CN117486809A - 2-氯喹唑啉类化合物及制备和在制备预防或治疗乳腺癌药物中的应用 - Google Patents

2-氯喹唑啉类化合物及制备和在制备预防或治疗乳腺癌药物中的应用 Download PDF

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郑翔
王钟慧
饶国武
靳浩
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/70—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D239/72—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines
    • C07D239/86—Quinazolines; Hydrogenated quinazolines with hetero atoms directly attached in position 4
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

本发明公开了2‑氯喹唑啉类化合物及制备和在制备预防或治疗乳腺癌药物中应用。所述2‑氯喹唑啉类化合物的结构如式(IA‑4)、(IA‑5)或(IB‑5)所示。本发明提供的2‑氯喹唑啉类化合物或其药学上可接受的盐对人乳腺癌细胞具有很好的抑制效果；且该类化合物制备方法简便，易于操作，原料易得，且生产成本较低，适于工业化应用。

Description

2-氯喹唑啉类化合物及制备和在制备预防或治疗乳腺癌药物 中的应用
技术领域
本发明涉及一种2-氯喹唑啉类化合物及其制备方法，以及所述化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗乳腺癌药物中的应用。
背景技术
喹唑啉类化合物具有许多较好的生物活性，在医药领域有着广泛的应用，尤其一些特殊结构的喹唑啉类衍生物具有明显的抗病毒活性、抗菌活性、抗肿瘤活性等，喹唑啉类化合物作为抗肿瘤药物已经上市了一些品种。例如上市的用于治疗肺癌的吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)，以及用于治疗乳腺癌的拉帕替尼(Lapatinib)，它们都属于喹唑啉类化合物。新型的喹唑啉类化合物及其生物活性也常见文献报道(参阅Y.-Y.Ke,H.-Y.Shiao,Y.C.Hsu,C.-Y.Chu,W.-C.Wang,Y.-C.Lee,W.-H.Lin,C.-H.Chen,J.T.A.Hsu,C.-W.Chang,C.-W.Lin,T.-K.Yeh,Y.-S.Chao,M.S.Coumar,H.-P.Hsieh,ChemMedChem 2013,8,136-148；A.Garofalo,A.Farce,S.Ravez,A.Lemoine,P.Six,P.Chavatte,L.Goossens,P.Depreux,J.Med.Chem.2012,55,1189-1204)。当然多数喹唑啉类化合物并不具有抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗癌活性的新型喹唑啉类化合物—2-氯喹唑啉类化合物及其制备方法和应用，该类化合物在一定剂量下对乳腺癌具有很好的抑制效果；且该类化合物制备方法简便，易于操作，原料易得，且生产成本较低，适于工业化应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种式(IA-4)、(IA-5)或(IB-5)所示的2-氯喹唑啉类化合物，
第二方面，本发明提供一种2-氯喹唑啉类化合物的制备方法，所述的制备方法包括：(1)将式(Ⅱ)所示的化合物加入有机溶剂A中，搅拌溶解，在室温搅拌条件下，滴加含有式(ⅢA)或(ⅢB)所示的化合物、催化剂B和有机溶剂A的混合液，滴完后反应液加热至回流状态，搅拌反应0.5～12小时后，反应液经分离纯化得到2-氯喹唑啉类化合物；
所述有机溶剂A为下列之一：二氯甲烷、乙醇、异丙醇或甲苯；
所述催化剂B下列之一：三乙胺、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、吡啶或氢氧化钠；
式(IIIA)中，R为3,4-二氯或3,5-二甲基；式(IIIB)中，R为3-甲基。
进一步，所述式(Ⅱ)所示化合物、式(ⅢA)或(ⅢB)所示化合物与催化剂B的投料物质的量之比为1﹕0.8～1.2﹕0.1～1。
进一步，所述有机溶剂A的用量以能够溶解式(Ⅱ)所示化合物、式(ⅢA)或(ⅢB)所示化合物、催化剂B即可，优选有机溶剂A总体积用量以式(Ⅱ)所示化合物的物质的量计为10～30mL/mmol，其中溶解式(Ⅱ)所示化合物所用有机溶剂A体积用量以式(Ⅱ)所示化合物的物质的量计为4～10mL/mmol，其中溶解式(ⅢA)或(ⅢB)所示化合物和催化剂B所用有机溶剂A体积用量以式(Ⅱ)所示化合物的物质的量计为6～20mL/mmol。
进一步，反应过程用TLC跟踪检测(展开剂为体积比0.5～10：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，以确定反应终点，一般反应时间在0.5～12小时。
进一步，本发明步骤(1)中所述分离纯化采用如下步骤：反应结束后，蒸除溶剂后，残留物柱层析得到2-氯喹唑啉类化合物。
更进一步，本发明步骤(1)中所述柱层析的操作步骤具体如下：取蒸除溶剂后的残留物于单口瓶中，加入有机溶剂C将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入残留物质量1～4倍量的柱层析硅胶(优选300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱上样，然后以体积比为0.5～10：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，进行洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比0.5～10：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含2-氯喹唑啉类化合物的洗脱液，将洗脱液浓缩干燥，获得2-氯喹唑啉类化合物；所述有机溶剂C为下列之一：石油醚、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯；所述有机溶剂C用量以能够溶解残留物即可。
本发明所述有机溶剂A和C均为有机溶剂，为了便于区分不同步骤所用有机溶剂不同而命名，字母本身没有含义。
