CN117500477A - 具有包含与壳聚糖共交联的多糖的基质的生物相容性产品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有交联基质的生物相容性产品，其中多糖与壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐共交联，所述基质进一步包含二价锌阳离子。

Description

具有包含与壳聚糖共交联的多糖的基质的生物相容性产品

技术领域

本发明涉及用于美容和/或医疗，特别是外科目的的生物相容性产品的领域。具体而言，本发明涉及具有包含多糖的基质的生物相容性产品，该多糖至少部分地与壳聚糖，优选壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐共交联。

多年来，在化妆品和医学领域中，人们对用于填充、替换或增加生物组织的体积和/或替换或补充生物流体的产品越来越感兴趣。

因此，例如，使用能够增加生物组织体积的产品在化妆品领域特别令人感兴趣，用于治疗细纹和皱纹，而且还用于重新定义面部和身体的轮廓。

用于生物组织的体积增大、填充、替换或者生物流体的替换或补充的产品也可用于医学领域。

设计用于补充患有关节退行行变的患者的滑液的产品例如是现有技术中已知的。此类产品最常见地包含透明质酸。

如US 4,716,154中所述，在眼科手术中用于替换或补充房水(在白内障手术期间或在屈光手术的框架中)或玻璃体液(在玻璃体切除术的情况下)的所谓“粘弹性”产品也是已知的。

产品的流变性质特别重要。

一定数量的生物相容性产品，特别是包含交联透明质酸或交联透明质酸的盐的产品，已经使得填充、替换或增加生物组织的体积和/或替换或补充生物流体成为可能。然而，其中一些由于其不期望的副作用和/或其功效弱而不能有效地用于美容或医学领域。

这些产品中的一些产品的功效可以通过赋予它们更高的流变特性并且还通过限制它们的流变特性退化的风险来改进。

特别地，对于许多应用来说，产品表现出高粘度是有用且重要的，尤其是在低剪切速率下。

具有交联透明质酸或交联透明质酸的盐的基质的产品在交联后表现出相对令人满意的粘度。

然而，这些产品的粘度在完成热处理之后趋于急剧降低。然而，这些产品在用于人类或动物之前必须进行灭菌，这通常通过热处理(例如在高压灭菌器中)来实现。

US 10,898,613 B2描述了交联透明质酸的生物相容性可注射水凝胶组合物，其含有0.05mM至4mM二价锌阳离子，以在高压灭菌后赋予改善的稳定性(通过粘度参数评估)。

FR 3 096 260 A1描述了羧甲基壳聚糖与乙酰透明质酸的共交联，其目的是将乙酰透明质酸的公认的保湿特性与壳聚糖的针对氧化应激的保护特性结合起来。

具体实施方式

本发明提出的任务是提供一种生物相容性产品，其允许更好地填充、替换、增加生物组织的体积和/或替换或补充生物流体。

同时，本发明旨在提供这样的产品，其表现出改进的流变性质，特别是在使用热处理(诸如高压灭菌器灭菌)之后的粘度方面。

为了实现这些和其他目标，本发明提出了根据权利要求1所述的生物相容性产品。

本发明意义上的“生物相容性产品”是指能够被活体良好耐受并且不会对活体的生物功能造成排斥反应、毒性反应、损伤或有害影响的任何产品。

“壳聚糖衍生物”意指表现出D-葡糖胺和/或N-乙酰基-D-葡糖胺单元的取代的取代的壳聚糖，并且其中取代基团以共价方式键合。

申请人发现多糖(选自包含透明质酸、透明质酸的盐、硫酸软骨素、纤维素衍生物及其混合物的组)与壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐的共交联导致多糖与壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐之间在基质中建立共价键，从而与交联多糖相比使得产品的粘度显著增加。然而，申请人还发现，在热处理(诸如高压灭菌)之后，所述共交联产物的粘度仍然高度容易退化。

在这种情况下，申请人惊奇地发现多糖(选自包含透明质酸、透明质酸的盐、硫酸软骨素、纤维素衍生物及其混合物的组)与壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐的交联，结合二价锌阳离子的存在，不仅显著增加了产品的粘度，而且有效地限制了热处理(诸如高压灭菌)后粘度的降低。此外，粘度的这种较小的降低预示着改进的耐用性以及对填充、替换、增加生物组织的体积和/或替换、补充生物流体的更好的适用性。

根据第一种可能性，二价锌阳离子可以通过添加锌糖来引入以在基质中交联。出于本发明的目的，“在基质中交联”意指通过至少两个共价键与基质的至少一种成分键合。

根据另一种可能性，二价锌阳离子可以通过添加待接枝到基质中的锌糖来引入。出于本发明的目的，“接枝到基质中”意指通过共价键连接至基质的至少一种成分。

根据又一种可能性，二价锌阳离子可优选地分散在基质中。“分散在基质中”应理解为意指不存在与基质成分的共价键合。二价锌阳离子在基质中的分散体在粘度方面产生了优异的结果。此外，制备方法比为了交联或接枝目的而添加的情况更简单，因为锌(以锌的盐的形式，或者特别是以锌糖的形式)在交联或接枝所需的pH范围内表现出相对差的溶解性。

