CN117756733A - 脲基四嗪类化合物及其制备和应用 - Google Patents

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CN117756733A CN202310881325.4A CN202310881325A CN117756733A CN 117756733 A CN117756733 A CN 117756733A CN 202310881325 A CN202310881325 A CN 202310881325A CN 117756733 A CN117756733 A CN 117756733A
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郑翔
饶国武
艾晶燕
程康
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Abstract

本发明公开了一种脲基四嗪类化合物及其制备和应用。所述脲基四嗪类化合物具有下列结构式(Ⅰ)，其制备方法如反应方程式所示。本发明提供了所述的脲基四嗪类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防癌症药物中的应用，所述的癌症为人宫颈癌，所述的癌症的癌细胞为Hela细胞。本发明提供的脲基四嗪类化合物对于人宫颈癌细胞具有良好抑制活性。

Description

脲基四嗪类化合物及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种脲基四嗪类化合物及其制备方法，以及所述化合物在制备治疗或预防人宫颈癌药物中的应用。
背景技术
四嗪类化合物具有许多较好的物理性质、光谱性质以及较高的反应活性，尤其一些特殊结构的四嗪衍生物具有明显的抗肿瘤活性、抗病毒活性，以及可用作为农药及杀虫剂。例如农药已有两个品种(四螨嗪和氟螨嗪)上市，医药已有一个品种(抗肿瘤药替莫唑胺)上市。
1978年，文献报道3,6-二苯炔基-六氢-1,2,4,5-四嗪具有抗肿瘤活性(参阅Eremeev,A.V.；Tikhomirova,D.A.；Tyusheva,V.A.；Liepins,F.Khim.Geterotsikl.Soedin,1978,753)，这是1,2,4,5-四嗪类化合物首次被报道可能有潜在的抗肿瘤活性。之后，陆续报道了一些1,2,4,5-四嗪类化合物具有抗肿瘤活性，例如具有抗肿瘤活性的3,6-双(2'-羟基-5'-氯苯基)-1,2,4,5-四嗪(参阅Rao,G.-W.；Hu,W.-X.Bioorg.Med.Chem.Lett.2006,16(14),3702)。当然大多数1,2,4,5-四嗪类化合物并不具有抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种对于人宫颈癌细胞具有良好抑制活性的新型脲基四嗪类化合物。
本发明的第二个目的是提供所述脲基四嗪类化合物的制备方法，该制备方法简便，易于操作，原料易得，且生产成本较低，适于工业化应用。
本发明的第三个目的是提供所述脲基四嗪类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防癌症药物中的应用，所述的癌症为人宫颈癌，所述的癌症的癌细胞为Hela细胞。
下面对本发明所采用的技术方案做具体说明。
第一方面，本发明提供了一种脲基四嗪类化合物，其具有下列结构式(Ⅰ)：
第二方面，本发明提供了一种式(I)所示的脲基四嗪类化合物的制备方法，所述制备方法包括：
(1)将三光气加入有机溶剂A中，在-10～12℃搅拌条件下，滴加含有式(Ⅱ)所示的3,6-二甲基-1,6-二氢-1,2,4,5-四嗪和碱性催化剂a的有机溶剂A溶液，滴完后反应液升至室温，室温搅拌反应0.5～50小时后，向反应体系通入氮气并用尾气吸收装置吸收尾气，至碱性尾气吸收液(优选NaOH水溶液)中不产生白雾，生成的产物直接用于下一步反应；
(2)将式(Ⅲ)所示的化合物和碱性催化剂b加入有机溶剂B中，搅拌溶解，在-10～12℃搅拌条件下滴加步骤(1)得到的反应液，滴完后反应液升至室温，室温搅拌反应0.5～50小时后，反应液经分离纯化得到式(Ⅰ)所示的脲基四嗪类化合物；
所述碱性催化剂a和碱性催化剂b各自独立为下列之一：三乙胺、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、吡啶或氢氧化钠；
本发明所述制备脲基四嗪类化合物(Ⅰ)的反应如下列反应式所示，下列反应式尚未见文献报道：
进一步，所述的化合物(Ⅱ)与碱性催化剂a、碱性催化剂b、三光气、化合物(Ⅲ)的投料物质的量之比为1﹕0.1～3﹕0.1～3﹕0.1～3﹕0.1～3，优选为所述的化合物(Ⅱ)与碱性催化剂a、碱性催化剂b、三光气、化合物(Ⅲ)的投料物质的量之比为1﹕0.1～2﹕0.1～2﹕0.1～2﹕0.1～2。