第三方面，本发明还涉及2-氯喹唑啉类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗乳腺癌药物中的应用，特别适用于制备预防或治疗人乳腺癌细胞株MDA-MB-231药物中的应用。
术语"药学上可接受的"在本申请中是指：化合物在化学上和/或在毒理学上与构成制剂的其它成分和/或与用其预防或治疗疾病或病症的人类或哺乳动物相容。
术语"药学上可接受的盐"是指本发明化合物的相对无毒、无机酸或有机酸加成盐。例如，参见S.M.Berge等人"Pharmaceutical Salts"，J.Pharm.Sci.1977，66，1-19。其中，无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸或硝酸等；有机酸例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)-苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡萄糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、巴莫酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、胺基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、海藻酸、马来酸、富马酸、D-葡萄糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、天冬胺酸、磺基水杨酸等。
本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明所述的2-氯喹唑啉类化合物(Ⅰ)具有好的抗乳腺癌活性，有望应用于制备预防或治疗乳腺癌的药物中；(2)本发明提供的2-氯喹唑啉类化合物的制备方法，简单易于操作，原料易得，且生产成本较低，适于实用。
具体实施方式
本发明结合具体实施例作进一步的说明，以下的实施例是说明本发明的，而不是以任何方式限制本发明。
本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过常规技术手段获得或者通过市购获得的常规产品。
化合物(Ⅱ)的制备参照文献(Journal ofMedicinal Chemistry,2022,65(10),7246-7261；Bioorganic Chemistry,2021,117,105407)的方法制备得到。
化合物(ⅢA)的具体结构如下：
化合物(IA)的具体结构如下：
化合物(ⅢB)的具体结构如下：
化合物(IB)的具体结构如下：
实施例1：化合物(ⅢA-1)的制备
将1.12g(12.0mmol)苯胺和1.22g(10.0mmol)DMAP加入30mL二氯甲烷中搅拌，0～5℃条件下，滴加含有1.64g(10.0mmol)4-硝基苯基异氰酸酯的二氯甲烷溶液30mL，滴毕，室温反应20h，水洗涤(25mL×3)，分离有机相，干燥，过滤，真空蒸除溶剂，残留物用乙醇重结晶，得1-(4-硝基苯基)-3-苯基脲，产率71％。
将1.29g(5.0mmol)1-(4-硝基苯基)-3-苯基脲加入30mL乙醇中，再加入0.20g Pd/C(5％)，室温搅拌条件下，常压下通入氢气反应，TLC检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)至反应结束，过滤，真空蒸除溶剂，残留物用乙醇重结晶，得到产物(ⅢA-1)，产率83％。
化合物(ⅢA-2)～(ⅢA-9)的制备：将苯胺替换为相应的取代苯胺，参照实施例1的方法制备得到相对应的化合物(ⅢA-2)～(ⅢA-9)，在此不再赘述。
实施例2：化合物(ⅢB-1)的制备
将1.29g(12.0mmol)苯甲胺和1.22g(10.0mmol)DMAP加入30mL二氯甲烷中搅拌，0～5℃条件下，滴加含有1.64g(10.0mmol)4-硝基苯基异氰酸酯的二氯甲烷溶液30mL，滴毕，室温反应22h，水洗涤(25mL×3)，分离有机相，干燥，过滤，真空蒸除溶剂，残留物用乙醇重结晶，得1-(4-硝基苯基)-3-苄基脲，产率65％。
将1.36g(5.0mmol)1-(4-硝基苯基)-3-苄基脲加入30mL乙醇中，再加入0.20g Pd/C(5％)，室温搅拌条件下，常压下通入氢气反应，TLC检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)至反应结束，过滤，真空蒸除溶剂，残留物乙醇重结晶，得到产物(ⅢB-1)，产率78％。
化合物(ⅢB-2)～(ⅢB-5)的制备：将苯甲胺替换为相应的取代苯甲胺，参照实施例2的方法制备得到相对应的化合物(ⅢB-2)～(ⅢB-5)，在此不再赘述。
实施例3：化合物(ⅠA-1)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.455g(2.0mmol)化合物(ⅢA-1)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应12小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：2的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：2的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：2的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠA-1)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠA-1)，收率63％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点218～220℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.16(s,1H),8.72(s,1H),8.69(s,1H),8.54(d,J＝8.1Hz,1H),7.91-7.83(m,1H),7.65(d,J＝7.9Hz,2H),7.63(d,J＝8.2Hz,2H),7.51(d,J＝8.9Hz,2H),7.46(d,J＝7.6Hz,2H),7.28(t,J＝7.9Hz,2H),6.97(t,J＝7.3Hz,1H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ155.2,154.6,153.2,152.5,151.3,137.1,133.6,132.3,122.1,119.4,119.1,119.0,118.8,118.4,118.3,116.9,116.7.
