His-tag进行标记。而另一组在相同条件下不添加MTG。Cy5-BisNTA-Ni荧光素可以和QT-PPK-DT上的6His-Tag结合并在770nm-622nm范围内激发出红色荧光。结果如图4所示，图4为MTG将融合蛋白QT-PPK-DT固定化至氨基树脂的CLSM分析图，由图4可以观察到添加MTG作为催化剂的树脂为红色荧光(见图4a)，未添加MTG的对照组不发光(见图4b)，说明QT-PPK-DT在MTG的作用下成功地固定在树脂上。
2.将1中收集的树脂分散在含有3倍量(相对于被固定的QT-PPK-DT)的SC-FucT2-DC融合蛋白的细胞破碎液中，然后将反应液置于摇床里摇晃2h，使DogCatcher和DogTag充分发生反应，然后10000rpm离心5min收集树脂，并用pH 8Tris-HCl缓冲液进行洗涤直至上清液中无残余未固定蛋白；
3.将2中收集的树脂分散在2mg的Fkp-ST融合蛋白的细胞破碎液中，然后将反应液置于摇床里摇晃2h，使SpyCatcher和SpyTag充分发生反应，然后10000rpm离心5min收集树脂，并用pH 8Tris-HCl缓冲液进行洗涤直至上清液中无残余未固定蛋白，即得到三酶有序固定化氨基微球，将其放在冰上保存等待用于催化反应。
4.以L-岩藻糖作为底物催化合成2’-岩藻糖基乳糖，使用三酶有序固定化氨基微脂进行催化。反应体系为3mL其中含有：10mM Mg2+、40mM Poly-p、10mM GDP、10mM ADP、20mMTris-HCl(pH7.0)、20g/L乳糖、10g/L L-岩藻糖，上述固定化后的微球(约100mg)，30℃摇晃下反应18h。反应结束后，将固定化酶通过12000rpm离心5min去除，通过配制不同浓度的2’-岩藻糖基乳糖标准品溶液，绘制标准曲线，上清进行高效液相色谱检测(具体条件可参考实例5)，计算得到产物2’-岩藻糖基乳糖3.65g/L。
实施例4：三酶有序固定化氨基微球的制备与应用
1.取160mg氨基化树脂，加入含有2mL的QT-PPK-DT融合蛋白细胞破碎液上清浓缩液，加入0.4mg的MTG作为催化剂，然后将反应液置于摇床里摇晃1.5h，使氨基树脂充分固定QT-PPK-DT；反应结束后在4℃下10000rpm离心5min收集树脂，用pH 8Tris-HCl缓冲液进行洗涤直至上清液中无残余未固定蛋白；
2.将1中收集的树脂分散在含有SC-FucT2-DC融合蛋白的细胞破碎液上清浓缩液中，然后将反应液置于摇床里摇晃2h，使DogCatcher和DogTag充分发生反应，然后10000rpm离心5min收集树脂，并用pH 8Tris-HCl缓冲液进行洗涤直至上清液中无残余未固定蛋白；
3.将2中收集的树脂分散在Fkp-ST融合蛋白的细胞破碎液上清浓缩液中中，然后将反应液置于摇床里摇晃2h，使SpyCatcher和SpyTag充分发生反应，然后10000rpm离心5min收集树脂，并用pH 8Tris-HCl缓冲液进行洗涤直至上清液中无残余未固定蛋白，即得到三酶有序固定化氨基微球，将其放在冰上保存等待用于催化反应。
4.以L-岩藻糖作为底物催化合成2’-岩藻糖基乳糖，使用三酶有序固定化氨基微脂进行催化。反应体系为3mL其中含有：其中含有5mM Mg2+、10mM Poly-p、5mM GDP、5mM ADP、0.02mM Tris-HCl(pH7.0)、5g/L乳糖、5g/L L-岩藻糖，上述固定化后的微球(约160mg)，25℃摇晃下反应36h。反应结束后，将固定化酶通过12000rpm离心5min去除，通过配制不同浓度的2’-岩藻糖基乳糖标准品溶液，绘制标准曲线，上清进行高效液相色谱检测(具体条件可参考实例5)，计算得到产物2’-岩藻糖基乳糖4.17g/L。
实施例5：2’-岩藻糖基乳糖检测：
HPLC检测条件：HPLC(Waters e2695)；色谱柱：Carbohydrate Analysis column(Rezex ROA-organic acid H+(8％)250*4.6mm)；流动相：5mM H2SO4；流速0.6mL/min；检测器：示差检测器；柱温60℃；进样量：10μL。
将实例中的反应液上清，用水系滤头过滤后，按照上述条件上样检测结果如图5所示，成功在反应液中检测2’-岩藻糖基乳糖。
本发明将聚磷酸激酶PPK引入了2’-岩藻糖基乳糖的催化体系中，实现了一酶同时再生GTP与ATP(如图6所示)，实现了催化反应中的能量循环，大大降低了成本，提高了经济效益。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种氨基微球有序固定多酶的方法，包括以下几个步骤：
(1)、制备多孔氨基化固定化载体；
(2)、在聚磷酸激酶PPK上分别融合DogTag与QTag、在岩藻糖基转移酶FucT2上分别融合DogCatcher与SpyCatcher、在GDP-岩藻糖焦磷酸化酶Fkp上融合SpyTag，得到融合蛋白QT-PPK-DT，SC-FucT2-DC，Fkp-ST；
