CN117491535A - 一种乌药外用凝胶原料药的质量评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然产物检测技术领域，具体涉及一种乌药外用凝胶原料药的质量评价方法。该方法通过以下步骤实现：（1）供试品溶液的制备；（2）标准曲线溶液的制备；（3）采用超高效液相色谱质谱联用分析方法对不同结构种类的活性物质进行分离，进行定性定量检测，建立各活性物质的质谱数据库。本发明为乌药醇提冻干粉的质量控制提供了方法指导，为乌药经皮给药制剂的开发及有效性提供了方向和技术保证，为乌药药材及相关制剂的含量测定提供了新的评价指标。另外，本发明建立的活性化合物质谱数据库，可用于乌药及其他中药材、中药饮片样品无对照品筛查过程中的高精准定性分析。
Description
技术领域
本发明属于天然产物检测技术领域，具体涉及一种乌药外用凝胶原料药的质量评价方法。
背景技术
乌药(L. aggregata)为樟科山胡椒属植物，最早记载在《本草拾遗》，为传统常用中药，是重要的温胃理气止痛药，主治胸腹胀痛、恶心呕吐，消化不良、小便过频等。近年来国内外学者对乌药进行了大量的研究，研究发现乌药中含有挥发油、生物碱、萜类、黄酮类、鞣质、糖类、氨基酸、蛋白质、皂苷、蒽醌、甾体等多种化学成分，中国药典2020年版一部收录的乌药饮片及其成方制剂的含量评价指标就是以乌药醚内酯、去甲异波尔定两种化学成分为主。现代药理活性研究表明乌药具有抗炎、抗肿瘤、降血压、抑菌、保肝等广泛的药理活性，但是有关其药理活性与所含化学成分之间相互关系的报道较少，乌药多数药理活性的药效物质基础仍不明确。
目前，市售乌药配方颗粒临床用于行气止痛、温肾散寒，缩泉丸及缩泉胶囊主要用于补肾缩尿，其他适应症的乌药成方制剂尚未见报道。经皮给药系统（TDDS）是指药物透过皮肤经毛细血管吸收进入人体循环，与普通制剂（如口服制剂、注射剂）相比，经皮给药可通过皮肤或黏膜直接发挥药效，避免因口服给药的肝首过效应和胃肠道吸收的影响，减少用药次数，给药剂量可灵活调节。经皮给药的优点还在于可随时中断用药，减少药物的副作用，无创伤性等。
鉴于中药材化学成分的多样性以及原料药中活性物质化学结构的特殊性，现有技术中，尚未有乌药醇提冻干粉相关的质量评价方法，且目前，国内外关于乌药外用凝胶原料药中的相关新活性物质的测定方法未见有公开的报道。
发明内容
针对现有技术中存在的技术空白，本发明提供了一种乌药外用凝胶原料药的质量评价方法，本发明采用超高效液相色谱质谱联用分析方法，能够用于乌药醇提冻干粉中新活性物质的分离、检测。因此，本发明对乌药经皮给药制剂原料药的质量控制及制剂的有效性保证具有极其重要的意义，为乌药饮片及制剂的含量测定提供了新的评价指标，同时建立了新活性物质的质谱数据库，用于乌药及其他中药材、中药饮片样品筛查过程中的高精准定性分析。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种乌药外用凝胶原料药的质量评价方法，包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取乌药醇提冻干粉，加萃取溶剂，浸泡、超声萃取，用萃取溶剂转移并定容，滤过，取续滤液；
（2）标准曲线溶液的制备；
（3）检测：采用超高效液相色谱质谱联用分析方法对不同结构种类的活性物质进行分离，进行定性定量检测，建立各活性物质的质谱数据库。
进一步的，步骤（1）中，所述萃取溶剂与乌药醇提冻干粉的体积质量比为300～500ml：1g；所述萃取溶剂为40%乙醇；所述超声萃取的温度为40～50℃，萃取时间不少于2h。
进一步的，步骤（2）中，所述标准曲线溶液的浓度为2.5ng/mL～1μg/mL。