实施例4：化合物(ⅠA-1)的制备
将8mL的甲苯溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.545g(2.4mmol)化合物(ⅢA-1)和0.008g(0.2mmol)氢氧化钠的12mL甲苯溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应0.5小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比10：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升二氯甲烷溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比10：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比10：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠA-1)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠA-1)，收率45％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点218～220℃。1H NMR和13C NMR同实施例1。
实施例5：化合物(ⅠA-1)的制备
将20mL的乙醇溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.364g(1.6mmol)化合物(ⅢA-1)和0.202g(2.0mmol)三乙胺的40mL乙醇溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应6小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升氯仿溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠA-1)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠA-1)，收率55％(以化合物(ⅢA-1)物质的量计)，熔点218～220℃。1H NMR和13C NMR同实施例1。
实施例6：化合物(ⅠA-1)的制备
将10mL的异丙醇溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.455g(2.0mmol)化合物(ⅢA-1)和0.079g(1.0mmol)吡啶的15mL异丙醇溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应4小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升乙酸乙酯溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠA-1)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠA-1)，收率42％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点218～220℃。1H NMR和13C NMR同实施例1。
实施例7：化合物(ⅠA-2)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.511g(2.0mmol)化合物(ⅢA-2)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应10小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠA-2)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠA-2)，收率61％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点232～234℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.19(s,1H),9.11(s,1H),8.56(d,J＝1.9Hz,1H),8.12(td,J＝9.3,6.2Hz,1H),7.96(s,1H),7.88-7.84(m,1H),7.71(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),7.69-7.64(m,2H),7.52(d,J＝8.9Hz,2H),7.33-7.29(m,1H),7.27-7.24(m,1H),7.07(dd,J＝8.6,2.9Hz,1H),2.90(s,3H),2.79(s,3H).
实施例8：化合物(ⅠA-3)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.515g(2.0mmol)化合物(ⅢA-3)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应9小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠA-3)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠA-3)，收率68％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点265～267℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.15(s,1H),8.68(s,1H),8.54(s,1H),7.86-7.82(m,1H),7.69(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),7.67-7.58(m,3H),7.55-7.44(m,2H),7.42-7.28(m,2H),7.22-7.07(m,1H),6.96-6.76(m,2H),3.71(s,3H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ163.0,159.6,156.6,154.6,153.0,150.8,150.5,141.0,137.3,133.0,132.0,124.1,122.5,120.1,118.3,114.2,113.9,55.4.