有利地，为了良好地增加粘度，基质中二价锌阳离子的浓度相对于基质的总重量可以为按重量计0.001％与1％之间，优选相对于基质的总重量为按重量计0.01％与1％之间。

优选地，为了保持产品的良好透明度以用于需要它的应用(特别是在眼科领域或用于靠近皮肤表面的注射)，基质中二价锌阳离子的浓度相对于基质的总重量可以为按重量计小于或等于0.1％。

有利地，基质中二价锌阳离子的浓度相对于基质的总重量可以为按重量计0.002％与0.06％之间，优选相对于基质的总重量为按重量计001％与06％之间。对于此类浓度，申请人非常惊讶但也非常感兴趣地注意到，根据本发明的产品在热处理(诸如高压灭菌)之后的粘度仍然很高，可以接近其在热处理之前的粘度，或者甚至可以高于热处理之前的粘度。

优选地，可以通过添加锌的盐或锌糖盐，优选葡萄糖酸锌、氯化锌或硫酸锌，将所述二价锌阳离子包含在所述基质中。葡萄糖酸锌有助于获得具有良好透明度的产品，特别是对于需要它的应用(特别是在眼科领域或用于靠近皮肤表面的注射)。氯化锌和硫酸锌也已被证明可用于风湿病、骨科手术、骨关节炎的治疗或软骨缺损的修复。

有利地，可以规定：

-选自包含透明质酸、透明质酸的盐、硫酸软骨素、纤维素衍生物及其混合物的组的多糖的浓度相对于基质的总重量为按重量计0.01％与3％之间，和/或

-基于基质的总重量，壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐的浓度为按重量计0.01％与3％之间。

优选地，壳聚糖衍生物可以是羧烷基壳聚糖。特别是使用羧甲基壳聚糖获得了良好的结果。

羧基烷基壳聚糖是指具有羧基烷基取代的葡糖胺单元、N-乙酰基葡糖胺单元和葡糖胺单元的壳聚糖。这被称为壳聚糖衍生物或取代的壳聚糖。

有利地，多糖可以是透明质酸或透明质酸的盐，并且可以优选地表现出0.1MDa与5MDa之间的分子量。

根据本发明的另一个方面，提出了一种化妆品或药物组合物，该化妆品或药物组合物包含前述的生物相容性产品。该化妆品或药物组合物可以是粘弹性溶液或水凝胶的形式。

有利地，化妆品或药物组合物可包含生理学上可接受的缓冲剂，优选含有多元醇(甘露醇、山梨醇、甘油)和/或磷脂。

优选地，所述组合物可用于美容或治疗性处理方法，具体包括局部施用、植入、滴注或皮下、皮内、粘膜、眼、眼内或关节内注射所述组合物。

有利地，所述组合物可用于预防和/或治疗可通过以下方式改善或避免的病理状况：

-填充或替换生物组织；以及/或者

-增加所述生物组织的体积；以及/或者

-补充或替换生物流体。

优选地，所述组合物可用于治疗骨关节炎或用于修复软骨缺损的方法，其中所述组合物例如被配制用于通过注射施用存在于滑液中或与血液混合后植入软骨中，或用于治疗干眼的方法。

有利地，所述组合物可用于治疗、外科或美容治疗方法，具体包括风湿病学、眼科、妇科、美容医学、整形外科、内科手术、整形外科手术中的治疗，用于预防术后组织粘连以及皮肤病学。

更特别优选地，所述组合物可用于治疗干眼综合征、角膜损伤或眼部或关节炎症。

有利地，所述组合物可用于治疗性处理，在所述治疗性处理期间，通过滴注将所述组合物施用于眼表面以预防或对抗角膜损伤或干眼综合征，特别是具有润滑或再生眼表面的目的。

根据本发明的另一个方面，提出了一种滴眼剂组合物，该滴眼剂组合物包含前述的生物相容性产品。

根据本发明的另一方面，提出了一种用于制备前述生物相容性产品或前述组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.溶解在相同的水溶液中：

i.选自包含透明质酸、透明质酸的盐、硫酸软骨素、纤维素衍生物及其混合物的组的多糖，优选透明质酸或透明质酸的盐；

ii壳聚糖，优选壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐；

b.将交联剂添加到所述水溶液中并引发混合物的交联以形成基质；

c.在步骤b之前和/或之后添加二价锌阳离子。

应当指出的是，本发明不限于特定的共价交联方法，而是使用化学分子作为交联剂的方法，诸如特别是1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)或聚(乙二醇)二缩水甘油醚(PEGDE)可能是优选的。

