CN117480392A - 用于执行微生物组分析的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于执行微生物组分析的方法，包括以下步骤：a)提供源于微生物组样品的原始样品，所述原始样品包括第一浓度的第一靶标物质和第二浓度的第二靶标物质，所述第二靶标物质不同于所述第一靶标物质，其中，所述第一靶标物质表示所述微生物组样品的微生物组的第一元素，并且所述第二靶标物质表示所述微生物组的第二元素，并且其中所述第二浓度高于所述第一浓度；b)提供源于所述原始样品的两个或更多个次级样品，所述两个或更多个次级样品至少包括最高稀释度的次级样品、最低稀释度的次级样品和任选地一个或多个中间稀释度的次级样品，其中，至少两个次级样品具有不同的稀释度，并且其中所述最低稀释度的次级样品可以是稀释的或未稀释的原始样品；c)在允许用第一荧光标记物标记第一靶标物质的条件下，将配置成直接或间接地特异性结合第一靶标物质的第一荧光标记物提供给所述最低稀释度的次级样品，并在允许用所述第二荧光标记物标记所述第二靶标物质的条件下，将配置成直接或间接地特异性结合第二靶标物质的第二荧光标记物提供给最高稀释度的次级样品，但不提供给最低稀释度的次级样品；d)根据以下步骤分析所述第一和第二靶标物质：dl)用荧光显微镜对所述次级样品进行成像，并对相应的次级样品中的荧光第一和第二标记物进行计数；d2)由步骤d1)的结果和相应次级样品的稀释度计算第一靶标物质与第二靶标物质的比率。

Description

用于执行微生物组分析的系统和方法
本发明涉及微生物组分析领域，尤其涉及用于执行微生物组分析的系统和方法。本文中，微生物组是指栖息在共同环境中的微生物和病毒的群落。微生物组通常包括大量的元素，这些元素可以以非常不同的种群规模存在。这些元素可以在不同的分类学水平上进行描述，诸如属于细菌、古细菌、真菌、病毒和真核生物，但也可以细化到物种或菌株水平。这些元素通常被称为操作分类单元(OTU)。微生物组的典型实例是栖息在人类肠道中的微生物和病毒的群落。
随着微生物组分析领域的成熟，微生物组的常规监测成为关注的焦点。支持其的技术必须是负担得起的，操作快速简单，并且定量的。通过微生物组分析，我们了解了根据微生物组的种群大小，对它们的全部或一些元素的组成进行分析。分析可以包括相对和/或绝对的种群大小。所分析的元素及其分析/描述的分类水平取决于感兴趣的具体问题。例如，微生物组分析可以在界的分类学水平上进行。例如，微生物组分析可以分析细菌的绝对数量或相对于其他元素诸如真菌等的数量，而不区分更细的分类水平，例如单个细菌物种。微生物组分析还可以旨在分析至少一些单个的细菌物种，例如大肠杆菌(E.coli)和艰难梭状芽孢杆菌(C.difficile)。
越来越多的研究显示特别是胃肠道微生物组对健康的影响(自身免疫、癌症抗性、肠-脑轴)(参见Zheng et al.,Cell Research 2020,https://doi.org/10.1038/s41422- 020-0332-7；Woelk et al,Cancer Imm 2021,https://doi.org/10.1126/ science.abg2904；and Margolis et al,Gastroenterology 2021,https://doi.org/ 10.1053/j.gastro.2020.10.066)。虽然胃肠道微生物组已显示在个体之间是可变的，但它在个体内随着时间更稳定(参见Mehta et al.,Nat Microbiol.2018,https://doi.org/ 10.1038/s41564-017-0096-0)。微生物组组成随着时间的细微变化可以允许深入了解宿主生物体的状态。微生物组组成也可能是药物治疗不良反应概率的代表。
在未来，诊断应用将需要在治疗前、治疗期间和治疗后重复应用，并且对微生物组组成的变化敏感的技术。
当前，微生物组通过分析16S和/或23S核糖体亚基中的可变区(对于古细菌和细菌)和/或相应的分析内转录间隔区(ITS，真菌)和/或18S和/或28S核糖体亚基(真核生物)来分析。这些序列在分类学水平上是特异的，通常细化至生物物种的水平。这些序列可以使用不同的技术进行分析，通常是qPCR或测序。
另一种方法被称为鸟枪法宏基因组测序，其基于对微生物组的总提取DNA进行测序，并以生物信息学方式将其分解为微生物组的潜在成分(即元素)的已知基因组。与16S分析相比，其优势是菌株级鉴定、高灵敏度和使用遗传学信息进行进一步分析的可能性。然而，由于微生物组组成的高度复杂的重建，它对于定量并不理想。
另一种方法是定量微生物组分析。它将测序与其他方法(例如流式细胞术)相结合，以将测序结果与细胞计数相关联，从而增加定量。
这些技术具有固有的噪声源，如逆转录和酶扩增，这导致相当高的可变性：
“据报道，16S qPCR估计值具有较高的技术噪声，变异系数(CV)范围为11至75％”(Li等人，Microbiome(2019)7:118https://doi.org/10.1186/s40168-019-0729-z)。
16S扩增子测序具有约10-175％的CV范围(Li等人，Nat Commun(2020)https:// doi.org/10.1038/s41467-020-16224-6)。
流式细胞术QMP是定量微生物组分析的实例，其具有2-50％的CV(参见Galazzo等人，Front.Cell.Infect.Microbio.(2020)https://doi.org/10.3389/fcimb.2020.00403,基于表S3)。
其他缺点包括同时分析的元素数量相对较少，以及待分析的样品通量。
JB Woehrstein等人用合成DNA寡聚体作为靶标的初步测量显示平均误差低于4％。对16S rRNA的初步测试表明存在类似程度的误差。该技术也被称为“荧光纳米颗粒的多路复用(multiplexing)”。
简言之，荧光DNA-纳米颗粒的多路复用允许在单分子水平上检测并定量靶标核酸。靶标核酸被固定化在表面上。一个或多个荧光DNA-纳米颗粒与固定化的靶标核酸杂交。不同类型的靶标核酸用不同的标签标记，即具有不同类型的荧光DNA-纳米颗粒或荧光DNA-纳米颗粒的不同组合，其中不同的标签在荧光显微镜下是可区分的。通过用荧光显微镜对荧光DNA-纳米颗粒成像来定量靶标核酸。通过去多路复用(de-multiplexing)鉴定荧光DNA-纳米颗粒并计数。
荧光纳米颗粒的多路复用在其他检测技术中脱颖而出，这是由于其高精度与可以同时分析相对大量的靶标、分析时间短以及可以直接分析所得数据的类型相结合。
然而，分析微生物组样品的问题在于微生物组的组分，即元素，以宽范围的浓度存在。例如，普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)和腐败另枝杆菌(Alistipes putredinis)在人粪便样品中通常以1-10％的种群规模存在，而脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)和嗜粪拟杆菌(Bacteroides coprophilus)以0.01％-0.1％的数量级存在，缺陷乏养菌(Abiotrophia defective)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)以0.00001％-0.0001％的范围存在(Kraal等人，Plos One2014https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097279(补充图S2))。到目前为止，通过荧光纳米颗粒的多路复用对微生物组样品的分析仅限于特定的浓度范围。典型的范围是三至四个数量级，即最高与最低可检测浓度之比为1000:1至10,000:1；取决于样品噪声源和成像区域。
因此，本发明的目的是提供用于微生物组分析的方法和系统，其能够定量微生物组样品中的不同靶标物质，特别是在靶标物质的宽浓度范围内定量不同靶标物质，其中不同靶标物质指示微生物组样品的微生物组元素。有利地，该方法和系统分析时间短(与已知技术相比)，提供可以直接分析的数据并且具有高精度(与已知技术相比)。
本发明增加了“多路复用的体外核酸检测分析”方法的动态范围，并将其应用于微生物组样品的分析。“动态范围”是指可以假定的某一数量的最高值与最低值的比率，下面将给出其详细解释。它可以表示为比率或比率的对数(通常是以10为基数的分贝(dB)或以2为基数的位)。在本发明最相关的领域照相机技术中，平面比是优选的，因此也在这里使用。
在微生物组样品中，待分析的靶标元素(例如特定细菌等)的预期浓度通常在一定程度上是已知的。这转移到指示靶标元素的靶标物质。例如，在具有预期浓度的特定类型细菌的情况下，靶标物质可以是具有成比例浓度的相应的16S-rRNA。比例因子及其确定性可以在本领域预先已知的单独测量中确定，或者从数据库获取(例如核糖体RNA操纵子拷贝数数据库,rrnDB,https://rrndb.umms.med.umich.edu/或AmpliCopyRighter,https://github.com/fangly/AmpliCopyRighter)。动态范围的增加是通过包括样品的几个稀释度(其也可以包括未稀释的样品)来实现的，其中对于每个稀释度，根据靶标物质的浓度和稀释度的稀释因子以及优选地用于分析的系统的动态范围来对通过荧光纳米颗粒的多路复用来分析的靶标物质进行选择。本发明使用更直接的方法，即多路复用的体外核酸检测分析对单个16SrRNA分子或其他靶标物质检测并计数，而不引入反转录和酶扩增的技术噪声源。使用荧光DNA-纳米颗粒的多路复用的体外核酸检测分析是已知的，例如来自JBWoehrstein等人，Science Adv(2017)https://doi.org/10.1126/sciadv.1602128，来自WO2016140727以及EP3472351。
