CN117512192A - 鉴定水稻中胚轴长度的方法及其所用SNP标记Kasp-7-13.7与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鉴定水稻中胚轴长度的方法及其所用SNP标记Kasp‑7‑13.7与应用。本发明所解决的技术问题是鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴长度。本发明在纯系中验证了序列1的第37位为AA基因型的水稻的中胚轴长度长于或候选长于序列1的第37位为GG基因型的水稻，GG纯合型的水稻品种比AA纯合型的水稻品种的中胚轴的平均值降低了36.1％,表明其单倍型或基因型分子标记可用于水稻分子标记辅助选择育种，显著提高水稻中胚轴长度的选择效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及鉴定水稻中胚轴长度的方法及其所用SNP标记Kasp-7-13.7与应用。
背景技术
水稻旱直播法与传统的秧植法相比，具有显著的节水效果、人力节约优势，并便于实现大规模机械化操作，同时有潜力实现与传统移栽法相当的产量水平。尽管如此，旱直播在实际农田作业中面临诸多挑战，包括出苗率低、苗期生长不一致、杂草控制困难以及作物容易发生倒伏等问题。在这些挑战中，水稻的中胚轴发挥着决定性的作用，特别是在幼苗顶土而出的阶段。因此，中胚轴长度较长的水稻幼苗在与杂草争夺资源时具备竞争优势。发现与中胚轴延长相关的基因，并选育中胚轴较长的种质资源，对于促进旱直播水稻技术的广泛应用，降低生产成本至关重要。值得注意的是，中胚轴的长度受多个基因的控制，并呈现复杂的数量性状。不同水稻品种中这一特性的长度差异明显，因此，在育种中寻找与中胚轴增长直接相关的基因，并开发出与之紧密相连的分子标记，是当前杂交育种所需迫切解决的问题之一。
单核苷酸多态性(SNP)标记技术在构建高密度遗传图谱、定位数量性状基因以及种质资源的基因型检测中发挥了越来越重要的作用，这在加快分子育种的过程中有着积极影响。通过与中胚轴增长量性状座位(QTL)紧密连锁的分子标记，可以在分子标记辅助选择(MAS)的框架下，有策略地增强特定品种中的中胚轴长度。此方法已在连锁分析、关联分析、标记辅助选择和作物设计育种等众多领域得到广泛应用。此外，KASP(KompetitiveAllele-Specific PCR)技术，一种快速而准确的分子检测方法，可大规模用于准确判断基因组DNA样本中SNPs以及特定位点的插入/缺失变异(InDels)，进而推动特异性标记在大量样品中的检测工作。这一技术提升了育种过程的效率，对于实现更精准的分子育种具有重要价值。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种中胚轴长度的分子标记。
为了解决上述问题，本发明提供了下述方法。
鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴长度的方法，包括检测待测水稻中SNP的基因型，根据待测水稻的所述基因型鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴长度：所述基因型为AA的水稻中胚轴长度长于或候选长于所述基因型为GG的中胚轴长度；所述SNP位点为水稻7号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为A或G，为序列表中序列1的第37位核苷酸；所述AA是序列表中SEQ IDNo.1的第37位核苷酸为A的纯合型；所述GG是序列表中SEQ ID No.1的第37位核苷酸为G的纯合型。
作为一种实施方案，所述鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴长度方法可包括如下步骤：
(1)以待测水稻的基因组DNA为模板，采用引物组进行KASP；
引物组可包括上游引物F1、下游引物F2和下游引物R；
所述上游引物F1可为核苷酸序列是序列表中序列2的第22-52位单链DNA分子；
所述下游引物F2可为核苷酸序列是序列表中序列3的第22-52位单链DNA分子；
所述下游引物R可为核苷酸序列是序列表中序列4的单链DNA分子。
(2)完成步骤(1)后，进行荧光检测，确定待测水稻的所述SNP的基因型；
(3)根据基因型结果进行鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴长度：所述SNP的基因型为基因型AA的待测水稻的中胚轴长度长于或候选长于所述基因型GG的待测水稻中胚轴长度。
上述方法在水稻育种中的应用。
所述育种可为培育中胚轴长度长或短的水稻。
所述育种可为培育中胚轴长度长的水稻。
为了解决上述问题，本发明还提供了下述应用。
应用，其特征在于，所述应用为P1或P2；
所述P1为检测SNP的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴长度中的应用，或，在制备鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴长度产品中的应用，
