CN117487951A - 与西瓜果皮条纹颜色共分离的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一对与西瓜果皮条纹颜色共分离的分子标记及应用，属于生物技术领域。本发明的分子标记可以直接用于西瓜果皮条纹颜色材料的分子标记辅助育种，加快了育种进程，利用该分子标记可在苗期快速鉴定出西瓜果皮条纹颜色性状，其方法简单可行，有利于提高效率，节省育种成本。

Description

与西瓜果皮条纹颜色共分离的分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子标记辅助育种技术领域，尤其涉及一种与西瓜果皮条纹颜色共分离的InDel分子标记、引物及其应用。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus)是葫芦科(Cucurbitaceae)西瓜属(citrullus)一年生蔓生草本植物，是世界上重要的园艺作物之一，在中国广泛种植，中国是世界上最大的西瓜生产国和消费国，西瓜栽培历史悠久。西瓜是夏季最具降温的水果，其果肉含多种营养成分，可以加工成果汁，也可以提取西瓜霜，其用途十分广泛。因此，西瓜在农业经济作物发展中占据着重要的经济作用。

现如今，随着人们生活水平的提高，消费者对西瓜质量有了不一样的要求，除了注重口感外，对其外观也有了不同的看法。消费者对体积小、具有特殊性状的品种更加喜爱。果皮条纹作为重要的商品性状，是消费者对商品最直接的评估标准，是十分重要的商品性状。果皮条纹是最为重要的外观品质，在一定程度上会影响到消费者的购买需要，果皮条纹的颜色在外观品质中也占着重要的作用，在视觉上能影响消费者的购买选择，是西瓜消费中重要的商品特性，因此研究高产、优质、美观的西瓜新品种有利于西瓜品种商品性的提高。

随着研究的不断深入，国内外学者对西瓜果皮条纹展开了研究。Gusmini和Wehner以果皮上有间歇性条纹的材料与果皮上有连续性条纹的材料为亲本，进行杂交，研究发现，间歇性条纹由单个隐性基因ins控制，并通过用果皮上有黄肚斑的材料与果皮上无黄肚斑的进行杂交，获得F2群体，对其进行研究分析发现，果皮上黄肚斑是由一个显性单基因Yb控制。Kim等以‘Arka Manik’(边缘弥漫的浅绿色宽条纹)与‘TS34’(边缘清晰的深绿色中等宽度条纹)为亲本材料进行杂交，获得F2代分离群体，群体中果皮条纹差异明显，表明果皮条纹是由多个基因控制的数量性状，并在第6号染色体的26246077至26246993bp的范围内，定位到一个主效QTL位点。Yang等通过用01(有条纹的标准绿色果皮)、109(有条纹的标准黄色果皮)、905(有条纹的深绿色果皮)分别与09(无条纹的标准绿色果皮)的材料进行杂交，构建3个F2群体，进行遗传分析发现，西瓜有条纹对无条纹为显性。Maragal等利用中等绿色大理石花纹浅绿色网纹分别与深绿色条纹进行杂交，分析得出，条纹及条纹颜色受单基因控制，条纹与深绿色条纹均为显性。Park等将控制果皮条纹有无的基因S定位于6号染色体末端，控制果皮颜色D位于8号染色体末端；控制果皮颜色类型Dgo位于4号染色体前150kb区间。Yue等将中等宽度边缘清晰的深绿色纹由显性基因C1SP控制的基因定位于6号染色体611.78kb区域，通过前人研究我们发现，对研究果皮条纹颜色相关的基因报道较少。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种西瓜果皮条纹颜色共分离的分子标记。

本发明目的之二在于提供一种上述分子标记在西瓜分子育种的应用。

本发明的另一目的在于提供一种西瓜果皮条纹颜色性状的判定方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

与西瓜果皮条纹颜色共分离的分子标记Indel12，其中该分子标记可以采用Indel标记，扩增所述分子标记的引物对为：

本发明还公开了与西瓜果皮条纹颜色共分离的分子标记在西瓜分子标记辅助育种中的应用，该分子标记在分子水平上可以辅助鉴定西瓜果皮条纹颜色性状，即在苗期即可利用该分子标记通过进一步的PCR扩增，根据产物片段大小判定西瓜果皮条纹颜色类型，从而加快育种进程。本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来判定西瓜果皮条纹颜色品种。具体地，可以使用上述的本发明的分子标记的引物对，所述检测还可以通过测序方法进行。