在一方面，本发明涉及用于执行微生物组分析的第一方法，包括以下步骤：
a)提供衍生自微生物组样品的原始样品，所述原始样品包括第一浓度的第一靶标物质和第二浓度的第二靶标物质，所述第二靶标物质不同于所述第一靶标物质，
其中，所述第一靶标物质表示所述微生物组样品的微生物组的第一元素，并且所述第二靶标物质表示所述微生物组的第二元素，并且
其中，所述第二浓度高于所述第一浓度；
b)提供两个或更多个衍生自所述原始样品的次级样品，所述两个或更多个次级样品至少包括最高稀释度的次级样品、最低稀释度的次级样品和任选地一个或多个中间稀释度的次级样品，
其中，至少两个次级样品具有不同的稀释度，并且
其中，所述最低稀释度的次级样品可以是稀释的或未稀释的原始样品；
c)在允许用第一荧光标记物标记第一靶标物质的条件下，将配置成直接或间接地特异性结合第一靶标物质的第一荧光标记物提供给所述最低稀释度的次级样品，并在允许用所述第二荧光标记物标记所述第二靶标物质的条件下，将配置成直接或间接地特异性结合第二靶标物质的第二荧光标记物提供给最高稀释度的次级样品，但不提供给最低稀释度的次级样品；
d)根据以下步骤分析所述第一和第二靶标物质:
d1)用荧光显微镜对所述次级样品进行成像，并对相应的次级样品中的荧光第一和第二标记物进行计数；
d2)由步骤d1)的结果和相应次级样品的稀释度计算第一靶标物质与第二靶标物质的比率。
任选地，在允许用第一荧光标记物标记第一靶标物质的条件下，不将所述第一荧光标记物提供给最高稀释度的次级样品。
如上所述，微生物组样品可以是粪便样品或其任何衍生物。
如上文已经提到的，本文中的术语“靶标物质”是指一类靶标，例如一类靶标分子，诸如一类靶标DNA或靶标RNA，例如一类16S-rRNA(例如细菌大肠杆菌的16S-rRNA)，一类18S-rRNA(例如酵母布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)的18S-rRNA)。不要将其与生物物种混淆。
原始样品是在适合于上述方法的条件下包括靶标物质的样品。特别地，在原始样品中，靶标物质可能已经从所述微生物组样品的靶标元素中提取出来。例如，所述原始样品可以包括从微生物组样品(例如粪便样品、唾液样品、皮肤拭子或非人微生物群样品，如植物微生物组、海洋微生物组样品、下水道样品或培养的微生物组)中提取的并指示其相应靶标元素的16S-rRNA。可以将样品纯化至仅含有选定种类的分子，例如核酸、全RNA或核糖体RNA。
最高稀释度的次级样品是指具有最高稀释因子的次级样品，即被稀释最多的次级样品，因此具有最低的靶标物质浓度。
最低稀释度的次级样品是具有最低稀释因子的次级样品，即被稀释最少的次级样品，因此具有最高的靶标物质浓度。在最低稀释度的次级样品是未稀释的原始样品的情况下，靶标物质的浓度与原始样品中靶标物质的浓度相同。最低稀释度的次级样品是未稀释的原始样品，也包括原始样品已被稀释并再浓缩至原始样品的浓度的情况。
如果第二浓度与第一浓度之比足够接近或超过测量系统的动态范围，例如至少比所用测量系统的动态范围低一个数量级，则该方法特别有用。例如，如果所述测量系统的动态范围是103:1，则该方法对于第二浓度与第一浓度的比率为100:1或更大(诸如103:1、105:1、107:1、108:1)的情况特别有用。如果测量系统的动态范围为104:1，则该方法对于第二浓度与第一浓度的比率为103:1或更大时特别有用，等等。即使对于样品中第一和第二靶标物质的浓度范围接近和/或超出测量系统的动态范围的情况，该方法也能够定量第一和第二靶标物质。即使样品中第一和第二靶标物质的浓度不接近和/或未超出测量系统的动态范围，该方法也可能是有利的。在这种情况下，可以在多个稀释度下同时测量两个靶标物质，以产生更精确的测量。如果测量系统的动态范围为104:1，第一浓度与第二浓度的比率为102:1，则可以在稀释度为1和100的情况下对样品进行测量，并对结果的一致性进行分析。
当两个分子以具有明确亲和力的机制锁定在一起时，就会发生特异性结合。它可以通过互补单链核酸的杂交、蛋白质-配体(诸如例如生物素-链霉亲和素)相互作用以及抗体-抗原相互作用而发生。最后，它还可以描述化学结合配偶体的相互作用，诸如NHS-酯-胺；马来酰亚胺-巯基，以及一般的生物缀合反应。相互作用力主要是范德华键、氢键和离子相互作用，或者在生物缀合物的情况下是共价键。通过提供固定化的相互作用配偶体，它可用于从溶液中将一种类型的分子固定化。特异性结合与非特异性结合形成对比，后者基于相同类型的力，但没有明确的亲和力。因此，配偶体之间结合的重复试验不会产生一致的结果。术语“非特异性结合”常被用来描述这样的事实，即分子粘附到并非被设计充当相互作用的配偶体的东西上。
组分A与组分B的直接结合是指组分A与组分B结合，中间没有任何附加组分。例如，单链DNA A可以通过杂交直接结合到互补的单链DNA B。组分A与组分B的间接结合是指组分A与组分B结合，中间有附加组分。例如，单链DNA A可以通过单链DNA C间接结合单链DNA B，其中单链DNA C的第一部分与单链DNA A的一部分互补并杂交，并且单链DNA C的第二部分与单链DNA B的一部分互补并杂交。即使没有特别说明，结合总是包括直接和/或间接结合。
“不向样品提供组分X(在结合的条件下)”可以包括向样品提供组分X，其中发生不干扰测量的非常低的结合。
“不向样品提供组分X(在结合的条件下)”可以包括向样品提供组分X，其中结合以如此小的程度(以如此小的亲和力)发生，使得在方案中的最后洗涤步骤之后，在样品中保留微量的组分X。最后，如果在所得到的数据中在噪声基底的水平检测到洗涤后的量，则洗涤后的量是无关紧要的，与组分X的初始量无关。
在第二种方法中，步骤c)可以包括以下步骤:
c1)将所述次级样品施加到对应的盖玻片区域，其中所述盖玻片区域根据相应的次级样品并且以如下方式修饰：
c1.1)使每个盖玻片区域钝化，以防止所述第一和第二靶标物质的非特异性结合，以及任选地防止所述荧光标记物的非特异性结合；
c1.2)使每个盖玻片区域覆盖有直接或间接地结合至所述盖玻片的固定化分子，其中所述固定化分子被配置为直接或间接地结合所述第一和第二靶标物质；
c2)任选地从所述盖玻片区域去除所述第一和第二靶标物质的未结合个体；
c3)在允许用第一荧光标记物标记第一靶标物质的条件下，将所述第一荧光标记物提供给所述最低稀释度的次级样品，并在允许用所述第二荧光标记物标记所述第二靶标物质的条件下，将所述第二荧光标记物提供给最高稀释度的次级样品，但不提供给最低稀释度的次级样品；
c4)任选地从所述盖玻片区域去除第一和第二荧光标记物的未结合个体。
盖玻片区域可以位于同一个盖玻片上，或者位于两个或更多个盖玻片上。例如，每个盖玻片区域可以位于另一个盖玻片上。在另一种实施方式中，一些盖玻片区域可以位于同一个盖玻片上，而其余的盖玻片区域各自位于它们自己的盖玻片上。任何组合都是可能的。
步骤c1)是用于将第一和第二靶标物质结合至盖玻片区域的固定化步骤。在步骤c1)中，将次级样品施加到相应的盖玻片区域。当盖玻片区域被钝化以防止所述第一和第二靶标物质与盖玻片区域的非特异性结合(项目c1.1)时，基本上仅可能发生所述第一和第二靶标物质与结合至所述盖玻片的固定化分子结合(项目c1.2)。
步骤c1)、c2)和c3)的顺序可以是任何合适的顺序，只要c2)在c1)之后。优选地，所述顺序是：首先c1)，接着c2)，接着c3)。然而，顺序也可以是：首先c1)，接着c3)，接着c2)。顺序也可以是：首先c3)，接着c1)，接着c2)。在“首先c3)，接着c1)，接着c2)”的情况下，在步骤c2)中的固定化之前，允许形成靶标物质与相应的一种或多种荧光标记物的复合物。c1)、c2)和c3)的顺序可以针对每个靶标物质单独选择，并且可以考虑顺序的每个合适组合。如上所述，c2)是可选步骤。
步骤c4)可以附加于或替代步骤c2)执行，并且总是在c3)之后。如果在c3)之后执行c2)和c4)两者，则步骤c2)可以与步骤c4)是同一步骤。步骤c1)、c2)、c3)和c4)的顺序可以是任何合适的顺序，只要c4)在c3)之后且c2)在c1)之后。优选地，所述顺序是：首先c1)，接着c3)，接着c4)和/或c2)。然而，顺序也可以是：首先c1)，接着c2)，接着c3)，接着c4)。顺序也可以是：首先c3)，接着c1)，然后是c2)和/或c4)。。在“首先c3)，然后c1)，然后c2)和/或c4)”的情况下，在步骤c2)中的固定化之前，允许形成靶标物质与相应的一种或多种荧光标记物的复合物。c1)、c2)、c3)和c4)的顺序可以针对每个靶标物质单独选择，并且可以考虑顺序的每个合适组合。如上所述，c2)和c4)是可选步骤。
到目前为止，所描述的方法的一般思想如下：通过荧光标记物实现在各个次级样品中待分析的不同靶标物质的选择。将第一和第二靶标物质两者提供给次级样品和任选地对应盖玻片区域，并在结合条件下将荧光标记物选择性地加入次级样品。
然而，这种选择也可以通过选择性固定化不同的靶标物质来实现。因此，本发明还涉及用于执行微生物组分析的第三方法，包括以下步骤:
a)提供衍生自微生物组样品的原始样品，所述原始样品包括第一浓度的第一靶标物质和第二浓度的第二靶标物质，所述第二靶标物质不同于所述第一靶标物质，
