CN117511873A - 人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法 - Google Patents
人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117511873A CN117511873A CN202311509073.9A CN202311509073A CN117511873A CN 117511873 A CN117511873 A CN 117511873A CN 202311509073 A CN202311509073 A CN 202311509073A CN 117511873 A CN117511873 A CN 117511873A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cells
- induction
- cells
- human embryonic
- embryonic stem
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 39
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 35
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 90
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 86
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 9
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 7
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 abstract description 3
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 49
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 16
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 12
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000803709 Homo sapiens Vitronectin Proteins 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 3
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 3
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 3
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 2
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 102100040501 Contactin-associated protein 1 Human genes 0.000 description 1
- JMIFGARJSWXZSH-UHFFFAOYSA-N DMH1 Chemical compound C1=CC(OC(C)C)=CC=C1C1=CN2N=CC(C=3C4=CC=CC=C4N=CC=3)=C2N=C1 JMIFGARJSWXZSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102100035290 Fibroblast growth factor 13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100028073 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 1
- 108060006662 GSK3 Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 101100114028 Homo sapiens CNTNAP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001060267 Homo sapiens Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000652332 Homo sapiens Transcription factor SOX-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 description 1
- 101000713575 Homo sapiens Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 description 1
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 1
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 1
- 101100219214 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MIS1 gene Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100030248 Transcription factor SOX-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036790 Tubulin beta-3 chain Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N n-[2-chloro-5-(trifluoromethyl)phenyl]-2-[3-(4-ethyl-5-ethylsulfanyl-1,2,4-triazol-3-yl)piperidin-1-yl]acetamide Chemical compound CCN1C(SCC)=NN=C1C1CN(CC(=O)NC=2C(=CC=C(C=2)C(F)(F)F)Cl)CCC1 NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007992 neural conversion Effects 0.000 description 1
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 description 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 description 1
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000012879 subculture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0623—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及细胞工程技术领域，特别是涉及人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法。本发明首次仅使用一种小分子抑制剂CHIR‑99021作为诱导剂，即可获得稳定传代的类神经干细胞；在之前神经干细胞诱导的报道中，诱导培养基和维持培养基需要更换不同培养基，本发明提供的方法只需使用一种培养基即可完成诱导并且支持细胞增殖和自我更新，所需成本更低，操作简单便捷，适合NSCs进行大规模生产并推向临床试验，为使用干细胞移移植治疗神经系统疾病提供材料，在未来的临床应用中拥有极大前景。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，特别是涉及人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法。
背景技术
干细胞移植是促进脊髓损伤(Spinal Cord Injury SCI)后组织修复的一种治疗策略。干细胞为组织再生提供了具有可塑性的可再生细胞来源。神经干/祖细胞(NerveStem Progenitor Cells，NSPCs)是多能细胞，可自我更新并发育成为神经谱系，因此，它们特别适用于SCI修复。NSPCs在移植到受损脊髓后可能分化为神经细胞，替代丢失或受损的细胞，提供营养支持，恢复连接并促进再生[1]。
神经干细胞(neural stem cells，NSCs)存在于人的大脑海马齿状回颗粒下区和侧脑室室下区。早在1992年Reynolds BA,TetzlaffW,Weiss S.A发现EGF和FGF2可以诱导小鼠胚胎干细胞(ESCs)产生多能祖细胞以产生神经元和星形胶质细胞[2]。2001年ReubinoffBE,Itsykson P,Turetsky T等人从人类胚胎干细胞(hESCs)增殖出神经祖细胞并且可以在体外分化为三种神经谱系——星形胶质细胞、少突胶质细胞和成熟神经元[3]。一直到2009年Chambers SM,Fasano CA,Papapetrou EP等人提出了两种SMAD信号抑制剂Noggin和SB431542的协同作用，足以在贴壁培养条件下诱导hESCs快速且完全向神经转化。随诱导时间的推移，细胞需要先经历了一个短暂的FGF5+外胚层样阶段，然后是PAX6+具有玫瑰花结形成能力的神经细胞。而且他们还发现了初始细胞密度会影响中枢神经系统(central nervous system，CNS)与神经嵴后代的比例[4]。这个新的诱导方案使人类iPSC向中脑多巴胺和脊髓运动神经元的定向分化更加稳定且增加了其普适性。至此，经典的由ESCs向NSC诱导的方法被长期且广泛的使用。
但目前的诱导体系成本较高，而且操作复杂，不适合NSCs进行大规模生产并推向临床试验。
参考文献：
[1]、Mothe AJ,Tator CH.Review oftransplantation ofneural stem/progenitor cells for spinal cord injury.Int J Dev Neurosci.2013Nov,31(7):701-13.doi:10.1016/j.ijdevneu.2013.07.004.Epub 2013Aug 6.PMID:23928260.
