CN117480178A - 嵌合FC-α受体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含Fcα受体(FcαR)的细胞内结构域、FcαR的跨膜结构域和配体结合结构域的多肽和嵌合抗原受体(CAR)，涉及包含和表达此类多肽和CAR的细胞及其用途。

Description

嵌合FC-α受体及其用途

技术领域

本发明涉及嵌合受体和治疗领域，包括癌症治疗。特别地，本发明涉及嵌合Fcα受体。

背景技术

通过体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继转移，在肿瘤疗法中已经获得了显著的成功。CAR包含对肿瘤上发现的抗原具有特异性的胞外结构域(抗体的一部分)，其偶联至例如CD3ζ和共刺激受体(如CD28或4-1BB)的信号结构域。其他信号结构域如Fc-γ受体(FcγR)(如FcγRIIIA(CD16A))和C型凝集素样受体NKG2D或二聚体受体DAP10。CAR在T细胞中的表达导致它们被肿瘤抗原激活。在某些血液恶性肿瘤中，使用CAR T细胞已经获得了最高达90％的完全缓解。由于来自肿瘤微环境的有限的T细胞运输和免疫抗性机制，在实体瘤的治疗中已获得了少得多的成功。

在效力和安全性方面优化CAR治疗并且将其应用扩展至其他恶性肿瘤中，已经尝试在其他白细胞(包括NK细胞和髓样细胞)中使用如上所述的CAR。NK细胞在CAR研究中受到第二大关注，并且基于NK细胞CAR治疗已开始了多次临床试验，其主要目的在于治疗血液恶性肿瘤，还旨在治疗实体瘤(Sievers et al.2020)。已经描述了CAR-髓样细胞，如嗜中性粒细胞和单核细胞，但迄今为止尚未开始临床试验。一种可能性是转导人造血干细胞(HSC)，随后扩增和分化以产生表达CAR的粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，例如De Olivera et al.(2013)对于在CD34⁺HSC中转导CD19-特异性CAR所描述的。Roberts等人描述了用抗CD4-CD3ζCAR转导HSC以及分离表达CAR的嗜中性粒细胞(1998)。WO 2020/223550描述了在髓样细胞、特别是吞噬细胞上表达的嵌合融合蛋白或CAR。其描述了吞噬性髓样细胞如巨噬细胞可以用融合蛋白工程化以具有增强的吞噬活性。为此目的，使用包含吞噬细胞信号结构域的胞内信号结构域，该结构域优选衍生自MegflO、MerTk、FcRa和Bail之外的受体。其进一步描述了髓样细胞可以被工程化以促进T细胞活化，但是没有描述出于此目的的特异性嵌合融合蛋白。在实验部分中，制备了具有CD8跨膜和FcγR胞内结构域与另外的细胞质结构域(如PI3K募集结构域或CD40细胞质部分)的嵌合融合蛋白，并且为单核细胞和巨噬细胞系提供了这些构建体。

本领域仍然需要用于免疫疗法、特别是肿瘤如实体瘤的改善的新组合物和方法。

发明内容

本发明的目的是提供改善的嵌合受体。本发明的另外的目的是提供用于改善一般肿瘤且特别地实体瘤的治疗的方法。

因此本发明提供了一种多肽，该多肽包含：

-Fcα受体(FcαR)的细胞内结构域，

-FcαR的跨膜结构域，和

-配体结合结构域。

在优选的实施方式中，该多肽是嵌合受体，特别是嵌合FcαR。在一个优选的实施方式中，该多肽是嵌合抗原受体(CAR)。

在另一方面，本发明提供了包含多肽的嵌合抗原受体(CAR)，该多肽包含：

-Fcα受体(FcαR)的细胞内结构域，

-FcαR的跨膜结构域，和

-配体结合结构域。

该多肽或CAR优选地按以下顺序包含指定的结构域：3’-FcαR细胞内结构域-FcαR跨膜结构域-配体结合结构域-5’。在一个优选的实施方式中，多肽或CAR优选地按以下顺序包含以下结构域：3’-FcαR细胞内结构域-FcαR跨膜结构域-间隔子-配体结合结构域-信号肽-5’。

在另一方面，本发明提供了包含编码根据本发明的多肽或CAR的序列的核酸分子。

在另一方面，本发明提供了包含根据本发明的核酸分子的载体。

在另一方面，本发明提供了包含根据本发明的多肽、CAR、核酸分子或载体的细胞。所述细胞进一步优选的是已经引入根据本发明的核酸分子或载体的细胞。所述细胞优选地表达根据本发明的多肽或CAR。所述细胞优选地是造血干细胞、髓样细胞或髓样祖细胞、或先天淋巴样细胞，更优选地是人造血干细胞、人髓样细胞或髓样祖细胞、或人先天淋巴样细胞。所述细胞进一步优选地选自粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞及其组合。在一个实施方式中，所述细胞是原代细胞，更优选地是从有待根据本发明治疗的受试者中分离的自体细胞。在另一个实施方式中，所述细胞是细胞系的细胞，例如NK-92细胞，优选照射的NK-92细胞。

在另一方面，本发明提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞，优选粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或NK细胞，更优选嗜中性粒细胞或NK细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含多肽，所述多肽包含：

-Fcα受体(FcαR)的细胞内结构域，

-FcαR的跨膜结构域，和

-异源配体结合结构域。

在另一方面，本发明提供了细胞，优选粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或NK细胞，更优选嗜中性粒细胞或NK细胞，该细胞提供有编码CAR的核酸分子，该CAR包含Fcα受体(FcαR)的细胞内结构域、FcαR的跨膜结构域和异源配体结合结构域。

在另一方面，本发明提供了包含多个根据本发明的细胞的细胞群。

在另一方面，本发明提供了包含根据本发明的核酸分子、载体、多肽或CAR以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

在另一方面，本发明提供了用于治疗、特别是用于免疫治疗的本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群。所述细胞优选地是髓样细胞或髓样祖细胞、造血干细胞或先天淋巴样细胞，更优选地是人髓样细胞或髓样祖细胞、人造血干细胞或人先天淋巴样细胞。所述细胞优选地选自粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞及其组合。在一个实施方式中，所述细胞是原代细胞，更优选地是从有待根据本发明治疗的受试者中分离的自体细胞。在另一个实施方式中，所述细胞是细胞系的细胞，例如NK-92细胞，优选照射的NK-92细胞。

在另一方面，本发明提供了用于在需要其的受试者中进行免疫治疗的方法，包括向其受试者给予治疗有效量的本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群。