本发明提供的评价方法中，所使用的超高效液相色谱的参数为：采用五氟苯基与十八烷基硅烷相结合的键合硅胶为填充剂，规格为2.1×100mm，1.8μm；以0.1%～0.5%甲酸水溶液为流动相A，0.1%～0.5%甲酸甲醇溶液为流动相B，梯度洗脱，流速为0.5ml/min；柱温为35℃～45℃，进样体积为2μL。
上述梯度洗脱的条件为：
。
进一步的，所述质谱的参数为：采用电喷雾电离源（ESI），正离子扫描模式，平行反应监测（PRM）模式，离子传输管温度为350℃，鞘气流速60 arb，辅助气加热器温度为400℃，辅助气流速为20 arb，喷雾电压为3.5kv。
本发明质量评价过程中，所述活性物质选自倍半萜衍生物类化合物、香叶基苯衍生物类化合物、丁酮内酯类化合物及环戊烯二酮类化合物。
优选的，所述倍半萜衍生物类化合物为：化合物A（linderin B）：；和化合物B（lindechunisin A）：/>；
所述香叶基苯衍生物类化合物为化合物E（1-acetyl-4-methoxyl-denudaquinol）:；
所述丁酮内酯类化合物为化合物F（(2E,3R,4S)-2-tetradecylinene-3-hydroxy-4-ethoxy-4-methylbutanolide）：和化合物G（(2E,3R,4S)-2-dodecylinene-3-hydroxy-4-ethoxy-4-methylbutanolide）：；
所述环戊烯二酮类化合物为化合物J（乌药环戊烯二酮）：和化合物K（乌药环戊烯二酮甲醚）：/>。
进一步的，各活性物质定量检测的离子对为：
。
本发明提供的活性物质的质谱数据库中，各活性物质的质谱碎片及参数如下：
。
本发明所使用的乌药醇提冻干粉提取工艺如下：取乌药饮片8 kg，适当破碎。
用8倍量80%乙醇浸泡过夜，然后加热回流提取4次：第一次提取2小时，第二次用8倍量80%乙醇提取1.5小时，第三次和第四次，分别用5倍量80%乙醇分别提取1小时，四次提取液合并后，减压回收乙醇，适当浓缩，置于冻干机中冷冻干燥。
本发明提供的从乌药醇提冻干粉中分离出的多个化合物均能够减轻紫外线照射对人角质细胞Hacat的炎症反应，显著降低炎症因子白介素1β的释放量，对细胞光损伤具有一定的保护作用。这一研究结果对于乌药经皮给药制剂的开发提供了方向，而这些活性化合物的含量极有可能影响乌药经皮给药制剂的有效性。
本发明提供的评价方法中，能够最大效率的提取各活性物质；实现了不同结构种类活性物质的同步洗脱、分离；本发明不断摸索超高效液相色谱质谱检测条件，极大程度提高了各活性物质的信号响应强度，有效提高了各活性物质的检测灵敏度和准确度。
本发明提供了一种超高效液相色谱质谱联用分析方法，用于乌药外用凝胶原料药中倍半萜衍生物类、香叶基苯衍生物类、丁酮内酯类及环戊烯二酮类等结构新颖化合物的定量分析。首次发现了化合物A、B、J和K具有缓解紫外线光损伤导致的炎症反应的活性，且首次实现了乌药醇提冻干粉中上述新活性物质的定量控制，一定程度为乌药经皮给药制剂的开发及有效性提供了方向和技术保证，为乌药饮片及制剂的含量测定提供了新的评价指标和方法；同时建立了新活性物质的质谱数据库，可用于乌药及其他中药材、中药饮片样品无对照品筛查过程中的高精准定性分析。
本发明的有益效果在于：
1. 本发明首次实现了倍半萜衍生物类、香叶基苯衍生物类、丁酮内酯类及环戊烯二酮类等不同结构种类新化合物的准确定量，为乌药外用凝胶原料药的质量控制提供技术支持，同时为乌药饮片、提取物及成方制剂的含量测定提供了新的评价指标和方法。
2. 本发明首次建立了乌药醇提冻干粉中多个不同结构种类新化合物的质谱数据库，现有技术中，尚未有本发明提供的化合物的对照品，本发明所建立的质谱数据库可用于乌药及其他中药材、中药饮片样品筛查过程中的无对照品高精准定性分析。