[2]、Reynolds BA,TetzlaffW,Weiss S.A mμLtipotent EGF-responsivestriatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.JNeurosci.1992Nov,12(11):4565-74.doi:10.1523/JNEUROSCI.12-11-04565.1992.PMID:1432110；PMCID:PMC6575989.
[3]、Reubinoff BE,Itsykson P,Turetsky T,Pera MF,Reinhartz E,Itzik A,Ben-Hur T.Neural progenitors from human embryonic stem cells.NatBiotechnol.2001Dec；19(12):1134-40.doi:10.1038/nbt1201-1134.PMID:11731782.
[4]、Chambers SM,Fasano CA,Papapetrou EP,Tomishima M,Sadelain M,StuderL.Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dualinhibition of SMAD signaling.Nat Biotechnol.2009Mar；27(3):275-80.doi:10.1038/nbt.1529.Epub 2009Mar 1.Erratumin:Nat Biotechnol.2009May；27(5):485.PMID:19252484；PMCID:PMC2756723.
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法。本发明提供的方法诱导成本低，而且操作简单，适合NSCs进行大规模生产并推向临床试验。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法，包括以下步骤：
将人胚胎干细胞在诱导培养液中进行诱导培养后转移到新的诱导培养液中进行传代培养，得到神经干细胞；所述诱导培养和传代培养的过程中每隔36～48h更换一半体积的诱导培养液；所述诱导培养液由诱导剂和培养液组成；所述诱导剂为CHIR-99021。
优选的，所述CHIR-99021在诱导培养液中的浓度为3μM。
优选的，所述培养液包括N2B27培养液。
优选的，所述人胚胎干细胞包括人胚胎干细胞W24。
优选的，所述诱导培养和传代培养的条件均包括：温度为37℃，环境中CO2体积浓度为5％。
优选的，所述传代培养在细胞变圆且粘附能力降低时开始。
优选的，所述传代培养包括：将变圆的细胞克隆吹散至非单细胞状态后，离心，得到沉淀；
将所述沉淀在所述诱导培养液中传代培养。
优选的，所述离心的转速为1300rpm/min，时间为3min。
优选的，所述方法还包括：将传代培养3～5天的细胞系利用Accutase酶消化，得到神经干细胞的单细胞悬液。
优选的，所述人胚胎干细胞在诱导培养液中进行诱导培养前还包括：将所述人胚胎干细胞在mTeSR培养基中培养2～3天。
有益效果：
本发明提供了人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法，包括以下步骤：将人胚胎干细胞在诱导培养液中进行诱导培养后转移到新的诱导培养液中进行传代培养，得到神经干细胞；所述诱导培养和传代培养的过程中每隔36～48h更换一半体积的诱导培养液；所述诱导培养液由诱导剂和培养液组成；所述诱导剂为CHIR-99021。本发明首次仅使用一种小分子抑制剂CHIR-99021作为诱导剂，即可获得稳定传代的类神经干细胞；在之前神经干细胞诱导的报道中，诱导培养基和传代培养基需要更换不同培养基，本发明提供的方法只需使用一种培养基即可完成诱导并且支持细胞增殖和自我更新，所需成本更低，操作简单便捷，适合NSCs进行大规模生产并推向临床试验，为使用干细胞移移植治疗神经系统疾病提供材料，在未来的临床应用中拥有极大前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为诱导培养液诱导hESCs形态变化；标尺：100μm；
图2为CHIR-99021directly induced NSCs(CdNSCs)基因表达对比分析结果，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；
图3为CdNSCs IF染色；标尺：50μm；
图4为每隔18～24h观察培养的细胞状态；
图5为每隔42～48h观察培养的细胞状态；
图6为诱导过程中单细胞传代细胞状态；
图7为诱导过程中克隆传代细胞状态；
