CN117511783A - 一种霉鱼源清酒乳杆菌及其在接种发酵霉鱼中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种霉鱼源清酒乳杆菌，菌株的分类名称为：清酒乳杆菌JXNU1‑3(Lactobacillus sakei JXNU1‑3)，已于2023年10月07日提交中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址为：中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20231834。本申请中，发明人从传统发酵霉鱼中筛选获得一株清酒乳杆菌菌株，并将该菌株应用于低盐霉鱼接种发酵中。与传统自然发酵霉鱼相比，清酒乳杆菌接种发酵霉鱼的菌群组成中腐败菌相对丰度降低，感官品质和风味均较优，且挥发性盐基氮含量显著低于自然发酵霉鱼，提高了霉鱼的营养价值，该指标符合国家标准GB10136‑2015。本发明提供的清酒乳杆菌及其在接种发酵霉鱼中的应用。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，一种霉鱼源清酒乳杆菌及其在接种发酵霉鱼中的应用。
背景技术
霉鱼起源于江西，在永丰、吉安县等地区流行，形成了吉水霉鱼、乐安霉鱼、峡江霉鱼等品类。其历史悠久，口味独特，具有香、辣、咸、鲜，是极具代表的地方特色下酒菜。传统自然发酵的霉鱼色泽红亮，香辣咸鲜，口感紧实，回味悠长，具独特风味。
然而，传统自然发酵霉鱼的生产过程多依赖人工经验，导致产品质量参差不齐，口感与风味不稳定，氨基氮含量超标，食品的营养价值降低，存在食源性病源微生物污染导致的食品安全性风险，因而亟需对该工艺过程进行标准化关键技术调控，改善其产品品质与风味，保障其食品安全性。
值得注意的是，乳酸菌是最早应用于肉制品发酵中的菌种；接种发酵是一种改善食品风味、营养和品质的优良方法，在食品工业上具有广泛应用。乳酸菌在发酵过程中可形成乳酸等有机酸，迅速降低环境的pH，调节酸度，同时可产生抗菌物质，达到抑制腐败菌和致病菌等有害微生物生长的目的，降低挥发性盐基氮含量。此外，乳酸菌发酵可产生特殊的风味物质，赋予肉类典型特征、改善其感官品质，因此，有望应用到实际样品中。
发明内容
基于此，本发明的目的是提出一种霉鱼源清酒乳杆菌及其在接种发酵霉鱼中的应用，以解决目前传统自然发酵霉鱼的生产产品质量参差不齐，口感与风味不稳定，氨基氮含量超标，食品的营养价值降低存在食源性病源微生物污染导致的食品安全性风险等问题，从而制备出一种高品质发酵霉鱼产品，以促进传统淡水鱼制品的工业化和标准化生产。
根据本发明的第一方面，提供了一种清酒乳杆菌菌株，其特征在于，于2023年10月07日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 20231834菌株的分类名称为：清酒乳杆菌JXNU1-3(Lactobacillus sakeiJXNU1-3)。
进一步地，所述清酒乳杆菌菌株是由传统发酵霉鱼中分离筛选获得的。
根据本发明的第二方面，还提供了一种清酒乳杆菌的菌悬液。
进一步地，所述清酒乳杆菌菌悬液的制备工艺：
步骤1：将清酒乳杆菌JXNU1-3接种到MRS液体培养基中培养，得清酒乳杆菌JXNU1-3培养液；
步骤2：将步骤1所得清酒乳杆菌JXNU1-3培养液离心，弃上清，洗涤菌体，然后将洗涤后的菌体悬浮于灭菌生理盐水中，制成清酒乳杆菌JXNU1-3菌悬液；
步骤3：将步骤2的菌悬液离心，条件为4~10 ℃、7800 rmp/min、离心15分钟，用灭菌的0.85%的生理盐水洗涤1~3次，即得清酒乳杆菌菌悬液。