实施例9：化合物(ⅠA-4)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.592g(2.0mmol)化合物(ⅢA-4)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应10小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入7毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠA-4)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠA-4)，收率51％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点188～189℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.18(s,1H),9.05(s,1H),8.89(s,1H),8.54-8.51(m,1H),7.96-7.81(m,2H),7.75-7.60(m,4H),7.52(dd,J＝8.8,4.3Hz,3H),7.34(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H)；13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ159.4,156.4,152.4,150.7,140.1,136.3,134.0,132.5,131.1,130.62,126.8,126.5,123.9,123.4,123.0,119.2,118.6,118.2,113.8.
实施例10：化合物(ⅠA-5)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.511g(2.0mmol)化合物(ⅢA-5)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应8小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠA-5)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠA-5)，收率67％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点204～206℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.15(s,1H),8.69(s,1H),8.54(d,J＝7.3Hz,2H),7.95-7.78(m,2H),7.73-7.67(m,1H),7.65(s,1H),7.66-7.60(m,3H),7.51(d,J＝7.4Hz,2H),7.50(d,J＝7.4Hz,1H),2.24(s,6H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ159.6,156.6,152.7,150.9,139.8,137.9,137.0,134.1,132.2,127.1,127.0,126.7,124.1,123.6,118.4,116.1,113.9,21.3.
实施例11：化合物(ⅠA-6)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.526g(2.0mmol)化合物(ⅢA-6)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应11小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠA-6)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠA-6)，收率67％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点238～239℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.91(s,1H),8.90(s,1H),8.79(s,1H),8.36(d,J＝6.4Hz,1H),7.82(dd,J＝6.7,1.8Hz,1H),7.73(d,J＝8.3Hz,2H),7.50(d,J＝6.0Hz,1H),7.49(s,1H),7.47(s,1H),7.32(td,J＝6.0,3.8Hz,2H),7.17(td,J＝8.4,1.7Hz,2H),13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ162.1,159.2,156.2,152.2,150.6,140.7,136.2,133.8,132.2,126.8,126.7,126.6,126.3,123.8,123.26,118.1,115.1,113.6,99.4.
实施例12：化合物(ⅠA-7)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.523g(2.0mmol)化合物(ⅢA-7)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应6小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠA-7)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠA-7)，收率59％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点198～199℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.81(s,1H),9.66(d,J＝6.4Hz,1H),8.83(s,1H),8.77(s,1H),8.57(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H),7.85(d,J＝8.2Hz,1H),7.66(d,J＝8.9Hz,2H),7.56-7.53(m,2H),7.47-7.44(m,2H),7.31-7.27(m,2H),6.98(d,J＝7.4Hz,1H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ155.2,154.6,154.4,152.4,141.3,135.2,133.6,133.1,132.3,130.3,124.0,122.1,121.3,118.8,117.5,116.5,100.2.
实施例13：化合物(ⅠA-8)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.483g(2.0mmol)化合物(ⅢA-8)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应5小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠA-8)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠA-8)，收率55％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点182～184℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.16(s,1H),8.71(s,1H),8.62(s,1H),8.52(d,J＝7.9Hz 1H),7.89-7.85(m,1H),7.70(d,J＝7.5Hz 1H),7.65(m,3H),7.53-7.50(m,2H),7.32(s,1H),7.25(d,J＝8.35Hz 1H),7.18(m,1H),6.80(d,J＝7.35Hz 1H),2.29(s,3H).
实施例14：化合物(ⅠA-9)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.515g(2.0mmol)化合物(ⅢA-9)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应9小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠA-9)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠA-9)，收率51％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点228～230℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.17(s,1H),8.72(s,2H),8.55(d,J＝8.3Hz,1H),7.88(t,J＝7.7Hz,1H),7.71(d,J＝8.3Hz,1H),7.65(dd,J＝8.4,2.7Hz,3H),7.51(dd,J＝6.7,2.2Hz,2H),7.19-7.14(m,2H),6.94(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),6.56(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),3.74(s,3H).
实施例15：化合物(ⅠB-1)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.483g(2.0mmol)化合物(ⅢB-1)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应12小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：2的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：2的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：2的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠB-1)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠB-1)，收率70％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点189～191℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.19(s,1H),10.10(s,1H),8.55(d,J＝8.0Hz,1H),7.88-7.84(m,2H),7.71(d,J＝7.9Hz,2H),7.68(d,J＝5.7Hz,3H),7.64-7.61(m,2H),7.16-6.12(m,2H),6.74(dd,J＝6.3,2.8Hz,1H),6.61-6.57(m,1H),3.90(s,2H).