(3)、往步骤(1)的多孔氨基化固定化载体中加入步骤(2)的QT-PPK-DC融合蛋白，并加入谷氨酰胺转胺酶MTG，使QT-PPK-DT融合酶蛋白上的QTag与多孔氨基化固定化载体上的氨基树脂发生反应进行特异性固定；
(4)、将步骤(3)得到的产物重新分散到步骤(2)的SC-FucT2-DC融合蛋白中，使QT-PPK-DT上的DogTag和SC-FucT2-DC上的DogCatcher进行生物正交，实现对第二个酶蛋白的固定；
(5)、将步骤(4)得到的产物重新分散到步骤(2)中得到的Fkp-ST融合蛋白中，使SC-FucT2-DC上的SpyCatcher与Fkp-ST上的SpyTag进行生物正交，实现在固定化载体上形成三酶有序固定涂层；
所述的聚磷酸激酶来源于土拉伦氏弗朗西斯菌(Francisella tularensis)；
所述的岩藻糖基转移酶来源于嗜热链球菌(Thermosynechococcus vestitus)；
所述的GDP-岩藻糖焦磷酸化酶来源于脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)；
所述的谷氨酰胺转氨酶来源于茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)；
所述DogCatcher的编码基因序列如SEQ ID No.5所示；所述DogTag的编码基因序列如SEQ ID No.6；所述SpyCatcher的编码基因序列如SEQ ID No.7；所述SpyTag的编码基因序列如SEQ ID No.8和所述Qtag的编码基因序列如SEQ ID No.9所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中的多孔氨基固定化载体为表面富含氨基的多孔聚合物微球。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述聚磷酸激酶的编码基因序列如SEQ IDNo.1所示；所述岩藻糖基转移酶的编码基因序列如SEQ ID No.3所示；所述GDP-岩藻糖焦磷酸化酶的编码基因序列如SEQ ID No.2所示；所述谷氨酰胺转氨酶的编码基因序列如SEQ IDNo.4所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中使QT-PPK-DT融合酶蛋白上的QTag与多孔氨基化固定化载体上的氨基树脂发生反应进行特异性固定为：在谷氨酰胺转胺酶MTG的作用下，氨基树脂上富含的氨基与QTag上的酰胺发生反应，从而实现氨基载体对第一个酶蛋白聚磷酸激的固定；QT-PPK-DT通过MTG固定到氨基微球上时，混合的QT-PPK-DC与MTG的比例为5～10:1，反应时间为1～10h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中SC-FucT2-DC上的DogCatcher与QT-PPK-DT上的DogTag交联，混合酶蛋白的比例为3:1～8，在160～220rpm下摇晃2～8h，交联温度控制在10-35℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中SC-FucT2-DC上的SpyCatcher与Fkp-ST上的SpyTag交联时，混合酶蛋白的比例为3:1～3，在160～220rpm下摇晃2～4h，交联温度控制在10-35℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)、步骤(4)与步骤(5)中所得到的固定化氨基微球均使用离心进行收集，离心的转速为8000～12000rpm，时间为5min，并用0.02mol·L-1、pH 8.0的Tris-HCl重复洗涤三次，并使用Bradford法进行检测直到上清液中未检测到蛋白质。
8.权利要求1-7中任一权利要求所述的方法制备所得的产物，其特征在于：所述产物为三酶有序固定化氨基微球。
9.根据权利要求8所述的三酶有序固定化氨基微球的应用，其特征在于：所述应用为用于2’-岩藻糖基乳糖催化合成的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：将三酶有序固定化氨基微球与底物L-岩藻糖、乳糖、GDP、ADP和Poly-p混合并悬浮于20mM、pH 7.0的含有Mg2+的Tris-HCl缓冲液中，在20-40℃下反应12-48h生成2’-岩藻糖基乳糖。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090061014A1 (en) * | 2007-08-30 | 2009-03-05 | Messersmith Phillip B | Synthetic peptide and peptide conjugates and related tissue coupling methods via transglutaminase enzyme |