根据本发明的第三方面，还提供了一种清酒乳杆菌JXNU1-3在低盐、低挥发性盐基氮发酵霉鱼中的应用。
进一步地，所述接种发酵霉鱼的制备工艺为：
步骤1：取新鲜鳙鱼，去除鱼鳞，剖腹宰杀，去除内脏、鱼头和鱼尾，用流水清洗干净；
步骤2：将步骤1得到的鱼肉切成块状，添加食盐腌制，晾干，将清酒乳杆菌菌悬液均匀涂抹在鱼块的表面；
步骤3：2 h后，拌10%辣椒面，并逐块放人干净的陶瓷罐中，发酵1~7 d。
进一步地，在步骤2中用于涂抹的清酒乳杆菌菌悬液与鱼块的质量比为1.25:1000。
进一步地，在步骤2中所述清酒乳杆菌JXNU1-3菌悬液的菌浓度为105~108CFU/mL。
进一步地，在步骤2中所述食盐的添加量为1~5%。
进一步地，所述接种发酵霉鱼的挥发性盐基氮含量低于10mg/100g，符合国家标准GB10136-2015。
本发明的有益效果为：根据本发明从传统发酵霉鱼中筛选获得的一株清酒乳杆菌菌株，并将该菌株制成混悬液后应用于低盐霉鱼接种发酵中。由于清酒乳杆菌对腐败菌和致病菌的抑制作用，与传统自然发酵霉鱼相比，清酒乳杆菌接种发酵霉鱼的菌群组成中腐败菌相对丰度降低，感官品质和风味均较优，腐败菌显著降低，其色泽、质构、感官和风味指标均有改善，且挥发性盐基氮含量显著降低，有效提高了霉鱼的营养价值，从而可以制备出一种高品质发酵霉鱼产品，以促进传统淡水鱼制品的工业化和标准化生产，有望应用到实际样品中。
生物保藏信息：一株抑制致病菌的清酒乳杆菌菌株，菌株的分类名称为：清酒乳杆菌JXNU1-3(Lactobacillus sakeiJXNU1-3)，已于2023年10月07日提交中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址为：中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 20231834。
附图说明
图1自然发酵霉鱼和清酒乳杆菌接种发酵霉鱼切面对比图；
图2清酒乳杆菌接种发酵对霉鱼白度的影响；
图3清酒乳杆菌接种发酵霉鱼感官评价结果；
图4清酒乳杆菌接种发酵霉鱼电子鼻分析结果；
图5 清酒乳杆菌接种发酵霉鱼挥发性风味物质分析结果；
图6清酒乳杆菌接种发酵对霉鱼挥发性盐基氮的影响；
图7自然发酵霉鱼和清酒乳杆菌接种发酵霉鱼的菌群分析（门水平）；
图8自然发酵霉鱼和清酒乳杆菌接种发酵霉鱼的菌群分析（属水平）
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1 霉鱼源清酒乳杆菌的分离和鉴定
（1）霉鱼源清酒乳杆菌菌株的分离纯化及菌落形态特征
（a）MRS-溴甲酚紫固体培养基的制备：
配方（1L）：胰蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母粉10 g、番茄汁200 g、葡萄糖10 g、碳酸钙20 g、溴甲酚绿0.1 g、吐温-80 0.5 mL，琼脂18 g，pH6.0±0.2。培养基配制好后，121℃高压灭菌20 min，备用。
（b）乳酸菌的分离：
在无菌操作条件下，将传统发酵霉鱼鱼肉打成鱼糜，用灭菌生理盐水将鱼糜样品稀释至适当浓度，涂布于MRS-溴甲酚紫平板上，平板经封口后装入真空包袋装中，进行真空包装（0.07 MP，6 s），并倒置于恒温培养箱中进行培养（30℃，48 h）。挑取平板上周围呈黄色、有溶钙圈的菌落进行重复划线培养，至菌株纯化。通过革兰氏染色，完成对疑似乳酸菌菌株的初步筛选。
（2）清酒乳杆菌的筛选和鉴定：