其中，所述第一靶标物质表示所述微生物组样品的微生物组的第一元素，并且所述第二靶标物质表示所述微生物组的第二元素，并且
其中，所述第二浓度高于所述第一浓度；
b)提供两个或更多个衍生自所述原始样品的次级样品，所述两个或更多个次级样品至少包括最高稀释度的次级样品、最低稀释度的次级样品和任选地一个或多个中间稀释度的次级样品，
其中所述至少两个次级样品具有不同的稀释度，并且
其中所述最低稀释度的次级样品可以是稀释的或未稀释的原始样品；
c)在允许用第一荧光标记物标记第一靶标物质的条件下，将直接或间接地特异性结合第一靶标物质的第一荧光标记物提供给所述最低稀释度的次级样品，并在允许用所述第二荧光标记物标记所述第二靶标物质的条件下，将直接或间接地特异性结合第二靶标物质的第二荧光标记物提供给最高稀释度的次级样品；和
其中，在所述最低稀释度的次级样品中，所述第一靶标物质被固定化用于分析，而所述第二靶标物质没有被固定化用于分析，
其中，在所述最高稀释度的次级样品中，所述第二靶标物质被固定化用于分析，任选地，所述第一靶标物质没有进行被固定化用于分析，
d)根据以下步骤分析所述第一和第二靶标物质:
d1)用荧光显微镜对所述次级样品进行成像，并对每个次级样品中的第一和第二荧光标记物进行计数
d2)由步骤d1)的结果和相应次级样品的稀释度计算第一靶标物质与第二靶标物质的比率。
得到第四方法，所述第三方法的步骤c)可以包括以下步骤:
c1)将所述次级样品施加到对应的盖玻片区域，其中所述盖玻片区域根据相应的次级样品并且以如下方式修饰：
c1.1)使每个盖玻片区域钝化，以防止所述第一和第二靶标物质的非特异性结合，以及任选地防止所述荧光标记物的非特异性结合；
c1.2)使对应于最低稀释度的次级样品的盖玻片区域覆盖有直接或间接地结合至所述盖玻片的第一固定化分子，其中所述第一固定化分子被配置为直接或间接地特异性结合所述第一靶标物质；
c1.3)使对应于最高稀释度的次级样品的盖玻片区域覆盖有直接或间接地结合至所述盖玻片的第二固定化分子，其中所述第二固定化分子被配置为直接或间接地特异性结合所述第二靶标物质；
c2)任选地从所述盖玻片区域去除所述第一和第二靶标物质的未结合个体；
c3)在允许用第一荧光标记物标记第一靶标物质的条件下，将所述第一荧光标记物提供给所述最低稀释度的次级样品，并在允许用所述第二荧光标记物标记所述第二靶标物质的条件下，将所述第二荧光标记物提供给最高稀释度的次级样品，并任选地在允许用所述第二荧光标记物标记所述第二靶标物质的条件下，不将所述第二荧光标记物提供给所述最低稀释度的次级样品。
c4)任选地从所述盖玻片区域去除所述第一和第二荧光标记物的未结合个体。
上面关于第一和第二方法给出的定义和解释，特别是步骤c1)、c2)、c3)和c4)的顺序，加以必要的修正后适用于第三和第四方法。
得到第五方法，所述第四方法可以包括预先确定第一阈值稀释因子的步骤，并且其中所述第四方法的步骤c1)包括用于修饰所述盖玻片区域的以下条件:
c1.4)使对应于中间稀释度的次级样品的盖玻片区域覆盖有直接或间接地结合至所述盖玻片的第一和/或第二固定化分子，其中，对应于具有大于第一阈值稀释因子的稀释因子的次级样品的盖玻片区域未覆盖有第一固定化分子。
第一阈值稀释因子以及以下提到的其他阈值稀释因子可以明确地或隐含地确定。明确地确定阈值稀释因子可以是计算相应的值。隐含地确定阈值稀释因子可以是计算不同的值，该不同的值可以被重新计算为阈值稀释因子和/或导致将中间的次级样品划分为用于覆盖的样品和用于非覆盖的样品。
得到第六方法，所述第四或第五方法可以包括预先确定第二阈值稀释因子的步骤，并且其中步骤c1)包括用于修饰所述盖玻片区域的以下条件:
c1.5)使对应于中间稀释度的次级样品的盖玻片区域覆盖有直接或间接地结合至所述盖玻片的第一和/或第二固定化分子，其中，对应于具有等于或小于所述第二阈值稀释因子的稀释因子的次级样品的盖玻片区域未覆盖有第二固定化分子，
任选地，其中所述第二阈值稀释因子等于所述第一阈值稀释因子。
根据本发明的另一方面，一种方法，可以包括预先确定第三阈值稀释因子的步骤，并且其中，在允许用第二荧光标记物标记第二靶标物质的条件下，稀释因子大于第三阈值稀释因子的中间稀释度的次级样品被提供第二荧光标记物，而在允许用第二荧光标记物标记第二靶标物质的条件下，所述稀释因子等于或小于第三阈值稀释因子的中间稀释度的次级样品不被提供第二荧光标记物；任选地，其中第三阈值稀释因子等于第一和/或第二阈值稀释因子。
根据本发明的另一方面，一种方法，可以包括预先确定第四阈值稀释因子的步骤，并且其中，在允许用第一荧光标记物标记第一靶标物质的条件下，稀释因子等于或小于第四阈值稀释因子的中间稀释度的次级样品被提供第一荧光标记物，并且任选地在允许用第一荧光标记物标记第一靶标物质的条件下，所述稀释因子大于第三阈值稀释因子的中间稀释度的次级样品不被提供第一荧光标记物。
第四阈值稀释因子可以等于第一、第二和/或第三阈值稀释因子。
中间稀释度的次级样品的数量可以被调整以适应预期浓度和/或预期浓度的比率。例如，中间稀释度的次级样品的数量可以被调整以使得每个预期浓度在线性测量范围内出现一次。如果测量系统具有103:1的动态范围并且预期的第一和第二浓度的比率(第二浓度/第一浓度)是105，则需要两个次级样品，而如果预期的第一和第二浓度的比率是102:1，则仅需要一个次级样品。在测量系统的动态范围为103∶1的另一实例中，以及在待测量分别处于第一、第二和第三浓度的第一、第二和第三物质的情况下，其中第一和第二浓度的比率(第二浓度/第一浓度)为106并且第一和第三浓度的比率(第三浓度/第一浓度)为103，将使用三个次级样品。在具有相同的三个靶标物质和浓度但具有104:1的测量系统动态范围的又一实例中，仅使用两个次级样品即可。
中间稀释度的次级样品的数量可以被调整以便考虑预期浓度的不确定性。如果测量系统具有102:1的动态范围并且预期的第一浓度和第二浓度的比率(第二浓度/第一浓度)为103，但是预期第一浓度和第二浓度都向上或向下变化一个数量级，则待测定的总浓度范围为105，并且因此可以使用三个盖玻片区域并因此使用一个中间盖玻片区域。由此，可以确认以更高的置信度在线性范围中测量第一和第二靶标物质。在第三个实施例中，可以通过在多个稀释度下测量一个靶标来提高测量精度。如果测量系统具有102:1的动态范围，并且预期的第一和第二浓度的比率(第二浓度/第一浓度)是103，并且每个靶标应该在两个稀释步骤中进行分析，则需要总共至少三个稀释样品(即次级样品)，即需要至少一个中间稀释度的次级样品。
附加地或替代地，次级样品的稀释度可以被调整以适应预期的第一和预期的第二浓度和/或预期的第一和预期的第二浓度的比率。与使用独立于靶标物质的特定浓度的标准稀释度的实施方式相比，使用调整的稀释度的实施方式可具有几个优点。可以减少次级样品的数量。这不仅可以节省材料，而且可以节省时间，特别是用于方法步骤d)的时间。
如上所述，调整次级样品的数量和/或稀释度也可以有助于验证本发明方法的准确性。例如，对于每个靶标物质，优选总是测量至少两到三个次级样品，即稀释度。根据这样的测量次数，可以识别步骤c1)中饱和条件的次级样品。步骤c1)中的饱和条件意指在盖玻片区域上各个靶标物质的结合位点的数目不足以使次级样品中靶标物质的所有个体结合到盖玻片区域。
可以制备第一靶标物质用于分析，并在一个或多个中间稀释度的次级样品中分析。
附加地或替代地，可以制备第二靶标物质用于分析，并在一个或多个中间稀释度的次级样品中分析。
盖玻片区域可以包括在流体操纵装置中，优选微流控装置中，每个盖玻片区域至少部分地限定相应的流体反应室，优选微流控反应室，每个反应室包括入口；并且其中将次级样品施加到和/或将DNA-纳米结构施加到相应的盖玻片区域是通过各自的入口执行的。
流体操纵装置是用于操纵即处理一种或多种流体的装置。流体操纵装置可以是流动室或井室。最突出的实例是微流控装置。然而，也可以考虑尺寸超过微流控装置尺寸的装置。
入口也可以充当出口，即用于从反应室中提取流体。替代地或附加地，反应室可包括用于从反应室提取流体的单独出口。所有的反应室可以具有相同的入口和出口结构，或者一些反应室可以具有组合的入口和出口，而其他反应室具有单独的入口与出口。
第一荧光标记物和/或第二荧光标记物可以包括具有至少一种荧光染料的至少一种DNA-纳米结构。可以区分两种情况，即“非重叠情况”和“重叠情况”。在非重叠情况下，在每个次级样品中，第一和第二靶标物质中仅有一个被制备用于分析，例如标记。在重叠情况下，在至少一个次级样品中，第一和第二靶标物质两者均被制备用于分析，例如分别用第一和第二荧光标记物进行标记。在非重叠情况下，在与第二靶标物质结合时的第二荧光标记物可以在荧光显微镜下与在与第一靶标物质结合时的第一标记是可区分的，或是不可区分开的。在重叠情况下，在与第二靶标物质结合时的第二荧光标记物在荧光显微镜下必须与在与第一靶标物质结合时的第一标记物是可区分的，至少在其中两个靶标物质都要被分析的那些次级样品中。
本领域技术人员知道如何选择和/或产生合适的荧光标记物，特别是包括至少一种DNA-纳米结构的合适的荧光标记物。必要的信息可以在文献中找到，例如以上引用的Woehrstein等人，DE102012107719、WO2019149932、WO2012058638、WO2017100251、US2014031243、WO2016140727和/或EP3472351。
第一靶标物质可以包括第一核酸，优选第一16S-rRNA，第一核酸包括特异性用于第一核酸的序列部分S1，并且其中第一荧光标记物包括与序列部分S1至少部分互补的序列部分S3。这可以使第一荧光标记物与第一靶标物质特异性结合。