图8为CdNSCs细胞分化的细胞形态图；左图为分化第1天的细胞形态图，右图为分化第6天的细胞形态图；标尺均为：100μm；
图9为CdNSCs细胞分化后的免疫荧光染色结果；标尺均为：50μm；。
具体实施方式
本发明提供了人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法，包括以下步骤：
将人胚胎干细胞在诱导培养液中进行诱导培养后转移到新的诱导培养液中进行传代培养，得到神经干细胞；所述诱导培养和传代培养的过程中每隔36～48h更换一半体积的诱导培养液；所述诱导培养液由诱导剂和培养液组成；所述诱导剂为CHIR-99021。
本发明优选将人胚胎干细胞在mTeSR培养基中培养2～3天，得到稳定的人胚胎干细胞。在本发明中，所述人胚胎干细胞优选包括人胚胎干细胞W24。本发明所述人胚胎干细胞W24保藏在内蒙古大学生命科学学院432室，公开于文献【Liu BC,Liu FY,Gao XY,ChenYL,Meng QQ,SongYL,Li XH,Bao SQ.Global Transcriptional Analyses of theWnt-Induced Development of Neural Stem Cells from Human Pluripotent StemCells.Int J Mol Sci.2021JμL 12；22(14):7473.doi:10.3390/ijms22147473.PMID:34299091；PMCID:PMC8308016.】。
得到稳定的人胚胎干细胞后，本发明将所述稳定的人胚胎干细胞在诱导培养液中进行诱导培养后转移到新的诱导培养液中进行传代培养，得到神经干细胞；所述诱导培养液由诱导剂和培养液组成；所述诱导剂为CHIR-99021。
2017年有报道提出使用CHIR-99021诱导人iPSC分化为运动神经元，但是在诱导过程中在基础培养液中除添加不同浓度的CHIR99021外还需添加利于向外胚层分化的Smad抑制剂SB和DMH1。而本发明使用的诱导培养基始终仅需在基础培养液(N2B27培养液)中添加3μM CHIR99021即可将人ESC诱导为神经干细胞并能获得稳定传代的细胞系，并且初步鉴定该细胞为类神经干细胞，将其命名为CdNSCs(CHIR-99021directly inducedNSCs)；在之前神经干细胞诱导的报道中，诱导培养基和维持培养基需要更换不同培养基，本发明提供的方法只需使用一种培养基即可完成诱导并且支持细胞增殖和自我更新，所需成本更低，操作简单便捷；另外，在扩展NSCs来源的道路上，有学者提出使用转基因重编程体细胞的方法获得NSCs，需要在细胞中转入慢病毒或逆转录病毒，也会带来一定风险，而本专利所使用的方法诱导培养基成分明确，诱导效率高，能够有效避免转基因带来的风险。
在本发明中，所述CHIR-99021在诱导培养液中的浓度优选为3μM，所述培养液优选包括N2B27培养液。本发明实施例所用N2B27培养液的各组分及用量如表1所示。
表1N2B27培养液各组分及用量
在本发明中，所述诱导培养和传代培养的条件均优选包括：温度为37℃，环境中CO2体积浓度为5％。
本发明所述诱导培养和传代培养的过程中每隔36～48h更换一半体积的诱导培养液，优选为每隔42～48h更换一半体积的诱导培养液，更优选为每隔48h更换一半体积的诱导培养液。本发明通过适宜的时间更换诱导培养基，可以使细胞克隆成型且饱满，能够稳定传代，避免间隔时间短导致细胞状态变差，不会形成饱满的神经球并发生大量凋亡。
在本发明中，优选当细胞变圆且粘附能力降低时进行传代培养；所述传代培养优选包括：将变圆的细胞克隆吹散至非单细胞状态后，离心，得到沉淀；将所述沉淀在所述诱导培养液中传代培养，得到可以稳定传代的神经干细胞系；所述离心的转速优选为1300rpm/min，离心的时间优选为3min。
在本发明中，所述方法优选还包括：将传代培养3～5天的细胞系利用Accutase酶消化后离心，利用所述诱导培养液进行重悬，得到神经干细胞的单细胞悬液。
2017年的报道中，诱导分化获得NSC后继续终末分化分为两个阶段，第一阶段分化至运动神经元祖细胞，在分化培养基中撤去Smad抑制剂和GSK3抑制剂，加入音猥因子通路激活剂Pur 0.5μM和0.1μM RA培养6天。第二阶段将RA增至0.5μM，Pur减至0.1μM，培养的第6天在原来的基础上再加入0.1μMCpd E，继续培养6～7天。而本发明获得的细胞系在终末分化时只需撤除CHIR99021使其自由分化为神经元和胶质细胞即可。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.1hESCs的复苏