所述P2为检测SNP的多态性或基因型的物质在水稻育种或制备水稻育种产品中的应用；
所述SNP为序列表中SEQ ID No.1的第37位核苷酸，其为A或G。
所述物质可为产品。所述检测物质可包括检测上述单核苷酸多态性的试剂、试剂盒和仪器。具体的说，为检测上述单核苷酸多态性进行核酸体外扩增所需的引物和其他试剂和仪器。
所述SEQ ID No.1为Kasp-7-13.7的基因的基因组序列的一部分，在实际检测过程中SNP多态性可通过检测由SNP多态性引起的Kasp-7-13.7基因转录的mRNA、Kasp-7-13.7mRNA反转录的cDNA的核苷酸多态性或Kasp-7-13.7蛋白质氨基酸的多态性来检测分析。
本申请中，所述SNP的基因型可为基因型AA或基因型GG，基因型AA是SNP为A的纯合型；基因型GG是SNP为G的纯合型。
所述SNP为A的纯合型为序列表中SEQ ID No.1的第37位为核苷酸A的纯合型。
所述SNP为G的纯合型为序列表中SEQ ID No.1的第37位为核苷酸G的纯合型。
为了解决上述问题，本发明还提供了下述产品。
产品，其特征在于，所述产品含有上任一所述检测水稻基因组SNP的多态性或基因型的物质，且为下述G1)-G3)中的任一种：
G1)检测水稻中胚轴长度关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
G2)鉴定或辅助鉴定中胚轴长度的产品；
G3)用于水稻育种的产品。
上述任一所述的应用或上述的产品中，所述水稻为水稻纯系。
根据上述的应用、上述的产品或上述的应用或产品中，所述育种的目的包括培育或选育中胚轴长度短或中胚轴长度长的水稻。
上文中，所述育种的目的包括培育或选育中胚轴长度长的水稻。
上述的应用或上述的产品、上述的应用或产品或上述的应用、产品或应用或产品中，所述检测SNP多态性或基因型的物质，或所述检测单倍型的物质，为如下D1)、D2)、D3)或D4)：
D1)含有特异性扩增所述SNP的体外核酸扩增引物；
D2)含有D1)所述体外核酸扩增引物的体外核酸扩增试剂；
D3)含有D1)所述体外核酸扩增引物或D2)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒；
D4)含有D1)所述体外核酸扩增引物、D2)所述体外核酸扩增试剂或D3)所述试剂盒的检测仪器。
所述体外核酸扩增技术可为聚合酶链式反应(PCR)、链替代扩增(SDA)、连接酶链式反应(LCR)和依赖核酸序列的扩增(NASBA)、滚环核酸扩增(RCA)、环介导等温扩增(lamp)、依赖解旋酶的等温扩增技术(HDA)或Qβ复制技术。
本申请以聚合酶链式反应(PCR)为扩增手段，进行多态性检测。
D1)中所述特异性扩增可通过扩增产物的有无或者通过扩增产物的有无再结合探针等辅助试剂来检测SNP多态性位点的核苷酸序列。
上述应用、方法和产品中，所述体外核酸扩增引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测。
上述的应用、产品或方法中，所述体外核酸扩增引物包括上游引物组F1、下游引物F2和下游引物R：
所述上游引物F1为核苷酸序列是序列表中序列2的第22-52位单链DNA分子；
所述下游引物F2为核苷酸序列是序列表中序列3的第22-52位单链DNA分子；
所述下游引物R为核苷酸序列是序列表中序列4的单链DNA分子。
所述上游引物F1为检测SNP多态性位点为T的体外核酸扩增引物，可为核苷酸序列是序列表中序列2的单链DNA分子(序列表中SEQ ID No.2的第1-21位为FAM序列)。
所述下游引物F2为检测SNP多态性位点为C的体外核酸扩增引物，可为核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA分子(序列表中SEQ ID No.3的第1-21位为FAM序列)。
上述应用、产品及方法中，所述水稻为纯系。
上述应用和方法中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由PCR引物、PARMS master mix试剂、酶标仪和在线软件SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由PCR引物、PARMS master mix试剂、在线软件SNP decoder和荧光定量PCR仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测稻基因组中SNP位点的多态性或基因型的物质。
为了解决上述问题，本发明还提供了水稻育种的方法。
所述方法包括将基因型是GG的水稻基因组中序列1的第37位核苷酸替换为A，得到中胚轴长度长于所述基因型是GG的水稻；所述GG为序列表中SEQ ID No.1的第37位核苷酸为G的纯合型。
所述将基因型是GG的水稻基因组中序列1的第37位核苷酸替换为A的方法包括如下步骤：选择基因型为AA水稻与基因型为GG水稻进行杂交，所述AA为序列表中SEQ ID No.1的第37位核苷酸为A的纯合型。