当在步骤b之前添加二价锌阳离子时，考虑到基质中的交联和/或接枝，这种添加可以是锌糖的形式，或者可以是待分散在基体中的锌的盐的形式。

当在步骤b之后添加二价锌阳离子时，该添加以分散在基质中的锌的盐或锌糖的形式进行。

可以组合前面两种添加二价锌阳离子的可能性。

有利地，生物相容性产品或组合物的pH可调节至6与8之间，优选7。

优选地，可以对所述生物相容性产品或组合物进行灭菌热处理，优选在120℃与140℃之间的温度下进行热处理时间在1分钟与20分钟之间。

本领域技术人员在阅读解释性描述后将清楚本发明的进一步的目标、特征和优点，该解释性描述涉及实例和实施例，这些实例和实施例仅以说明的方式给出并且决不限制权利要求书的范围。

实例和实施例形成本发明的组成部分，并且从整个描述(包括实例和实施例)中相对于任何现有技术显得新颖的任何特征在其功能和整体上形成本发明的组成部分。

因此，每个实例和实施例的范围是广泛的。

此外，在实例或实施例中，除非另有说明，所有百分比均以质量给出；除非另有说明，温度以摄氏度表示；除非另有说明，压力为大气压。

附图说明

通过下面结合附图对特定实施例的描述，本发明的进一步的目的、特征和优点将变得显而易见，其中：

[图1]图1是在热处理之前和之后测量的不同制剂的粘度的直方图；并且

[图2]图2是示出作为剪切速率的函数的市场上不同制剂和产品的粘度的变化的曲线图。

优选实施例的描述

材料；

-来自生物发酵的透明质酸钠(NaHa)；

-乙酰化度小于10％(表示为N-乙酰氨基葡萄糖单元的摩尔数相对于总单元的摩尔数)、取代度为80％(表示为N-乙酰氨基葡萄糖单元的摩尔数相对于总单元的摩尔数)的羧甲基壳聚糖(CMCS)；

-1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)；

-聚(乙二醇)二缩水甘油醚(PEGDE)；

-葡萄糖酸锌(ZnGluc)；

-氯化锌(ZnCl2)；

-硫酸锌(ZnSO₄)；

-氯化钠(NaCl)；

-生理缓冲剂；

-盐酸(HCl)；

-氢氧化钠(NaOH)；

-透析膜。

生理缓冲溶液的制备

在去离子水中制备生理缓冲溶液以实现6与8之间的pH和250mOsm/L与350mOsm/L之间的渗透压。

包含多糖(也就是说，透明质酸或透明质酸的盐)的交联相的合成

为了简化读者的理解，透明质酸或透明质酸的盐被称为“HA”。

HA的交联是通过将HA(例如，透明质酸钠(NaHa))溶解在0.25mol/L苏打水溶液中直至完全溶解来实现的。然后添加交联剂(例如，BDDE或PEGDE)并搅拌以均质化。将混合物密封并置于50℃水浴中3小时以引发HA的交联反应。从而在交联剂与HA之间形成共价键。因此，可以在两条HA链之间形成桥。然后在容器中加入盐酸水溶液对凝胶进行均质化和中和，形成均质、透明的相。然后进行透析以消除残留的交联剂并稳定pH和渗透压。

包含壳聚糖或壳聚糖的盐的多糖(也就是说，透明质酸或透明质酸的盐)的交联相 的合成

为了简化读者的理解，透明质酸或透明质酸的盐被称为“HA”，而壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐被称为“CHITO”。

HA与CHITO的交联是通过将HA(例如，透明质酸钠(NaHa))和“CHITO”(例如，羧烷基壳聚糖)溶解在0.25mol/L苏打水溶液中直至完全溶解来实现的。然后添加交联剂(例如，BDDE或PEGDE)并搅拌以均质化。将混合物密封并置于50℃水浴中3小时以引发HA和CHITO同时交联反应(或共交联)。“同时交联”或“共交联”意指可以在交联剂与HA之间产生共价键，然而在交联剂与CHITO之间同样如此。因此，可以在两条HA链之间、两条CHITO链之间、或者一条HA链与一条CHITO链之间形成桥。然后在容器中加入盐酸水溶液对凝胶进行均质化和中和，形成均质、透明的相。然后进行透析以消除残留的交联剂并稳定pH和渗透压。

多糖(也就是说，透明质酸或透明质酸的盐)与二价锌阳离子(以及，如果合适的 话，壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐)的线性相(非交联)的合成

为了简化读者的理解，透明质酸或透明质酸的盐被称为“HA”，而壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐被称为“CHITO”。

将单独施用或与CHITO一起施用的HA溶解在生理缓冲溶液中直至完全溶解以形成透明粘弹性溶液。二价锌阳离子可以通过掺入(通过分散)在锌的盐或锌糖(特别是葡萄糖酸锌、氯化锌或硫酸锌)的溶液中来添加。混合物使得锌的盐能够在线性相中溶解并均质化。