实施例16：化合物(ⅠB-1)的制备
将8mL的甲苯溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.579g(2.4mmol)化合物(ⅢB-1)和0.008g(0.2mmol)氢氧化钠的12mL甲苯溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应0.5小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比10：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升二氯甲烷溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比10：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比10：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠB-1)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠB-1)，收率56％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点189～191℃。1HNMR同实施例1。
实施例17：化合物(ⅠB-1)的制备
将20mL的乙醇溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.386g(1.6mmol)化合物(ⅢB-1)和0.202g(2.0mmol)三乙胺的40mL乙醇溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应6小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升氯仿溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠB-1)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠB-1)，收率67％(以化合物(ⅢB-1)物质的量计)，熔点189～191℃。1H NMR同实施例1。
实施例18：化合物(ⅠB-1)的制备
将10mL的异丙醇溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.483g(2.0mmol)化合物(ⅢB-1)和0.079g(1.0mmol)吡啶的15mL异丙醇溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应4小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升乙酸乙酯溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠB-1)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠB-1)，收率54％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点189～191℃。1H NMR同实施例1。
实施例19：化合物(ⅠB-2)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.687g(2.0mmol)化合物(ⅢB-2)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应11小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠB-2)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠB-2)，收率55％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点267～269℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.18(d,J＝8.8Hz,2H),8.55(dd,J＝8.4,1.3Hz,1H),7.89-7.85(m,1H),7.77-7.56(m,6H),7.39(d,J＝8.8Hz,1H),7.07(d,J＝6.8Hz,1H),6.85(dd,J＝8.8,2.9Hz,1H),6.73(s,1H),3.99(s,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ168.4,159.6,156.5,151.0,147.9,135.8,134.2,133.7,132.1,127.0,126.7,123.8,123.6,119.6,116.5,116.0,113.9,111.3,46.8,35.9.
实施例20：化合物(ⅠB-3)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.551g(2.0mmol)化合物(ⅢB-3)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应10小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠB-3)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠB-3)，收率67％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点271～273℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.11(s,1H),8.53(d,J＝7.3Hz,2H),7.86(m,1H),7.69(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),7.62(t,J＝6.3Hz,1H),7.59-7.52(m,2H),7.48-7.40(m,2H),7.40-7.34(m,2H),7.33-7.21(m,2H),6.13(t,J＝5.7Hz,1H),2.76(t,J＝7.0Hz,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ159.6,156.7,155.4,151.0,138.8,137.8,134.1,131.5,130.9,130.8,128.4,127.0,126.6,124.1,123.5,117.9,113.9,35.3.
实施例21：化合物(ⅠB-4)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.542g(2.0mmol)化合物(ⅢB-4)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应8小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入7毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠB-4)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠB-4)，收率62％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点＞300℃。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.19(s,1H),10.06(s,1H),8.59-8.49(m,1H),7.88(m,1H),7.79-7.54(m,6H),7.00(t,J＝8.4Hz,1H),6.30-6.10(m,3H),6.03(t,J＝6.1Hz,1H),3.87(d,J＝6.1Hz,2H),3.67(s,3H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ169.0,160.2,159.2,156.2,150.7,149.5,135.6,133.8,133.2,129.5,126.7,126.4,123.5,123.2,119.3,113.6,105.3,101.9,98.2,54.5,47.2.
实施例22：化合物(ⅠB-5)的制备
将20mL的二氯甲烷溶解0.398g(2.0mmol)2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)，室温磁力搅拌条件下，滴加含有0.511g(2.0mmol)化合物(ⅢB-5)和0.122g(1.0mmol)DMAP的30mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液油浴加热至回流，回流反应10小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液蒸除溶剂，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入1.5克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(ⅠB-5)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(ⅠB-5)，收率48％(以2,4-二氯喹唑啉(Ⅱ)物质的量计)，熔点269～271℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.19(s,1H),10.03(s,1H),8.55(d,J＝8.0Hz,1H),8.10(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.91-7.87(m,2H),7.72(s,1H),7.67-7.63(m,2H),7.59-7.56(m,1H),7.25-7.21(m,1H),6.99(t,J＝7.7Hz,1H),6.52-6.31(m,3H),3.87(d,J＝5.9Hz,2H),2.20(s,3H).