为了解决上述问题，本发明还提供了一种短中胚轴水稻育种的方法。
所述方法包括将基因型是AA的水稻基因组中序列1的第37位核苷酸替换为G，得到中胚轴长度短于所述基因型是AA的水稻且基因型为GG的水稻；所述AA为序列表中SEQ IDNo.1的第37位核苷酸为A的纯合型；所述GG为序列表中SEQ ID No.1的第37位核苷酸为G的纯合型。
所述植物基因组中序列1区域的第37位核苷酸为A植物中胚轴长度长于或候选长于所述目的植物基因组中序列1区域的第37位核苷酸为G的植物。
所述植物为纯合植株。
上述应用、方法和产品中，所述物质可为通过下述至少一种方法确定所述SNP的多态性或基因型所需的试剂和/或试剂盒和/或仪器：体外核酸扩增、DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。
上文所述应用及方法中，可选择水稻品种作为亲本进行育种。
上文所述水稻中胚轴长度具体可为幼苗全部出土后3天的中胚轴长度。
所述育种的目的包括培育或选育长中胚轴长度或短中胚轴长度的水稻。
上述应用和方法中，所述PCR引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32P；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(DIG)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。
上述应用和方法中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由PCR引物、PARMS master mix试剂、酶标仪和在线软件SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由PCR引物、PARMS master mix试剂、在线软件SNP decoder和荧光定量PCR仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测水稻基因组中SNP位点的多态性或基因型的物质。
有益效果
本发明通过在318份IR 145/CHANGAI F2:3群体中发现了一个与水稻中胚轴长度相关联的多态性位点，即SEQ ID No.1的第37位核苷酸为A或G。在纯系中存在两种基因型，即基因型AA或基因型GG，基因型AA是序列表中SEQ ID No.1的第37位为A的纯合型，基因型GG是序列表中SEQ ID No.1的第37位为G的纯合型,所述基因型为AA的水稻中胚轴长度长于或候选长于所述基因型为GG的中胚轴长度。
通过对470份水稻进行进行了验证,在纯系中存在两种基因型，即基因型AA或基因型GG，基因型AA是序列表中SEQ ID No.1的第37位为A的纯合型，基因型GG是序列表中SEQID No.1的第37位为G的纯合型，470份水稻品种中，250个基因型为AA的水稻品种中，中胚轴长度均值1.54cm，175个基因型为GG的水稻品种中，中胚轴长度均值1.00cm，AA纯合型的水稻品种(中胚轴1.54cm)比GG纯合型的水稻品种(中胚轴1.00cm)的中胚轴的平均值降低了36.1％。表明其单倍型或基因型分子标记可用于水稻分子标记辅助选择育种，显著提高水稻中胚轴长度的选择效率。
附图说明
图1为实施例1中318个IR 145和IR64的F2:3群体的部分检测结果图；红色为IR145基因型(GG)，蓝色为IR64基因型(AA)，粉色为检测失败，绿色杂合(AG)。
图2为实施例2中Indic群体470个水稻品种的部分检测结果图；红色为IR145基因型(GG)，蓝色为IR64基因型(AA)，粉色为检测失败，绿色杂合(AG)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
‘IR 145’和IR64是重要的籼稻材料。IR 145中胚轴较短，仅为0.18cm。Changai中胚轴较长，为3.83cm。
IR145记载于下述文献中：“结合QTL-seq和连锁分析发掘水稻中胚轴伸长相关QTL(在该文献中的名称为短中胚轴品种‘IR145’或‘IR145’)”和“Liu,J.,Zhan,J.,Chen,J.,Lu,X.,Zhi,S.,&Ye,G.(2021).Validation of genes affecting rice grain zinccontent through candidate gene-based association analysis.Frontiers inGenetics,12,701658。”
IR64记载于下述文献中：“结合QTL-seq和连锁分析发掘水稻中胚轴伸长相关QTL(在该文献中的名称为籼稻IR64)”和“Mackill,D.J.,&Khush,G.S.(2018).IR64:a high-quality and high-yielding mega variety.Rice,11,1-11”。