进一步，所述有机溶剂A和有机溶剂B各自独立选自下列之一：二氯甲烷、氯仿或甲苯。所述有机溶剂A的用量以能够溶解三光气、化合物(Ⅱ)、碱性催化剂a即可，所述有机溶剂B的用量以能够溶解碱性催化剂b、化合物(Ⅲ)即可。优选有机溶剂A总体积用量以式(Ⅱ)所示化合物物质的量计为3-18mL/mmol，其中溶解三光气所用有机溶剂A体积用量以式(Ⅱ)所示化合物的物质的量计为1-10mL/mmol，有机溶剂B总体积用量以式(Ⅱ)所示化合物的物质的量计为2-20mL/mmol。
进一步，步骤(1)中，在-10～5℃搅拌条件下，滴加含有式(Ⅱ)所示的3,6-二甲基-1,6-二氢-1,2,4,5-四嗪和碱性催化剂a的有机溶剂A溶液。
进一步，步骤(2)中，在-10～5℃搅拌条件下滴加步骤(1)反应完成的反应液。
进一步，步骤(1)和(2)的反应过程用TLC跟踪检测(展开剂为体积比0.5～20：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，以确定反应终点，一般反应时间在0.5～50小时。
进一步，步骤(2)所述分离纯化采用如下步骤：反应结束后，反应液水洗，分出有机相，蒸除溶剂后，残留物柱层析得到式(Ⅰ)所示的取代苯基二甲基四嗪甲酰胺类化合物。
更进一步，所述柱层析的操作步骤具体如下：取蒸除溶剂后的残留物于单口瓶中，加入有机溶剂C将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入残留物质量1～2倍量的柱层析硅胶(优选300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱上样，然后以体积比为0.5～20：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，进行洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比0.5～20：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(Ⅰ)所示化合物的洗脱液，将洗脱液浓缩干燥，获得式(Ⅰ)所示化合物；所述有机溶剂C为下列之一：石油醚、二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯；所述有机溶剂C用量以能够溶解残留物即可。
本发明所述的有机溶剂A、有机溶剂B、有机溶剂C，所表示的都是指用于反应或柱层析的有机溶剂，这里的字母并没有特指某一些有机溶剂的含义，字母只是为了便于表达清楚，用来区分这些出现在不同的步骤中的有机溶剂。上述有机溶剂A为同一有机溶剂，有机溶剂A、B、或C可以为同一溶剂，也可为不同种溶剂。所述的碱性催化剂a、碱性催化剂b中的a和b也不是特指某一类碱性催化剂，字母只是为了区分不同步骤使用的碱性催化剂，碱性催化剂a、碱性催化剂b可以选择同一种碱性催化剂，也可以选择不同的碱性催化剂。
第三方面，本发明提供了式(Ⅰ)所示的脲基四嗪类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防癌症药物中的应用。所述的癌症为人宫颈癌，所述的癌症的癌细胞为Hela细胞。
术语"药学上可接受的"在本申请中是指：化合物在化学上和/或在毒理学上与构成制剂的其它成分和/或与用其预防或治疗疾病或病症的人类或哺乳动物相容。
术语"药学上可接受的盐"是指本发明化合物的相对无毒、无机酸或有机酸加成盐。例如，参见S.M.Berge等人"Pharmaceutical Salts"，J.Pharm.Sci.1977，66，1-19。其中，无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸或硝酸等；有机酸例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)-苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡萄糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、巴莫酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、胺基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、海藻酸、马来酸、富马酸、D-葡萄糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、天冬胺酸、磺基水杨酸等。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)提供了一种新型的、具有良好的抗癌(尤其是人宫颈癌)活性的1,2,4,5-四嗪类化合物；(2)提供了该1,2,4,5-四嗪类化合物的制备方法，该制备方法简单，易于操作，原料易得且生产成本较低，适于实用，有望应用于制备预防或治疗肿瘤疾病的药物中；(3)提供了一类新型1,2,4,5-四嗪类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防癌症药物中的应用，表现出对人宫颈癌Hela细胞具有良好的抑制活性。