3. 本发明首次发现从乌药醇提冻干粉中提取得到的化合物A、B、J和K能够减轻紫外线照射对人角质细胞Hacat的炎症反应，对紫外线损伤具有一定的保护作用，为乌药外用抗炎凝胶制剂的开发提供了理论基础。
4. 本发明采用冷浸与超声萃取技术相结合提取活性物质，操作方法简单快速、提取率高，所用萃取液40%乙醇经济易得、毒性低，且对于乌药醇提冻干粉具有较高的溶解度，因此本发明的供试品溶液可用于乌药外用凝胶原料药中其他活性成分的检测，很大程度上提高了工作效率、节约了工作成本。
5. 本发明采用五氟苯基与十八烷基硅烷相结合的键合硅胶作为填充剂，有效实现了不同结构种类化合物的同步洗脱、分离和保留。
6. 本发明分析方法灵敏度高，准确度好，解决了乌药外用凝胶制剂透皮实验样品中痕量活性物质检测的技术瓶颈。化合物A、B、E、F、G、J、K的检测限浓度分别为0.082ng/ml、0.088ng/ml、0.084ng/ml、0.33ng/ml、0.35ng/ml、0.078ng/ml、0.077ng/ml，定量限浓度分别为0.25ng/ml、0.27ng/ml、0.25ng/ml、0.98ng/ml、1.1ng/ml、0.23ng/ml；平均回收率分别为96.7%、99.3%、101.2%、94.9%、98.8%、100.5%、97.2%之间。
7. 本发明分析方法检测乌药外用凝胶原料药乌药醇提冻干粉中活性物质，操作简便快速，检测成本低廉，具有较强的推广性及应用价值。
8. 本发明分析方法经过方法学验证，结果均符合要求，证明本发明可用于乌药醇提冻干粉中活性物质的分离和定量分析。
附图说明
图1为化合物A、B、E、F、G、J、K的提取离子流图；其中，A为化合物A，B为化合物B，C为化合物E，D为化合物F、E为化合物G、F为化合物J、G为化合物K；
图2为化合物A的MS/MS一级质谱图；
图3为化合物A的MS/MS二级质谱图；
图4为化合物B的MS/MS一级质谱图；
图5为化合物B的MS/MS二级质谱图；
图6为化合物E的MS/MS一级质谱图；
图7为化合物E的MS/MS二级质谱图；
图8为化合物F的MS/MS一级质谱图；
图9为化合物F的MS/MS二级质谱图；
图10为化合物G的MS/MS一级质谱图；
图11为化合物G的MS/MS二级质谱图；
图12为化合物J的MS/MS一级质谱图；
图13为化合物J的MS/MS二级质谱图；
图14为化合物K的MS/MS一级质谱图；
图15为化合物K的MS/MS二级质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，而不是对本发明进行限制。实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可以从商业途径得到。因此熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1 提取溶剂的考察
1. 供试品溶液制备
取乌药醇提冻干粉适量，精密称定，选择不同溶剂浸泡，于40℃超声萃取4小时使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，摇匀，即得。
溶剂1：水
溶剂2：甲醇
溶剂3：乙醇
溶剂4：20%乙醇
溶剂5：40%乙醇
溶剂6：60%乙醇
溶剂7：80%乙醇
2. 色谱质谱条件
仪器：超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱高分辨质谱联用仪。色谱柱：ACEEXCEL C18-PFP（2.1×100mm，3μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脱，流速为0.5ml/min；柱温为35℃～45℃，进样体积为2μl。质谱检测器，采用电喷雾电离源（ESI），正离子扫描模式，平行反应监测（PRM）模式，离子传输管温度为350℃，鞘气流速60 arb，辅助气加热器温度为400℃，辅助气流速为20 arb，喷雾电压为3.5kv。