1.1.1 hESCs细胞系W24来自于英国剑桥大学Wellcome Trust/Cancer ResearchUK Gurdon Institute，现保藏于内蒙古大学生命科学学院432室。复苏hESCs前需在24孔板中先加入300μLVTN(见表2)均匀包被孔底，37℃放置至少30min，室温放置至少1h可接入细胞。
表2 VTN包被液(10mL)
| 试剂名称 | 体积/质量 | 供应商 | 货号 |
| HumanVitronectin(重组人玻连蛋白) | 0.1mL | Gibco | A14700 |
| DPBS(杜氏磷酸缓冲盐溶液) | 10mL | Gibco | 14190-144 |
1.1.2在包被时间足够时，取出液氮中的细胞，迅速放入37℃～38℃温水中解冻。将融化的细胞悬液转入到3ml常温放置的mTesR培养液(表3)中，1300rpm离心3min，弃上清后将细胞沉淀用1mL mTesR重悬，均匀接入到24孔中(重悬时不可反复吹打，轻轻将沉淀重悬即可，不能在传代时消化为单细胞，否则容易分化)，CO2培养箱中37℃培养。
表3 mTeSR培养液(50mL)
| 试剂 | 体积/质量 | 供应商 | 货号 |
| mTeSR basal | 40mL | StemCell Technologies | #85851 |
| mTeSR5×补充液 | 10mL | StemCell Technologies | #85852 |
| 青霉素/链霉素(P/S) | 0.5mL | Gibco | 15140122 |
1.2 hESCs的培养、传代及冻存
1.2.1细胞培养
该细胞需每日更换培养液，每日镜检仔细观察细胞是否分化，死细胞数量。若有克隆分化严重需在体视镜下挑去分化克隆，操作时间不能超过15min。死细胞多或者挑分化克隆操作后进行换液，在换上新的培养液之前可用DBPS(Gibco，14190-144)清洗一到两次。
1.2.2细胞传代
当细胞密度长至孔底80％-90％时，可对细胞进行传代。传代前需先加入300μLVTN/24孔均匀包被孔底，37℃放置至少30min，室温放置至少1h可进行细胞消化。传代前再次镜检，没有分化克隆且死细胞数量不多即可吸出培养液，加入DPBS洗一次后加入Versene溶液(表4)300μL/孔，37℃消化3min，弃Versene，加入mTeSR培养液吹起克隆，不可吹打，得到细胞悬液。将1/10的细胞悬液接入提前铺好的24孔板孔内，置于CO2培养箱中37℃培养。
表4 Versene溶液(1L)
| 试剂 | 体积/质量 | 供应商 | 货号 |
| 乙二胺四乙酸 | 0.2g | Sigma | E6511 |
| 杜氏磷酸缓冲盐溶液 | 1L | Gibco | 14190-144 |
1.2.3细胞冻存
在传代后收集剩余9/10的克隆放入离心管中1300rpm，离心3min。离心后弃上清加入冻存液(表5)500μL缓慢重悬沉淀，不要将克隆打散，利于细胞复苏后的存活。将细胞悬液移入冻存管内并标记细胞信息，冻存管先放入冻存盒置于-80℃冰箱梯度降温，24h后即可将冻存管移入液氮罐内保存。
表5冻存液(10mL)
| 试剂 | 体积/质量 | 供应商 | 货号 |
| KnockOutTM血清替代物(KSR) | 9mL | Gibco | 10828-028 |
| 二甲基亚砜 | 1mL | Sigma | D2650 |
2、CHIR-99021培养液直接诱导hESCs
2.1、CdNSCs诱导
hESCs(W24)生长状态良好时传代，传代需选取大小适宜(300～350μm)的克隆，再将克隆使用mTeSR培养2～3天时，更换培养液为诱导培养液进行诱导，所述诱导培养液由CHIR-99021(Miltenyi Biotec，货号130-103-926)和N2B27培养液(表1)组成；所述CHIR-99021在诱导培养液中的浓度为3μM。
诱导过程中，细胞状态脆弱，生存环境非常重要，不可经常置于室温观察，每隔36～48h更换一半培养液即可，换液时，观察细胞状态变化并拍照。当细胞变圆且粘附能力降低(晃动孔板或者用液体轻轻吹打就会飘起来的程度)时，玻璃针挑起变圆克隆，用口吸管转移至1.5mL离心管中机械吹打至克隆变小但不用吹打为单细胞，1300rpm/min离心3min后弃上清，使用诱导培养液重悬接入包被好VTN的孔中放入CO2培养箱中37℃培养，获得稳定传代的细胞系命名为CdNSCs。使用尼康显微镜对细胞诱导不同天数进行观察，结果见图1，其中CdNSCs P0 D0为第0代第0天，CdNSCs P0 D3为第0代第3天，CdNSCs P2D1为第2代第一天，CdNSCs P14 D6为第14代第6天。
由图1可知，将mTeSR培养液更换为诱导培养液诱导第3天时，细胞出现neuralrosette样结构，之后，细胞由贴壁状态逐渐转换为悬浮状态，纯化悬浮细胞传代培养即可获得新的细胞系。