具体实施方式
本发明结合具体实施例作进一步的说明，以下的实施例是说明本发明的，而不是以任何方式限制本发明。
本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过常规技术手段获得或者通过市购获得的常规产品。
3,6-二甲基-1,6-二氢-1,2,4,5-四嗪(Ⅱ)的制备参照文献(SyntheticCommunications,2003,33(16),2769-2775)的方法制备得到。
实施例1：化合物(Ⅲ)的制备
三口烧瓶中加入2-(4-氯苯基)乙胺(7.47g，48.0mmol)和三乙胺(4.05g，40.0mmol)，加入120mL四氢呋喃搅拌溶解，冰浴控温0-5℃，滴加含有4-硝基苯基异氰酸酯(6.57g,40.0mmol)的四氢呋喃溶液60mL，滴毕，撤冰浴，室温反应，TLC监测(PE:EA＝1:2)直至反应结束，真空蒸除溶剂，酸水洗涤(100mL×3)，甲醇重结晶得1-(4-氯苯乙基)-3-(4-硝基苯基)脲4.12g。
三口烧瓶中依次加入1-(4-氯苯乙基)-3-(4-硝基苯基)脲3.20g(10mmol)，乙醇(60mL)、蒸馏水(25mL)和冰醋酸(3.3mL)，磁力搅拌，再加入活性铁粉0.33g(6mmol)，回流反应，TLC监测(PE:EA＝1:2)直至反应结束。趁热过滤，乙酸乙酯(25mL×3)洗涤滤饼，合并有机相，蒸除溶剂，残留物用饱和NaHCO3水溶液调节pH至10，乙酸乙酯萃取(40mL×3)，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，蒸除溶剂，得产物(Ⅲ)2.05g。该方法合成的化合物(III)供下列实施例使用。
实施例2：化合物(Ⅰ)的制备
将10mL的氯仿溶解0.297g(1.0mmol)三光气，-10℃磁力搅拌条件下，滴加含有1.121g(10.0mmol)3,6-二甲基-1,6-二氢-1,2,4,5-四嗪(Ⅱ)和0.122g(1.0mmol)DMAP的20mL氯仿溶液，滴完后反应液升至室温，室温反应50小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：2的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，向反应体系通入氮气，并用尾气吸收装置吸收气体(尾气吸收液为10％NaOH水溶液)，至尾气吸收液中不再产生白雾，生成的产物直接用于下一步反应。
将60mL的氯仿溶解2.898g(10.0mmol)化合物(Ⅲ)和0.122g(1.0mmol)DMAP，-10℃磁力搅拌条件下，滴加上步反应完成的反应液，滴完后反应液升至室温，室温反应10小时后(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比1：2的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液用(50mL×3)水洗，分出有机相，蒸除溶剂后，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升石油醚溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入2.0克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比1：2的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比1：2的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(Ⅰ)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(Ⅰ)，收率30％(以3,6-二甲基-1,6-二氢-1,2,4,5-四嗪物质的量计，除实施例5外，下同)，熔点234～236℃。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.22(s,1H),8.74(s,1H),8.40(s,1H),7.42-7.39(m,2H),7.38-7.35(m,2H),7.30-7.25(m,4H),6.08(t,J＝5.8Hz,1H),3.31(q,J＝6.7Hz,2H),2.74(t,J＝7.0Hz,2H),2.17(s,3H),1.93(s,3H).