梯度洗脱程序见表1。
表1
3. 结果与结论
具体提取溶剂筛选的结果如表2所示。
表2
结论：由表2可知，采用40%乙醇为溶剂，供试品溶液中各活性物质峰面积总和最大，提取率最高，最终选择40%乙醇作为溶剂。
实施例2 提取时间的考察
1. 供试品溶液制备
取乌药醇提冻干粉适量，精密称定，采用40%乙醇浸泡，于40℃分别超声萃取0.5h、1h、2h、3h、4h使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，摇匀，即得。
按照实施例1中设定的色谱质谱条件进行测定。
2. 结果与结论
提取时间的筛选结果如表3所示。
表3
结论：由表3可知，供试品溶液中各活性物质的峰面积总和随着超声萃取时间延长而增大，当萃取时间大于2小时，峰面积无显著变化，最终将超声萃取时间确定为不少于2小时。
实施例3 提取温度的考察
1. 供试品溶液制备
取乌药醇提冻干粉适量，精密称定，采用40%乙醇浸泡，分别于20℃、30℃、40℃、50℃超声萃取4h使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，摇匀，即得。
按照实施例1中设定的色谱质谱条件进行测定。
2. 结果与结论
提取温度的筛选结果如表4所示。
表4
结论：由表4可知，供试品溶液中各活性物质的峰面积总和随着超声萃取温度的增加而增大，当萃取温度在30℃至50℃时，峰面积和变化不明显，此外，考虑温度高可能导致供试品溶液中其他活性成分的降解，温度低可能导致提取时间延长影响提取效率，最终将提取温度确定为40℃。
实施例4 色谱柱的选择
1. 对照品溶液制备
分别取各活性物质（化合物A、B、E、F、G、J、K）适量，精密称定，用40%乙醇超声使溶解并定量稀释制成每1ml中各约含100ng的溶液，摇匀，即得。
2. 色谱质谱条件
选择三种不同填料的色谱柱，按照实施例1中确定的色谱质谱条件，分别进行测定。
色谱柱1：ACE EXCEL C18-PFP（2.1×100mm，3μm）；
色谱柱2：Waters Atlantis Premier BEH C18（2.1×100mm，1.7μm）；
色谱柱3：Waters CORTECS T3 Column 120A（2.1×100mm，1.6μm）。
3. 结果与结论
采用Waters Atlantis Premier BEH C18色谱柱，对照品溶液色谱图中活性物质的柱保留较差，采用Waters CORTECS T3 Column 120A色谱柱，活性物质拖尾较严重，且个别活性物质的色谱峰存在基质干扰，影响灵敏度，而使用Waters ACQUITY UPLC HSS PFP色谱柱，各活性物质色谱峰的保留时间合适，峰型较好，且响应灵敏度高。故选择ACE EXCELC18-PFP（2.1×100mm，3μm）作为色谱柱。
实施例5 流动相的选择
1. 对照品溶液制备
分别取各活性物质适量，精密称定，用40%乙醇超声使溶解并定量稀释制成每1ml中各约含100ng的溶液，摇匀，即得。
2. 色谱质谱条件
分别选择三种不同极性的有机溶剂作为洗脱相，按照实施例1中确定的色谱条件，分别进行测定。
洗脱相1：乙腈；洗脱相2：甲醇；洗脱相3：0.1%甲醇。
3. 结果与结论