第二靶标物质可以包括第二核酸，优选第二16S-rRNA，第二核酸包括特异性用于第二核酸的序列部分S2，并且其中第二荧光标记物包括与序列部分S2至少部分互补的序列部分S4。这可以使第二荧光标记物与第二靶标物质特异性结合。
固定化分子可以包括寡核苷酸，并且与相应的靶标物质特异性结合可以通过寡核苷酸上的至少部分互补的序列部分与相应的靶标物质的杂交发生。
在包括第一方法并且其中第一和第二靶标物质包括核酸的方法中，固定化分子可以包括一种类型的寡核苷酸，其被配置为结合第一和第二靶标物质。例如，如果第一靶标物质是具有多聚A尾的第一mRNA，第二靶标物质是具有多聚A尾的第二mRNA，则寡核苷酸可以包括相应的多聚T序列，该序列被配置为结合到多聚A尾，即第一和第二靶标物质中的任一个。16S-rRNA在其核酸序列中也具有保守区域。如果第一和第二靶标物质是16S-rRNA，则它们可以包括序列Seq-ID No 1“AAACTCAAAGGAATTGACGGGG”(参见Wang等人，Encyclopediaof Metagenomics 2013,DOI 10.1007/978-1-4614-6418-1_772-1,表2)，寡核苷酸可以包含相应的互补序列，其被配置为结合SEQ-ID NO 1，即第一和第二靶标物质中的任一个。这可以是例如SEQ-ID No 2。
在其中第一和第二靶标物质包括核酸的方法中，固定化分子可以包括被配置为结合第一靶标物质而不结合第二靶标物质的第一寡核苷酸和被配置为结合第二靶标物质而不结合第一靶标物质的第二寡核苷酸。该特征不仅适用于包括第一方法的方法，也适用于包括第三方法的方法。
本发明的方法可以包括从微生物组样品制备原始样品。例如，微生物组样品可以是例如人或动物的粪便样品。该方法可以包括收集这种粪便样品。该方法可以包括从微生物组样品(例如粪便样品)中纯化第一和第二靶标物质，从而提供原始样品。技术在本领域中是已知的并且是常规使用的。优选地，使用保持感兴趣的靶标物质的比率的技术。如果不是这种情况，分析可能仍然是有意义的，例如，如果为个体(例如人)监测纯化样品(即原始样品)中的靶标物质的比率，以调查该个体的治疗是否影响该个体的微生物组。
到目前为止，已经参考两个靶标物质，即第一和第二靶标物质，对本发明进行了描述。尽管本说明书确实包括分析两个以上靶标物质的实施方式，但是为了解释本发明的全部优点，给出了参考几个靶标物质的本发明的描述。
类似于第一方法，本发明涉及用于执行微生物组分析的第七方法，包括以下步骤:
A)提供衍生自微生物组样品的原始样品，所述原始样品包括处于相应浓度ci的m种靶标物质，
其中所述m种靶标物质中的每一个指示所述微生物组样品的微生物组的元素；
B)提供衍生自所述原始样品的u个次级样品，所述u个次级样品至少包括最高稀释度的次级样品、最低稀释度的次级样品和任选地一个或多个中间稀释度的次级样品，
其中所述u个次级样品具有不同的稀释度，并且
其中所述最低稀释度的次级样品可以是稀释的或未稀释的原始样品；
C)对于每个次级样品进行选择
C1)m种靶标物质中的一种或多种靶标物质，其通过提供相应的荧光标记物被制备以用于分析，所述荧光标记物被配置为在允许用相应的荧光标记物标记所述一种或多种靶标物质的条件下，直接或间接地特异性结合所述靶标物质，其中对应于不同靶标物质的所述荧光标记物在荧光显微镜中是可区分的，以及
C2)相应的荧光标记物，其被配置为在允许用相应的荧光标记物标记所述一种或多种靶标物质的条件下，直接或间接地特异性结合步骤C1)中选择的所述一种或多种靶标物质；
D)在允许用所选择的荧光标记物标记相应的靶标物质的条件下，将选择的荧光标记物提供给如在步骤C)中选择的相应的次级样品；
E)根据以下步骤分析m种靶标物质：
E1)用荧光显微镜对所述次级样品进行成像，并对相应的次级样品中的荧光标记物进行计数；
E2)由步骤E1)的结果和相应次级样品的稀释度计算m种靶标物质的比率。
类似于第三方法，本发明涉及用于执行微生物组分析的第八方法，包括以下步骤:
A)提供衍生自微生物组样品的原始样品，所述原始样品包括处于相应浓度ci的m种靶标物质，
其中所述m种靶标物质中的每一个指示所述微生物组样品的微生物组的元素；
B)提供衍生自所述原始样品的u个次级样品，所述u个次级样品至少包括最高稀释度的次级样品、最低稀释度的次级样品和任选地一个或多个中间稀释度的次级样品，
其中所述u个次级样品具有不同的稀释度，并且
其中所述最低稀释度的次级样品可以是稀释的或未稀释的原始样品；
C)对于每个次级样品进行选择
C1)通过固定化制备用于分析的m种靶标物种中的那些一个或多个靶标物质，和
C2)相应的荧光标记物，其被配置为在允许用相应的荧光标记物标记所述一种或多种靶标物质的条件下，直接或间接地特异性结合步骤C1)中选择的所述一种或多种靶标物质，其中对应于不同靶标物质的荧光标记物在荧光显微镜下是可区分的；
D)通过以下制备次级样品
D1)根据步骤C1)中的选择来固定化靶标物质；
D2)在允许用所选择的荧光标记物标记相应的靶标物质的条件下，将选择的荧光标记物提供给如在步骤C)中选择的相应的次级样品；
E)根据以下步骤分析m种靶标物质：
E1)用荧光显微镜对所述次级样品进行成像，并对相应的次级样品中的荧光标记物进行计数；
E2)由步骤E1)的结果和相应次级样品的稀释度计算m种靶标物质的比率。
“荧光标记物在荧光显微术中是可区分的”是指荧光标记物可以用适当的荧光显微术系统、该系统的适当设置、适当的图像处理和适当的数据分析来区分，所有这些都是本领域技术人员已知的。显然，在技术领域中常规使用的装置和荧光标记物存在大量可能的组合，使得特定的特征组合既不必要也没有意义。本领域技术人员知道如何选择系统和荧光标记物以及软件的合适组合。
对荧光标记物(例如第一和第二荧光标记物)进行计数(步骤D)和d))可以包括图像处理，例如卷积、阈值、稀释和侵蚀、斑点识别和定量等。技术是本领域公知的。
在第七和第八方法中，步骤C1)中的靶标物质的选择可以根据最小检测程序来执行。替代地或附加地，步骤C1)中的靶标物质的选择可以根据最大检测程序来执行。这意味着可以用最大检测程序选择所有靶标物质，或者可以用最小检测程序选择所有靶标物质。替代地，可以用最小检测程序选择一些靶标物质，并且可以用最大检测程序选择一些靶标物质。还可以定义选择标准，如果靶标物质的预期浓度ci在最小检测程序和最大检测程序之间(见下文)，则根据该选择标准选择靶标物质。
最小检测程序和最大检测程序的定义在下面对选择用于各个次级样品和最终对应的盖玻片区域的靶标物质的子方法的解释过程中给出。为了便于阅读，我们将“通道”作为“次级样品和最终对应的盖玻片区域”的同义词。
选择用于稀释通道的靶标物质的子方法
使用对于待检测的靶标物质m的数量(靶标物质的定义参见上述)，以及由先前的参考实验或可公开获得的数据确定的，它们预期的(例如典型的)平均浓度ci和相应的标准偏差σi的已知参考表，建立了生物物质的典型浓度和每个细胞的分子物质的分子量(Kraal等人，如上所引用Plos One 2014，如上所引用rrnDB)。如果标准偏差不可用，则可以选择估计值作为安全措施。整数i对靶标物质计数，即i从1至m。为此，假定靶标物质根据其预期的(例如典型的)平均浓度分类。最高ci被称为cmax，并且cmin指最低ci。因此，cmax＝cm并且cmin＝c1
还给出了以下值，即已知值:
·K通道数(即次级样本和最终的相应的盖玻片区域)。
·nacq每个盖玻片区域在不同位置采集的图像数量。该参数可以自由选择，增加改善动态范围，但也会增加采集时间。其最大值由盖玻片区域的大小决定。对盖玻片区域的区域进行多次成像是可能的，但在此不打算如此。如果执行此操作，必须注意不要对斑点执行多于一次的计数。
·Nmax用于定量的每幅图像的最大斑点数(斑点是指为分析而采集的图像中的荧光点，如上面引用的Woehrstein等人所使用的。参见图3B、C和“结果/可调亮度”部分；该值是取决于成像系统和分析算法的属性。例如，如果分析算法允许分析密度高达1斑点/μm的斑点，并且成像系统产生10,000μm2的图像，则Nmax将为10,000。
·fi捕获因子：其为校准因子，取决于分析参数，如孵育时间和盖玻片区域的体积/表面积之比，以及可及性。它是在单独的实验中预先确定的。
·Ni每幅图像中物质I的预期斑点数；Ni由fi和ci计算得出：Ni＝fi*ci；
·α变化安全系数：α是用于选择过程的系数，以说明靶标物质的实际浓度可能与预期值ci不同；如果靶标物质的浓度在ci-α*σ和ci+α*σ之间，确保对靶标物质的适当的检测。
·rdyn对数动态范围；理想地，rdyn＝log(Nmax*nacq/m)(假定所有靶标物质的浓度相等，并且没有非特异性结合–实际上，假定rdyn＝log(Nmax*nacq/(10*m))给出了良好的结果，并且是优选的)。
·rK连续盖玻片区域之间的对数动态范围偏移。这等于盖玻片区域之间的稀释因子的对数。
则应测量的总对数动态范围为
rtot＝log((cmax+α*σmax)/(cmin-α*σmin))
然后，从通道到通道的动态范围偏移rK可以是
rk＝rtot/K，通道K数量固定不变。
替代地，可以固定动态范围偏移rK，以便在连续通道之间给出有意义的重叠，例如rK＝rdyn/2。在这种情况下，所使用的盖玻片区域的总数取决于要覆盖的总浓度范围(因此rtot)。
然后，可以使用从0到K-1的整数j对通道进行排序。通道j中的靶标物质浓度与通道0中的靶标物质浓度的分数为为10^(j*rK)。这里，j＝0表示最低浓度(最高稀释度)通道，并且j＝K-1表示最高浓度(最低稀释度)通道。通道的浓度范围可以被设计表示为从cj,lo到cj,hi(这些不一定是检测极限)：