实施例3：化合物(Ⅰ)的制备
将100mL的二氯甲烷溶解8.903g(30.0mmol)三光气，12℃磁力搅拌条件下，滴加含有1.121g(10.0mmol)3,6-二甲基-1,6-二氢-1,2,4,5-四嗪(Ⅱ)和2.373g(30.0mmol)吡啶的80mL二氯甲烷溶液，滴完后反应液升至室温，室温反应0.5小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比20：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，向反应体系通入氮气，并用尾气吸收装置吸收气体(尾气吸收液为10％NaOH水溶液)，至尾气吸收液中不再产生白雾，生成的产物直接用于下一步反应。
将200mL二氯甲烷溶解8.694g(30.0mmol)化合物(Ⅲ)和2.373g(30.0mmol)吡啶，12℃磁力搅拌条件下，滴加上步反应完成的反应液，滴完后反应液升至室温，室温反应0.5小时后(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比20：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液用(50mL×3)水洗，分出有机相，蒸除溶剂后，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升二氯甲烷溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入4.0克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比20：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比20：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(Ⅰ)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(Ⅰ)，收率52％，熔点234～236℃。1H NMR同实施例1。
实施例4：化合物(Ⅰ)的制备
将40mL的甲苯溶解5.935g(20.0mmol)三光气，0℃磁力搅拌条件下，滴加含有1.121g(10.0mmol)3,6-二甲基-1,6-二氢-1,2,4,5-四嗪(Ⅱ)和2.024g(20.0mmol)三乙胺的20mL甲苯溶液，滴完后反应液升至室温，室温反应3小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比10：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，向反应体系通入氮气，并用尾气吸收装置吸收气体(尾气吸收液为10％NaOH水溶液)，至尾气吸收液中不再产生白雾，生成的产物直接用于下一步反应。
将50mL甲苯溶解5.796g(20.0mmol)化合物(Ⅲ)和2.024g(20.0mmol)三乙胺，0℃磁力搅拌条件下，滴加上步反应完成的反应液，滴完后反应液升至室温，室温反应8小时后(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比10：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液用(50mL×3)水洗，分出有机相，蒸除溶剂后，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升乙酸乙酯溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入3.0克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比10：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比10：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(Ⅰ)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(Ⅰ)，收率41％，熔点234～236℃。1H NMR同实施例1。
实施例5：化合物(Ⅰ)的制备
将20mL的甲苯溶解1.484g(5.0mmol)三光气，5℃磁力搅拌条件下，滴加含有1.121g(10.0mmol)3,6-二甲基-1,6-二氢-1,2,4,5-四嗪(Ⅱ)和0.200g(5.0mmol)氢氧化钠的50mL甲苯溶液，滴完后反应液升至室温，室温反应12小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，向反应体系通入氮气，并用尾气吸收装置吸收气体(尾气吸收液为10％NaOH水溶液)，至尾气吸收液中不再产生白雾，生成的产物直接用于下一步反应。
将20mL的氯仿溶解0.290g(1.0mmol)化合物(Ⅲ)和0.200g(5.0mmol)氢氧化钠，5℃磁力搅拌条件下，滴加上步反应完成的反应液，滴完后反应液升至室温，室温反应50小时后(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液用(50mL×3)水洗，分出有机相，蒸除溶剂后，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升氯仿溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入0.3克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(Ⅰ)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(Ⅰ)，收率34％(以化合物Ⅲ物质的量计)，熔点234～236℃。1H NMR同实施例1。