在另一方面，本发明提供了本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群在制备用于免疫疗法的药物中的用途。

在另一方面，本发明提供了用于诱导或刺激免疫应答的本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群。所述细胞优选地是髓样细胞或髓样祖细胞、造血干细胞或先天淋巴样细胞，更优选地是人髓样细胞或髓样祖细胞、造血干细胞或先天淋巴样细胞。所述细胞优选地选自粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞及其组合。所述细胞进一步优选地是原代细胞，更优选地是从有待根据本发明治疗的受试者中分离的自体细胞。在另一个实施方式中，所述细胞是来自细胞系如NK-92细胞系的细胞。

在另一方面，本发明提供了用于在需要其的受试者中诱导或刺激免疫应答的方法，包括给予受试者本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群。

在另一方面，本发明提供了本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群在制备用于诱导或刺激免疫应答的药物中的用途。

在另一方面，本发明提供了用于治疗受试者的癌症的本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群。在一个实施方式中，该受试者(优选人)患有癌症。所述细胞优选地是髓样细胞或髓样祖细胞、造血干细胞或先天淋巴样细胞，更优选地是人髓样细胞或髓样祖细胞、造血干细胞或先天淋巴样细胞。所述细胞优选地选自粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞及其组合。所述细胞进一步优选地是原代细胞，更优选地是从有待根据本发明治疗的受试者中分离的自体细胞。在另一个实施方式中，该细胞是来自细胞系如NK-92细胞系的细胞。

在另一方面，本发明提供了用于治疗需要其的受试者中的癌症的方法，包括给予受试者本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群。

在另一方面，本发明提供了本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防病原性感染的本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群。所述细胞优选地是髓样细胞或髓样祖细胞、造血干细胞或先天淋巴样细胞，更优选地是人髓样细胞或髓样祖细胞、造血干细胞或先天淋巴样细胞。所述细胞优选地选自粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞及其组合。所述细胞进一步优选地是原代细胞，更优选地是从有待根据本发明治疗的受试者中分离的自体细胞。在另一个实施方式中，该细胞是来自细胞系如NK-92细胞系的细胞。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防需要其的受试者中的病原性感染的方法，包括向受试者给予治疗有效量的本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群。

在另一方面，本发明提供了本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群在制备用于治疗或预防病原性感染的药物中的用途。

在另一方面，本发明提供了生产根据本发明的细胞或根据本发明的细胞群的方法，包括

-将根据本发明的核酸分子或载体引入细胞群的一个或多个细胞中，以及

-使根据本发明的多肽或CAR表达。所述细胞优选地是髓样细胞或髓样祖细胞、造血干细胞或先天淋巴样细胞，更优选地是人髓样细胞或髓样祖细胞、造血干细胞或先天淋巴样细胞。所述细胞优选地选自粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞及其组合。所述细胞进一步优选地是原代细胞，更优选地是从有待根据本发明治疗的受试者中分离的自体细胞。在另一个实施方式中，该细胞是来自细胞系如NK-92细胞系的细胞。

具体实施方式

如在此使用的，“包含”及其变化形式以其非限制性含义使用，是指包括跟随该词的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，动词“由…组成”可以由“基本上由…组成”替代，是指如本文限定的化合物或辅助化合物(adjunct compound)可以包含除了具体指出的组分之外的另外的组分，所述另外的组分不改变本发明的独特特征。

冠词“一个(a)”和“一种(an)”在此用于指一个或多于一个(即，至少一个)的该冠词的语法对象。举例来讲，“元件”是指一个元件或多于一个元件。

词语“大约”或“约”在与数值结合使用(大约10，约10)时优选地是指该值可以是给定值10大于或小于该值的1％。

替代方案(例如，“或”)的使用应理解为是指替代方案中的任一个、两个或其任何组合。

如在此使用的，术语“治疗有效量”是指所施用的化合物的量足以在一定程度上缓解所治疗的疾病或病症的一种或多种症状。这可以是症状的减少或减轻、疾病或病症的病因的减少或减轻、或任何其他所希望的治疗效果。

如在此使用的，术语“预防”是指阻止或延迟疾病或病症的发作和/或在尚未经历该疾病的临床症状的受试者中该疾病或病症的临床症状的出现。

术语“治疗”是指抑制该疾病或病症，即停止或减少其发展或该疾病或病症的至少一种临床症状，和/或减轻该疾病或病症的症状。在一些实施方式中，可以在一种或多种症状已经发展之后给予治疗。在其他实施方式中，治疗可以在没有症状的情况下给予。例如，治疗可以在症状发作之前给予易感个体(例如，根据症状史和/或根据遗传或其他易感因素)。还可以在症状已经消退后继续治疗，例如以预防或延迟它们的复发。

如在此使用的，术语“受试者”涵盖人和动物，优选哺乳动物。优选地，受试者是哺乳动物，更优选地是人。

术语“多肽”是指包含经由肽键连接的氨基酸的化合物。由核酸序列编码的多肽不限于由核酸序列编码的氨基酸序列，而是可以包括多肽的翻译后修饰。

如在此使用的，关于多肽的氨基酸序列，术语“N-末端”和“C-末端”是指该多肽的氨基酸序列中分别朝向N-末端和C-末端的相对位置。“N-末端”和“C-末端”分别是指多肽的最远氨基末端和羧基末端。“紧邻N-末端”和“紧邻C-末端”是指第一氨基酸序列相对于第二氨基酸序列的位置，其中第一氨基酸序列和第二氨基酸序列共价结合以提供连续的氨基酸序列。

在本文定义的氨基酸序列中，氨基酸由单字母符号表示。这些单字母符号以及三字母符号是本领域技术人员熟知的并且具有以下含义：A(Ala)是丙氨酸，C(Cys)是半胱氨酸，D(Asp)是天冬氨酸，E(Glu)是谷氨酸，F(Phe)是苯丙氨酸，G(Gly)是甘氨酸，H(His)是组氨酸，I(Ile)是异亮氨酸，K(Lys)是赖氨酸，L(Leu)是亮氨酸，M(Met)是甲硫氨酸，N(Asn)是天冬酰胺，P(Pro)是脯氨酸，Q(Gln)是谷氨酰胺，R(Arg)是精氨酸，S(Ser)是丝氨酸，T(Thr)是苏氨酸，V(Val)是缬氨酸，W(Trp)是色氨酸，Y(Tyr)是酪氨酸。