实施例23：抗癌活性体外测试
将制得的化合物(ⅠA-1)～(ⅠA-9)分别进行了人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、人肝癌细胞Huh7、人肝癌细胞HepG2生物活性测试，其中化合物(ⅠA-1)由实施例3方法制备得到。将制得的化合物(ⅠB-1)～(ⅠB-5)分别进行了人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、人肝癌细胞Huh7、人肝癌细胞HepG2生物活性测试，其中化合物(ⅠB-1)由实施例15方法制备得到。
测试方法：四氮唑盐还原法(MTT法)。
细胞株：人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、人肝癌细胞Huh7、人肝癌细胞HepG2。上述细胞株购自中国科学院上海生命科学院细胞库。
实验步骤如下：
(1)肿瘤细胞的培养
实验所用的细胞代数均在5代以内。细胞培养所用的耗材和试剂均经过严格的灭菌操作，并且所有实验操作均在无菌操作台内进行。
(a)肿瘤细胞的复苏
实验开始前先把要使用的物品，如培养瓶、离心管、移液枪、枪头、废液桶等放入超净台打开紫外灯灭菌，并将细胞培养所用的试剂放入37℃恒温水浴锅内预热。一切准备工作就绪后关掉紫外灯，开启超净台日光灯及通风扇。从-80℃冰箱内取出冻存的肿瘤细胞，在37℃水浴中振摇快速解冻，保证冻存管内冻存液仍有少部分未解冻的情况下，喷酒精放入超净台，然后立即将冻存管内的细胞全部转移至已加入1640培养液的15mL离心管中，用移液枪轻轻吹打混匀。将离心管置于离心机中，转速1000rpm离心5min，在超净台内吸掉上清液。用移液枪吸取2mL1640培养液至含有细胞沉淀的离心管中制成细胞悬液，并将细胞悬液吹打混匀转移到瓶底面积为25cm2的透气培养瓶中，再补加1640培养液4mL，轻轻摇晃培养瓶混匀细胞，将培养瓶放至5％CO2、37℃恒温培养箱中培养。
(b)肿瘤细胞的传代
当细胞生长状态良好并且铺满培养瓶瓶底70％～80％时，即可进行传代。传代操作步骤均在超净台内完成，将准备工作做好后即可开始传代。首先将培养瓶中的原有培养液用移液枪吸掉打进废液桶内，加2mL的PBS反复洗涤几次吸掉，然后加入600～700μL左右的胰蛋白酶(含0.02％EDTA、酚红和0.25％胰酶)，保证瓶底完全被胰蛋白酶覆住，轻轻摇动培养瓶，放入37℃恒温培养箱中孵育1～2min，在显微镜下观察细胞脱落情况，如有少量细胞仍贴在壁上，可以用指肚轻轻敲打甁壁，直至细胞大部分能从瓶底脱落。加入2mL的1640培养液终止消化后用移液枪轻轻吹打细胞，将细胞从瓶底全部吹落，并将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm,离心5min。吸掉上清液，用1640培养液稀释吹打均匀后平均分配到2～3个培养瓶中继续在5％CO2、37℃恒温培养箱内培养。
(c)肿瘤细胞的冻存
预先按照FBS(胎牛血清):DMSO＝9:1的体积比例配置好细胞冻存液，置于4℃冰箱备用。冻存操作步骤均在超净台内完成，将准备工作做好后即可开始冻存。首先将培养瓶中的原有培养液吸掉，加2mL的PBS缓冲液反复洗涤几次倒掉，然后加入600～700μL左右的胰蛋白酶(含0.02％EDTA、酚红和0.25％胰酶)，轻轻摇动培养瓶，保证胰酶能够把培养瓶瓶底覆盖，放入37℃恒温培养箱中孵育1～2min，在显微镜下观察细胞脱落情况，如有少量细胞仍贴在壁上，可以用指肚轻轻敲打甁壁，直至细胞能大部分从瓶底脱落。加入2mL的1640培养液终止消化后用移液枪轻轻吹打细胞，将细胞从瓶底全部吹落，并将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm，离心5min。倒掉上清液。加入1mL刚从4℃冰箱取出的冻存液，并吹打均匀形成细胞悬液，转移至冻存管内。在标记好细胞种类、细胞代数、冻存日期后放入4℃中静置30min，-20℃中静置1小时后放入-80℃超低温冰箱内保存。
(2)MTT实验方法
(a)细胞计数：将培养瓶中生长状态良好的肿瘤细胞经消化、离心后，用4mL1640培养液重悬，取10μL细胞悬液至细胞计数板，计数后，B16F10细胞稀释到5×104个/mL。