采用乙腈作为洗脱相，对照品溶液色谱图中各活性物质色谱峰保留非常差，且受溶剂基质等干扰响应信号较低；采用甲醇作为洗脱相，各活性物质色谱峰保留时间合适，但个别色谱峰因化合物自身结构原因响应强度仍较低；而使用0.1%甲酸甲醇作为洗脱相，各色谱峰峰形好、保留时间合适，且信号强度均增大了1-2个数量级，同时可以解决乌药外用凝胶制剂透皮实验样品中痕量活性物质检测的技术难题。故选择0.1%甲酸甲醇作为洗脱相，同时为了提高检测灵敏度，在水相中也加入0.1%甲酸。
实施例6 体外生物活性测定
取生长对数期的人角质细胞Hacat细胞，以2×106个/mL的密度将细胞悬浊液接种于6孔细胞培养板上，每孔加入1 mL细胞悬液，孵箱培养24 h，小心吸去上清。空白组加入DMEM溶液1 mL；实验组加入化合物100 μM的DMEM溶液1 mL；阳性对照组加入地塞米松（25 μg/mL）的DMEM溶液1 mL，空白对照加入等量的DMEM溶液，6 h后除空白孔外其余各孔紫外（UVA）照射9 J/cm2。每组样品重复3个平行，每个平行样品检测3次。紫外照射后继续培养24h。细胞裂解液处理细胞，10000 r/min 4℃下离心5 min，取上清，得到细胞裂解上清液。取10 μL细胞裂解液用BCA试剂盒检测样品中的总蛋白含量，炎症因子白介素1β的测定按照ELISA 试剂盒说明书进行实验操作后，于450 nm处测定各吸光值，根据吸光值计算炎症因子白介素1β的释放水平，炎症因子的释放量需要BCA含量校正。
结果如表5（化合物对白介素1β释放量的抑制作用）所示，经过紫外线照射后，模型组白介素1β的含量显著增加，表明紫外线照射可以明显引起Hacat细胞产生炎症反应释放炎症因子。各化合物在100 μM的浓度下，能够显著抑制炎症因子白介素1β的释放量，化合物A、B、J和K抑制率分别为57.58%，56.81%，62.72%和65.30%。结果表明，乌药乙醇提取物能够减轻紫外线照射对人角质细胞Hacat的炎症反应，对紫外线损伤具有一定的保护作用。
表5
“a”：与空白组比较，有显著性差异，P<0.05。
“b”：与模型组比较，有显著性差异，P<0.05。
实施例7 质谱数据库的建立
1. 对照品溶液制备
分别取各活性物质适量，精密称定，用40%乙醇超声使溶解并定量稀释制成每1ml中各约含10µg的混合溶液，摇匀，即得。
2. 色谱质谱条件
色谱条件： ACE EXCEL C18-PFP（2.1×100mm，3μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脱，流速为0.5ml/min；柱温为40℃，进样体积为2μl，样品室温度为10℃。
梯度洗脱程序见表6。
表6
质谱条件：采用可加热的电喷雾离子源（HESI），正离子检测模式。鞘气流速设为60arb (arbitrary units)，辅助气流速为20 arb，喷雾电压设为3.5 kv，离子传输管温度设定为350℃，辅助气加热温度设定为400℃。
3. 质谱库和定量分析方法的建立
首先，取各活性化合物对照品溶液，采用全扫描/数据依赖的二级扫描模式（FullMS/dd-MS2）进行检测，一级全扫描范围为m/z 100~1000，分辨率为70 000 FWHM，自动增益控制的目标值（AGC）为1.0×106，最大注入时间为100 ms。利用Xcalibur4.0计算得到各化合物母离子[M+H]+准确质量，据此对总离子流图进行提取，得到各活性物质的提取离子色谱图（XICs）及高分辨一级质谱图（见图2、图4、图6、图8、图10、图12和图14），然后以不同的碰撞能量（NCEs）对母离子进行打碎，得到高分辨二级质谱图（见图3、图5、图7、图9、图11、图13和图15），根据母离子的碎裂程度以及碎片离子的响应强度选择碰撞能量和特征碎片离子。汇总各化合物的色谱保留时间、母离子准确质量及碎片离子准确质量等信息，构建各活性物质的高分辨质谱数据库，同时建立基于平行反应监测（PRM）模式的活性物质定量分析方法（见图1）。