cj,lo＝(cmin-α*σmin)*10^(j*rK)
cj,hi＝(cmin-α*σmin)*10^((j+1)*rK)
为了从在每个通道中待检测的m种靶标物质中选择那些靶标物质，一些方法特别突出:
a)使用“最小检测程序”时，仅检测靶标物质以满足变化安全系数(即在ci-α*σI至ci+α*σi的浓度范围内)。
靶标物质i被指定为在通道j中被检测，如果
cj,lo≤ci+α*σI并且
cj,hi<ci-α*σI,
其中j是计数通过通道的整数，即j从0到K-1。
b)“最大检测程序”，只要最大预期浓度在测量的线性范围内，就可以检测靶标物质。
靶标物质i被设计为在通道j中被检测，如果
1<cj,hi/(ci+α*σI)≤rdyn
其中j也是计数通过通道的整数，即j从0到K-1。
c)“单一检测程序”，每个靶标物质仅在一个通道中检测。可使用以下计算分配的通道：
j分配＝轮次(rk/2+log((ci/(cmin-α*σmin)))/rk)
根据上述子方法或任何其他合适的方法分配了靶标物质的通道后，我们就可以计算出每幅图像的预期斑点数Nj：
如果任一通道的Nj大于Nmax，则可以通过因子d稀释从原始样本中获得最低稀释度的次级样品：
d＝Nmax/最大(Nj)
否则，可以选择d接近1(尽可能接近转移到杂交缓冲液所允许的范围)。术语“杂交缓冲液”是指促进寡核苷酸之间杂交的缓冲液，例如缓冲液RX20或缓冲液B(配方见下文)。
分配给每个通道的靶标物质数量为
替代地，可以不同地分配盖玻片区域的稀释度，例如非均匀地分配，并且可以使用不同的算法将靶标物质分配给盖玻片区域，这取决于待分析的靶标物质的特定集合。
通过这些计算，根据本发明的程序可以是如下：
·采集粪便样品，纯化其RNA(或任选地rRNA)
·将其以d稀释，同时将其转移到杂交缓冲液中(结果可以为原始样品)
·在通道K-1中孵育部分样品，即最低稀释度的次级样品
·将其他部分以10^rK稀释(从而产生另一个次级样品)，并在通道K-2中孵育
·重复直到通道0中的总稀释度为d*10^(k*rK)(通道0接收最高稀释度的次级样品)
·孵育后，冲洗掉未结合的RNA
·用荧光标记物(例如DNA-纳米颗粒)孵育通道j中根据上述子方法为其选择的所有靶标物质
·冲洗掉未结合的荧光标记物(例如DNA-纳米颗粒)
·图像
·如果和/或必要时，执行图像处理，例如卷积、阈值、稀释和腐蚀、斑点识别等
·对每个物质i的图像中的斑点进行计数，乘以d*10^((K-j)*rK)并除以fi，以获得未稀释样品中的测量浓度。
·如果一个物质在多个通道中，则执行误差计算，以提供测量精度。
如上所述，根据本发明的另一种方法可以是在单独的反应容器中使用荧光标记物孵育次级稀释液，并如前所述将反应后的构建体固定化在盖玻片区域上，然后从盖玻片区域冲洗掉任何未结合的部分。
特别地，所述方法可以包括以下步骤：
·采集粪便样品，纯化其RNA(或任选地rRNA)
·将其以d稀释，同时将其转移到杂交缓冲液中(结果可以为原始样品)
·将部分样品(即最低稀释度的次级样品)放入反应容器K-1中，用于通道K-1
·将用于根据上述子方法为通道K-1选择的所有靶标物质的荧光标记物(例如DNA-纳米颗粒)放入至反应容器K-1中并孵育
·将原始样品的另一部分稀释10^rK(从而产生另一个次级样品)，并将其放入反应容器K-2中，用于通道K-2
·将用于根据上述子方法为通道K-2选择的所有靶标物质的荧光标记物(例如DNA-纳米颗粒)放入至反应容器K-2中并孵育
·重复直到用于通道0的反应容器0中的总稀释度为d*10^(k*rK)(通道0接收最高稀释度的次级样品)
·孵育后，将混合物从反应容器中转移至相应的通道中
·孵育通道
·冲洗掉未结合的部分(即RNA和荧光标记物(例如DNA-纳米颗粒))
·图像
·如果和/或必要时，进行图像处理，例如卷积、阈值、稀释和腐蚀、斑点识别等
·对每个物质i的图像中的斑点进行计数，乘以d*10^((K-j)*rK)并除以fi，以获得未稀释样品中的测量浓度。
·如果一个物质在多个通道中，则执行误差计算，以提供测量精度。
替代地和或附加地，可以在允许荧光标记物与相应的靶标物质结合的条件下向原始样品提供荧光标记物，随后制备次级样品，任选地固定化并从盖玻片区域冲洗掉任何未结合的部分。
特别地，所述方法可以包括以下步骤
·采集粪便样品，纯化其RNA(或任选地rRNA)
·将其以d稀释，同时将其转移到杂交缓冲液中(结果可以为原始样品)
·为所有靶标物质添加荧光标记物(例如DNA-纳米颗粒)并孵育
·在通道K-1中孵育该样品的部分，即为最低稀释度的次级样品，该通道预先配置为仅捕获根据上述子方法选择的靶标物质。
·将其另一部分稀释10^rK(从而产生另一个次级样品)，并在通道K-2中孵育，该通道预先配置为仅捕获根据上述子方法选择的靶标物质。
·重复直到通道0中的总稀释度为d*10^(k*rK)(通道0接收最高稀释度的次级样品)
·冲洗掉未结合的部分(即RNA和荧光标记物(例如DNA-纳米颗粒))
·图像
·如果和/或必要时，执行图像处理，例如卷积、阈值、稀释和腐蚀、斑点识别等
·对每个物质i的图像中的斑点进行计数，乘以d*10^((K-j)*rK)并除以fi，以获得未稀释样品中的测量浓度。
·如果一个物质在多个通道中，则执行误差计算，以提供测量精度。
本发明还涉及一种系统，其包括荧光显微镜、具有至少两个盖玻片区域的至少一个样品载体、一个或多个待分析的样品和处理器，其中该系统被配置、调整和/或编程为优选自动地执行根据前述权利要求中任一项所述的方法。待分析的一个或多个样品可以包括原始样品和/或一个或多个次级样品。所述系统可以包括软件，其中该系统被配置为运行该软件，并且其中该软件被配置为以执行根据前述权利要求中任一项所述的方法的方式来控制该系统。
本文引用的现有技术通过引用以其整体并入本文。
下面参照图1描述本发明的示例性实施方式。
图1示出了示例性分析过程。注意，体积、质量、尺寸等的具体数字是示例性的，并且在其他实施方式中可以变化。特别地，它们可以按比例放大或缩小，以适应除以下实施方式中使用的反应室之外的其他反应室，该实施方式是来自IBIDI GmbH的“具有粘性底部的μ-载玻片VI 0.1”(或者，可以使用“粘性载玻片VI 0.4”；液体的体积优选适于“粘性载玻片VI 0.4”的体积)。当然，其他实施方式可以包括其他靶标物质和其他相关分子，诸如荧光标记物。
样品收集
1.将1.5g粪便样品收集在DNA/RNA保护剂粪便收集管(Zymo Research EuropeGmbH,Freiburg,Germany；在以下简称ZYMO或Zymo Research)，管中预填充9ml DNA/RNA保护溶液(Zymo)。
2.立即将样品储存在-20℃下(最多可保存1个月)。
从粪便样品中分离RNA(ZYMOBIOMICS RNA MINI试剂盒，ZYMO RESEARCH)
1.在冰上解冻样品，并将750μl充分混合的样品+DNA/RNA保护剂(Zymo)转移至BashingBead裂解管(Zymo)。
2.将试管固定在适用于2ml试管的涡旋适配器中，并以最高速度涡旋45min。
按照制造商的建议执行以下步骤：
3.将试管离心1分钟以沉淀碎片。
4.将高达200μl的澄清上清液转移至无核酸酶的试管中。
5.向上清液中加入等体积的RNA裂解缓冲液(1:1)(Zymo)并充分混合。
6.向样品中添加等体积的乙醇并混合。
7.将混合物转移到收集管中的Zymo-spin IIICG柱中并离心。然后，弃去管中液体。
8.向柱中加入400μl RNA制备缓冲液(Zymo)并离心。弃去管中液体，并将柱转移到无核酸酶管(Zymo)中。
9.向柱中加入400μl RNA洗涤缓冲液(Zymo)并离心。弃去管中液体，并将柱转移到无核酸酶的管中(例如来自Eppendorf GmbH的“PCR clean”管)。
10.直接向柱基质(C1006-50-G,Zymo)中加入85μl无酶无菌水(DNase/RNase-freewater)(Zymo)，然后离心洗脱。
11.DNA酶I处理:向洗脱液中加入10μl DNA消化缓冲液(Zymo)和5μl DNA酶I(Zymo)，并通过手动翻转顶部和底部几次轻轻混合。在室温下孵育15min。
12.向样品中加入2倍体积的RNA裂解缓冲液(Zymo)(2:1)并混合。
13.加入等体积的乙醇(95-100％)(1:1)并混合均匀。
14.将混合物转移到收集管中的新的Zymo-Spin IIICG柱中并离心。弃去管中液体。
15.向柱中加入400μl RNA制备缓冲液(Zymo)并离心。弃去管中液体。
16.向柱中加入700μl RNA洗涤缓冲液(Zymo)并离心。弃去管中液体。
17.添加400μl RNA洗涤缓冲液(Zymo)并将柱离心1min，以确保完全去除洗涤缓冲液。小心地将柱转移到无核酸酶的试管中。
18.向柱基质中加入100μl无酶无菌水并离心洗脱。
19.将Zymo-Spin III HRC过滤器放入新的收集管中，并加入600μlZymoBiomics制备液。以8000g离心3min。
20.将(步骤18)洗脱的RNA转移到无核酸酶管中制备的Zymo-Spin III-HRC过滤器中。然后16000g精确离心3min。
21.收集得到的过滤的RNA作为原始样品。
“从粪便样品中分离RNA”的结果可能是原始样品。此时转移到杂交缓冲液中可能是有利的。根据该方案制备原始样品是任选的和示例性的。可以使用其它合适的方案来提供原始样品。
次级样品的数量和稀释因子的选择
1.选择待分析的靶标物质。
2.根据所选择的靶标物质和靶标物质的预期浓度ci来选择/确定次级样品的数量和次级样品的稀释因子。上文描述了合适的选择程序。