清酒乳杆菌在MRS-溴甲酚紫平板上可形成独特的菌落特征，即周围黄色的菌落。在以上固体平板上，筛选符合清酒乳杆菌独特菌落特征的菌株，进行菌株鉴定。通过细菌基因组提取试剂盒提取该菌基因DNA，后续进行16 S rDNA序列鉴定，引物序列为：16 S rDNA-27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQ ID NO .1）、16 S rDNA-1492R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’，SEQ ID NO .2）。
通过MRS-溴甲酚紫培养基结合菌落形态观察和分子生物学鉴定方法，从霉鱼中分离得到一株清酒乳杆菌，并命名为JXNU1-3。
清酒乳杆菌JXNU1-3的16 S rDNA序列（CGGTGGGGGGGGTGCCTATACATGCAAGTCGAACGCACTCTCGTTTAGATTGAAGGAGCTTGCTCCTGATTGATAAACATTTGAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTAAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAAAACCTAACACCGCATGGTGTAGGGTTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTTAGGATGGACCCGCGGTGCATTAGTTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGACCGTGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGTATCTGATAGTAACTGATCAGGTAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTT）SEQ IDNO .3
实施例2 清酒乳杆菌JXNU1-3的活化培养
（1）MRS培养基制备：按照20 g/L葡萄糖，10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母膏，10 g/L牛肉膏，1 mL吐温80，2 g/L磷酸氢二钾，2 g/L柠檬酸二铵，5 g/L乙酸钠，0.58 g/L七水硫酸镁，0.25 g/L四水硫酸锰，称取这些原料，混合均匀，将得到的混合物混溶于去离子水中，得到的溶液在温度121℃下灭菌20 min，得到所述的MRS培养基。
（2）活化菌株：将冷冻保存的清酒乳杆菌划线接种于含有2%琼脂步骤（1）中得到的MRS培养基中，在温度37 ℃下恒温培养24 h，挑取单菌落于步骤（1）得到的MRS培养基中培养24 h。
（3）菌株培养：按照MRS培养基重量计2%接种量，把步骤（2）中的活化菌株添加到步骤（1）得到的MRS培养液中，在恒温培养箱中，在温度为37 ℃的条件下培养24 h，连续传代两次，得到清酒乳杆菌培养液。
（4）菌液制备：将步骤（3）得到的清酒乳杆菌培养液于4 ℃，7800 rmp/min下离心15分钟，用灭菌0.85%生理盐水洗涤2-3次，然后把洗涤的菌体悬浮于灭菌生理盐水中，制成105~ 108CFU/mL清酒乳杆菌菌悬液。
实施例3 清酒乳杆菌JXNU1-3在接种发酵霉鱼生产中的应用
参照国家食品风险评估中心的《可用于食品的菌种名单》，将清酒乳杆菌JXNU1-3菌悬液均匀涂抹在新鲜鱼块中进行后续的发酵霉鱼的制备。
（1）自然发酵霉鱼的制备