实施例6：化合物(Ⅰ)的制备
将20mL的甲苯溶解1.484g(5.0mmol)三光气，5℃磁力搅拌条件下，滴加含有1.121g(10.0mmol)3,6-二甲基-1,6-二氢-1,2,4,5-四嗪(Ⅱ)和0.200g(5.0mmol)氢氧化钠的50mL甲苯溶液，滴完后反应液升至室温，室温反应12小时(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，向反应体系通入氮气，并用尾气吸收装置吸收气体(尾气吸收液为10％NaOH水溶液)，至尾气吸收液中不再产生白雾，生成的产物直接用于下一步反应。
将60mL的二氯甲烷溶解2.898g(10.0mmol)化合物(Ⅲ)和1.012g(10.0mmol)三乙胺，-5℃磁力搅拌条件下，滴加上步反应完成的反应液，滴完后反应液升至室温，室温反应9小时后(反应过程采用TLC跟踪检测，展开剂为体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，反应液用(50mL×3)水洗，分出有机相，蒸除溶剂后，残留物柱层析，即取蒸除溶剂后的残留物加入10毫升氯仿溶剂将其溶解，获得溶解液，然后向溶解液中加入3.0克硅胶(300～400目粗孔(zcx.II)型柱层析硅胶)，混匀后，蒸除溶剂，得干燥的残留物与硅胶的混合物，将混合物装柱，然后以体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为洗脱剂，洗脱，TLC跟踪检测(展开剂为体积比5：1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液)，根据TLC检测收集含式(Ⅰ)所示的化合物的洗脱液，收集的洗脱液蒸除溶剂，干燥得到白色固体产物，即化合物(Ⅰ)，收率38％，熔点234～236℃。1H NMR同实施例1。
实施例7：抗癌活性体外测试
参照实例1合成了下列化合物1a～1h：
将上述制得的化合物1a～1h和化合物(Ⅰ)分别进行了人宫颈癌细胞Hela、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞Huh7、人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MDA-MB-231生物活性测试，其中化合物(Ⅰ)按照实施例1方法制得。
测试方法：四氮唑盐还原法(MTT法)。
细胞株：人宫颈癌细胞Hela、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞Huh7、人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MDA-MB-231。上述肿瘤细胞株购自中国科学院上海生命科学院细胞库。
实验步骤如下：
(1)肿瘤细胞的培养
实验所用的细胞代数均在5代以内。细胞培养所用的耗材和试剂均经过严格的灭菌操作，并且所有实验操作均在无菌操作台内进行。
(a)肿瘤细胞的复苏
实验开始前先把要使用的物品，如培养瓶、离心管、移液枪、枪头、废液桶等放入超净台打开紫外灯灭菌，并将细胞培养所用的试剂放入37℃恒温水浴锅内预热。一切准备工作就绪后关掉紫外灯，开启超净台日光灯及通风扇。从-80℃冰箱内取出冻存的肿瘤细胞，在37℃水浴中振摇快速解冻，保证冻存管内冻存液仍有少部分未解冻的情况下，喷酒精放入超净台，然后立即将冻存管内的细胞全部转移至已加入1640培养液的15mL离心管中，用移液枪轻轻吹打混匀。将离心管置于离心机中，转速1000rpm离心5min，在超净台内吸掉上清液。用移液枪吸取2mL1640培养液至含有细胞沉淀的离心管中制成细胞悬液，并将细胞悬液吹打混匀转移到瓶底面积为25cm2的透气培养瓶中，再补加1640培养液4mL，轻轻摇晃培养瓶混匀细胞，将培养瓶放至5％ CO2、37℃恒温培养箱中培养。
(b)肿瘤细胞的传代
当细胞生长状态良好并且铺满培养瓶瓶底70％～80％时，即可进行传代。传代操作步骤均在超净台内完成，将准备工作做好后即可开始传代。首先将培养瓶中的原有培养液用移液枪吸掉打进废液桶内，加2mL的PBS反复洗涤几次吸掉，然后加入600～700μL左右的胰蛋白酶(含0.02％EDTA、酚红和0.25％胰酶)，保证瓶底完全被胰蛋白酶覆住，轻轻摇动培养瓶，放入37℃恒温培养箱中孵育1～2min，在显微镜下观察细胞脱落情况，如有少量细胞仍贴在壁上，可以用指肚轻轻敲打甁壁，直至细胞大部分能从瓶底脱落。加入2mL的1640培养液终止消化后用移液枪轻轻吹打细胞，将细胞从瓶底全部吹落，并将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm，离心5min。吸掉上清液，用1640培养液稀释吹打均匀后平均分配到2～3个培养瓶中继续在5％ CO2、37℃恒温培养箱内培养。
(c)肿瘤细胞的冻存