固定化分子和荧光标记物柄的序列设计
在本文中，术语“条形码”用作荧光标记物的同义词。术语“捕获衔接子”和“捕获链”和“表面捕获柄”用作“固定化分子”的同义词。术语“条形码柄”和“条形码链”描述了介导靶标物质和荧光标记物的结合的荧光标记物(或条形码)的部分。
A部分-数据库准备:
1.安装R，版本4.0.4(https://www.r-project.org/)
2.安装DECIPHER包并用R加载
(https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DECIPHER.html)
3.下载“fasta”文件格式的SILVA数据库
(https://www.arb-silva.de/browser/,点击SILVA以添加到列表，并“下载为具有gap的fasta文件”)并将其读入R。收集来自三个出版物的肠道细菌，并通过提取相关物质来生成缩短的参考数据库。
4.使用DECIPHER函数AlignSeqs()将参考数据库比对为大小相等的序列，并查找和完成多重部分序列(详见ES Wright(2015)"DECIPHER:harnessing local sequencecontext to improve protein multiplesequence alignment".BMC Bioinformatics,doi:10.1186/s12859-015-0749-z)。
5.使用DECIPHER软件包中的“DesignProbe”功能设计可能的序列(参数设置：minLength＝23,maxLength＝23,hybTemp＝30,P＝2.5e-11,FA＝15,numProbeSets＝50,minCoverage＝0.9,minGroupCoverage＝0.2,batchSize＝1000,target＝"SSU")
B部分：靶标物质分析：
1.从SILVA数据库
(https://www.arb-silva.de/no_cache/download/archive/release_138.1/ Exports/)下载感兴趣的靶标物质的序列。
2.将序列插入RNA fold网络服务器
(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)，以确定预测的二级结构和单个核苷酸的“可及度”。
3.提取RNAfold输出：
a)下载Ct格式的热力学集合预报结果，并在Microsoft Excel中打开。
b)单击“质心结构图编码碱基对概率”下的“在FORNA中查看”，单击“颜色/自定义/设置”，并将碱基对概率值添加到Excel中的列中。
4.将RNAfold输出与来自部分A的设计序列合并(步骤4；R；ply包，连接函数)。
5.选择具有最佳得分的序列组合。
该程序产生23nt长的序列，其可用作DNA-纳米结构的柄(即，单链oligo，其被配置为特异性结合靶标，并附着于某物，例如DNA-纳米结构或表面)，以使其充当上述靶向分子靶标物质的荧光标记物。附加地，通过订购一种包括23nt长的序列和下述表面链的互补序列的寡核苷酸，产生了可用于捕获衔接子的23nt长的序列。对于通用的16S表面捕获而不是物种特异性捕获，可以使用一个或多个保守区域，例如SEQ-ID No 2。
在下面的方法中，使用了具有通用序列(Seq-ID No 3:“gaatcggtca cagtacaaccg”,5’生物素修饰)的生物素化的“表面链”和包括表面链的互补序列以及由本分析产生的序列的“捕获衔接子”。对于通用捕获，所得到的捕获衔接子例如可以是Seq-ID No 4。
折叠DNA-纳米结构：
使用以上衍生的条形码柄序列折叠DNA-纳米结构，如描述于JB Woehrstein等人，Science Adv(2017)https://doi.org/10.1126/sciadv.1602128。DNA-纳米结构的数量和类型，尤其是其荧光染料(即颜色)，需要被调整以适应本文所述的靶标物质的数量、次级样品的数量以及次级样品的稀释因子。
所得DNA-纳米结构可以用作靶向分子物质(即靶标物质)的荧光标记物。
杂交方案：
流体操纵装置/流动室的制备：
3.将盖玻片在异丙醇中孵育5min并在N2流下干燥。
4.之后，立即将“带有粘性底部的μ-载玻片VI 0.1”(ibidi GmbH)放置在盖玻片上，通过粘性底部将它们粘合在一起，从而形成作为盖玻片区域的流通通道。
5.对盖玻片施加轻微的压力，例如使用移液管吸头，以提高盖玻片和粘性底部之间的粘附力。
流体操纵装置/流动室现在就可以使用了。它也被称为“载玻片”。流体操纵装置/流动室包括几个(例如六个)盖玻片区域。
流动室的制备是可选的和示例性的。其他流动室和其他制备过程也是可以预期的。还可以提供合适的随时可用的流动室。
钝化盖玻片区域以防止非特异性结合&通过生物素-BSA-链霉亲和素表面用固定化分子覆盖盖玻片区域(5分钟孵育):
1.平衡所有的流通通道(简称：通道)，来自ibidi-GmbH的μ-载玻片VI 0.1通过将缓冲液A+添加到流动室入口和出口来提供样品应用(即反应室)，然后前后倾斜载玻片直到实现平稳流动。
2.使用缓冲液A+(定义见下文)制备1mg/ml的生物素-BSA。每张载玻片制备200μL生物素-BSA(每条流通通道25μL)。
3.从流通通道中除去液体。
4.向每条流通通道施加25μL的生物素-BSA。将载玻片向后倾斜，以确保均匀分布。
5.用石蜡膜密封流通通道，并在室温下孵育5min。
6.除去液体，并用25μl的缓冲液A+洗涤每个流通通道3x。在准备应用链霉亲和素之前，不要去除最后的清洗液(见下一步)。
7.使用缓冲液A+制备100μg/ml的链霉亲和素。每张载玻片制备200μL链霉亲和素(每条流通通道25μL)。
8.从流通通道中除去液体。
9.向每条流通通道施加25μL链霉亲和素。将载玻片向后倾斜，以确保均匀分布。
10.用石蜡膜密封流通通道，并在室温下孵育5min。
11.除去液体，并用25μl的缓冲液A+洗涤每个流通通道3x。在准备施加生物素化的表面链之前，不要去除最后的清洗液(见下一步)。
缓冲液A+成分：
·10mM Tris-HCl，pH 7.5
·100mM NaCl
·0.05％吐温20
缓冲液B+成分：
·10mM Tris-HCl，pH 8.0
·10mM MgCl2
·1mM EDTA
结果是具有六个流动通道的流动室，所述通道具有链霉亲和素修饰的表面。
生物素化表面链(孵育5分钟)
1.在缓冲液A+中制备1μM生物素化的表面链。
2.每张载玻片制备200μL生物素化的表面链(每条流通通道25μL)。
3.从流通通道中除去液体。
4.向每条流通通道施加25μL表面链。将载玻片向后倾斜，以确保均匀分布。
5.用石蜡膜(Bemis company In)或类似的密封剂密封流动通道，并在室温(RT)下孵育5min。
6.除去液体，并用25μl的缓冲液A+洗涤每个流通通道3x。在准备施加捕获-衔接子链之前，不要去除最后的清洗液。
该方法的结果是具有六个流通通道的流动室，该流通通道具有包括单个DNAoligo的表面，该DNA oligo包括序列Seq-ID No 3。
捕获-衔接子链(5分钟孵育)
对于每个盖玻片区域，制备用于相应盖玻片区域的捕获-衔接子混合物，其包括由步骤“序列设计，B部分”产生的那些捕获衔接子，所述捕获衔接子靶向根据本文上述的子方法选择的靶标物质。
对于所有通道j，制备捕获-衔接子混合物：
1.在缓冲液A+中将所有捕获衔接子稀释至200μM
2.对于通道j，将选择用于载玻片j的捕获衔接子混合。
3.在缓冲液A+中稀释至每个捕获衔接子的最终浓度为1μM。
将捕获衔接子混合物在各自的盖玻片区域孵育：
4.从通道中除去液体。
5.向每条通道施加25μL相应的捕获-衔接子混合物。将载玻片向后倾斜，以确保均匀分布。
6.用石蜡膜密封通道，并在37℃下孵育5min。
7.除去液体，并用25μl的缓冲液A+洗涤每个通道3x。在准备施加RNA溶液之前，不要去除最后的清洗液。
该方法的结果是具有六个流通通道的流动室，该流通通道具有包括单个DNAoligo的表面，该DNA oligo包括在步骤“B部分：靶标物质分析”中产生的捕获序列。它们与靶标物质(例如16S rRNA)互补，并且可以通过杂交特异性结合它们。如果选择捕获所有16SrRNA的方法，并且不在不同的盖玻片区域中捕获不同的靶标物质，则结果可以是具有六个流动通道的流动室，该流动室具有包括单链DNA的表面，该单链DNA包括序列Seq-ID No 2。
RNA捕获(45分钟孵育)
1.根据下表，在每个载玻片(即流动室)上由原始样品制备200μl在杂交溶液(此处：含甲酰胺的RX20)中的16S rRNA，以产生次级样品K-1，所述原始样品得自步骤“从粪便样品中分离RNA”。以下配方假定RNA浓度为1nM(所有靶标物质的总RNA)，这是通常产生良好结果的值，但可以使用稀释因子d进行调整。
2.制备稀释溶液
稀释溶液 体积(μl) 最终浓度
H20 70
甲酰胺 30 15％
2x RX20(配方见下文) 100 1x
总计 200
3.对于其他次级样品j中的每一个，在稀释溶液中以因子10^rK稀释次级样品j+1，如上文详述的子方法中所述。
4.从流通通道中除去洗涤缓冲液
5.向每条流通通道施加25μl的次级样品。将载玻片向后倾斜，以确保均匀分布。
6.用石蜡膜密封流通通道，并在37℃下孵育45min
7.除去液体，并用25μl的缓冲液A+洗涤每个流通通道3x。在准备施加条形码溶液之前，不要去除最后的清洗液。
RX20-缓冲液成分：