本发明还公开了一种西瓜果皮条纹颜色性状的判定方法，所述判定方法包括以下步骤：

(1)提取待测西瓜基因组DNA；

(2)以步骤(1)中所提取基因组DNA为模板，利用权利要求1所述分子标记的引物对其进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测和/或测序；

(3)根据步骤(2)的电泳条带和/或测序结果进行判定，具体标准为：

如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ ID NO.3所示的所示的长度为147bp的特征条带，则该待测品种为西瓜纯合深绿色果皮条纹品种；如果PCR扩增产物中仅有一条如SEQ IDNO.4所示的长度为150bp的特征条带，则该待测品种为西瓜纯合浅绿色果皮条纹性状品种；如果PCR扩增产物中既有一条如SEQ ID NO.3所示的长度为147bp的特征条带，又有一条如SEQ ID NO.4所示的长度为150bp的特征条带，则该待测品种为杂合西瓜果皮深绿色条纹品种。

另外，包括上述引物对的试剂盒，可以用来鉴定西瓜材料果皮条纹颜色性状，具体应用时，可以选择含有上述分子标记引物对的试剂做成试剂盒。

在这里，利用本发明的分子标记，可以对西瓜果皮条纹颜色相关基因进行定位，上述这些应用都可以按照常规的方法进行。

本发明的优点：

本发明通过采用西瓜材料WM114(果皮表面覆有深绿色条纹)以及西瓜材料WM60(果皮覆有浅绿色条纹)为亲本，利用这两个亲本配制了杂交组合；统计显示深绿色果皮条纹相对于浅绿色条纹来讲为单基因控制的显性性状，并且对控制西瓜果皮深绿色条纹基因候选区段进行生物信息分析，在测序结果中我们发现，一个3bp的缺失在亲本两个不同西瓜果皮条纹颜色类型中有明显的差异，故基于此开发了分子标记Indel12，其中，深绿色果皮条纹亲本WM114序列有3bp碱基的缺失，故该标记可用于识别深绿色果皮条纹和浅绿色果皮条纹性状，该分子标记能用于西瓜条纹颜色的分子辅助育种。本发明的分子标记为鉴定西瓜条纹颜色提供了便捷、快速的新手段，提高了西瓜条纹颜色育种的准确率，加快了育种进程，为西瓜优质新品种的培育提供了理论支持和技术支持。

附图说明

图1为西瓜果皮浅绿色条纹材料WM60和西瓜果皮深绿色条纹材料WM114表型图；

图2为西瓜果皮条纹颜色相关基因定位图；

图3为Indel12在自然群体中PCR产物的电泳图，其中M代表marker；其余条带为从F2群体中随机选取的30份F2群体材料。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，以下例中试验方法，如无说明，均为常规方法。

下面结合具体实例来说明本发明的具体实施方式、技术方案，详细说明如后，但本发明的保护范围不仅仅限于此。

生物材料：

西瓜材料WM114：果皮表面覆有深绿色条纹；

西瓜材料WM60：果皮覆有浅绿色条纹；

以WM114和WM60为亲本，杂交获得F1代植株，F1代植株自交构建F2分离群体；

以上材料在申请人实验室均有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验或者公众也可以通过购买的方式获取。

实验过程中，两亲本及构建的F2群体种植于河南农业大学扶沟蔬菜研究院日光温室及河南农业大学毛庄科教园区日光温室内，催芽后在穴盘中育苗，采用正常的栽培管理方式，在授粉后14天开始对单株果实表皮条纹颜色类型进行统计。

实施例1西瓜果皮条纹着色基因的定位

(一)遗传分离群体的构建

以西瓜深绿色果皮条纹材料WM114与西瓜浅绿色果皮条纹材料WM60为亲本，利用这两个亲本配制了杂交组合，结果表明，获得的F₁代植株果皮条纹颜色全部表现为深绿色条纹类型(亲本材料表型如图1所示)。

从F₁代中选择8个单株，自交获得F₂代种子，用于遗传分析与基因定位。

对F₂代单株的果皮条纹颜色表型进行鉴定，且用卡方测验进行验证。结果表明：对2021年春季种植的387株F₂群体的果皮条纹颜色表型调查分析显示：深绿色果皮条纹植株有293株，浅绿色果皮条纹植株有94株，经卡平方检测符合3：1的性状分离比。

对2021年球季种植的338株F2群体的果皮条纹颜色表型调查分析显示：深绿色果皮条纹植株有259株，浅绿色果皮条纹植株有78株，经过卡平方检测符合3：1的性状分离比。