如本文使用的，本发明的核酸分子或核酸序列包含任何长度的核苷酸链，优选DNA和/或RNA。更优选地，本发明的核酸分子或核酸序列包含双链RNA，以使用RNA干扰来降解靶RNA，如下文所解释的。在其他实施方式中，本发明的核酸分子或核酸序列包含其他种类的核酸结构，例如DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和/或核酶。术语核酸分子包括重组和合成的核酸分子。

氨基酸序列或核酸序列的同一性百分比或术语“％序列同一性”在此定义为在比对两个序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大百分比同一性之后，与参考氨基酸序列或核酸序列中的残基一致的氨基酸序列或核酸序列的全长的残基的百分比。如本文使用的，序列同一性是基于主题氨基酸序列的连续氨基酸计算的。用于比对的方法和计算机程序在本领域中是熟知的，例如“Align 2”。用于确定核苷酸序列同一性的程序在本领域中也是熟知的，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序。使用制造商推荐的默认参数容易地使用这些程序。

如在此使用的，术语“特异性结合”和“对于…具有特异性”是指配体结合结构域与其配体之间的相互作用，包括抗体或其抗原结合部分与其表位之间的相互作用。这些术语是指所述配体结合结构域优先于其他配体结合至所述配体。尽管配体结合结构域可以非特异性地结合至其他部分、氨基酸序列或配体，所述配体结合结构域对其配体的结合亲和力显著高于所述配体结合结构域对其他部分、氨基酸序列或配体的非特异性结合亲和力。

如在此使用的，术语“抗体”是指至少包括与轻链可变区(VL)配对的重链可变区(VH)的免疫球蛋白，该轻链可变区对靶表位具有特异性。

抗体的“抗原结合部分”在此定义为共享所述抗体的对于靶表位具有特异性的特性的部分。即，抗原结合部分能够结合与所述抗体相同的抗原，但是不必需达到相同的程度。在一个实施方式中，抗体的抗原结合部分至少包含重链可变域(VH)。抗体的抗原结合部分的非限制性实例是单结构域抗体、单链抗体、纳米抗体、单抗体(unibody)、单链可变片段(scFv)、Fab片段和F(ab’)₂片段。

如在此使用的，术语“纳米抗体”或“抗原结合纳米抗体”是指由能够选择性结合至靶抗原的单个单体可变抗体结构域组成的单结构域抗体。

如在此使用的，术语“scFv”是指包含抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的分子，它们可以通过接头连接，例如具有通用结构NH₂-V_L-接头-V_H-COOH或NH₂-V_H-接头-V_L-COOH。

如在此使用的，术语“亲和体(affimer)”是指能够特异性地结合至抗原的基于单链的抗体类似物，并且其是基于胱抑素半胱氨酸蛋白酶抑制剂支架的(参见Johnson etal.2012，以引用方式结合于本文)。

如在此使用的，术语“间隔子”是指连接多肽或CAR中的两个结构域并且可以提供多肽或CAR的适当表达和功能性的氨基酸序列。

如在此使用的，术语“结构域”是指在本发明的多肽或CAR中具有一定功能的氨基酸序列。此类结构域的实例尤其包括但不限于，FcαR细胞内结构域、FcαR跨膜结构域、配体结合结构域、跨膜结构域与配体结合结构域之间的间隔子、信号肽、标签以及二聚化结构域(dimerization domain)。

如在此使用的，术语“嵌合受体”和“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包含至少一个与配体如抗原或靶特异性结合的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和至少一个细胞内信号结构域的重组多蛋白。该至少三个结构域来源于至少两种不同的天然存在的多肽或蛋白质。嵌合抗原受体或CAR可以包含其他序列，如信号肽序列、一个或多个间隔子结构域和共刺激结构域。

本发明人已开发了包含Fcα-受体(FcαR)的跨膜和细胞内部分和可变细胞外结构域的可调CAR构建体。通过结合IgA同工型肿瘤抗原特异性抗体激活嗜中性粒细胞上的FcαR导致强抗肿瘤作用，与由IgG诱导的Fcγ-受体信号传导相比，这通常更强，治疗性抗体的同工型目前在临床上广泛应用。通过利用这种激活的Fcα-受体的细胞内结构域，可以推断与使用基于Fcγ-受体的CAR的Fcγ-受体信号传导相比，该CAR的抗肿瘤效应子功能放大。

进一步推断，表达具有FcαR细胞内结构域的CAR的嗜中性粒细胞的效应子功能之一是胞啃作用(trogocytosis)，其为一种最近描述的嗜中性粒细胞对抗抗体调理的肿瘤细胞的效应子机制。胞啃作用是一种坏死的溶解细胞死亡，其特征在于靶细胞的碎裂(破碎，fragmentation)，该碎裂是由嗜中性粒细胞对靶细胞的膜片段进行膜摄取而引发的。

可以调节包括FcαR细胞内和跨膜结构域的本发明的CAR用于识别多种抗原，包括造血系统恶性肿瘤的抗原和实体瘤抗原，导致对于靶向不同来源的癌症具有高治疗潜力。因此，CAR在其胞外肿瘤识别结构域中是模块化的(模制的，modular)，以获得最佳适应性(灵活性，柔性，flexibility)。此外，CAR技术被设计成适用于多种先天效应细胞，包括嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和NK细胞。

先天细胞(包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞)是免疫系统的基本效应子。利用这些先天细胞对抗肿瘤细胞是长期所关注的，尤其是在实体瘤的情况下，其中现有T细胞疗法获得有限的成功。CAR是最初设计成特异性地使朝向肿瘤抗原的T细胞活性重定向的受体，其已经成功地用于靶向血液癌，但是在实体瘤中不太成功。据认为本发明的CAR技术在基于T细胞的疗法受限的情况下是特别适合的并且是广泛适用的。通过靶特异性CAR表达而特异性地引导针对肿瘤的先天效应子功能为长期肿瘤控制开辟了新的可能性。特别地，已知肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和多形核细胞(PMN)良好地浸润实体瘤，并且认为CAR-TAM/PMN将肿瘤微环境(TME)极化成抗肿瘤vs促肿瘤。此外，CAR-TAM/PMN具有通过肿瘤抗原的交叉呈递或T细胞的共刺激在直接抗肿瘤作用之上产生适应性应答的潜力。虽然先天CAR的使用可以为维持持久应答提供障碍(由于它们的快速转变(turnover))，但是这实际上可以增加对如CAR T细胞所见的严重副作用的限制。