2.2、CdNSCs培养及冻存
CdNSCs每36～48h半量换液，由于CdNSCs会随生长时间推移漂浮在培养液中，贴壁能力没有W24强，吸弃培养液时要缓慢操作，否则容易将漂浮在培养液中的细胞一起吸弃。一般，CdNSCs培养5～8天可传代一次，接种体积比例为1:8～1:10(24孔板)。小心吸弃诱导培养液，加入Accutase酶300μL/孔，37℃消化6min，镜检观察到细胞均悬浮后，移液器吹散细胞团块，获得单细胞悬液，加入500μL/孔消化终止液(表6)终止消化作用，1300rpm/min离心3min，弃上清加诱导培养液重悬，取1/10接入铺好的新孔中后置于37℃培养箱培养。剩余9/10细胞用配制好的冻存液500μL重悬细胞克隆，将细胞悬液移入冻存管，记录好细胞信息。将冻存管放入-80℃冰箱梯度降温，24h后将冻存管转入液氮罐长期保存。
表6消化终止液(10mL)
| 试剂 | 体积/质量 | 供应商 | 货号 |
| KnockOutTM血清替代物(KSR) | 1mL | Gibco | 10828-028 |
| DMEM/F12 | 9mL | Gibco | 11320-033 |
| 青霉素/链霉素(P/S，10000U/mL) | 0.1mL | Gibco | 15140-122 |
3、CdNSCs生物学特性鉴定
3.1CdNSCs内源基因表达检测
采用实时荧光定量PCR测定CdNSCs和hESCs(W24)的内源基因想到表达量，检测结果见图2。实时荧光定量PCR检测所用的引物序列如表7所示，实时荧光定量PCR的反应体系如表8所示，实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性3s，60℃退火30s，60℃延伸30s，40个循环；60℃～95℃，Melting curve；20℃，10s。
表7不同基因及引物序列
表8实时荧光定量PCR反应体系
| Component | V/μL |
| cDNA | 2μL |
| Forward(5μM) | 1μL |
| Reverse(5μM) | 1μL |
| Nuclease-FreeWater | 16μL |
| KAPA SYBR FAST Qpcr Master Mix | 20μL |
由图2可知，检测转录组水平变化，与hESCs相比，多能基因POU5F1、NANOG显著下调，神经谱系多能基因SOX2上调，外胚层标记SOX1、PAX6，早期神经标记NESTIN、MIS1表达上调。
3.2CdNSCs蛋白表达鉴定
对细胞进行免疫荧光染色(IF染色)，鉴定蛋白表达，具体染色过程为：细胞接种到8孔板中准备实验，接入第三天使用4％PFA进行固定，固定15～20min，加入IF Buffer室温放置30min，加入配好的一抗(IF Buffer稀释配制)放入4℃过夜孵育。第二天，弃一抗后用IF Buffer洗三遍，5min/遍。加入稀释好的二抗(IF Buffer稀释)，室温避光放置1h，吸弃二抗，IF Buffer洗三遍，5min/遍，再用DPBS洗一遍，时间5min，加入稀释好的Hoechst染液室温5min，弃Hoechst，DPBS洗一遍，时间5min。将孔内液体吸弃干净，拆下模具，滴加封片液盖上盖玻片，尽量减少气泡的产生，指甲油封片。-20℃避光保存，尽快使用激光共聚焦显微镜拍照。结果见图3。结果显示，CdNSCs不表达多能基因POU5F1、表达外胚层谱系标记SOX2，不表达中内胚层标记SOX17、T，表达外胚层标记物PAX6和神经早期标记NESTIN
对比例1
在细胞诱导之初，为了清楚观察到细胞的形态变化，每隔18～24h都会将细胞拿出培养箱进行观察并拍照记录，诱导第12天的结果见图4，分析原因后可能是由于诱导时细胞状态不稳定，改为每隔42～48h对诱导细胞进行观察并拍照记录，诱导第50天结果见图5。
由图4和图5可知，观察频率更改之前，细胞状态变差，不会形成饱满的神经球并发生大量凋亡，对细胞维持非常不利。更改观察频率后，细胞克隆成型且饱满，能够稳定传代。
对比例2
在细胞诱导过程中，本发明分别在传代时采用了酶传法和机械传代两种，发现常规的酶传法传代的细胞分化严重，不能维持干细胞特性(图6)。推测是因为诱导过程中细胞更加脆弱，用酶消化为单细胞后不能支持其自我更新与增殖。故在机械传代时，将细胞克隆收集后，只需将细胞克隆吹散即可，不可吹打为单细胞，将吹散的克隆接入包被好的孔中继续培养，发现克隆能维持其自我更新及增殖能力(图7)。
实施例2
将实施例1得到CdNSCs在不含CHIR-99021的N2B27培养液中进行培养使其自由分化，观察细胞的形态变化。如图8所示，随培养时间推移，细胞贴壁后形成突触，且细胞与细胞之间通过细长的突触进行连接，表现出神经元与胶质细胞的典型特征。