取新鲜鳙鱼，除去鱼鳞，剖腹宰杀，去除内脏、鱼头和鱼尾，用流水清洗干净；切成宽二寸长四寸块状，晾干，放入盆中，加食用盐（1%~5%）拌匀，腌制2 小时；鱼块晾干后，按照10%的比例加辣椒粉，拌匀，并逐块放入干净的陶瓷罐中，室温条件下发酵1~7 天。
（2）清酒乳杆菌JXNU1-3接种发酵霉鱼的制备
将实施例2中已活化好的清酒乳杆菌菌悬液按每1.00 kg鱼块添加1.25 g菌悬液的质量比，均匀涂抹在鱼块的表面。拌入辣椒粉，放入干净的陶瓷罐中，室温条件下发酵1~7天。
（3）发酵结束后，将霉鱼取出，测定鱼肉色泽、质构和风味，同时建立由10人组成的感官评定小组，对霉鱼进行感官评价，每个样品设置3个平行。评价指标为鱼肉色泽、气味、组织状态、滋味、口感，评价标准见表1，结果取平均值。
请参阅图3、4、5，表3结果表明，从传统霉鱼中分离得到的清酒乳杆菌JXNU1-3作为发酵菌株,，进行霉鱼的发酵，随着发酵天数的增加，鱼肉的发酵气味、口感和滋味逐渐变好，但到第5天之后开始降低。在同一发酵天数的情况下，随盐浓度的升高，滋味和口感开始变差，原因是加入的盐太多使人口感不适，而2%盐浓度的口感最佳。
综合色泽、气味、组织状态、滋味、口感五个指标，发酵3天，盐浓度为2%的接种发酵霉鱼的评分最高，其次是相同条件下的传统发酵的霉鱼。由此可见，接种发酵可改善霉鱼制品的感官。
请参阅图6，电子鼻分析结果显示，自然、接种发酵臭鳜鱼在发酵过程中的挥发性物质均在不断地变化，清酒乳杆菌接种发酵对霉鱼风味物质形成具有明显影响，比自然发酵霉鱼挥发性成分种类多，在一定程度上降低腥味和酸臭味，并产更多样化的酯类化合物，赋予霉鱼更浓郁的酯香、甜香，对产品风味具有提升作用。
实施例4 清酒乳杆菌JXNU1-3接种发酵降低霉鱼产品挥发性盐基氮含量
需要说明的是，挥发性盐基氮是动物性食品在腐败过程中，由于酶和细菌的作用，使蛋白质分解产生的氨以及胺类等碱性含氮物质。其含量越高，表明食品的营养价值降低越多。GB10136-2015食品安全国家标准动物性水产制品中规定腌制生食动物性水产品挥发性盐基氮的含量≤25mg/100g，预制动物性水产制品（不含干制品和盐渍制品）挥发性盐基氮的含量≤30mg/100g。
请参阅附图6，随着发酵时间的延长，接种发酵霉鱼和自然发酵霉鱼的挥发性盐基氮含量逐渐升高，相比而言，接种发酵霉鱼的挥发性盐基氮含量较自然发酵霉鱼的含量低；当发酵3天后，自然发酵霉鱼的挥发性盐基氮含量继续上升，而接种发酵霉鱼的挥发性盐基氮含量显著下降，说明清酒乳杆菌JXNU1-3接种发酵可有效降低霉鱼产品挥发性盐基氮含量，从而提高营养价值含量，产品符合符合国家标准GB10136-2015，有望应用到实际样品中。
实施例5 清酒乳杆菌JXNU1-3接种发酵降低霉鱼产品腐败菌的相对丰度
请参阅附图7（门水平）、8（属水平），发酵3天后，在门水平上，清酒乳杆菌JXNU1-3接种发酵霉鱼的放线菌门相对丰度显著高于自然发酵霉鱼，研究表明放线菌和抗菌活性相关。在属水平上，进一步的，微生物绝对定量分析结果显示，在传统发酵霉鱼中检测到腐败菌—黄单胞菌属、肠杆菌属和Romboutsia菌属，以上菌属在接种发酵霉鱼样品中均未检测出；此外，有益菌如：Lactobacillus、Lactococcus、Akkermansia在接种发酵霉鱼中的相对丰度相比传统发酵霉鱼中的含量较高。接种发酵可抑制腐败菌和病原菌的生长，降低食源性病源微生物污染导致的食品安全性风险。其机制可能为有益菌Lactobacillus和Lactococcus为产酸细菌，使样品pH值降低，抑制腐败菌生长，因此在接种发酵霉鱼中未检测到黄单胞菌属、肠杆菌属和Romboutsia菌属。