本文的实例公开了开发针对在成神经细胞瘤细胞上表达的GD2的CAR。CAR构建体设计为识别GD2的结构域，其由衍生自可商购的抗GD2抗体(克隆14.18)的单链片段可变(scFv)部分和Fcα-受体(FcαR)的跨膜和细胞内部分组成。如本文实施例中所示，成熟可诱导细胞可以成功地转导以表达CAR(超过80％阳性细胞)并且分化为嗜中性粒细胞样细胞。此外，表达GD2-CAR的嗜中性粒细胞样细胞能够特异性地杀死GD2+成神经细胞瘤细胞。特别地，显示这些细胞诱导GD2阳性成神经细胞瘤细胞的细胞毒性，而不需要抗GD2调理作用。进一步显示，FcαR细胞内结构域对于GD2-CAR的功能是必需的。重要的是，本发明人已经发现，与具有FcγRIIA细胞内和跨膜结构域的CAR构建体相比，在嗜中性粒细胞样细胞中具有FcαR细胞内和跨膜结构域的CAR构建体显示好得多的有效性：在所有测试的靶与效应细胞比率中，GD2-FcαR CAR嗜中性粒细胞样细胞显示能够有效地杀死GD2+靶细胞，而在这些嗜中性粒细胞样细胞中的GD2-FcγR CAR不诱导杀死(参见图11B)。出人意料地，与单独的GD2-FcαR CAR相比，GD2-FcαR CAR和GD2-FcγR CAR的组合还致使增强的细胞毒性，这表明该组合的协同效应。

此外，已经制备了具有Her2/neu或EGFR识别结构域的CAR构建体，并且显示提供有这些CAR构建体的嗜中性粒细胞样细胞分别对EGFR+和Her2/neu+表皮样癌以及乳腺癌细胞系A431和SKBR3是有效的，而不需要抗EGFR和抗Her2/neu调理作用。出人意料地发现，Her2/neu-FcαR CAR对于非调理细胞的细胞毒性能力高于野生型嗜中性粒细胞样细胞对于曲妥珠单抗调理的靶细胞的细胞毒性能力。

最后，本发明人已经进一步成功地在NK细胞中表达GD2-CAR。

在第一方面，本发明因此提供了一种多肽，该多肽包括：

-Fcα受体(FcαR)的细胞内结构域，

-FcαR的跨膜结构域，和

-配体结合结构域。

在优选的实施方式中，该多肽是嵌合受体，特别是嵌合FcαR。在一个优选的实施方式中，该多肽是嵌合抗原受体(CAR)。

还提供了包含多肽的嵌合抗原受体(CAR)，所述多肽包含：

-Fcα受体(FcαR)的细胞内结构域，

-FcαR的跨膜结构域，和

-配体结合结构域。

在优选的实施方式中，CAR由多肽组成，即CAR包含Fcα受体(FcαR)的细胞内结构域、FcαR的跨膜结构域和配体结合结构域。

本发明的多肽和CAR包含Fcα受体(FcαR)的细胞内和跨膜结构域。根据本发明的多肽或CAR的细胞内和跨膜结构域优选地具有人FcαR。FcαR也称为免疫球蛋白αFc受体，并且人FcαR以多种同工型存在，包括同工型A.1、同工型A.2、同工型A.3、同工型B、同工型B-δ-S2、同工型U02、同工型L10、同工型U09、同工型U10、同工型U11和同工型U13。这些FcαR同工型以及它们的序列是本领域已知的。在本文的实例中，使用同工型A.1的经典同工型的细胞内和跨膜结构域。FcαR同工型A.1的序列描绘在图1中。然而，任何FcαR的序列可以用于本发明的多肽或CAR中。在优选的实施方式中，人FcαR是人FcαR同工型A.1、同工型A.2、同工型A.3、同工型U02、同工型L10、同工型U10、同工型U11或同工型U13。

如在此使用的，“FcαR的细胞内结构域”是指能够启动FcαR信号传导的细胞内结构域。因此，根据本发明的多肽或CAR能够进行FcαR信号传导。当配体结合结构域与配体结合时，FcαR信号传导启动。因此，“能够进行FcαR信号传导”是指当多肽或CAR的配体结合结构域与配体结合时FcαR信号传导启动。FcαR细胞内结构域是本领域技术人员熟知的。它包括人FcαR的41个C末端氨基酸。这些是FcαR同工型A.1的氨基酸247-287，即序列ENWHSHTALNKEASADVAEPSWSQQMCQPGLTFAR TPSVCK，或其他FcαR同工型中的相应氨基酸。因此，本发明的多肽或CAR中存在的FcαR的细胞内结构域优选地包括如图1所示的FcαR同工型A.1序列的氨基酸247-287的序列，或不同于同工型A.1的FcαR同工型的相应序列，或与所述序列具有至少90％同一性的序列。除同工型A.1以外的所述FcαR同工型优选地是同工型A.2、同工型A.3、同工型U02、同工型L10、同工型U10、同工型U11或同工型U13。本发明的多肽或CAR中存在的细胞内结构域优选地能够启动FcαR信号传导。所述序列优选地与图1所示的FcαR同工型A.1的所述序列的氨基酸247-287至少95％一致，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％。在特别优选的实施方式中，FcαR的细胞内结构域包含图1所示的FcαR同工型A.1的所述序列的氨基酸247-287，更优选地，它由图1所示的FcαR同工型A.1的所述序列的氨基酸247-287组成。

在优选的实施方式中，除了FcαR的细胞内结构域之外，CAR不包含另外的细胞内结构域。特别地，除了FcαR的细胞内结构域之外，CAR不包含另外的功能性细胞内结构域。因此，当CAR由细胞(优选粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或NK细胞，更优选嗜中性粒细胞或NK细胞)表达时，细胞内不存在另外的功能性结构域。可以存在非功能性序列，例如连接序列或间隔子。在特别优选的实施方式中，CAR的细胞内和跨膜部分由FcαR的细胞内结构域和跨膜结构域组成，可选地由连接序列或间隔子隔开。在进一步优选的实施方式中，CAR的细胞内和跨膜部分由FcαR的细胞内结构域和跨膜结构域组成。如在此使用的，“CAR的细胞内和跨膜部分”是指当CAR由细胞(优选粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或NK细胞，更优选嗜中性粒细胞或NK细胞)表达时CAR的细胞内和跨膜部分。

如在此使用的，“FcαR的跨膜结构域”是指FcαR的跨膜结构域。FcαR跨膜结构域是本领域技术人员熟知的。它包含紧邻FcαR细胞内结构域的N末端的19个氨基酸。这些是FcαR同工型A.1的氨基酸228-246，即序列LIRMAVAGLVLVALLAILV，或在其他FcαR同工型中的相应氨基酸。因此，本发明的多肽或CAR中存在的FcαR的跨膜结构域优选地包括图1所示的FcαR同工型A.1序列的氨基酸228-246的序列，或不同于同工型A.1的FcαR同工型的相应序列，或与所述序列至少90％一致的序列。除同工型A.1以外的所述FcαR同工型优选地是同工型A.2、同工型A.3、同工型U02、同工型L10、同工型U10、同工型U11或同工型U13。所述序列优选地与图1所示的FcαR同工型A.1的所述序列的氨基酸228-246至少95％一致，更优选地至少97％一致，更优选地至少98％一致，更优选地至少99％一致。在特别优选的实施方式中，FcαR的跨膜结构域包含图1所示的FcαR同工型A.1的所述序列的氨基酸228-246，更优选地，它由图1所示的FcαR同工型A.1的所述序列的氨基酸228-246组成。

因此，本发明的优选的多肽或CAR包含图1所示的FcαR同工型A.1序列的氨基酸228-287的序列，或不同于同工型A.1的FcαR同工型的相应序列，或与所述序列至少90％一致的序列。除同工型A.1以外的所述FcαR同工型优选地是同工型A.2、同工型A.3、同工型U02、同工型L10、同工型U10、同工型U11或同工型U13。所述序列优选地与图1所示的FcαR同工型A.1的所述序列的氨基酸228-287至少95％一致，更优选地至少97％一致，更优选地至少98％一致，更优选地至少99％一致。在特别优选的实施方式中，FcαR的跨膜结构域包含图1所示的FcαR同工型A.1的所述序列的氨基酸228-287，更优选地它由图1所示的FcαR同工型A.1的所述序列的氨基酸228-287组成。

本发明的多肽或CAR可以包含FcαR的另外的部分序列，如FcαR的细胞外结构域的部分。例如，本发明的多肽或CAR可选地包含FcαR的细胞外结构域的1至50个连续氨基酸，优选地紧邻FcαR的跨膜结构域的N末端的1至50个连续氨基酸。这对应于图1所示的FcαR同工型A.1序列的氨基酸178-227，但也可以是不同于A.1的FcαR同工型的178-227。在一个实施方式中，本发明的多肽或CAR包含紧邻FcαR的跨膜结构域N末端的5至30个氨基酸，即紧邻图1所示的FcαR同工型A.1的跨膜结构域的N末端的氨基酸198-227中的至少5个连续氨基酸，或不同于A.1的FcαR同工型的相应氨基酸。例如紧邻图1所示的FcαR同工型A.1的跨膜结构域的N末端的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续氨基酸，或不同于A.1的FcαR同工型的相应氨基酸。紧邻跨膜结构域的N末端的此类另外的氨基酸可以提供本发明的多肽或CAR的适应性。

如在此使用的，术语“配体结合结构域”是指特异性地结合至配体的结构域。配体结合结构域是异源配体结合结构域，如在此使用的，该结构域是指它是不同于FcαR的细胞外结构域的配体结合结构域。配体结合结构域可以是可以被所选择的配体结合的任何结构域。具体地，该配体结合结构域可以是任何细胞表面抗原或任何可溶性配体的结合配偶体(partner)。配体结合结构域的多样性允许对于任何特定应用选择适当的配体。以这种方式，由本发明的多肽或CAR激活FcαR信号传导可以在选择的时间、选择的位置/细胞类型或两者启动。合适的细胞外配体结合结构域的优选实例是对可溶性配体具有特异性的配体结合结构域、对细胞表面抗原具有特异性的配体结合结构域以及它们的组合。细胞表面抗原的优选实例是肿瘤抗原、髓源性抑制细胞抗原和病原性抗原。如在此使用的，“肿瘤抗原”是指在肿瘤的细胞上表达的任何抗原。肿瘤抗原也称为肿瘤相关抗原(TAA)。如在此使用的，“髓源性抑制细胞抗原”是指在MDSC上表达的任何抗原。如在此使用的，“在髓源性抑制细胞上表达的抗原”涉及来自髓样细胞系的免疫细胞，这些免疫细胞在病理情况(如癌症和慢性感染)下扩增并且具有免疫抑制特性。因此，MDSC具有取决于环境的感染性或肿瘤促进活性。在一个优选的实施方式中，该MDSC是肿瘤相关的MDSC，例如存在于肿瘤微环境中的MDSC。如在此使用的，“病原性抗原”是指由微生物或寄生虫表达的任何抗原，该微生物或寄生虫包括但不限于病毒、细菌、寄生虫、真菌以及寄生虫。在优选的实施方式中，所述配体结合域对肿瘤抗原或髓源性抑制细胞(MDSC)抗原具有特异性。以下类型的细胞表面抗原可以是本发明的多肽或CAR的配体结合结构域的靶：肿瘤或MDSC特异性抗原；与非肿瘤细胞和非MDSC上的表达水平相比，在肿瘤细胞或MDSC上具有更高表达水平的抗原；在肿瘤细胞或MDSC以及非肿瘤细胞和非MDSC两者上表达的抗原，但是由此由非肿瘤细胞和非MDSC诱导的表达本发明的多肽或CAR的细胞的活化导致可接受的副作用；在肿瘤细胞或MDSC以及非肿瘤细胞或非MDSC两者上表达、但与一种或多种其他抗原组合对肿瘤细胞或MDSC具有特异性的抗原；和在肿瘤周围细胞上表达的抗原。