实施例1、Kasp-7-13.7与水稻自然品种中胚轴的关联分析及验证
Kasp-7-13.7为水稻基因组的一个SNP，该SNP为水稻基因组中SEQ ID No.1的第37位核苷酸，其为A或G。Kasp-7-13.7的基因型可为基因型AA、基因型AG或基因型GG，基因型AA是Kasp-7-13.7为A的纯合型，基因型AG是Kasp-7-13.7为A和G的杂合型，基因型GG是Kasp-7-13.7为G的纯合型。
1、检测470个水稻品种基于KASP-7-13.7位点的基因型
待测水稻为470个品种记载于下述文件的附件中：(Wang W,Mauleon R,Hu Z,Chebotarov D,Tai S,Wu Z,Li M,Zheng T,Fuentes R R,Zhang F,Mansueto L,CopettiD,Sanciangco M,Palis K C,Xu J,Sun C,Fu B,Zhang H,Gao Y,Zhao X,Shen F,Cui X,YuH,Li Z,Chen M,Detras J,Zhou Y,Zhang X,Zhao Y,Kudrna S,Wang C,Li R,Jia B,Lu J,He X,Dong Z,Xu J,Li Y,Wang M,Shi S,Li J,Zhang D,Lee S,Hu W,Poliakov A,DubchakI,Ulat V J,Borja F N,Mendoza J R,Ali J,Li J,Gao Q,Niu Y,Yue Z,Naredo M EB,Talag J,Wang X,Li J,Fang X,Yin Y,Glaszmann J C,Zhang J,Li J,Hamilton RS,WingRA,RuanJ,ZhangG,WeiC,AlexandrovN,McNallyKL,LiZ,LeungH.Genomicvariation in 3,010diverse accessions of Asian cultivated rice.Nature,2018,557:43-49，具体品种信息如表1所示)。
分子鉴定：
(1)采用CTAB法提取470份水稻种质资源幼嫩叶片的基因组DNA。基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，A260/A280比值介于1.8-2.0之间，A260/A230比值介于1.8-2.0之间，270nm没有明显的光吸收；待测水稻的基因组DNA的浓度在50-200ng/μL。
(2)竞争性等位基因特异性PCR。以待测水稻的基因组DNA为模板，采用实施例2合成的引物组(由上游引F1(FAM)、上游引物F2(HEX)和下游引物R组成)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃1min，继续扩增26个循环。
(3)完成步骤(2)后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断待测水稻基于Kasp-7-13.7位点的基因型。
具体的判断原则如下：如果待测水稻基于Kasp-7-13.7位点显示红色荧光信号，则该待测水稻基于Kasp-7-13.7位点的基因型GG纯合型，与IR145一致；如果待测水稻基于Kasp-7-13.7位点显示蓝色荧光信号，则该待测水稻基于Kasp-7-13.7位点的基因型为AA纯合型，与IR64一致；如果待测水稻基于Kasp-7-13.7位点显示绿色荧光信号，则该待测水稻基于Kasp-7-13.7位点的基因型为AG杂合型；根据上述方法得到470个水稻品种基于KASP-7-13.7位点的基因型(Kasp-7-13.7的基因型)，检测结果见图2和表4。
2、检测中胚轴
1、选择来自于东南亚和南亚地区的Indica亚群的470份水稻材料。在每份材料中挑选15粒饱满无开裂的水稻籽粒，播种于装有定量均质营养土的10×5孔穴盘内，每穴1个品种。确保播种深度达到6cm。覆盖营养土至与穴孔表面平齐。称取500g营养土至托盘内，取适量自来水分别喷洒穴盘与托盘，并将整个装置置于30℃恒温黑暗培养箱内。每日定时浇水至出苗，并记载发芽情况。恒温培养约10d，将穴盘从人工气候箱中取出，用流动水快速冲洗幼苗根部土壤并去除长势有明显差异的单株，对长势均匀株系进行拍照并利用Image J(https://image j.en.softonic.com/)软件测量中胚轴长度。
3、关联分析
分别统计两种基因型的水稻的平均中胚轴，同时用国际通用SAS9.2统计软件PROCTTEST模型进行t检验，统计结果见表4。结果表明，GG纯合型的水稻品种(中胚轴1.00cm)比AA纯合型的水稻品种(中胚轴1.54cm)的中胚轴的平均值降低了36.1％，在P＝0.05水平上有显著差异(表5)。
表4 470份水稻品种的基因型检测结果
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红色为IR145基因型(GG)，蓝色为IR64基因型(AA)，“-”为检测失败，绿色杂合(AG)
表5Kasp-7-13.7在470份Indica材料中的中胚轴长度关联分析
上述结果表明，通过检测待测水稻基于Kasp-7-13.7位点的基因型可以鉴定水稻中胚轴，在水稻分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。
实施例2、水稻中胚轴长度分子标记Kasp-7-13.7的开发和多态性检测
一分子标记Kasp-7-13.7的开发
实施例1为对胚轴长度分子标记分子标记Kasp-7-13.7的验证，本发明通过下述实验寻找到分子标记Kasp-7-13.7，具体如下：
本发明的发明人经过大量实验，通过精细定位的方式，在水稻7号染色体上(13.7Mb)设计并合成适合用等位基因竞争性特异PCR法鉴定水稻中胚轴的引物组。发现了一个与胚轴长度分子标记Kasp-7-13.7。分子标记Kasp-7-13.7为水稻基因组的一个SNP，SNP的位点为水稻基因组中SEQ ID NO：1自5’末端起第37位的核苷酸，SNP基因型为AA型、GG型和AG型。
AA型(AA纯合型)为基因组中SEQ ID NO：1第37位为A的纯合型，GG型(GG纯合型)为基因组中SEQ ID NO：1第37位为G的纯合型，AG型(AG杂合型)为基因组中SEQ ID NO：1第37位为A和SEQ ID NO：1第37位为G的杂合型。
SEQ ID NO：1：CCATAGAAACCCAGATAATTTAGTATTGCTTACTCTrCTTATAATCTGGTTAAAATATCT TATACTTAGATTG，其中r为A或G。
并设计了相关引物组，引物组由上游引F1(FAM)、上游引物F2(HEX)和下游引物R组成，用于扩增包括Kasp-7-13.7位点的靶序列。各个引物的核苷酸序列如表1所示。
表1各个引物的核苷酸序列
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上游引物F1中的下划线为FAM序列标签序列，上游引物F2的下划线为HEX序列标签序列。
由于基因组DNA是由反向互补的两条单链DNA分子组成双链DNA分子，因此一般将编码蛋白质的DNA分子命名为正义DNA分子；将与正义DNA分子的反向互补的DNA分子命名为反义DNA分子。Kasp-7-13.7位点的基因型均为正义DNA的基因型。
二多态性检测
1、IR 145/IR64田间中胚轴的表型鉴定
(1)、以水稻IR 145为母本，水稻IR64为父本，收获F1代种子后，12月在海南省陵水县试验基地进行南繁加代，构建F2:3群体。在IR 145/IR64群体中，挑选400粒饱满无开裂的水稻籽粒(由于部分籽粒未发芽或苗情较差，最终采用318份植株表型数据)，播种于装有定量均质营养土的10×5孔穴盘内，确保播种深度达到6cm。确保籽粒间无相互挤压，覆盖营养土至与穴孔表面平齐。称取500g营养土至托盘内并压实，取适量自来水分别喷洒穴盘与托盘，并将整个装置置于30℃恒温黑暗培养箱内。定时浇水至出苗，并记载发芽情况。恒温培养约10d将穴盘从人工气候箱中取出，用流动水快速冲洗幼苗根部土壤并去除长势有明显差异的单株，对长势均匀株系进行拍照并利用Image J(https://imagej.en.softonic.com/)软件测量中胚轴长度，结果如表2所示，国际通用SAS9.2统计软件PROC TTEST模型进行t检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异，结果如表3所示。
2318份水稻F2:3群体的分子鉴定(分子鉴定方法)
(1)采用CTAB法提取318份水稻种质资源幼嫩叶片的基因组DNA。基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，A260/A280比值介于1.8-2.0之间，A260/A230比值介于1.8-2.0之间，270nm没有明显的光吸收；待测水稻的基因组DNA的浓度在50-200ng/μL。
(2)竞争性等位基因特异性PCR。以待测水稻的基因组DNA为模板，采用上述合成的引物组(由上游引F1(FAM)、上游引物F2(HEX)和下游引物R3条引物序列组成)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃1min，继续扩增26个循环。
(3)完成步骤(2)后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断待测水稻基于Kasp-7-13.7位点的基因型。
具体的判断原则如下：如果待测水稻基于Kasp-7-13.7位点显示红色荧光信号，则该待测水稻基于Kasp-7-13.7位点的基因型GG纯合型，与IR145一致；如果待测水稻基于Kasp-7-13.7位点显示蓝色荧光信号，则该待测水稻基于Kasp-7-13.7位点的基因型为AA纯合型，与IR64一致；如果待测水稻基于Kasp-7-13.7位点显示绿色荧光信号，则该待测水稻基于Kasp-7-13.7位点的基因型为AG杂合型。检测结果见图1和表2。
三、显著性分析