热处理

每种制剂经受对应于灭菌循环的热处理。该热处理在来自HMC EUROPE的HMT260MB实验室高压灭菌器中进行。灭菌平台持续1分钟，温度设置为131℃。热处理的总持续时间(包括升温、稳定和冷却)约为22分钟至23分钟。

粘度测量方法

使用来自TA Instruments的Discovery“DHR2”混合流变仪进行流变表征，该流变仪配备有直径为40mm、角度为2度的锥板几何结构以及55微米的截断。流变仪还配备有珀耳帖板，用于在测量过程中控制样品的温度。

在测量期间，将样品放置在底板上并且降低几何结构直到达到修整间隙(105μm)。用抹刀除去多余的产品。然后将下板的几何结构降低至55μm。

所使用的方法包括在35℃下的流动斜坡，应用在1s^-1与1000s^-1之间变化的剪切速率，每十年5个点。

然后从对应于8.6s^-1的剪切速率的粘度值获取用于比较不同制剂的粘度。

测试1：配制具有交联HA基质且基质中不存在二价锌阳离子的生物相容性产品

制备包含交联HA相的HA制剂。HA的最终浓度相对于基质的总重量为按重量计0.9％。

如前所述制备HA的交联相。

首先，称取1.12g透明质酸钠(NaHa)并溶解在8.7g0.25mol/L苏打水溶液中。完全溶解后，将交联剂滴加到溶液中。进行混合以使反应介质均质化并实现均质交联。然后将含有混合物的容器密封并置于50℃水浴中3小时。然后将凝胶在2℃与8℃之间下保存直至第二天。

第二天，收集9.58g凝胶并置于均化器中，向其中添加87.4g浓缩至24mmol/L的盐酸(HCl)。通过剪切混合物使介质均质化，从而导致膨胀并快速中和pH值。收集以此方式均质和中和的介质，然后将其转移至使用钳子封闭的透析膜，然后将所述膜置于缓冲溶液中至少24小时。

由此获得的具有交联基质的生物相容性产品的密度约为1，然后将其转移至1mL玻璃注射器中。

然后，通过在131℃下用灭菌平台高压灭菌1分钟，对玻璃注射器进行如前所述的热处理。热处理的总持续时间(包括升温、稳定和冷却)约为22分钟至23分钟。

如上所述测量获得的具有交联基质的生物相容性产品(制剂1)的粘度。

测试2：配制具有交联HA基质且基质中存在一种二价锌阳离子的生物相容性产品

制备具有HA基质的HA制剂，其包含90％HA交联相和10％非交联(线性)相。基于基质的总重量，HA浓度为按重量计0.9％。通过分散在基质中添加二价锌阳离子。

HA的交联相如先前结合测试1所述来制备。

同时，如前所述制备线性相。

称取0.21g透明质酸钠(NaHa)，向其中添加20.0g缓冲溶液，并进行混合。

然后将交联相和线性(非交联)相以9∶1的比例混合。通过将葡萄糖酸锌掺入溶液中(通过分散体)将二价锌阳离子添加到基质中。混合物使得锌的盐能够在线性相中溶解并均质化。

应用多种浓度的二价锌阳离子，即：相对于基质的总重量按重量计0.0022％(制剂2a)、0.0072％(制剂2b)和0.0144％(制剂2c)。

获得的具有交联基质的生物相容性产品的密度约为1，然后将其转移至1mL玻璃注射器中。

然后，通过在131℃下用灭菌平台高压灭菌1分钟，对玻璃注射器进行如前所述的热处理。热处理的总持续时间(包括升温、稳定和冷却)约为22分钟至23分钟。

如前所述测量获得的具有交联基质的生物相容性产品(制剂2a、2b和2c)的粘度。

测试3：配制具有共交联HA和CHITO基质且基质中存在一种二价锌阳离子的生物相容性产品

制备包含90％共交联的HA-CHITO相的HA和CHITO制剂。基于基质的总重量，HA和CHITO浓度分别为按重量计0.9％和0.1％。

HA-CHITO交联相制备如下。

首先，称量2.00g透明质酸钠(NaHa)。接下来，称取0215g羧甲基壳聚糖并将其添加到透明质酸钠中。将羧甲基壳聚糖和透明质酸钠的混合物溶解在20g0.25mol/L苏打水溶液中。完全溶解后，将交联剂滴加到溶液中。进行混合以使反应介质均质化并实现均质共交联(或同时交联)。然后将含有混合物的容器密封并置于50℃水浴中3小时。然后将凝胶在2℃与8℃之间下保存直至第二天。

第二天，收集22.02g凝胶并置于均化器中，向其中添加175.4g浓缩至28mmol/L的盐酸(HCl)水溶液。通过剪切混合物使介质均质化，从而导致膨胀并快速中和pH值。收集以此方式均质和中和的介质，然后将其转移至使用钳子封闭的透析膜，然后将所述膜置于缓冲溶液中至少24小时。