预先按照FBS(胎牛血清):DMSO＝9:1的体积比例配置好细胞冻存液，置于4℃冰箱备用。冻存操作步骤均在超净台内完成，将准备工作做好后即可开始冻存。首先将培养瓶中的原有培养液吸掉，加2mL的PBS缓冲液反复洗涤几次倒掉，然后加入600～700μL左右的胰蛋白酶(含0.02％EDTA、酚红和0.25％胰酶)，轻轻摇动培养瓶，保证胰酶能够把培养瓶瓶底覆盖，放入37℃恒温培养箱中孵育1～2min，在显微镜下观察细胞脱落情况，如有少量细胞仍贴在壁上，可以用指肚轻轻敲打甁壁，直至细胞能大部分从瓶底脱落。加入2mL的1640培养液终止消化后用移液枪轻轻吹打细胞，将细胞从瓶底全部吹落，并将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm,离心5min。倒掉上清液。加入1mL刚从4℃冰箱取出的冻存液，并吹打均匀形成细胞悬液，转移至冻存管内。在标记好细胞种类、细胞代数、冻存日期后放入4℃中静置30min,-20℃中静置1小时后放入-80℃超低温冰箱内保存。
(2)MTT实验方法
(a)细胞计数：将培养瓶中生长状态良好的肿瘤细胞经消化、离心后，用4mL1640培养液重悬，取10μL细胞悬液至细胞计数板，计数后，B16F10细胞稀释到5×104个/mL。
(b)铺板：取96孔板，实验孔加入100μL稀释过的细胞悬液，空白孔加入100μL1640培养液，周围补加100μL PBS缓冲液，在CO2恒温培养箱中培养。
(c)配制化合物加药：用1640培养液将DMSO配置的10μmol/mL化合物以及阳性对照药索拉菲尼稀释到指定浓度，分别为20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM，采用换液法进行上药。将原有培养液弃去，向实验孔中加入100μL含化合物或者阳性对照药的1640培养液，向对照组以及空白孔中加入100μL1640培养液，加药后把96孔板放入5％ CO2、37℃恒温培养箱内继续培养。
(d)加MTT：48小时后，取出96孔板放入超净台内，避光条件下每孔加入10μL，5mg/mL的MTT溶液，之后放入5％ CO2、37℃恒温培养箱内继续培养。
(e)检测：加入MTT的96孔板在培养箱中孵育3.5～4h取出，将每孔中的溶液小心地吸出，每孔加入150μL的DMSO溶解生成的甲臜，然后放至平板振荡器上震荡20min，使用酶标仪检测490nm下的吸光度值。
(f)实验数据处理：按照以下公式计算细胞存活率，细胞存活率50％的值即为IC50。
细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％
As:实验孔(含有细胞的培养液、MTT、毒性物质)
Ac:对照孔(含有细胞的培养液、MTT、没有毒性物质)
Ab:空白孔(含MTT、不含细胞和毒性物质的培养液)。
测试的结果如表2所示：
表2.化合物对癌细胞生长的抑制作用

Claims (8)

1.一种脲基四嗪类化合物，其具有下列结构式(Ⅰ)：
2.一种如权利要求1所述的脲基四嗪类化合物的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：
(1)将三光气加入有机溶剂A中，在-10～12℃搅拌条件下，滴加含有式(Ⅱ)所示的3,6-二甲基-1,6-二氢-1,2,4,5-四嗪和碱性催化剂a的有机溶剂A溶液，滴完后反应液升至室温，室温搅拌反应0.5～50小时后，向反应体系通入氮气并用尾气吸收装置吸收尾气，至碱性尾气吸收液中不产生白雾，生成的产物直接用于下一步反应；
(2)将式(Ⅲ)所示的化合物和碱性催化剂b加入有机溶剂B中，搅拌溶解，在-10～12℃搅拌条件下滴加步骤(1)得到的反应液，滴完后反应液升至室温，室温搅拌反应0.5～50小时后，反应液经分离纯化得到式(Ⅰ)所示的脲基四嗪类化合物；
所述碱性催化剂a和碱性催化剂b各自独立为下列之一：三乙胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶或氢氧化钠；
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述3,6-二甲基-1,6-二氢-1,2,4,5-四嗪与碱性催化剂a、碱性催化剂b、三光气、化合物(Ⅲ)的投料物质的量之比为1﹕0.1～3﹕0.1～3﹕0.1～3﹕0.1～3。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述3,6-二甲基-1,6-二氢-1,2,4,5-四嗪与碱性催化剂a、碱性催化剂b、三光气、化合物(Ⅲ)的投料物质的量之比为1﹕0.1～2﹕0.1～2﹕0.1～2﹕0.1～2。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂A和有机溶剂B各自独立选自下列之一：二氯甲烷、氯仿或甲苯。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，在-10～5℃搅拌条件下，滴加含有式(Ⅱ)所示的3,6-二甲基-1,6-二氢-1,2,4,5-四嗪和碱性催化剂a的有机溶剂A溶液。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，在-10～5℃搅拌条件下滴加步骤(1)反应完成的反应液。
8.如权利要求1所述的脲基四嗪类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防癌症药物中的应用，其特征在于：所述的癌症为人宫颈癌，所述的癌症的癌细胞为Hela细胞。
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