| EP3336099A1 (de) * | 2016-12-16 | 2018-06-20 | Karlsruher Institut für Technologie | Verfahren zur selektiven bindung von zellen an einen bindungspartner und zellen umfassende vorrichtungen |
| US20190194641A1 (en) * | 2016-07-20 | 2019-06-27 | Paul Scherrer Institut | Site-specific conjugation to antibody lysine residues with solid-phase immobilized microbial transglutaminase mtg and mtg in solution |
| CN110944718A (zh) * | 2017-05-18 | 2020-03-31 | 里珍纳龙药品有限公司 | 环糊精蛋白质药物偶联物 |
| US20200277403A1 (en) * | 2016-09-14 | 2020-09-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Proximity-based sortase-mediated protein purification and ligation |
| CN113337554A (zh) * | 2021-05-28 | 2021-09-03 | 华东理工大学 | 一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法 |
| WO2021249433A1 (zh) * | 2020-06-10 | 2021-12-16 | 华南理工大学 | 蛋白固定化用载体及其制备方法 |
| US20230329245A1 (en) * | 2020-09-08 | 2023-10-19 | Curie Co. Inc. | Compositions and methods of use thereof |
-
2023
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090061014A1 (en) * | 2007-08-30 | 2009-03-05 | Messersmith Phillip B | Synthetic peptide and peptide conjugates and related tissue coupling methods via transglutaminase enzyme |
| US20190194641A1 (en) * | 2016-07-20 | 2019-06-27 | Paul Scherrer Institut | Site-specific conjugation to antibody lysine residues with solid-phase immobilized microbial transglutaminase mtg and mtg in solution |
| US20200277403A1 (en) * | 2016-09-14 | 2020-09-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Proximity-based sortase-mediated protein purification and ligation |
| EP3336099A1 (de) * | 2016-12-16 | 2018-06-20 | Karlsruher Institut für Technologie | Verfahren zur selektiven bindung von zellen an einen bindungspartner und zellen umfassende vorrichtungen |
| CN110944718A (zh) * | 2017-05-18 | 2020-03-31 | 里珍纳龙药品有限公司 | 环糊精蛋白质药物偶联物 |
| WO2021249433A1 (zh) * | 2020-06-10 | 2021-12-16 | 华南理工大学 | 蛋白固定化用载体及其制备方法 |
| US20230329245A1 (en) * | 2020-09-08 | 2023-10-19 | Curie Co. Inc. | Compositions and methods of use thereof |
| CN113337554A (zh) * | 2021-05-28 | 2021-09-03 | 华东理工大学 | 一种体外多酶级联催化合成岩藻糖基化乳糖的方法 |
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