细胞分化6天后进行免疫荧光染色，染色方法如下：
细胞接种到八孔板中准备实验，接入第三天使用4％PFA进行固定，固定15-20min，加入IF Buffer室温放置30min，加入配好的一抗(IF Buffer稀释配制)放入4℃过夜孵育。第二天，弃一抗后用IF Buffer洗三遍，5min/遍。加入稀释好的二抗(IF Buffer稀释)，室温避光放置1h，吸弃二抗，IF Buffer洗三遍，5min/遍，再用DPBS洗一遍，时间5min，加入稀释好的Hoechst染液室温5min，弃Hoechst，DPBS洗一遍，时间5min。将孔内液体吸弃干净，拆下模具，滴加封片液盖上盖玻片，尽量减少气泡的产生，指甲油封片。-20℃避光保存，尽快使用激光共聚焦显微镜拍照。
表达神经元标记TUBB3、神经细胞核分子标记NeuN、星形胶质细胞标记GFAP、少突胶质细胞标记CASPR，染色结果如图9所示。
由图9可知，CdNSCs分化后染色结果与Q-PCR结果相符，证明CNSCs具有向神经三系分化的能力，符合神经干细胞的潜能特征。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法，其特征在于，包括以下步骤：
将人胚胎干细胞在诱导培养液中进行诱导培养后转移到新的诱导培养液中进行传代培养，得到神经干细胞；所述诱导培养和传代培养的过程中每隔36～48h更换一半体积的诱导培养液；所述诱导培养液由诱导剂和培养液组成；所述诱导剂为CHIR-99021。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CHIR-99021在诱导培养液中的浓度为3μM。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培养液包括N2B27培养液。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞包括人胚胎干细胞W24。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述诱导培养和传代培养的条件均包括：温度为37℃，环境中CO2体积浓度为5％。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述传代培养在细胞变圆且粘附能力降低时开始。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述传代培养包括：将变圆的细胞克隆吹散至非单细胞状态后，离心，得到沉淀；
将所述沉淀在所述诱导培养液中传代培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述离心的转速为1300rpm/min，时间为3min。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将传代培养3～5天的细胞系利用Accutase酶消化，得到神经干细胞的单细胞悬液。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞在诱导培养液中进行诱导培养前还包括：将所述人胚胎干细胞在mTeSR培养基中培养2～3天。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311509073.9A CN117511873A (zh) | 2023-11-13 | 2023-11-13 | 人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311509073.9A CN117511873A (zh) | 2023-11-13 | 2023-11-13 | 人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117511873A true CN117511873A (zh) | 2024-02-06 |
Family
ID=89763876
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311509073.9A Pending CN117511873A (zh) | 2023-11-13 | 2023-11-13 | 人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117511873A (zh) |
-
2023