同时，如前所述，用HA和CHITO制备线性相。

将0.20g透明质酸钠(NaHa)和22mg羧甲基壳聚糖混合，向其中添加20.0g缓冲溶液。获得混合物。

然后将交联相和线性(非交联)相以9∶1的比例混合。

获得的具有交联基质的生物相容性产品的密度约为1，然后将其转移至1mL玻璃注射器中。

然后，通过在131℃下用灭菌平台高压灭菌1分钟，对玻璃注射器进行如上所述的热处理。热处理的总持续时间(包括升温、稳定和冷却)约为22分钟至23分钟。

如上所述测量获得的具有交联基质的生物相容性产品(制剂3)的粘度。

测试4：通过添加葡萄糖酸锌配制具有共交联HA和CHITO基质且基质中存在一种二价锌阳离子的生物相容性产品

制备HA和CHITO的制剂，该制剂包含90％共交联的HA-CHITO相和10％非交联(线性)HA-CHITO基相。基于基质的总重量，HA和CHITO浓度分别为按重量计0.9％和0.1％。

HA-CHITO交联相如先前结合测试3所述来制备。

同时，如先前结合测试3所述制备具有HA和CHITO的线性相，不同之处在于在透明质酸钠(NaHa)和羧甲基壳聚糖完全溶解后，通过掺入葡萄糖酸锌溶液(通过分散体)将二价锌阳离子添加到基质中。混合使得所述锌的盐能够在线性相中溶解并均质化。

应用多种浓度的二价锌阳离子，即：相对于基质的总重量按重量计0.0072％(制剂4a)和0.0144％(制剂4b)。

然后将交联相和线性(非交联)相以9∶1的比例混合。

由此获得的具有交联基质的生物相容性产品的密度约为1，然后将其转移至1mL玻璃注射器中。

然后，通过在131℃下用灭菌平台高压灭菌1分钟，对玻璃注射器进行如上所述的热处理。热处理的总持续时间(包括升温、稳定和冷却)约为22分钟至23分钟。

如前所述测量获得的具有交联基质的生物相容性产品(制剂4a和4b)的粘度。

测试5：通过添加氯化锌配制具有共交联HA和CHITO基质且基质中存在一种二价锌阳离子的生物相容性产品

制备具有HA-CHITO基质的HA和CHITO的制剂，其包含90％共交联的HA-CHITO相和10％非交联(线性)相。基于基质的总重量，HA和CHITO浓度分别为按重量计0.9％和0.1％。

HA-CHITO交联相如先前结合测试4所述来制备。

同时，如先前结合测试4所述制备具有HA和CHITO的线性相，不同之处在于在透明质酸钠(NaHa)和羧甲基壳聚糖完全溶解后，通过掺入氯化锌溶液(ZnCl₂)(通过分散体)将二价锌阳离子添加到基质中。混合使得所述锌的盐能够在线性相中溶解并均质化。

应用多种浓度的二价锌阳离子，即：相对于基质的总重量按重量计0.0072％(制剂5a)、0.0144％(制剂5b)和0.048％(制剂5c)。

然后将交联相和线性(非交联)相以9∶1的比例混合。

由此获得的具有交联基质的生物相容性产品的密度约为1，然后将其转移至1mL玻璃注射器中。

然后，通过在131℃下用灭菌平台高压灭菌1分钟，对玻璃注射器进行如上所述的热处理。热处理的总持续时间(包括升温、稳定和冷却)约为22分钟至23分钟。

如上所述测量获得的具有交联基质的生物相容性产品(制剂5a、5b和5c)的粘度。

测试6：通过添加硫酸锌配制具有共交联HA和CHITO基质且基质中存在一种二价锌阳离子的生物相容性产品

制备具有HA-CHITO基质的HA和CHITO的制剂，其包含90％共交联的HA-CHITO相和10％非交联(线性)相。基于基质的总重量，HA和CHITO的浓度分别为按重量计0.9％和0.1％。

HA-CHITO的交联相如先前结合测试4所述来制备。

同时，如先前结合测试4所述制备具有HA和CHITO的线性相，不同之处在于在透明质酸钠(NaHa)和羧甲基壳聚糖完全溶解后，通过掺入硫酸锌溶液(ZnSO₄)(通过分散体)将二价锌阳离子添加到基质中。混合使得所述锌的盐能够在线性相中溶解并均质化。

应用多种浓度的二价锌阳离子，即：相对于基质的总重量按重量计0.0072％(制剂6a)、0.0144％(制剂6b)和0.0360％(制剂6c)。

然后将交联相和线性(非交联)相以9∶1的比例混合。

由此获得的具有交联基质的生物相容性产品的密度约为1，然后将其转移至1mL玻璃注射器中。

然后，通过在131℃下用灭菌平台高压灭菌1分钟，对玻璃注射器进行如上所述的热处理。热处理的总持续时间(包括升温、稳定和冷却)约为22分钟至23分钟。

如上所述测量获得的具有交联基质的生物相容性产品(制剂6a、6b和6c)的粘度。

热处理之前和之后粘度的测量

如上所述，使用来自TA Instruments的Discovery“DHR2”混合流变仪在应用上述热处理(通过在131℃温度下持续1分钟的平台灭菌，包括升温、平台和冷却的总热处理时间约为22分钟至23分钟)之前和之后测量制剂1、2a至2c、3、4a、4b、5a至5c以及6a至6c的粘度。