(二)采用BSA法对目标基因进行初步定位

(1)多态性筛选分析，具体为：

利用发明人前期从西瓜全基因组开发的1256对SSR引物，筛选在亲本中具有多态性的标记。其中有245个标记在亲本间表现出多态性。

(2)制备基因池，具体为：

在上述步骤(一)的F2群体中随机选取20个深绿色果皮条纹单株与20个浅绿色果皮条纹单株，采集嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA，分别混合构建深绿色果皮条纹混池和浅绿色果皮条纹混池(深绿色果皮条纹与深绿色果皮条纹混合，浅绿色果皮条纹与浅绿色果皮条纹混合)。

(3)第二次多态性筛选

用对亲本有多态性的标记对在步骤(2)中制备的两个基因池进行第二次多态性筛选，获得与目标基因连锁的标记。

PCR扩增反应体系：Master Mix 5μL，DNA模板(30ng/μL)1μL，F-Primer(5μmol/μL)0.5μL，R-Primer(5μmol/μL)0.5μL，dd H2O 3μL；反应程序为：95℃5min(预变性)；94℃45S(变性)；6个循环68-58℃(退火)；72℃1min(延伸)；94℃30S(变性)；8个循环58-50℃(退火)，；72℃1min(延伸)；94℃30S(变性)；50℃30s(退火)；

20个循环72℃1min(延伸)；72℃7min(延伸)；4℃(保温)。

对上述扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测、带型判读，找到目标条带，根据扩增产物位置关系及条带大小确定所属基因型。

试剂配制：

10×TBE

Tris-base 108g；0.5M EDTA 40ml；Boric acid 55g；用ddH2O定容至1L，将10×TBE稀释为5×TBE。

聚丙烯酰胺凝胶的溶液

29：1(Acrylamide：Bis-Acrylamide)：24ml，5×TBE：16ml，ddH2O：40ul；TEMED：60μl；APl0％：700μl。

配制染色液：1000ml蒸馏水加入1.2g AgNo₃；显色液：1000ml的蒸馏水加入15g的无水NaOH和15ml的甲醛。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

将电泳凝胶的玻璃杯及梳子清洗干净，在通风处晾干，用过滤纸擦拭干净。将长板和凹槽板两侧对齐，放在试验台上，用夹子夹紧，将工作混合好的工作液倒入玻璃板中间空隙中，当玻璃底部溢出工作液时不再倒入，将梳子插入中间缝隙中。放置30min，凝固可使用；将玻璃板装到电泳仪上，倒入适量的1×TBE电泳缓冲液，取下梳子，在第一个样前梳孔中加入1μl Marker，PCR产物依次加到聚丙烯酰胺凝胶板的相应梳孔中，用电线连接电泳仪和电泳槽，通上电源。约1h后取出胶板，进行银染。

银染检测

倒出缓冲液，取下胶板，将凝胶取下放于装置蒸馏水的塑料槽中，倒出蒸馏水，倒入染色液，用摇床摇1-2min，倒出染色液，倒入蒸馏水清洗，倒出蒸馏水，倒入显色液，在摇床上摇至胶上出现条带，倒出显色液，用蒸馏水清洗，用保鲜膜包好胶。

带型判读

将凝胶放于阅片台上进行读胶，观察两个亲本条带的差异。

(4)亲本重测序

利用Illumina Hi-seq2000高通量测序平台对两亲本材料进行重测序，控制测序深度20倍。

(5)基因精细定位，具体为：

结合(3)中的结果，通过开发更多的SSR标记、提高F2群体单株的数量，我们将目标基因定位在9号染色体标记C1SSR24968与C1SSR24989之间。此外，结合(4)中的结果，对标记C1SSR24968与C1SSR24989之间的374kb的序列进行比对，最终针对两亲本序列之间的SNPs和Indels差异，开发设计了23个InDel标记和9个SNP标记，最终将候选基因锁定在SNP7与Indel127之间147.6kb的区域内(见图2)。

实施例2Indel12标记的开发

发明人对控制西瓜果皮深绿色条纹基因候选区段进行生物信息分析，并开发了Indel标记。

在测序结果中我们发现，一个3bp的缺失在亲本两个不同西瓜果皮条纹类型中有明显的差异，故基于此开发了分子标记Indel12，其中，深绿色果皮条纹亲本WM114序列有3bp碱基的缺失，故该标记可用于识别深绿色果皮条纹和浅绿色果皮条纹性状，利用所述Indel12分子标记进行PCR扩增时，引物序列设计为：

具体验证时：

利用分子标记Inde112检测西瓜深绿色条纹性状时，可通过PCR扩增获得147bp的特征条带，所述147bp的特征条带的具体碱基序列如下所示：

利用分子标记Indel12检测西瓜浅绿色条纹性状时，可通过PCR扩增获得150bp的特征条带，所述150bp的特征条带的具体碱基序列如下所示：

序列对比表明，在96bp处，有一个TTA的插入，换言之，通过PCR，深绿色果皮条纹中扩增后的产物为147bp的片段；而浅绿色果皮条纹因存在一个TTA的插入，故扩增后的产物长度为150bp。

实施例3 Indel12分子标记功能验证

在上述实施例基础上，发明人以所收集的来自世界各地的西瓜种质材料为基础，随机选择30份材料为例(而所述西瓜种质材料均为发明人工作过程中搜集所得，相关种质材料在国内及国外部分专业种质库中亦有保藏，加上下述工作仅为实验验证，相关种质材料与本申请保护主题并不具有直接关联性，因而不再提供这些种质材料的信息)，对Indel12分子标记功能进行了进一步验证，具体过程简要介绍如下。

(1)提取西瓜基因组DNA

以育苗后未展开的幼嫩叶片(分别采集亲本深绿色果皮条纹材料WM114与西瓜浅绿色果皮条纹材料WM60和30份自然群体材料)为样品，CTAB法提取其基因组DNA；

(2)PCR扩增

利用Indel12分子标记，即如下引物对：

以步骤(1)中的基因组DNA为模板进行PCR扩增，

PCR扩增时，10μL扩增体系设计如下：

基因组DNA(30ng/μL)，1μL(约30ng)；

Indel12-F，0.5μL(引物浓度均为10μmol/L)；

Indel12-R，0.5μL(引物浓度均为10μmol/L)；

PCR Taq-Mix，5.0μL；

ddH2O，3.0μL；

PCR扩增程序为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃、5min。

对扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

电泳结果如图3所示，其中第一泳道为mareker。通过电泳结果可以判断，如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ ID NO.3所示的长度为150bp的特征条带，则该待测品种为西瓜果皮浅绿色果皮条纹性状的品种；如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ ID NO.4所示的长度为147bp的特征条带，则待测品种为纯合西瓜果皮深绿色带状性状品种；如果PCR扩增产物中既有一条如SEQ ID NO.3所示的长度为150bp的特征条带，又有一条如SEQ ID NO.4所示的长度为147bp的特征条带，则该待测品种为杂合西瓜果皮深绿色带状性状品种。所以通过对扩增的特征条带进行分析，就可以判断出西瓜果皮的果皮条纹颜色性状。

进一步地，发明人结合表型数据，发现30份自然材料的表型与基因型是一致的。基于此结果，表明Indel12分子标记能够有效地区分深深绿色果皮条纹材料以及浅绿色果皮条纹材料。

综上所述，结合电子BSA分析及在自然群体中的验证，本发明所述分子标记Indel12能够在西瓜生长的早期准确的进行分子标记辅助选择，大大地提高了选择和育种的进程。为西瓜优质新品种的培育提供了理论支持和技术支持。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.与西瓜果皮条纹颜色共分离的分子标记，其特征在于，扩增所述分子标记引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的与西瓜果皮条纹颜色共分离的分子标记，其特征在于，所述分子标记为Indel标记。

3.权利要求1所述的分子标记在西瓜分子标记辅助育种中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述分子标记用于鉴定或者辅助鉴定西瓜果皮条纹颜色性状。

5.一种西瓜果皮条纹颜色性状的判定方法，其特征在于，所述判定方法包括以下步骤：

(1)提取待测西瓜基因组DNA；

(2)以步骤(1)中所提取基因组DNA为模板，利用权利要求1所述分子标记的引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测和/或测序；

(3)根据步骤(2)的电泳条带和/或测序结果进行判定，具体标准为：

如果PCR扩增产物仅有一条如SEQ ID NO.3所示的长度为147bp的特征条带，则该待测品种为西瓜纯合深绿色果皮条纹性状；如果PCR扩增产物中仅有一条如SEQ ID NO.4所示的长度为150bp的特征条带，则该待测品种为西瓜纯合浅绿色果皮条纹性状；如果PCR扩增产物中既有一条如SEQ ID NO.3所示的长度为147bp的特征条带，又有一条如SEQ ID NO.4所示的长度为150bp的特征条带，则该待测品种为杂合西瓜果皮深绿色条纹性状。

6.一种用于鉴定西瓜条纹颜色性状的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1中所述的引物对。

7.用于检测Indel标记是否存在的试剂在西瓜果皮条纹颜色相关基因定位中的应用，其特征在于，扩增所述标记的引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。