·4x SSC(柠檬酸钠-盐水缓冲液，由150mM氯化钾和15mM柠檬酸三钾的水性溶液组成，pH 7.0)
·5％硫酸葡聚糖
·0.1％吐温20
·5x Denhardt’s培养基
条形码杂交(80分钟孵育)
在该步骤中，在允许标记靶标物质的条件下，将配置为直接地或间接地特异性结合靶标物质的荧光标记物提供给次级样品。
对于每个盖玻片区域，制备条形码溶液，其包括由步骤“折叠DNA-纳米结构”产生的那些条形码，所述条形码靶向根据本文上述的子方法选择的靶标物质。如果每个盖玻片区域Lj的靶标物质数量不超过25，则将条形码稀释至每个约2.5nM的输入浓度，并使用下表作为制备配方。如果Lj超过25，则相应地调整条形码预稀释度和加水量。
1.每个盖玻片区域制备80μl条形码溶液
2.从流通通道中除去洗涤缓冲液
3.向各自的流动通道(盖玻片区域)施加12μl的条形码溶液。将载玻片向后倾斜，以确保均匀分布
4.在37℃下孵育80min(1小时20min)
5.用25μl的缓冲液B+洗涤每个流通通道3x。不要去除最后的洗涤液。
6.用石蜡膜或透明胶带将流通通道密封。
7.进行成像
成像
1.将样品，即流动室放置在显微镜上，这里是Zeiss AxioObserver 7，具有60x/1.4物镜，Colibri 7照明，AxioCam 506。
2.在多个(nacq)位置和对应于“折叠DNA-纳米结构”中使用的染料的颜色通道获得z-stack(以300nm间隔的7个平面)。
3.使用Zeiss ZEN软件的后处理模块“扩展焦深(Extended depth offocus)”投影Z平面。
使用IMAGEJ(FIJI)和COMDETV.0.5.4插件处理图像，计算荧光标签
给出了ImageJ(Fiji)和OMDET V.0.5.4插件的图像处理说明。然而，可以使用任何合适的图像处理。
1.通过czi extension将来自Zeiss Observer显微镜的图像直接加载到Fiji中。(Nature methods 9(7):676-682,PMID 22743772)
2.调整对比度，查看荧光斑点，检查采集是否正确执行。
3.加载COMDET插件，按“检测颗粒(Detect particles)”，在弹出窗口中根据需要调整参数(“预览计算按钮(preview calculation button)”必须勾选)
https://github.com/ekatrukha/ComDet
软件步骤：
原始图像2用高斯墨西哥帽过滤器(Gaussian Mexican hat filter)4进行卷积(用户定义墨西哥帽的大小，这里为四个像素)。结果得到卷积图像6。卷积图像6的直方图10通过自动阈值检测来制作，并用高斯分布拟合以找到表示斑点的像素的阈值8(例如，3*SD，其中SD是拟合的高斯分布的标准偏差)。利用该阈值8对卷积图像6进行阈值处理，并且结果是阈值处理掩模。通过稀释/侵蚀操作去除一些斑点(例如，描述于开源代码KatrukhaE.2020,ComDet plugin for ImageJ,v0.5.3,Zenodo,doi:10.5281/zenodo.4281064)，从而产生过滤掩模。在前一步骤中未被去除的剩余斑点被认为是有效的，并且由多个连续的像素组成。它们被用于计算“质心x,y”，并且所产生的标记(即质心)被覆盖在原始图像2上，从而产生最终图像16。此外，构成这些剩余斑点的像素被用于计算积分强度(IntegratedInt)和NArea值。
IntegratedInt的值被复制到表中，组合了为每个点所获取的不同颜色通道的值。根据上文引用的Woehrstein等人描述的方法，该表用于分配条形码，从而指定其设计的靶标物质。最后，使用预定参数fi将检测到的靶标物质分子的数量Ni,det转换为靶标物质的检测浓度ti：ti＝Ni,det/fi
如果生物物质的浓度是感兴趣的，则可以使用分子物质浓度结合上述校准测量或数据库条目诸如RRNDB(上面引用的)进行估算。
/>
/>
序列表
<110> 马比奥米奇有限责任公司(mbiomics GmbH)
<120> 用于执行微生物组分析的系统和方法
<130> PPI23172440DE
<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16S 保守区域
<400> 1
aaactcaaag gaattgacgg gg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16S 引物
<400> 2
ccccgtcaat tcctttgagt tt 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表面链, 5'修饰：生物素
<400> 3
gaatcggtca cagtacaacc g 21
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 捕获衔接子
<400> 4
ccccgtcaat tcctttgagt tttttggttg tactgtgacc gattc 45

Claims (25)

1.一种用于执行微生物组分析的方法，包括以下步骤:
a)提供源于微生物组样品的原始样品，所述原始样品包括第一浓度的第一靶标物质和第二浓度的第二靶标物质，所述第二靶标物质不同于所述第一靶标物质，
其中，所述第一靶标物质表示所述微生物组样品的微生物组的第一元素，并且所述第二靶标物质表示所述微生物组的第二元素，并且
其中，所述第二浓度高于所述第一浓度；
b)提供源于所述原始样品的两个或更多个次级样品，所述两个或更多个次级样品至少包括最高稀释度的次级样品、最低稀释度的次级样品和任选地一个或多个中间稀释度的次级样品，
其中，至少两个次级样品具有不同的稀释度，并且其中，所述最低稀释度的次级样品可以是稀释的或未稀释的原始样品；
c)在允许用第一荧光标记物标记第一靶标物质的条件下，将配置成直接或间接地特异性结合所述第一靶标物质的所述第一荧光标记物提供给所述最低稀释度的次级样品，并在允许用第二荧光标记物标记第二靶标物质的条件下，将配置成直接或间接地特异性结合所述第二靶标物质的所述第二荧光标记物提供给所述最高稀释度的次级样品，但不提供给所述最低稀释度的次级样品；
d)根据以下步骤分析第一和第二靶标物质:
dl)用荧光显微镜对所述次级样品进行成像，并对相应的次级样品中的荧光第一和第二标记物进行计数；
d2)由步骤d1)的结果和相应的次级样品的稀释度计算所述第一靶标物质与所述第二靶标物质的比率。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤c)包括以下步骤：
c1)将所述次级样品施加到对应的盖玻片区域，其中所述盖玻片区域根据相应的次级样品并且以如下方式修饰：
c1.1)使每个盖玻片区域钝化，以防止所述第一和第二靶标物质的非特异性结合，以及任选地防止所述荧光标记物的非特异性结合；
cl.2)使每个盖玻片区域覆盖有直接或间接地结合至所述盖玻片的固定化分子，其中所述固定化分子被配置为直接或间接地结合所述第一和第二靶标物质；
c2)任选地从所述盖玻片区域去除所述第一和第二靶标物质的未结合个体；
c3)在允许用所述第一荧光标记物标记所述第一靶标物质的条件下，将所述第一荧光标记物提供给所述最低稀释度的次级样品，并在允许用所述第二荧光标记物标记所述第二靶标物质的条件下，将所述第二荧光标记物提供给所述最高稀释度的次级样品，但不提供给所述最低稀释度的次级样品；
c4)任选地从所述盖玻片区域去除第一和第二荧光标记物的未结合个体。
3.一种用于执行微生物组分析的方法，包括以下步骤:
a)提供源于微生物组样品的原始样品，所述原始样品包括第一浓度的第一靶标物质和第二浓度的第二靶标物质，所述第二靶标物质不同于所述第一靶标物质，
其中，所述第一靶标物质表示所述微生物组样品的微生物组的第一元素，并且所述第二靶标物质表示所述微生物组的第二元素，并且
其中，所述第二浓度高于所述第一浓度；
b)提供源于所述原始样品的两个或更多个次级样品，所述两个或更多个次级样品至少包括最高稀释度的次级样品、最低稀释度的次级样品和任选地一个或多个中间稀释度的次级样品，
其中至少两个次级样品具有不同的稀释度，并且其中，所述最低稀释度的次级样品可以是稀释的或未稀释的原始样品；
c)在允许用第一荧光标记物标记第一靶标物质的条件下，将直接或间接地特异性结合所述第一靶标物质的所述第一荧光标记物提供给所述最低稀释度的次级样品，并在允许用第二荧光标记物标记第二靶标物质的条件下，将直接或间接地特异性结合所述第二靶标物质的所述第二荧光标记物提供给所述最高稀释度的次级样品；和
其中，在所述最低稀释度的次级样品中，所述第一靶标物质被固定化用于分析，而所述第二靶标物质没有被固定化用于分析，
其中，在所述最高稀释度的次级样品中，所述第二靶标物质被固定化用于分析，任选地，所述第一靶标物质没有进行被固定化用于分析，
d)根据以下步骤分析第一和第二靶标物质:
d1)用荧光显微镜对所述次级样品进行成像，并对每个次级样品中的第一和第二荧光标记物进行计数
d2)由步骤d1)的结果和相应的次级样品的稀释度计算所述第一靶标物质与所述第二靶标物质的比率。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤c)包括以下步骤:
c1)将所述次级样品施加到对应的盖玻片区域，其中所述盖玻片区域根据相应的次级样品并且以如下方式修饰:
c1.1)使每个盖玻片区域钝化，以防止所述第一和第二靶标物质的非特异性结合，以及任选地防止所述荧光标记物的非特异性结合；