在一个实施方式中，所述配体结合结构域包含选自由以下各项组成的组的部分：

··抗体或抗体的抗原结合部分，如对细胞表面抗原具有特异性的单链可变片段(scFv)、纳米抗体或亲和体(affimer)；

·Fc受体的细胞外Fc结合结构域或其配体结合片段，

··对可溶性配体具有特异性的配体结合结构域，

··抗体的表位，其可以交联多肽或CAR而不涉及表面抗原或分子；

··识别部分(如生物素、FITC或肽表位)的结构域，该部分可以偶联至对细胞表面抗原(如肿瘤抗原)具有特异性的分子(例如抗体或scFv)，

··部分(如生物素)，其可以通过具有针对该部分的多个结合位点的试剂交联，如链霉素(在添加所述试剂时产生多个多肽或CAR的团簇)。

在一个优选的实施方式中，细胞表面抗原是肿瘤抗原。

在一个优选的实施方式中，配体结合结构域是抗体或抗体的抗原结合部分，包括对所述肿瘤抗原具有特异性的scFv和纳米抗体或亲和体。例如，对肿瘤抗原或其抗原结合部分具有特异的任何已知的治疗性抗体，如scFv，可以用作本发明的多肽或CAR的配体结合结构域。肿瘤抗原的优选实例是GD2、EGFR、HER2/Neu、TAG-72、钙活化的氯化物通道2，包括TMEM16A、9D7、Ep-CAM、EphA3、间皮素、SAP-1、BAGE家族、MC1R、前列腺特异性抗原、CML66、TGF-βR11、MUC1、CD5、CD19、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD152(CTLA-4)、CD274(PD-L1)、CD273(PD-L2)、CD340(ErbB-2)、TPBG、CA-125、MUC1以及未成熟的层粘连蛋白受体。

在一个优选的实施方式中，肿瘤抗原选自GD2、EGFR和HER2/Neu。GD2是在神经外胚层起源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷，包括人成神经细胞瘤(约91％-100％的患者)和黑色素瘤(约2.4％-14％的患者)。GD2还在小细胞肺癌(SCLC；约>50％的患者)、尤文肉瘤(约40％-90％的患者)、骨肉瘤(约88％的患者)、神经胶质瘤(约80％的患者)、视网膜母细胞瘤(约40％的患者)以及乳腺癌、膀胱癌(取决于阶段和亚型的表达)上表达。表皮生长因子受体(EGFR)是跨膜蛋白。已经将导致EGFR过表达的突变与多种癌症关联，这些癌症包括结肠直肠癌、头颈癌(约80％-100％的患者)、非小细胞肺癌(NSCLC；约40％的患者)，特别是转移性NSCLC、肛门癌和成胶质细胞瘤(约50％的患者)。HER2/Neu是由某些类型的乳腺癌表达的癌基因。

本领域技术人员完全能够识别可以用作根据本发明的多肽或CAR中的配体结合结构域的可溶性配体和它们的结合配偶体。作为可溶性配体，例如可以使用结合至本发明的多肽或CAR的配体结合结构域的可溶性形式的配体，并且因此为表达多肽或CAR的细胞提供终止信号。

在一个实施方式中，配体结合结构域包含Fc受体的细胞外Fc结合结构域或其配体结合片段。代替细胞表面抗原作为配体结合结构域，多肽或CAR在细胞外包含Fc受体的抗体识别结构域，即CD16。以这种方式，设计多肽或CAR以识别针对肿瘤细胞或MDSC的治疗性抗体，但同时受益于由多肽或CAR的跨膜和细胞内FcαR结构域诱导的放大信号传导。

还可行的是包含在本发明的多肽或CAR中的对可溶性配体具有特异性的配体结合结构域和包含在单独分子(例如，抗体或scFv)中的对细胞表面抗原(如肿瘤抗原)具有特异性的配体结合结构域的组合。在这种情况下，只有可溶性配体和细胞表面抗原都存在时，才会诱导FcαR信号传导。例如，本发明的多肽或CAR的配体结合结构域可以包含识别例如肽新表位或针对生物素或FITC部分的结构域。然后将利用针对肿瘤上的(肿瘤)表面抗原(其包含肽新表位、生物素或FITC部分)的另一种抗体(“开关(switch)”抗体)。因此，FcαR信号传导的激活将仅在以下情况下发生：除了由开关抗体靶向的细胞表面抗原之外，开关抗体本身也存在。可以与本发明的多肽或CAR一起使用的这类技术的实例描述于Ma et al.(2016)和Mitwasi et al.(2020)，其通过引用结合于此，并允许受体的临时控制(仅当需要时打开和关闭它)以及定量控制(通过增加或降低开关抗体的浓度)。

除了FcαR的细胞内结构域、FcαR的跨膜结构域和配体结合结构域之外，根据本发明的多肽或CAR可以包含另外的序列或结构域。此类序列和结构域的实例是FcαR细胞内结构域与FcαR跨膜结构域之间和/或FcαR跨膜结构域与配体结合结构域之间的一个或多个连接序列或间隔子、信号肽序列、一个或多个标签以及二聚化基序。

在一个优选的实施方式中，间隔子位于FcαR跨膜结构域和配体结合结构域之间。此类间隔子优选地包括最高达300个氨基酸，例如10-300个氨基酸。在一个优选的实施方式中，间隔子由至少200个氨基酸组成。原则上，此类间隔子可以是任何随机的氨基酸序列。合适的间隔子序列的实例是基于IgG1、IgG2或IgG4的间隔子，例如基于CH₂CH₃铰链区，该铰链区可选地包括一个或多个突变以减少与Fcγ受体的结合，以及缺乏FcγR结合活性的细胞外结构域，如CD28和CD8α结构域。适合的实例描述于Guedan et al.(2019)中，其通过引用结合在此。合适的间隔子的另一实例是基于Siglec-4的间隔子(如et al.(2020)所述，其通过引用并入本文)。在一个优选的实施方式中，间隔子包括或者是人IgG(优选地IgG1、IgG2或IgG4，更优选地IgG1)的CH₂CH₃铰链区，该铰链区可选地包含一个或多个突变。人IgG的该CH₂CH₃铰链区及其序列在本领域中是熟知的，并且是例如GenBank登录号AAC82527.1的序列的氨基酸98-329。

在一个优选的实施方式中，本发明的多肽或CAR包含信号肽。可以存在能够将多肽引导至细胞膜的信号肽以刺激细胞将多肽或CAR易位至细胞膜。信号肽在本领域中是熟知的，并且本领域技术人员能够熟练选择合适的信号肽。此类信号肽优选地包括最高达50个氨基酸。在一个优选的实施方式中，信号肽由10-40个氨基酸或15-35个氨基酸组成。在一个实施方式中，信号肽是具有序列MEFGLSWLFLVAILKGVQCE(GenBank登录号AAA587335.1的序列的氨基酸1-19)的人免疫球蛋白重链信号肽。

在另一个实施方式中，本发明的多肽或CAR包含标签，优选包含在细胞外结构域中，如小肽表位。通过特异性靶向标签，例如对于标签具有特异性的CAR T细胞，这样的标签可以用于消除表达本发明的多肽或CAR的细胞。本领域技术人员可以识别适合的标签，并且在Koristka et al.(2019)(其通过引用并入本文)中描述了可以用于本发明的多肽或CAR中以消除表达CAR的细胞的一种适合的标签和的程序。作为另一个实例，这种标签可以用于将包含识别标签的部分的配体结合结构域附接至多肽或CAR的剩余部分。