(b)铺板：取96孔板，实验孔加入100μL稀释过的细胞悬液，空白孔加入100μL1640培养液，周围补加100μLPBS缓冲液，在CO2恒温培养箱中培养。
(c)配制化合物加药：用1640培养液将DMSO配置的10μmol/mL化合物以及阳性对照药索拉非尼稀释到指定浓度，分别为40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM，采用换液法进行上药。将原有培养液弃去，向实验孔中加入100μL含化合物或者阳性对照药的1640培养液，向对照组以及空白孔中加入100μL1640培养液，加药后把96孔板放入5％CO2、37℃恒温培养箱内继续培养。
(d)加MTT：48小时后，取出96孔板放入超净台内，避光条件下每孔加入10μL，5mg/mL的MTT溶液，之后放入5％CO2、37℃恒温培养箱内继续培养。
(e)检测：加入MTT的96孔板在培养箱中孵育3.5～4h取出，将每孔中的溶液小心地吸出，每孔加入150μL的DMSO溶解生成的甲臜，然后放至平板振荡器上震荡20min，使用酶标仪检测490nm下的吸光度值。
(f)实验数据处理：按照以下公式计算细胞存活率，细胞存活率50％的值即为IC50。
细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％
As:实验孔(含有细胞的培养液、MTT、毒性物质(即化合物(IA)或(IB)))
Ac:对照孔(含有细胞的培养液、MTT、没有毒性物质)
Ab:空白孔(含MTT、不含细胞和毒性物质的培养液)。
测试的结果如表1所示：
表1.化合物(ⅠA)对癌细胞生长的抑制作用(IC50，μΜ)
化合物 MDA-MB-231 HepG2 Huh7
IA-1 ≥40 9.10±0.28 ≥40
IA-2 ≥40 ≥40 ≥40
IA-3 ≥40 14.93±1.73 ≥40
IA-4 10.69±0.84 ≥40 ≥40
IA-5 7.71±0.48 ≥40 ≥40
IA-6 ≥40 9.08±0.82 13.59±2.34
IA-7 ≥40 ≥40 ≥40
IA-8 ≥40 12.35±1.04 ≥40
IA-9 ≥40 ≥40 ≥40
索拉非尼 9.14±0.82 8.15±0.26 -
表2.化合物(ⅠB)对癌细胞生长的抑制作用(IC50，μΜ)
/>

Claims (5)

1.一种2-氯喹唑啉类化合物，其特征在于：所述2-氯喹唑啉类化合物的结构如式(IA-4)、(IA-5)或(IB-5)所示：
2.一种如权利要求1所述的2-氯喹唑啉类化合物的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括：(1)将式(Ⅱ)所示的化合物加入有机溶剂A中，搅拌溶解，在室温搅拌条件下，滴加含有式(ⅢA)或(ⅢB)所示的化合物、催化剂B和有机溶剂A的混合液，滴完后反应液加热至回流状态，搅拌反应0.5～12小时后，反应液经分离纯化得到2-氯喹唑啉类化合物；
所述有机溶剂A为下列之一：二氯甲烷、乙醇、异丙醇或甲苯；
所述催化剂B下列之一：三乙胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶或氢氧化钠；
式(IIIA)中，R为3,4-二氯或3,5-二甲基；式(IIIB)中，R为3-甲基。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述式(Ⅱ)所示化合物、式(ⅢA)或(ⅢB)所示化合物与催化剂B的投料物质的量之比为1﹕0.8～1.2﹕0.1～1。
4.如权利要求1所述的2-氯喹唑啉类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗乳腺癌药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述预防或治疗乳腺癌药物为制备预防或治疗人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的药物。
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