cl.2)使对应于所述最低稀释度的次级样品的所述盖玻片区域覆盖有直接或间接地结合至所述盖玻片的第一固定化分子，其中所述第一固定化分子被配置为直接或间接地特异性结合所述第一靶标物质；
cl.3)使对应于所述最高稀释度的次级样品的所述盖玻片区域覆盖有直接或间接地结合至所述盖玻片的第二固定化分子，其中所述第二固定化分子被配置为直接或间接地特异性结合所述第二靶标物质；
c2)任选地从所述盖玻片区域去除所述第一和第二靶标物质的未结合个体；
c3)在允许用所述第一荧光标记物标记所述第一靶标物质的条件下，将所述第一荧光标记物提供给所述最低稀释度的次级样品，并在允许用所述第二荧光标记物标记所述第二靶标物质的条件下，将所述第二荧光标记物提供给所述最高稀释度的次级样品，并任选地在允许用所述第二荧光标记物标记所述第二靶标物质的条件下，不将所述第二荧光标记物提供给所述最低稀释度的次级样品，
c4)任选地从所述盖玻片区域去除所述第一和第二荧光标记物的未结合个体。
5.根据前述权利要求所述的方法，包括预先确定第一阈值稀释因子的步骤，并且其中步骤c1)包括用于修饰所述盖玻片区域的以下条件：
cl.4)使对应于所述中间稀释度的次级样品的所述盖玻片区域覆盖有直接或间接地结合至所述盖玻片的第一和/或第二固定化分子，其中，对应于具有大于所述第一阈值稀释因子的稀释因子的次级样品的盖玻片区域未覆盖有第一固定化分子。
6.根据前述两项权利要求中任一项所述的方法，包括预先确定第二阈值稀释因子的步骤，并且其中步骤c1)包括用于修饰所述盖玻片区域的以下条件：
cl.5)使对应于所述中间稀释度的次级样品的所述盖玻片区域覆盖有直接或间接地结合至所述盖玻片的第一和/或第二固定化分子，其中，对应于具有等于或小于所述第二阈值稀释因子的稀释因子的次级样品的盖玻片区域未覆盖有第二固定化分子，
任选地，其中所述第二阈值稀释因子等于所述第一阈值稀释因子。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括预先确定第三阈值稀释因子的步骤，并且其中，在允许用所述第二荧光标记物标记所述第二靶标物质的条件下，稀释因子大于所述第三阈值稀释因子的中间稀释度的次级样品被提供所述第二荧光标记物，并在允许用所述第二荧光标记物标记所述第二靶标物质的条件下，稀释因子等于或小于所述第三阈值稀释因子的中间稀释度的次级样品不被提供所述第二荧光标记物；任选地，其中所述第三阈值稀释因子等于所述第一和/或第二阈值稀释因子。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括预先确定第四阈值稀释因子的步骤，并且其中，在允许用所述第一荧光标记物标记所述第一靶标物质的条件下，稀释因子等于或小于所述第四阈值稀释因子的中间稀释度的次级样品被提供所述第一荧光标记物，并且任选地在允许用所述第一荧光标记物标记所述第一靶标物质的条件下，所述稀释因子大于所述第三阈值稀释因子的中间稀释度的次级样品不被提供所述第一荧光标记物。
9.根据前述权利要求所述的方法，其中，所述第四阈值稀释因子等于所述第一、所述第二和/或所述第三阈值稀释因子。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，中间稀释度次级样品的数量被调整以适应预期的第一和预期的第二浓度和/或所述预期的第一和第二浓度的比率。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述次级样品的稀释度被调整以适应所述预期的第一和预期的第二浓度和/或所述预期的第一和预期的第二浓度的比率。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，制备所述第一靶标物质用于分析，并在一个或多个中间稀释度的次级样品中进行分析。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，制备所述第二靶标物质用于分析，并在一个或多个中间稀释度的次级样品中进行分析。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述盖玻片区域包括在流体操纵装置中，优选微流控装置中，每个盖玻片区域至少部分地限定相应的流体反应室，优选微流控反应室，每个反应室包括入口；并且其中将所述次级样品施加到和/或将所述DNA-纳米结构施加到相应的盖玻片区域是通过各自的入口执行的。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一荧光标记物和/或第二荧光标记物包括具有至少一种荧光染料的至少一种DNA-纳米结构。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一靶标物质包括第一核酸，优选第一16S-rRNA，所述第一核酸包括特异性用于所述第一核酸的序列部分S1，并且其中所述第一荧光标记物包括与所述序列部分S1至少部分互补的序列部分S3。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第二靶标物质包括第二核酸，优选第二16S-rRNA，所述第二核酸包括特异性用于所述第二核酸的序列部分S2，并且其中所述第二荧光标记物包括与所述序列部分S2至少部分互补的序列部分S4。
18.根据前述两项权利要求中任一项所述的方法，其中，所述固定化分子包括寡核苷酸，并且与相应的靶标物质特异性结合是通过所述寡核苷酸上的至少部分互补的序列部分与相应的靶标物质的杂交发生的。
19.根据前述直接或间接地从属于权利要求1或2的权利要求所述的方法，其中，所述固定化分子包括一种类型的寡核苷酸，所述寡核苷酸被配置为结合第一和第二靶标物质。
20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述固定化分子包括被配置为结合所述第一靶标物质而不结合所述第二靶标物质的第一寡核苷酸和被配置为结合所述第二靶标物质而不结合所述第一靶标物质的第二寡核苷酸。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在与所述第二靶标物质结合时的所述第二荧光标记物与在与所述第一靶标物种结合时的所述第一标记在荧光显微镜下是可区分的。
22.一种用于执行微生物组分析的方法，包括以下步骤:
A)提供衍生自微生物组样品的原始样品，所述原始样品包括各自浓度ci的m种靶标物质，其中所述m种靶标物质中的每一种指示所述微生物组样品的微生物组的元素；
B)提供衍生自所述原始样品的u个次级样品，所述u个次级样品至少包括最高稀释度的次级样品、最低稀释度的次级样品和任选地一个或多个中间稀释度的次级样品，
其中所述u个次级样品具有不同的稀释度，并且
其中，所述最低稀释度的次级样品可以是稀释的或未稀释的原始样品；
C)对于每个次级样品，选择
C1)m种靶标物质中的待通过提供相应的荧光标记物被制备以用于分析一种或多种靶标物质，所述荧光标记物被配置为在允许用相应的荧光标记物标记所述一种或多种靶标物质的条件下，直接或间接地特异性结合所述靶标物质，其中对应于不同靶标物质的所述荧光标记物在荧光显微镜下是可区分的，以及
C2)相应的荧光标记物，其被配置为在允许用相应的荧光标记物标记所述一种或多种靶标物质的条件下，直接或间接地特异性结合步骤C1)中选择的所述一种或多种靶标物质；
D)在允许用所选择的荧光标记物标记相应的靶标物质的条件下，将选择的荧光标记物提供给如在步骤C)中选择的相应的次级样品；
E)根据以下步骤分析m种靶标物质：
E1)用荧光显微镜对所述次级样品进行成像，并对相应的次级样品中的荧光标记物进行计数；
E2)由步骤E1)的结果和相应次级样品的稀释度计算m种靶标物质的比率。
23.一种用于执行微生物组分析的方法，包括以下步骤:
A)提供衍生自微生物组样品的原始样品，所述原始样品包括各自浓度ci的m种靶标物质，其中所述m种靶标物质中的每一个指示所述微生物组样品的微生物组的元素；
B)提供衍生自所述原始样品的u个次级样品，所述u个次级样品至少包括最高稀释度的次级样品、最低稀释度的次级样品和任选地一个或多个中间稀释度的次级样品，
其中所述u个次级样品具有不同的稀释度，并且
其中，所述最低稀释度的次级样品可以是稀释的或未稀释的原始样品；
C)对于每个次级样品，选择
C1)待通过固定化制备用于分析的m种靶标物质中的那些一种或多种靶标物质，和
C2)相应的荧光标记物，被配置为在允许用相应的荧光标记物标记所述一种或多种靶标物质的条件下，直接或间接地特异性结合步骤C1)中选择的所述一种或多种靶标物质，其中对应于不同靶标物质的荧光标记物在荧光显微镜下是可区分的；
D)通过以下制备所述次级样品
D1)根据步骤C1)中的选择来固定化所述靶标物质
D2)在允许用选择的荧光标记物标记相应的靶标物质的条件下，将所选择的荧光标记物提供给在步骤C)中选择的相应的次级样品；
E)根据以下步骤分析m种靶标物质：
E1)用荧光显微镜对所述次级样品进行成像，并对相应的次级样品中的荧光标记物进行计数；
E2)由步骤E1)的结果和相应次级样品的稀释度计算m种靶标物质的比率。
24.根据前述两项权利要求之一所述的方法，其中，
根据最小检测程序和/或最大检测程序执行步骤Cl)中的所述靶标物质的选择。
25.一种系统，包括
*荧光显微镜
*具有至少两个盖玻片区域的至少一个样品载体
*待分析的一个或多个样品
*处理器
其中所述系统被配置为优选地自动地执行根据前述权利要求中任一项所述的方法。
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