- 2023-11-13 CN CN202311509073.9A patent/CN117511873A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kwok et al. | Scalable stirred suspension culture for the generation of billions of human induced pluripotent stem cells using single‐use bioreactors | |
| Kurosawa | Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells | |
| WO2018228071A1 (zh) | 一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法 | |
| US8802431B2 (en) | Population of multipotent cardiac precursor cells derived from human blastocysts derived stem cells | |
| Chaddah et al. | Clonal neural stem cells from human embryonic stem cell colonies | |
| CN114457006B (zh) | 一种通过不连续分化制备肾脏足细胞的方法 | |
| JP2019013237A (ja) | 幹細胞および幹細胞に由来する細胞を単離するための、接着シグネチャーベースの方法 | |
| JP5252411B2 (ja) | 細胞培養担体および細胞の培養方法 | |
| CN115975914B (zh) | 利用化学小分子药物重编程诱导多能干细胞的方法 | |
| CN111269878B (zh) | 一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其应用 | |
| Deng et al. | Isolation and characterization of buffalo (bubalus bubalis) amniotic mesenchymal stem cells derived from amnion from the first trimester pregnancy | |
| WO2023016029A1 (zh) | 一种分离来源于人类诱导多能干细胞的成纤维细胞的方法及其应用 | |
| CN114480259A (zh) | 一种诱导小鼠全能样干细胞的培养基及诱导方法 | |
| CN115011553A (zh) | 一种躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的制备方法及用途 | |
| CN113388572B (zh) | 高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法 | |
| JP2021168679A (ja) | 奇形腫の形成が抑制された多分化能性幹細胞由来の神経前駆体球の製造方法 | |
| CN117511873A (zh) | 人胚胎干细胞向神经干细胞诱导的简易方法 | |
| CN110592007B (zh) | 一种间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| Nemati et al. | Scalable expansion of human pluripotent stem cell-derived neural progenitors in stirred suspension bioreactor under xeno-free condition | |
| CN103031271A (zh) | 分离纯化胚胎脑神经干细胞的快捷方法 | |
| CN115261301A (zh) | 一种视网膜色素上皮细胞体外诱导及培养方法 | |
| JP6980211B2 (ja) | 末梢神経細胞の製造方法 | |
| CN107177555B (zh) | 一种H9C2心肌细胞培养液诱导iPSCs定向心肌分化的方法 | |
| CN115612667B (zh) | 一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质细胞的制备方法 | |
| CN109825468B (zh) | 一种高效诱导鱼类多能性干细胞的方法以及用于该方法的诱导培养基 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |