CN117511809A - 一种抗幽门螺杆菌的干酪乳酪杆菌hy001及其用途、产品和方法 - Google Patents
一种抗幽门螺杆菌的干酪乳酪杆菌hy001及其用途、产品和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一种抗幽门螺杆菌的干酪乳酪杆菌HY001及其用途、产品与方法属于微生物技术领域。本发明提供一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001,其保藏编号为CGMCC NO.26837。基于该菌株HY001,本发明还提供其制备抗幽门螺杆菌药物或制备抑菌剂的用途,其抗幽门螺杆菌药物和抑菌剂。本发明提供的干酪乳酪杆菌HY001能较高的抗幽门螺杆菌的能力、具有广谱抑菌性能,对多种抗生素敏感,并且不产生生物胺,对人体安全。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,特别涉及一种抗幽门螺杆菌的干酪乳酪杆菌HY001及其用途、产品和方法。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)是一类在显微镜下呈螺旋形或弧形的需氧细菌,与慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的发生有密切的关系。在生长繁殖过程中对营养要求较高,而且可以抵抗胃酸,进入人体后可以在胃黏膜上皮细胞中生存并繁殖,在过程中会产生大量的侵袭因子和毒素,促使消化性溃疡甚至胃癌的发生。幽门螺杆菌对于胃炎的治病机制主要在于在胃内定植后可以产生大量的毒力因子,这些毒力因子会使胃黏膜上皮细胞发生变性,从而破坏正常的胃黏膜屏障,导致胃酸侵蚀胃黏膜,进而引发胃炎;而幽门螺杆菌对于消化性溃疡的治病机制主要在于幽门螺杆菌在破坏胃黏膜屏障的同时,还可能刺激胃酸的分泌,加重胃黏膜和十二指肠黏膜的损伤,进而导致胃溃疡或十二指肠溃疡的发生,约10%的幽门螺杆菌患者会发展胃溃疡。幽门螺杆菌可以打破胃黏膜上皮细胞的繁殖和死亡的平衡,导致慢性萎缩性胃炎。随着疾病进一步的发展,可以发展为肠上皮化生、不典型增生甚至癌变。
WHO(世界卫生组织)将幽门螺杆菌(Hp)定义为第一类生物致癌因子。幽门螺杆菌可以通过直接或间接激活转录因子,进一步转录调控下游基因的表达,对胃癌形成、转移、耐药及维持干细胞特性等方面发挥重要作用。对于幽门螺杆菌的感染,临床上一般采用三联或四联药物治疗的方法,但是也会产生一定的临床副作用,会导致胃肠道息肉和白细胞的减少,以及产生胃肠道反应,如恶心、呕吐和肠道细菌使用不平衡等,然而在治疗过程中抗生素对人体产生的副作用往往让人难以承受,抗生素疗法的根除率也在逐年降低。
为此,现有技术另辟新的抗幽门螺杆菌途径,比如,用相对安全的益生菌抑制幽门螺杆菌。然而,目前报道的具有幽门螺杆菌抑制作用的益生菌菌种资源相当有限,且抑菌效果欠佳,抑菌范围较窄。
因此,本领域亟需开发高效抑制幽门螺杆菌的新的益生菌菌株。
发明内容
为了解决现有技术存在的:现有抗幽门螺杆菌的益生菌菌种资源有限、抑菌效果欠佳、抑菌范围窄等问题,为了开发更多高效抑制幽门螺杆菌、抑菌范围宽的新菌株,本发明提供一种抗幽门螺杆菌的干酪乳酪杆菌HY001及其用途、产品和方法。
本发明的技术方案如下:
一种抗幽门螺杆菌干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001,其保藏编号为CGMCC NO.26837。
保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001制备抗幽门螺杆菌药物或制备抑菌剂的用途。
所述抗幽门螺杆菌包括:抑制幽门螺杆菌生长、抑制幽门螺杆菌尿素酶活性、与幽门螺杆菌竞争性黏附胃癌细胞、改善幽门螺杆菌引起的炎症;
优选地,所述抑菌剂的抑菌谱包括:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗格森埃希菌、脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌、肺炎链球菌。
所述改善幽门螺杆菌引起的炎症指:抑制幽门螺杆菌诱导胃癌细胞分泌细胞因子;
优选地,所述胃癌细胞指:人胃癌细胞AGS;
优选地,所述免疫因子包括:TNF-α、IL-8。
一种抗幽门螺杆菌药物,包括:药效活性成分;所述药效活性成分包括:保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001。
所述的一种抗幽门螺杆菌的药物,还包括:药学上可接受的辅料。
一种抑菌剂,包括:抑菌活性成分;所述抑菌活性成分包括:保藏编号为CGMCCNO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001。
所述的一种抑菌剂,还包括:辅料。
一种体外抑菌方法,采用保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001抑菌。
所述抑菌包括:抑制幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗格森埃希菌、脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌、肺炎链球菌。
本发明的有益效果如下:
本发明提供的干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001筛选自酸牛奶样品,经实验证明,该菌株具有较强的抑制幽门螺杆菌的能力,具体表现在:抑制幽门螺旋杆菌的生长、抑制幽门螺杆菌尿素酶活性、与幽门螺杆菌竞争性黏附胃癌细胞、改善幽门螺杆菌引起的炎症等;同时,本发明提供的菌株HY001还具有广谱抗菌作用,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗格森埃希菌、脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌、肺炎链球菌等病原菌都表现出较好的抑制作用。不仅如此,菌株HY001对15种常见抗生素敏感,说明其对人体安全,表明本发明的干酪乳酪杆菌HY001是具有开发应用潜力的安全菌株,可工业量产,广泛推广。
本发明的干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001的保藏信息如下:
保藏编号:CGMCC NO.26837
分类命名:干酪乳酪杆菌Lacticaseibacillus casei
保藏日期:2023年03月17日
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1为本发明实验例3的干酪乳酪杆菌HY001拮抗幽门螺杆菌SS1抑菌圈图片。
图2为本发明实验例8的干酪乳酪杆菌HY001抑制常见病原菌抑菌圈图片,其中A的病原菌为大肠埃希氏菌,B的病原菌为肠炎沙门氏菌,C的病原菌为金黄色葡萄球菌。
图3为本发明实验例8的干酪乳酪杆菌HY001抑制条件致病菌抑菌圈图片,其中A的病原菌为弗格森埃希菌,B的肺炎克雷伯氏菌,C的病原菌为脆弱拟杆菌,D的病原菌为咽峡炎链球菌,E的病原菌为肺炎链球菌。
图4为本发明实验例12的干酪乳酪杆菌HY001产生物胺实验图片,其中A添加的氨基酸是L-精氨酸,B添加的氨基酸是L-赖氨酸,C添加的氨基酸是L-色氨酸,D添加的氨基酸是L-组氨酸。
具体实施方式
以下由特定的具体实验例说明本发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。以下实验例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
生物材料的来源
一、本发明实验例3和实验例4使用的DSM17648为商品化的罗伊氏乳杆菌,可商购获得。
二、本发明实验例3和实验例5使用的幽门螺旋杆菌SS1(H.pyloriSS1),购自广东省微生物菌种保藏中心。
三、本发明实验例8使用的大肠埃希氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、肠炎沙门氏菌ATCC14028、脆弱拟杆菌ATCC25285、肺炎链球菌ATCC49619,均购自广东省微生物菌种保藏中心;肺炎克雷伯菌为肺炎克雷伯菌菌株587,该菌株已登录NCBI,其登录号为MT573143;弗格森埃希菌为弗格森埃希菌7610,该菌株已登录NCBI,其登录号为MW516163;咽峡炎链球菌为咽峡炎链球菌10378,该菌株已登录NCBI,其登录号为MW090399,这个菌株目前由申请人实验室保存,申请人承诺自本发明申请日起20年内向公众发放用于验证本发明的技术效果。
四、本发明实验例9和实验例10使用的AGS细胞购自武汉大学培养物保藏中心。
第1组实施例、本发明的菌株HY001
本组实施例提供一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001,其保藏编号为CGMCC NO.26837。
任何培养、扩繁、发酵、富集、生产、制备、使用、接种、扩增、转化、修饰、改造、销售、许诺销售保藏编号为CGMCC NO.26837的一株干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001的行为,和/或,将保藏编号为CGMCC NO.26837的一株干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001与其他益生菌联用的行为,和/或,用保藏编号为CGMCC NO.26837的一株干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001对各类病原菌的拮抗、和/或制备抗菌产品、和/或制备抗幽门螺杆菌药物均落在本发明的保护范围。
所述其他益生菌包括但不限于:植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、酿酒酵母属、德尔布有孢圆酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、布拉氏酵母属、白球拟酵母属、薛瓦酵母属、深红酵母属、粟酒裂殖酵母属、鲍氏酵母属、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、固氮芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌、青春双歧杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、干酪乳酪杆菌、短双歧杆菌、齿双歧杆菌、婴儿双歧杆菌(即,长双歧杆菌婴儿亚种)、乳双歧杆菌(即,动物双歧杆菌乳亚种)、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌以及嗜热双歧杆菌和嗜酸热双歧杆菌。
本领域技术人员可根据实际生产需要,结合药品领域生产工艺的常规技术手段或基本常识(例如,《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等),对药用辅料进行常规选择或调整,进而将保藏编号为CGMCC NO.26837的一株干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001制成不同剂型、不同存储条件、不同保质期的产品,这对于本领域技术人员而言无技术障碍,是可以并容易做到的。
第2组实施例、本发明菌株HY001的用途
本组实施例提供保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001制备抗幽门螺杆菌药物或制备抑菌剂的用途。
在具体的实施例中,所述抗幽门螺杆菌包括:抑制幽门螺杆菌生长、抑制幽门螺杆菌尿素酶活性、与幽门螺杆菌竞争性黏附胃癌细胞、改善幽门螺杆菌引起的炎症;
在更具体的实施例中,所述改善幽门螺杆菌引起的炎症指:抑制幽门螺杆菌诱导胃癌细胞分泌细胞因子;
优选地,所述胃癌细胞指:人胃癌细胞AGS;
优选地,所述免疫因子包括:TNF-α、IL-8。
优选地,所述抑菌剂的抑菌谱包括:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗格森埃希菌、脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌、肺炎链球菌。
第3组实施例、本发明的抗幽门螺杆菌药物
本组实施例提供一种抗幽门螺杆菌药物。本组所有的实施例都具备如下共同特征:所述一种抗幽门螺杆菌药物包括:药效活性成分;所述药效活性成分包括:保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001。
在进一步的实施例中,所述的一种抗幽门螺杆菌药物还包括:药学上可接受的辅料。
在更具体的实施例中,所述药学上可接受的辅料选自:溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
根据本发明的内容,出于实际生产应用中的不同需求,再结合药物制备领域的常规技术手段(例如,《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》、《微生物菌剂技术研究与应用》等),本领域技术人员可对上述药学上可接受的辅料进行选择和调配,并将保藏编号为CGMCC NO.26837的干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001制成不同的剂型,例如粉剂、片剂、注射剂、口服液、栓剂、凝胶剂、敷贴剂、喷雾剂、洗剂、颗粒剂等。
在具体的实施例中,所述药物的剂型选自:粉剂、片剂、液体剂、胶囊剂中的一种或一种以上。
第4组实施例、本发明的抑菌剂
本组实施例提供一种抑菌剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征:所述一种抑菌剂包括:抑菌活性成分;所述抑菌活性成分包括:保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001。
在进一步的实施例中,所述的一种抑菌剂,还包括:辅料。
在更具体的实施例中,所述辅料选自:溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
根据本发明的内容,出于实际生产应用中的不同需求,再结合药物制备领域的常规技术手段(例如,《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》、《微生物菌剂技术研究与应用》等),本领域技术人员可对上述辅料进行选择和调配,并将保藏编号为CGMCC NO.26837的干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001制成不同的剂型,例如粉剂、片剂、注射剂、口服液、栓剂、凝胶剂、敷贴剂、喷雾剂、洗剂、颗粒剂等。
在具体的实施例中,所述抑菌剂的剂型选自:粉剂、片剂、液体剂、胶囊剂中的一种或一种以上。
第5组实施例、本发明的体外抑菌方法
本组实施例提供一种体外抑菌方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征:采用保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001抑菌。
在具体的实施例中,所述抑菌的抑菌谱包括:金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗格森埃希菌、脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌、肺炎链球菌。
在一些实施例中,所述体外抑菌指:不接触人体或动物体的体外抑菌。
在另一些实施例中,本领域技术人员还可以将保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001与其他益生菌联用进行抑菌,其他益生菌具有本领域技术人员所熟知的常规技术含义,例如,植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、酿酒酵母属、德尔布有孢圆酵母属、假丝酵母属、威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、布拉氏酵母属、白球拟酵母属、薛瓦酵母属、深红酵母属、粟酒裂殖酵母属、鲍氏酵母属、苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、固氮芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌、青春双歧杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、干酪乳酪杆菌、短双歧杆菌、齿双歧杆菌、婴儿双歧杆菌(即,长双歧杆菌婴儿亚种)、乳双歧杆菌(即,动物双歧杆菌乳亚种)、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、嗜酸热双歧杆菌等。
下面结合实验例与附图对本发明的技术效果做进一步详细阐述。
本发明下述实验例中使用的培养基:
MRS培养基:蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉5 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、无水乙酸钠5 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、吐温80 1 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4 0.2 g/L、MnSO4 0.05g/L,pH=6.80 ± 0.20,121℃,灭菌20min。
LMRS培养基:在MRS培养基的基础上添加0.05%(w/v)L-半胱氨酸盐酸盐,pH=6.80± 0.20,121℃,灭菌20min。
BHI培养基:蛋白胨10 g/L、脱水小牛脑浸粉12.5 g/L、脱水牛心浸粉5 g/L、氯化钠5 g/L、葡萄糖2.0 g/L、磷酸氢二钠2.5g/L,pH=7.40 ± 0.20,121℃,灭菌20min。
BHI血琼脂培养基:在BHI培养基的基础上添加1.5%的哥伦比亚琼脂基础和5%的脱纤维羊血。
罗伊氏乳杆菌DSM17648,可商购获得;
哥伦比亚琼脂基础、BHI培养基、TSA培养基均为商业培养基。
如无特殊说明,本发明实施例和实验例中使用的各类试剂耗材均可商购获得,相关实验步骤均为本领域常见操作,具有本领域技术人员可常规理解的技术含义。
实验例1、菌株分离筛选
样品采集自酸牛奶样品,该样品置于无菌取样管中冰盒运输,在无菌条件下用0.85%生理盐水梯度稀释,选取合适稀释梯度在LBS琼脂平板上涂布,37℃培养48-72小时。通过肉眼观察其菌落形态挑取疑似单菌落,对其镜检观察并进行初步筛选和纯化培养。纯化后使用MRS液体厌氧管37℃培养8-12小时,离心去上清后重悬于无菌30%甘油水溶液中,超低温冰箱保藏备用。
实验例2、菌株鉴定及生理生化鉴定
(1)菌株鉴定
对实验例1分离筛选的目的菌株液体扩培,收集菌体,提取基因组DNA,采用中国发明专利ZL202210478937.4记载的通用引物27F和1492R,对16S rDNA序列进行扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,并对PCR产物进行测序。其中PCR反应体系:10×buffer 10μL,10mM dNTP 2μL,上下引物各1μL,DNA模板2μL,Taq酶0.5μL,ddH2O 34μL。95℃预变性10min;然后94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min共35个循环,结束后72℃延伸5min。将PCR产物通过凝胶电泳检测后送往武汉金开瑞生物工程有限公司测序。将鉴定的基因序列用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对,根据分子生物学鉴定结果,菌株的拉丁文名称为Lacticaseibacillus casei,确定该菌株属于干酪乳酪杆菌。将该菌株命名为HY001,并送保藏,其保藏信息如下:
保藏编号:CGMCC NO.26837
分类命名:干酪乳酪杆菌Lacticaseibacillus casei
保藏日期:2023年03月17日
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
(2)生理生化鉴定
干酪乳酪杆菌HY001菌株的生理生化特征结果显示如下:该菌株能利用D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡糖胺、肌醇、熊果甙、七叶灵、水杨苷、纤维二糖、松三糖、D-塔格糖、乳糖和海藻糖。
实验例3、干酪乳酪杆菌HY001抑制幽门螺旋杆菌的生长能力
从平板上刮取适量幽门螺杆菌用5mL BHI 培液重悬制成菌悬液,用BHI将其浓度调整到1×107 CFU/mL。用无菌打孔器(直径8mm)在平板上固定,倾注20mL混有幽门螺旋杆菌的BHI血琼脂培养基,待培养基凝固后,用镊子小心挑出打孔器以做成圆孔,往孔中注入150μL益生菌菌液,37℃微氧条件下培养72 h,测定抑菌圈大小,每个处理分别重复3次。
根据表1的实验结果可知,干酪乳酪杆菌HY001对幽门螺杆菌SS1的抑菌圈直径最大,达16.00 mm,具有较强的拮抗幽门螺杆菌作用。
实验例4、干酪乳酪杆菌抑制幽门螺旋杆菌尿素酶活性
从平板上刮取适量幽门螺杆菌用5mL BHI 培液重悬制成菌悬液,用BHI将其浓度调整到1×107 CFU/mL。孔板中,取 40μL H. pylori SS1和 10μL 干酪乳酪杆菌HY001上清液混匀后,放入三气培养箱中共培养 48h。然后取出加入 150μL尿素酶测试液,振荡后用550nm 的酶标仪测定吸光值,即是尿素酶试剂液测定的结果;对照是 BHI 代替上清液测定。
尿素酶指示剂配方:0.9%NaCl,20mmol/L 尿素,14μg/mL 苯酚红。用 HCl 调 pH至6.8(苯酚红的变色点)分光光度计 OD550nm 测定其OD值。计算菌株尿素酶活性抑制率。
根据表2的实验结果可知,4株干酪乳酪杆菌进行抑制幽门螺杆菌SS1尿素酶活性实验,尿素酶活性抑制率最高的菌株为干酪乳酪杆菌HY001,尿素酶活性抑制率达44.78%;
结合抑制幽门螺旋杆菌的生长能力和抑制幽门螺旋杆菌尿素酶活性的结果,筛选到干酪乳酪杆菌HY001具有拮抗幽门螺杆菌的能力。
实验例 5、干酪乳酪杆菌HY001与幽门螺旋杆菌的共聚集能力
调至益生菌活菌数标准大约为108 CFU/mL(OD600值为0.6左右),病原菌活菌数约108 CFU/mL(OD600值为0.4左右),充分震荡混匀,分别测定初始OD600nm处的值Ax、Ay,乳酸细菌与病原菌各取20mL等体积至50mL离心管中混,涡旋震荡10S后37℃静置孵育,菌悬液孵育2h、5h、21h、24h时,分别小心吸取上层液体2.5mL,测定菌悬液在600nm处的吸光值(A),计算菌株与病原菌的共聚力。
共聚力%=[(Ax+Ay)/2-A(x+y)]/[Ax+Ay/2]×100
其中,x和y分别代表两种菌株,(x + y)代表混合物。
根据实验例1和实验例2相关实验筛选出干酪乳酪杆菌HY001具有拮抗幽门螺杆菌的能力和抑制幽门螺杆菌尿素酶活性。在此基础上,考察干酪乳酪杆菌HY001与幽门螺杆菌SS1的共聚集能力,由表3实验结果可知,随着时间的延长,干酪乳酪杆菌HY001与H.PyloriSS1共聚集能力增大,24h干酪乳酪杆菌HY001共聚集能力达57.22%。
实验例6、干酪乳酪杆菌HY001对模拟胃液的耐受力
(1)试剂的配制:
人工胃液配制:配制0. 5%生理盐水,加入0.3%胃蛋白酶,用稀盐酸1MHCl调节pH至2.5,充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用;
(2)实验菌株准备:根据干酪乳酪杆菌HY001菌悬液制备方法,得到干酪乳酪杆菌HY001菌悬液,根据前期活菌计数的结果调整菌液活菌数在108 CFU/mL进行实验。
(3)耐人工胃液实验:取0.1mL菌悬液分别添加入0.9 mL人工胃液(pH=3)、中,在37℃孵育3h;分别于0h和3h对处理液进行梯度稀释后涂布于LMRS平板进行活菌计数。根据以下计算公式分别计算菌株在人工胃液和胆盐中的存活率:
其中,N1表示经过处理后菌株体系中的活菌数,lg (CFU/mL); N0表示菌株体系中初始活菌数,即0h测得的活菌数,lg( CFU/mL)
根据表4的实验结果显示,干酪乳酪杆菌HY001对人工胃液(pH=2.5)中处理3h后的存活率为99.56%,说明有很好的耐受性,表明干酪乳酪杆菌HY001在低酸的胃液环境中可以存活。
实验例7、干酪乳酪杆菌HY001对胆盐的耐受力
(1)胆盐制备:在LMRS液体培养基中添加0.2%(w/v)的巯基乙酸钠,再加入终浓度为0.3%(w/v)的胆盐,充分溶解后用0.22 μm无菌微孔滤膜过滤除菌备用。
(2)菌株准备:根据干酪乳酪杆菌HY001菌悬液制备方法,得到干酪乳酪杆菌HY001菌悬液,根据前期活菌计数的结果调整菌液活菌数在108 CFU/mL进行实验。
(3)耐胆盐实验:取0.1mL菌悬液添加入0.9mL含有0.3%胆盐的L-MRS培养基中,在37℃培养3h;分别于0h和3h对培养液进行梯度稀释后涂布于L-MRS平板进行平板计数。根据公式计算存活率。
其中,N1表示经过处理后菌株体系中的活菌数,lg (CFU/mL); N0表示菌株体系中初始活菌数,即0h测得的活菌数,lg( CFU/mL)
根据表5的实验结果显示,干酪乳酪杆菌HY001在0.3%的胆盐环境中处理3h后的存活率为86.73%,表明干酪乳酪杆菌HY001在极高的胆盐环境中,仍可以较好的存活,说明干酪乳酪杆菌HY001可以耐受胃肠道中极端环境。
实验例8、干酪乳酪杆菌HY001对病原菌的抑制能力
(1)指示菌悬液的制备:
将大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别在LB液体培养基上活化,37℃摇床培养16h,离心后弃掉上清液,菌体用PBS缓冲液清洗两次后,重悬于PBS缓冲液中,调整菌液浓度至108 CFU/mL备用。
将弗格森埃希菌在LB液体培养基上活化,37℃摇床培养16h,离心后弃掉上清液,菌体用PBS缓冲液清洗两次后,重悬于PBS缓冲液中,调整菌液浓度至108 CFU/mL备用。
将肺炎链球菌在TSA血平板培养基上活化,37摄氏度培养箱恒温培养48h,刮取菌体,用PBS缓冲液洗涤两次后,重悬于PBS缓冲液中,调整浓度至108 CFU/mL备用。
将咽峡炎链球菌在TSA血平板培养基上活化,37摄氏度培养箱恒温培养48h,刮取菌体,用PBS缓冲液洗涤两次后,重悬于PBS缓冲液中,调整浓度至108 CFU/mL备用。
将肺炎克雷伯氏菌、脆弱拟杆菌在BHI血平板培养基上活化,37℃培养箱恒温培养24h,刮取菌体,用PBS缓冲液洗涤两次后,重悬于PBS缓冲液中,调整浓度至108 CFU/mL备用。
(2)菌株发酵液制备:将干酪乳酪杆菌HY001按1%(v/v)接种至MRS液体培养基中,37℃培养12h。
抑菌实验:
(1)将含有1.5%琼脂的MRS肉汤培养基冷却至55℃左右,与大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、弗格森埃希菌菌悬液按一定比例混匀,使指示菌的活菌数在106 CFU/mL数量级,然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中,待培养基冷却凝固后,取出牛津杯,于每孔注入150μL菌株发酵液,37℃过夜培养后,测量抑菌圈直径。
结果显示,干酪乳酪杆菌HY001对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌等常见病原菌均具有较强的抑制作用。同时,考察干酪乳酪杆菌HY001对条件致病菌的抑菌作用发现,干酪乳酪杆菌HY001对脆弱拟杆菌、肺炎链球菌、咽峡炎链球菌、弗格森埃希菌、肺炎克雷伯氏菌等均具有较好的抑制作用。
实验例9、干酪乳酪杆菌HY001对AGS人胃腺癌细胞黏附能力
人胃腺癌细胞AGS细胞系的培养:从液氮罐中取出AGS细胞进行复苏后,用含有1%非必需氨基酸、1%青链霉素和10%胎牛血清的FK-12 培养液放置在37℃,5% CO2的恒温培养箱中进行培养;隔天换液一次,隔两天传代一次。将在细胞培养瓶中长势良好的AGS细胞,用无菌 PBS 洗涤两次。加入0.5 mL胰酶进行消化,离心弃上清,用 FK-12 完全培养液。
调整细胞浓度至2.4×104个/mL,用 12孔组织培养板进行铺板,待细胞长至单层,弃去组织培养板中各孔的培养液,用无菌 PBS 缓冲液洗两遍板,以洗掉未贴壁的细胞,备用。
与此同时,取已培养好的目标菌株菌液,10000 r/min 室温离心 1 min 收集菌体,并用无菌 PBS 洗涤两次,最后重悬于 FK-12 培养基使菌悬液浓度为1×108 CFU/mL)。
将新鲜乳酸菌离心洗涤后得到的菌泥,用不含双抗的 FK-12 细胞培养液重悬,向每孔中加入新鲜乳酸菌重悬菌液,于含 5% CO2 的培养箱中,37℃孵育 2h。弃去组织培养板中各孔的混合液,用无菌 PBS 洗涤 3次,以除去未黏附的乳酸菌。加入0.5 mL 胰酶进行消化至贴壁细胞完全脱落,然后加入0.5mL 不含双抗的细胞培养液终止消化。收集混合液,进行梯度稀释平板计数计算黏附的细菌数,并计算黏附能力。
表7实验结果显示,干酪乳酪杆菌HY001对人胃腺癌细胞(AGS)的黏附能力实验结果发现,干酪乳酪杆菌HY001对AGS细胞的黏附能力为2.01±0.11个/cell,实验结果表明,干酪乳酪杆菌HY01能够在人胃腺癌细胞(AGS)上很好的黏附,为其与幽门螺杆菌竞争性黏附提供了很好的条件。
实验例10、干酪乳酪杆菌HY001抑制幽门螺杆菌SS1诱导AGS细胞分泌细胞因子的研究
将人胃上皮细胞AGS细胞加入6孔板中,待为单层细胞时,用PBS缓冲液冲洗3次,用移液枪向每孔细胞中加入1 mL重悬于FK-12培养液的干酪乳酪杆菌HY001,作为实验组(HY001+HPSS1)。对照组(HPSS1)为不含干酪乳酪杆菌HY001的FK-12培养液,在37℃厌氧培养1h,用 PBS缓冲液洗去未粘附的干酪乳酪杆菌HY001,然后在实验组(HY001+HPSS1)和对照组(HPSS1)中加入等量的幽门螺杆菌菌液,在5% CO2的培养箱中,37℃条件下共同孵育24h,将消化得到的混合液转移至离心管中,在8000 r/min条件下离心5min取上清液,空白组(CK)为不含干酪乳酪杆菌HY001以及幽门螺杆菌菌液的FK-12培养液。根据试剂盒使用说明书测定分泌的 IL-8、IL-10、TNF-α。
幽门螺杆菌感染会引起胃粘膜细胞分泌细胞因子IL-10、IL-8、TNF-α。其中IL-8与幽门螺杆菌引发的胃炎相关,可导致黏膜中中性粒细胞持续激活,损伤胃粘膜屏障。幽门螺杆菌会促进IL-8、TNF-α的分泌。由表8结果可得,感染幽门螺杆菌的AGS细胞分泌的IL-8、TNF-α显著增加,分别增加到2203.89pg/mL、5841.11pg/mL;经干酪乳酪杆菌HY001处理后,AGS细胞的IL-8、TNF-α浓度分别减少到1720.56pg/mL、4441.11pg/mL。该结果表明,干酪乳酪杆菌HY001可以显著抑制幽门螺杆菌对细胞的感染。 同时,AGS细胞由幽门螺杆菌SS1诱导,再经干酪乳酪杆菌HY001处理后抗炎因子IL-10水平与幽门螺杆菌组H.pyloriSS1相比增加。说明干酪乳酪杆菌HY001具有很好的改善幽门螺杆菌引起的炎症反应。
实验例11、抗生素敏感性实验
菌种制备:将干酪乳酪杆菌HY001用MRS液体培养基活化,37℃培养15h左右;采用纸片扩散试验法。将培养好的菌液充分振荡混匀,取1.6mL离心,菌泥用1.6mL稀释液洗两次,然后取250μL到厌氧管,用麦士比浊管比浊浊度0.5MC左右。取350μL菌液,用棉签涂满后。用无菌镊子取不同类型药敏片小心置于涂好菌液的平板上层,贴在相应的号上,轻压放置,静置片刻后,正置培养,37℃厌氧培养24h后,测量抑制圈直径大小。
抗生素敏感性试验被认为是益生菌安全性评价的必要选择标准。采用滤纸片扩散法测定干酪乳酪杆菌HY001的抗生素敏感性,结果见表9。根据实验结果可知:HY001对测试的15种抗生素均敏感,实验表明干酪乳酪杆菌HY001具有开发应用潜力。
实验例12、干酪乳酪杆菌HY001产生物胺实验
氨基脱羧酶试验培养基配比:蛋白胨5g、酵母浸膏3g、葡萄糖1g、蒸馏水 1000ml、1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1ml,琼脂1.8%,pH6.8,115℃高压灭菌20min。(添加氨基酸分别是L-精氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸)
将培养好的菌液按2%接种于1.6mL未添加前体氨基酸的氨基脱羧酶培养液中过夜培养;每个滤纸片滴加活化培养好的菌液,浸湿滤纸片,将无菌滤纸片放置于添加了前体氨基酸的改良氨基脱羧酶检测琼脂培养基,37℃培养2天。观察滤纸片周围透明圈是否发生颜色变化。若滤纸片周围颜色变成紫色,说明产生物胺,反之,则说明不产生生物胺。
实验结果如图4所示,下面一行的图片显示大肠杆菌产生碱性生物胺,其滤纸片周围的培养基由黄色变成紫色,上面一行的图片显示HY001周围没有发生颜色变化,这表明,HY001不产生生物胺,具有较好的安全性。
Claims (10)
1. 一种抗幽门螺杆菌干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001,其特征在于,其保藏编号为CGMCC NO.26837。
2. 保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001制备抗幽门螺杆菌药物或制备抑菌剂的用途。
3. 根据权利要求2所述的保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001制备抗幽门螺杆菌药物或制备抑菌剂的用途,其特征在于,所述抗幽门螺杆菌包括:抑制幽门螺杆菌生长、抑制幽门螺杆菌尿素酶活性、与幽门螺杆菌竞争性黏附胃癌细胞、改善幽门螺杆菌引起的炎症;
和/或,所述抑菌剂的抑菌谱包括:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗格森埃希菌、脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌、肺炎链球菌。
4. 根据权利要求3所述的保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001制备抗幽门螺杆菌药物或制备抑菌剂的用途,其特征在于,所述改善幽门螺杆菌引起的炎症指:抑制幽门螺杆菌诱导胃癌细胞分泌细胞因子;
和/或,所述胃癌细胞指:人胃癌细胞AGS;
和/或,所述免疫因子包括:TNF-α、IL-8。
5. 一种抗幽门螺杆菌药物,其特征在于,包括:药效活性成分;所述药效活性成分包括:保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001。
6.根据权利要求5所述的一种抗幽门螺杆菌的药物,其特征在于,还包括:药学上可接受的辅料。
7. 一种抑菌剂,其特征在于,包括:抑菌活性成分;所述抑菌活性成分包括:保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001。
8.根据权利要求7所述的一种抑菌剂,其特征在于,还包括:辅料。
9. 一种体外抑菌方法,其特征在于,采用保藏编号为CGMCC NO.26837的一种干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌株HY001抑菌。
10.根据权利要求9所述的一种体外抑菌方法,其特征在于,所述抑菌包括:抑制幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、弗格森埃希菌、脆弱拟杆菌、咽峡炎链球菌、肺炎链球菌。
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