综上所述，根据本发明从传统发酵霉鱼中筛选获得的一株清酒乳杆菌菌株，并将该菌株制成混悬液后应用于低盐霉鱼接种发酵中。由于清酒乳杆菌对腐败菌和致病菌的抑制作用，与传统自然发酵霉鱼相比，清酒乳杆菌接种发酵霉鱼的菌群组成中腐败菌相对丰度降低，感官品质和风味均较优，且挥发性盐基氮含量显著降低，有效提高了霉鱼的营养价值，从而可以制备出一种高品质发酵霉鱼产品，以促进传统淡水鱼制品的工业化和标准化生产，有望应用到实际样品中。
尽管本发明的描述已经相当详尽且特别对几个所述实施例进行了描述，但其并非旨在局限于任何这些细节或实施例或任何特殊实施例，而是应当将其视作是通过参考所附权利要求考虑到现有技术为这些权利要求提供广义的可能性解释，从而有效地涵盖本发明的预定范围。此外，上文以发明人可预见的实施例对本发明进行描述，其目的是为了提供有用的描述，而那些目前尚未预见的对本发明的非实质性改动仍可代表本发明的等效改动。
表 1感官评价评分表
表 2PEN3 型电子鼻的标准传感器信息
表 3清酒乳杆菌接种发酵对霉鱼质构的影响
Claims (10)
1.一种清酒乳杆菌菌株，其特征在于，于2023年10月07日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 20231834，菌株的分类名称为：清酒乳杆菌JXNU1-3(Lactobacillus sakei JXNU1-3)。
2.根据权利要求1所述的一种清酒乳杆菌菌株，其特征在于，所述清酒乳杆菌菌株是由传统发酵霉鱼中分离筛选获得的。
3.含有权利要求1所述清酒乳杆菌的菌悬液。
4.根据权利要求3所述的清酒乳杆菌菌悬液，其特征在于，所述清酒乳杆菌菌悬液的制备工艺：
步骤1：将清酒乳杆菌JXNU1-3接种到MRS液体培养基中培养，得清酒乳杆菌JXNU1-3培养液；
步骤2：将步骤1所得清酒乳杆菌JXNU1-3培养液离心，弃上清，洗涤菌体，然后将洗涤后的菌体悬浮于灭菌生理盐水中，制成清酒乳杆菌JXNU1-3菌悬液；
步骤3：将步骤2的菌悬液离心，条件为4~10 ℃、7800 rmp/min、离心15分钟，用灭菌的0.85%的生理盐水洗涤1~3次，即得清酒乳杆菌菌悬液。
5.权利要求1所述的一种清酒乳杆菌JXNU1-3在接种发酵霉鱼中的应用。
6.根据权利要求5所述的一种清酒乳杆菌JXNU1-3在接种发酵霉鱼中的应用，其特征在于，所述接种发酵霉鱼的制备工艺为：
步骤1：取新鲜鳙鱼，去除鱼鳞，剖腹宰杀，去除内脏、鱼头和鱼尾，用流水清洗干净；
步骤2：将步骤1得到的鱼肉切成块状，添加食盐腌制，晾干，将清酒乳杆菌菌悬液均匀涂抹在鱼块的表面；
步骤3：2 h后，拌入10%辣椒面，并逐块放进干净的陶瓷罐中，发酵1~7 d。
7.根据权利要求5所述的一种清酒乳杆菌JXNU1-3在接种发酵霉鱼中的应用，其特征在于，在步骤2中用于涂抹的清酒乳杆菌菌悬液与鱼块的质量比为1.25:1000。
8.根据权利要求5所述的一种清酒乳杆菌JXNU1-3在接种发酵霉鱼中的应用，其特征在于，在步骤2中所述清酒乳杆菌JXNU1-3菌悬液的菌浓度为105 ~108 CFU/mL。
9.根据权利要求5所述的一种清酒乳杆菌JXNU1-3在接种发酵霉鱼中的应用，其特征在于，在步骤2中所述食盐的添加量为1~5%。
10.根据权利要求5所述的一种清酒乳杆菌JXNU1-3在接种发酵霉鱼中的应用，其特征在于，所述接种发酵霉鱼的挥发性盐基氮含量低于10mg/100g，符合国家标准GB10136-2015。
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