在优选的实施方式中，除了FcαR的细胞内结构域之外，CAR不包含另外的细胞内结构域。特别地，除了FcαR的细胞内结构域之外，CAR不包含另外的功能性细胞内结构域。因此，当CAR由细胞(优选粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或NK细胞，更优选嗜中性粒细胞或NK细胞)表达时，细胞内不存在另外的功能性结构域。可以存在非功能性序列，例如连接序列或间隔子。在特别优选的实施方式中，CAR的细胞内和跨膜部分由FcαR的细胞内结构域和跨膜结构域组成，可选地由连接序列间隔子隔开。

进一步提供了包含编码根据本发明的多肽或CAR的序列的核酸分子。还提供了包含根据本发明的核酸分子的载体。在优选的实施方式中，该载体是病毒载体，例如慢病毒载体或逆转录病毒载体。在另一优选的实施方式中，载体包含或是转座子。所述核酸分子或载体可以另外包含其他组件，如用于高表达水平的元件，如强启动子，例如病毒来源的强启动子，其引导在引入载体的特定细胞中的表达，以及信号序列。在一个优选的实施方式中，该核酸分子或载体包括以下组件中的一种或多种：驱动在先天细胞中表达的启动子，例如SFFV启动子；C末端信号肽，例如来自GMCSF蛋白或CD8蛋白用于靶向质膜；以及聚腺苷酸化信号。

进一步提供了当由细胞表达时本发明的多肽或CAR。还提供了包含根据本发明的核酸分子或载体的细胞，优选分离的细胞。还提供了根据本发明的细胞群。所述细胞群优选地包含多个根据本发明的细胞。该细胞优选地是人细胞。细胞群中的细胞优选地是人细胞。

该细胞优选地是造血干细胞、成熟可诱导细胞、人多能干细胞(hPSC)、诱导的多能干细胞(iPSC)、髓样细胞或髓样祖细胞或先天淋巴样细胞。先天淋巴样细胞(ILC)是T细胞的先天对应物，其通过分泌效应细胞因子和调节其他先天性和适应性免疫细胞的功能而有助于免疫应答，并且包括NK细胞、ILC1s、ILC2s、ILC3s和淋巴样组织诱导物(LTi)细胞。更优选地，该细胞是造血干细胞、hPSC、iPSC、粒细胞(包括嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)、单核细胞、巨噬细胞、成髓细胞、红细胞、树突细胞或肥大细胞、或NK细胞、或其组合。细胞群中的细胞优选为髓样细胞或髓样祖细胞、人造血干细胞、hPSC、人iPSC和/或先天淋巴细胞，更优选地选自造血干细胞、粒细胞(包括嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)、单核细胞、巨噬细胞、成髓细胞、红细胞、树突细胞和肥大细胞、NK细胞及其组合。在一个优选的实施方式中，该细胞是粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或NK细胞或其组合。在优选的实施方式中，该细胞是嗜中性粒细胞。在其他优选的实施方式中，该细胞是NK细胞。在一个优选的实施方式中，细胞群中的细胞选自粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞或其组合。在优选的实施方式中，细胞群中的细胞是嗜中性粒细胞。在其他优选的实施方式中，细胞群中的细胞是NK细胞。该细胞(特别是NK细胞的嗜中性粒细胞)可以是任何来源的，包括细胞系的细胞、原代细胞或从任何成熟可诱导的细胞分化的细胞、hPSC或iPSC。如在此使用的，“原代细胞”是指直接从生物体、优选人获得的细胞。可以培养原代细胞以进行增殖或扩增，或如下文所描述直接修饰(改变，modified)和使用细胞。在一个实施方式中，直接修饰原代细胞。原代细胞优选为造血干细胞、髓样细胞或髓样祖细胞，或先天淋巴样细胞，更优选造血干细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或NK细胞，或其组合，例如是从受试者的血液或健康组织中分离。可以使用本领域用于分离此类细胞的标准方法从血液或健康组织中分离细胞。细胞系的优选实例是NK细胞系，更优选NK-92细胞系。该细胞系适合CAR治疗并且在Tang et al.(2018)中公开，其通过引用并入本文。如果细胞是造血干细胞、髓样祖细胞、成熟可诱导细胞、hPSC或iPSC，则细胞可以是并且优选地是分化的或扩增的和分化的以产生表达CAR的髓样细胞，特别是粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和/或巨噬细胞或NK细胞。

细胞优选为造血干细胞、成熟可诱导细胞、hPSC、iPSC、髓样细胞或髓样祖细胞、或先天淋巴样细胞，优选是工程化细胞或重组修饰的细胞。如在此使用的，术语“工程化细胞”和“重组修饰的细胞”是指外来的(即，非天然存在的)核酸已经引入其中的细胞，特别是指其中已经引入本发明的核酸分子或载体的细胞。即，该细胞优选地是其中已经引入根据本发明的核酸分子或载体的细胞。可以通过本领域已知的任何方法将核酸分子或载体引入细胞、优选免疫细胞中，如通过转染、转导，例如，慢病毒转导或逆转录病毒转导、DNA电穿孔或RNA电穿孔。核酸分子或载体瞬时或稳定地提供给细胞。使用核酸对细胞进行转染、转导或电穿孔的方法是本领域技术人员已知的。

本发明的细胞优选地包括本发明的多肽或CAR，更优选地表达本发明的多肽或CAR。因此，还提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)包含含有Fcα受体(FcαR)的细胞内结构域、FcαR的跨膜结构域和异源配体结合结构域的多肽。

本发明的多肽或CAR优选地在细胞表面表达。即，细胞被遗传修饰以表达本发明的多肽或CAR。当多肽或CAR由细胞表达时，本发明的多肽或CAR中的FcαR的细胞内结构域优选是细胞内的。当多肽或CAR由细胞表达时，本发明的多肽或CAR中的FcαR的跨膜结构域优选是跨膜的。当多肽或CAR由细胞表达时，配体结合结构域优选是细胞外的。

在一个实施方式中，该细胞是从患者、特别是根据本发明待治疗的患者分离的自体细胞。在一个实施方式中，该细胞群是从患者、特别是根据本发明待治疗的患者分离的自体细胞群。在一个实施方式中，所述患者是患有癌症、特别是患有根据本发明治疗的癌症的患者。在另一个实施方式中，该细胞是来自细胞系、例如NK-92细胞系的细胞。