[表1]热处理之前和之后的粘度结果

这些结果使用直方图以图形方式显示在图1中。横坐标显示测试的制剂，而纵坐标显示测量的粘度(以cP为单位)。热处理之前的粘度显示为实心条，而热处理之后的粘度显示为阴影条。

基于制剂1和2a至2c的第一个观察结果是，如果二价锌阳离子的添加显著增加HA交联基质的粘度，则在热处理之后仍然存在显著的粘度损失。该损失似乎几乎恒定(在本实例中基本上等于400cP)并且与二价锌阳离子浓度无关。

基于制剂1和3的第二个观察结果是，HA和CHITO的共交联非常显著地增加了热处理之前和之后的基质粘度。然而，热处理之后粘度仍然显著下降(-80％)。

基于制剂4a、4b、5a至5c以及6a至6c的第三个观察结果是，基于基质的总重量，在HA和CHITO的共交联基质中以按重量计0.002％与0.06％之间的相对低浓度添加二价锌阳离子使得基质在热处理之后能够保持比制剂3(HA和CHITO的共交联基质，不含二价锌阳离子)更高的粘度(至少两倍高)。

因此，以0.001％与1％之间的浓度将二价锌阳离子添加到HA和CHITO的共交联基质中使得可以同时获得高得多的基质粘度并大大减少热处理之后的粘度损失。

更具体地基于制剂4b、5a至5c、6b和6c的第四个观察结果是，将二价锌阳离子以大约0.005％与大约0.06％之间的浓度添加到HA和CHITO的共交联基质中使得热处理之后的粘度几乎与热处理之前的粘度(制剂5a、5b)相同，或者甚至高于热处理之前的粘度(制剂4b、5c、6b和6c)。

最后的观察结果是非常令人惊讶的：通常，交联基质的热处理往往会降低所述基质的内聚力并因此降低其粘度。这种意想不到的现象甚至可能导致“粘度反转”(意味着热处理之后基质的粘度比热处理之前更高)，因此对于需要对包含生物相容性产品的组合物进行灭菌的所有应用来说是特别有利的，特别是用于美容或治疗性处理方法，包括局部施用、植入、滴注或皮下、皮内、粘膜、眼、眼内或关节内注射所述组合物。

本发明使得热处理之后具有高粘度，或者甚至高于热处理之前的粘度，其本身对于预防和/或治疗可通过以下方式改善或避免的病理状况非常有价值：

-填充或替换生物组织；以及/或者

-增加所述生物组织的体积；以及/或者

-补充或替换生物流体。

本发明使得能够在热处理之后获得高粘度，或者甚至高于热处理之前的粘度，对于治疗骨关节炎或修复软骨缺损的方法也是高度赞赏的，该组合物是例如配制用于通过注射到滑液中施用或用于在与血液混合后植入到软骨中，或用于治疗干眼的方法。

本发明使得能够在热处理之后获得高粘度，或者甚至高于热处理之前的粘度，对于在治疗性、外科或美容治疗方法中的使用也是高度赞赏的，具体包括风湿病学、眼科、妇科、美容医学、整形外科、内科手术、整形外科手术中的治疗，用于预防术后组织粘连以及皮肤病学。

本发明使得能够在热处理之后获得高粘度，或者甚至高于热处理之前的粘度，被证明对于用于干眼综合征、角膜损伤或眼或关节发炎的治疗性处理也是高度赞赏的。

本发明使得能够在热处理之后获得高粘度，或者甚至高于热处理之前的粘度，对于在治疗性处理中的使用也是高度赞赏的，在该治疗性处理期间，通过滴注将所述组合物施用于眼表面以预防或对抗角膜损伤或干眼综合征，特别是具有润滑或再生眼表面的目的。

特别地，可以生产包含具有如上所述的HA和CHITO共交联基质的生物相容性产品的滴眼剂组合物。

通过皮内注射进行生物相容性测试

生物相容性测试(采用ISO标准10993-第10部分)通过在兔子背部不同部位皮内注射0.2mL剂量来进行。注射后立即观察这些部位。24小时(1天)、48小时(2天)、72小时(3天)、7天和14天后观察红斑和水肿情况。

测试了以下产品

-样品A：根据制剂2a的生物相容性产品，其中通过掺入葡萄糖酸锌将二价锌阳离子10添加到基质中，葡萄糖酸锌浓度为20ppm(也就是说，基质中的二价锌阳离子浓度为0.002％)；

-样品B：根据本发明的生物相容性产品，并且其中它与制剂4a和4b的不同之处仅在于葡萄糖酸锌浓度为20ppm(也就是说，基质中的二价锌阳离子浓度为0002％)，其中指明羧甲基壳聚糖是植物(真菌)来源的；

-样品C：根据本发明生产的生物相容性产品，与制剂4a和4b的不同之处仅在于葡萄糖酸锌浓度为20ppm(也就是说，基质中的二价锌阳离子浓度为0.002％)，

其中指明羧甲基壳聚糖是动物来源的；

-样品D：以DERM品牌销售的产品(批号：190625-2)，由SinclairFrance SAS生产；

-样品E：生理缓冲溶液；

-样品F：9g/L的氯化钠溶液(盐水溶液)(也就是说，按重量计按体积计0.9％)。

[表2]根据ISO标准10993-10评级系统的平均刺激分数

	第1天	第2天	第3天	第7天	第14天
						样品A	2.00	0.75	1.50	1.00	0.00
样品B	2.00	0.00	0.00	0.00	0.00
						样品C	3.75	2.00	2.00	1.75	0.00
样品D	8.00	7.25	7.00	7.00	3.50
						样品E	0.25	0.00	0.00	0.00	0.00
样品F	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00

因此，根据本发明的生物相容性产品在皮内注射的情况下具有令人满意的生物相容性。

眼睛刺激测试

通过将0.1mL剂量的测试样品滴注到兔子左眼的下结膜囊中来进行眼睛刺激测试(采用ISO标准10993-第10部分)，而将0.1mL剂量的9g/L(0.9％w/v)氯化钠溶液(盐水溶液)滴入所述兔子的右眼下结膜囊作为对照。观察1小时、24小时(1天)、48小时(2天)和72小时(3天)后的眼部反应。每份样品在两只兔子身上进行测试。

测试了以下产品：

-样品G：根据制剂2a的生物相容性产品，其中通过掺入葡萄糖酸锌将二价锌阳离子添加到基质中，葡萄糖酸锌浓度为20ppm(也就是说，基质中的二价锌阳离子浓度为0.002％)；

-样品H：根据本发明的生物相容性产品，与制剂4a和4b的不同之处仅在于葡萄糖酸锌浓度为20ppm(也就是说，基质中的二价锌阳离子浓度为0.002％)，其中指明羧甲基壳聚糖是植物(真菌)来源的；

-样品I：根据本发明的生物相容性产品，与制剂4a和4b的不同之处仅在于葡萄糖酸锌浓度为20ppm(也就是说，基质中的二价锌阳离子浓度为0.002％)，其中指明羧甲基壳聚糖是动物来源的。

[表3]样品G和对照的眼睛评分

[表4]样品H和对照的眼睛评分

[表5]样品I和对照的眼睛评分

根据本发明的生物相容性产品是无刺激性的，因此具有令人满意的眼部安全性。

用于滴眼剂组合物的适用性

已经评价了根据本发明的产品用于干眼综合征、角膜损伤或眼部或关节炎症的治疗性处理的安全性。粘弹性产品通常用于此目的。基于透明质酸的产品，无论是否交联，都被广泛使用。

对于此类用途，适应性粘弹性行为是产品必须具有的主要特性。具有自适应粘弹性行为的产品是指具有以下特性的产品：

-静止时(也就是说，在低剪切速率下)足够高的粘度，以确保良好的持久性和对角膜的令人满意的保护，以及

-粘度在眨眼期间(也就是说，在高剪切速率下)降低，以提高舒适度和产品在眼表面的令人满意的分布。

通过与市场上市售产品的粘度比较来进行评价：

-VISUfarma公司的凝胶(样品J)；

-ALLERGAN公司的OPTIVE(样品K)；

-Ursapharm Arzneimittel GmbH公司的HYLO-(样品L)。

所测试的根据本发明的生物相容性产品(热处理之后)是：

-制剂4a(样品M)；

-制剂4b(样品N)。

还测试了制剂1(样品O)和制剂3(样品P)。

结果以图2的形式示出。

首先观察到样品J(VISUfarma公司的凝胶)、样品K(ALLERGAN公司的OPTIVE/>)和样品Q(制剂1)显示出具有非常小的适应性、具有低粘度的粘弹性行为，该低粘度在整个测试的剪切速率范围内基本恒定。

尽管样品L(Ursapharm Arzneimittel GmbH公司的HYLO-)显示出适应性更强的粘弹性行为，但其粘度在测试的整个剪切速率范围内保持较低。

可以看出，根据本发明的制剂(样品M和N)均具有在低剪切速率下高的粘度，并且在高剪切速率下相当稳定地(或多或少地快速)降低至显著较低的粘度。因此，根据本发明的制剂具有适应性粘弹性行为，使得它们适用于滴眼剂组合物，并且基质中二价锌阳离子的浓度和基质的交联程度使得可以使粘度适应于所需的用途。