分别统计两种基因型的水稻的平均中胚轴长度(表2)，同时用国际通用SAS9.2统计软件PROC TTEST模型进行t检验。统计结果见表3。结果表明，GG纯合型的水稻品种(中胚轴1.12cm)比AA纯合型的水稻品种(中胚轴1.51cm)的中胚轴的平均值降低了25.8％，在0.05水平上有显著差异(表3)。
由此可见，利用Kasp-7-13.7位点的基因型可以鉴定水稻的中胚轴，判断标准如下：如果待测水稻基于Kasp-7-13.7位点的基因型为AA纯合型，则待测水稻中胚轴较长；如果待测水稻基于Kasp-7-13.7位点的基因型为GG纯合型，则待测水稻中胚轴较短。
表2 IR 145/IR64 F2:3群体中KASP-7-13.7检测结果及中胚轴
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IR64基因型(AA)，IR145基因型(GG)，“-”为缺失，绿色为杂合(AG)
表3Kasp-1-38383221在IR 145/IR64群体中的中胚轴关联分析
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴长度的方法，包括检测待测水稻中SNP的基因型，根据待测水稻的所述基因型鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴长度：所述基因型为AA的水稻中胚轴长度长于或候选长于所述基因型为GG的中胚轴长度；所述SNP位点为水稻7号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为A或G，为序列表中序列1的第37位核苷酸；所述AA是序列表中SEQ IDNo.1的第37位核苷酸为A的纯合型；所述GG是序列表中SEQ ID No.1的第37位核苷酸为G的纯合型。
2.权利要求1所述方法在水稻育种中的应用。
3.应用，其特征在于，所述应用为P1或P2；
所述P1为检测SNP的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴长度中的应用，或，在制备鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴长度产品中的应用，
所述P2为检测SNP的多态性或基因型的物质在水稻育种或制备水稻育种产品中的应用；
所述SNP为序列表中SEQ ID No.1的第37位核苷酸，其为A或G。
4.产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1-3中任一所述检测水稻基因组SNP的多态性或基因型的物质，且为下述G1)-G3)中的任一种：
G1)检测水稻中胚轴长度关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
G2)鉴定或辅助鉴定中胚轴长度的产品；
G3)用于水稻育种的产品。
5.根据权利要求1-3任一所述的应用或权利要求4所述的产品其特征在于，所述水稻为水稻纯系。
6.根据权利要求1或5所述的应用、权利要求2所述的产品或权利要求5所述的的应用或产品，其特征在于，所述育种的目的包括培育或选育中胚轴长度短或中胚轴长度长的水稻。
7.权利要求1-3任一所述的应用或权利要求4所述的产品、权利要求5所述的应用或产品或6所述的应用、产品或应用或产品，其特征在于，所述检测SNP多态性或基因型的物质，或所述检测单倍型的物质，为如下D1)、D2)、D3)或D4)：
D1)含有特异性扩增所述SNP的体外核酸扩增引物；
D2)含有D1)所述体外核酸扩增引物的体外核酸扩增试剂；
D3)含有D1)所述体外核酸扩增引物或D2)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒；
D4)含有D1)所述体外核酸扩增引物、D2)所述体外核酸扩增试剂或D3)所述试剂盒的检测仪器。
8.根据权利要求7所述的应用、产品或方法，其特征在于，所述体外核酸扩增引物包括上游引物组F1、下游引物F2和下游引物R：
所述上游引物F1为核苷酸序列是序列表中序列2的第22-52位单链DNA分子；
所述下游引物F2为核苷酸序列是序列表中序列3的第22-52位单链DNA分子；
所述下游引物R为核苷酸序列是序列表中序列4的单链DNA分子。
9.水稻育种的方法，其特征在于，将基因型是GG的水稻基因组中序列1的第37位核苷酸替换为A，得到中胚轴长度长于所述基因型是GG的水稻；所述GG为序列表中SEQ ID No.1的第37位核苷酸为G的纯合型。
10.一种短中胚轴水稻育种的方法，其特征在于，将基因型是AA的水稻基因组中序列1的第37位核苷酸替换为G，得到中胚轴长度短于所述基因型是AA的水稻且基因型为GG的水稻；所述AA为序列表中SEQ ID No.1的第37位核苷酸为A的纯合型；所述GG为序列表中SEQID No.1的第37位核苷酸为G的纯合型。
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2023
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