实施例8 方法学考察
1、专属性考察：空白溶剂不干扰各活性物质的检测。
2、检出限/定量限考察：精密量取各活性物质对照品适量，用40%乙醇溶解并逐级进行稀释，选择信噪比约为3的溶液作为检出限溶液，信噪比约为10的溶液作为定量限溶液。
3、系统精密度考察：取100ng/ml对照品溶液，按照确定的色谱条件，连续进样6次，计算各活性物质峰面积的RSD，对照品溶液中各活性物质的提取离子流图见图1。
4、线性考察：取各活性物质对照品适量，精密称定，用40%乙醇溶解并定量稀释制成不同浓度溶液，以浓度对峰面积作线性回归方程。
5、重复性考察：按照确定的方法制备供试品溶液6份，按照确定的色谱条件进行分析检测，计算供试品溶液中各活性物质含量的RSD。
6、方法准确度考察：按照确定的方法制备标准曲线溶液。取乌药醇提冻干粉约25mg，置50ml量瓶中，精密加入每1ml中约含各活性物质25µg的对照品溶液0.2ml，用40%乙醇超声使溶解并稀释至刻度，作为方法准确度供试品溶液，同法制备6份。按照确定的色谱条件分析检测，计算各活性物质的回收率。
7、方法耐用性考察：取100ng/ml对照品溶液，分别改变柱温（±5℃）、离子源温度（±20℃）进行分析检测，其他色谱质谱条件不变。结果表明，柱温及离子源温度微调后，各活性物质峰面积无显著变化。
各方法学考察结果见表7。
表7
以上实施例仅用以详细说明本发明的技术方案而非限制，本领域的专业技术人员可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (3)
1.一种乌药外用凝胶原料药的质量评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取乌药醇提冻干粉，加萃取溶剂，浸泡、超声萃取，用萃取溶剂转移并定容，滤过，取续滤液；
所述萃取溶剂与乌药醇提冻干粉的体积质量比为300～500ml：1g；所述萃取溶剂为40%乙醇；所述超声萃取的温度为40～50℃，萃取时间不少于2h；
（2）标准曲线溶液的制备；
（3）检测：采用超高效液相色谱质谱联用分析方法对不同结构种类的活性物质进行分离和定性定量检测，建立各活性物质的质谱数据库；
所述超高效液相色谱的参数为：采用五氟苯基与十八烷基硅烷相结合的键合硅胶为填充剂，规格为2.1×100mm，1.8μm；以0.1%～0.5%甲酸水溶液为流动相A，0.1%～0.5%甲酸甲醇溶液为流动相B，梯度洗脱，流速为0.5ml/min；柱温为35℃～45℃，进样体积为2μL；
所述梯度洗脱的条件为：
；
所述质谱的参数为：采用电喷雾电离源，正离子扫描模式，平行反应监测模式，离子传输管温度为350℃，鞘气流速60arb，辅助气加热器温度为400℃，辅助气流速为20 arb，喷雾电压为3.5kv；
所述活性物质选自：倍半萜衍生物类化合物、香叶基苯衍生物类化合物、丁酮内酯类化合物及环戊烯二酮类化合物；
所述倍半萜衍生物类化合物为：化合物A：和化合物B：；所述香叶基苯衍生物类化合物为化合物E：/>；所述丁酮内酯类化合物为化合物F：；和化合物G：/>；所述环戊烯二酮类化合物为化合物J：/>和化合物K：/>；
各活性物质定量检测的离子对为：
。
2.根据权利要求1所述的乌药外用凝胶原料药的质量评价方法，其特征在于，步骤（2）中，所述标准曲线溶液的浓度为2.5ng/mL～1μg/mL。
3.根据权利要求1所述的乌药外用凝胶原料药的质量评价方法，其特征在于，活性物质的质谱数据库中，各活性物质的质谱碎片及参数如下：
。
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