因此，根据本发明的制剂对于通过滴注在眼表面上来预防或对抗角膜损伤或干眼综合征的治疗性处理特别有意义，特别是具有润滑或再生眼表面的目的。

在低剪切速率下，根据本发明的制剂的粘度(M和N)显著高于市售产品的粘度。

本发明不限于已经明确描述的实施例，而是包括包含在所附权利要求的范围内的各种变体和概念描述。

Claims (20)

1.具有基质的生物相容性产品，所述基质包含：

-选自包含透明质酸、透明质酸的盐、硫酸软骨素、纤维素衍生物及其混合物的组的多糖，

-所述基质中存在二价锌阳离子，

其特征在于：

-所述基质包含壳聚糖，优选壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐，

-在所述基质中，至少部分所述多糖与至少部分壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐共交联。

2.根据权利要求1所述的生物相容性产品，其特征在于，所述基质中二价锌阳离子的浓度相对于所述基质的总重量为按重量计0.001％与1％之间，优选相对于所述基质的总重量为按重量计0.01％与1％之间。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的生物相容性产品，其特征在于，所述基质中二价锌阳离子的所述浓度相对于所述基质的所述总重量为按重量计小于或等于0.1％。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的生物相容性产品，其特征在于，所述基质中二价锌阳离子的所述浓度相对于所述基质的所述总重量为按重量计0.002％与0.06％之间。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的生物相容性产品，其特征在于，通过添加锌的盐或锌糖盐，优选葡萄糖酸锌、氯化锌或硫酸锌，将所述二价锌阳离子包含在所述基质中。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的生物相容性产品，其特征在于：

-选自包含透明质酸、透明质酸的盐、硫酸软骨素、纤维素衍生物及其混合物的组的多糖的浓度相对于基质的总重量为按重量计0.01％与3％之间，和/或

-基于所述基质的总重量，壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐的浓度为按重量计0.01％与3％之间。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的生物相容性产品，其特征在于，所述壳聚糖衍生物为羧烷基壳聚糖，优选羧甲基壳聚糖。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的生物相容性产品，其特征在于，所述多糖为透明质酸或透明质酸的盐，并且优选地具有0.1MDa与5MDa之间的分子量。

9.化妆品或药物组合物，所述化妆品或药物组合物包含根据权利要求1至8中任一项所述的生物相容性产品。

10.根据权利要求9所述的化妆品或药物组合物，所述化妆品或药物组合物包含生理学上可接受的缓冲剂，优选含有多元醇和/或磷脂。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的组合物，所述组合物用于美容治疗或治疗性处理的方法中，所述方法具体包括所述组合物经由皮下、皮内、粘膜、眼、眼内或关节内途径的局部施用、植入、滴注或注射。

12.根据权利要求11使用的组合物，所述组合物用于预防和/或治疗可通过以下方式改善或避免的病理状况：

-生物组织的填充或替换；和/或

-所述生物组织体积的增加：和/或

-生物流体的补充或替换。

13.根据权利要求11或权利要求12所述的组合物，所述组合物用于治疗骨关节炎或修复软骨缺损的方法中，其中所述组合物例如被配制用于通过注射施用存在于滑液中或与血液混合后植入软骨中，或用于治疗干眼的方法。

14.根据权利要求9或权利要求10所述的组合物，所述组合物用于治疗、外科或美容治疗方法中，具体包括风湿病学、眼科、妇科、美容医学、整形外科、内科手术、整形外科手术中的治疗，用于预防术后组织粘连以及皮肤病学。

15.根据权利要求9或权利要求10所述的组合物，所述组合物用于干眼综合征、角膜损伤或眼部或关节炎症的治疗性处理。

16.根据权利要求9或权利要求10所述的组合物，所述组合物用于治疗性处理，在所述治疗性处理期间，通过滴注将所述组合物施用于眼表面以预防或对抗角膜损伤或干眼综合征，特别是用于润滑或再生所述眼表面的目的。

17.滴眼剂组合物，所述滴眼剂组合物包含根据权利要求1至8中任一项所述的生物相容性产品。

18.制备根据权利要求1至8中任一项所述的生物相容性产品或根据权利要求9至17中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.溶解在相同的水溶液中：

i.选自包含透明质酸、透明质酸的盐、硫酸软骨素、纤维素衍生物及其混合物的组的多糖，优选透明质酸或透明质酸的盐；

ii.壳聚糖，优选壳聚糖衍生物或壳聚糖的盐；

b.将交联剂添加到所述水溶液中并引发混合物的交联以形成基质；

c.在步骤b之前和/或之后添加二价锌阳离子。

19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，将所述生物相容性产品或组合物的pH调节至6与8之间，优选7。

20.根据权利要求18或权利要求19所述的制备方法，其特征在于，对所述生物相容性产品或组合物进行灭菌热处理，优选在120℃与140℃之间的温度下进行热处理时间在1分钟与20分钟之间。