还提供了包含根据本发明的核酸分子、载体、多肽或CAR以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。还提供了包含根据本发明的细胞或细胞群以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。“药学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其他成分相容并且对其受体无害，例如无毒。通常，可以使用不干扰活性化合物的功能的任何药学上合适的添加剂。根据本发明的药物组合物优选适于人使用。

合适的载体的实例包括溶液、乳糖、淀粉、纤维素衍生物等，或它们的混合物。在优选的实施方式中，所述合适的载体是溶液，例如盐水。该药物组合物优选地是用于肠胃外给予的制剂，特别是输注制剂。用于肠胃外给予的制剂包括关节内、肌内、静脉内、心室内、动脉内、鞘内和皮下给予。此外，该药物组合物可以经由灌注或经由来自医疗护理专业人员的注射给予至医院中的受试者。用于肠胃外给予的组合物可以是例如本发明的核酸分子、载体、多肽、CAR、细胞或细胞群在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，肠胃外制剂可以包括例如增溶剂、稳定剂和/或局部麻醉剂以减轻注射部位处的疼痛。

本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞和细胞群有利地用于治疗，优选免疫疗法。因此，提供了用于疗法和用于免疫疗法的本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群。还提供了用于在需要其的受试者中进行免疫疗法的方法，包括向其受试者给予治疗有效量的本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群。在一个实施方式中，所述免疫疗法是肿瘤免疫疗法。还提供了本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群，用于诱导或刺激免疫应答，特别是在癌症的治疗中。还提供了用于在需要其的受试者中、特别是在癌症的治疗中诱导或刺激免疫应答的方法，包括给予受试者本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群。在优选的实施方式中，任何此类方法包括给予根据本发明的细胞或细胞群。在优选的实施方式中，所述免疫疗法、特别是肿瘤免疫疗法包括过继性细胞转移，更优选过继性髓样细胞转移或过继性先天淋巴样细胞转移，其中髓样细胞或先天淋巴样细胞是在此以上定义的细胞。优选地，所述髓样细胞和/或先天淋巴样细胞选自粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞或其组合。

如在此使用的，“过继性细胞转移”是指将本发明的细胞转移到患者中，特别是患有癌症的患者中。具体地，“过继性髓样细胞转移”是指将本发明的髓样细胞转移到患者中并且“过继性先天性淋巴样细胞转移”是指将本发明的先天性淋巴样细胞转移到患者中。细胞可以来源于患者自身或可以来自另一个个体。根据本发明已工程化或重组修饰这些细胞以表达本发明的多肽或CAR。过继性髓样细胞转移优选地包括转移来源于待治疗的受试者或患者的自体髓样细胞。过继性先天性淋巴样细胞转移优选包括转移来源于待治疗的受试者或患者的自体先天性淋巴样细胞，特别是NK细胞，或NK-92细胞系的细胞。

如在此使用的，“免疫疗法”是指通过在所述个体中诱导或增强免疫应答来治疗患有疾病或病症的个体。肿瘤免疫疗法涉及诱导或增强个体针对肿瘤和/或所述肿瘤细胞的免疫应答。根据本发明的免疫疗法可以用于治疗或预防，优选地其用于治疗，特别是癌症或肿瘤。

还提供了用于治疗受试者的癌症的本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群。在一个实施方式中，该受试者(优选人)患有癌症。还提供了用于治疗在需要其的受试者中的癌症的方法，包括给予受试者本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体、细胞或细胞群。所述癌症治疗优选地包括给予患有癌症的受试者(优选人)有效量的本发明的细胞，即表达本发明的多肽或CAR的细胞。所述细胞优选地是髓样细胞或先天淋巴样细胞，更优选地是选自粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞或其组合的细胞。所述细胞进一步优选地是从受试者分离的自体细胞，其中随后引入本发明的核酸分子或载体，从而提供表达本发明的多肽或CAR的自体细胞。在另一个实施方式中，该细胞是来自细胞系(例如NK-92细胞系)的细胞。

可以使用基于根据本发明的多肽或CAR和/或细胞，优选髓样细胞、或先天淋巴样细胞，更优选自体或细胞系髓样细胞或先天淋巴样细胞，如粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞或其组合的疗法来治疗的癌症，其中已经引入或表达根据本发明的多肽或CAR的根据本发明的核酸分子或载体，所述癌症可以是任何类型的肿瘤，包括实体瘤、血液肿瘤、原发性肿瘤、继发性肿瘤、晚期肿瘤和转移。可以根据本发明治疗或预防的肿瘤的非限制性实例是急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性粒单核细胞性白血病(CMML)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、嗜酸性粒细胞性白血病、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、大细胞免疫母细胞淋巴瘤、浆细胞瘤、肺肿瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺肿瘤、乳腺肿瘤、肝脏肿瘤、脑肿瘤、皮肤肿瘤、骨肿瘤(包括尤文肉瘤和骨肉瘤)、结肠肿瘤、直肠肿瘤、肛门肿瘤、小肠肿瘤、胃肿瘤、神经胶质瘤、内分泌系统肿瘤、肾上腺肿瘤(包括成神经细胞瘤、甲状腺肿瘤、食管肿瘤、胃肿瘤、子宫肿瘤、泌尿道肿瘤和膀胱肿瘤)、肾肿瘤、肾细胞癌、前列腺肿瘤、胆囊肿瘤、头或颈肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、眼肿瘤(包括视网膜母细胞瘤)、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、子宫内膜、食管、眼或胃肠道基质瘤、脂肪肉瘤、鼻咽肿瘤、甲状腺肿瘤、阴道肿瘤和外阴肿瘤。

在一个实施方式中，肿瘤是实体瘤。本发明人已经发现，本发明的CAR技术尤其适合于治疗实体瘤。特别地，已知髓样细胞如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和多形核细胞(PMN)良好地浸润实体瘤，并且CAR-TAM/PMN被认为将肿瘤微环境(TME)极化成抗肿瘤vs促肿瘤。除此之外，当配体结合结构域结合时，FcαR信号传导启动，并且因此先天效应子功能启动。因此，在一个优选的实施方式中，癌症选自由以下各项组成的组：成神经细胞瘤、黑色素瘤、小细胞肺癌(SCLC)、尤文肉瘤、骨肉瘤、神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肛门癌和成胶质细胞瘤。

在一个优选的实施方式中，根据本发明治疗的癌症是成神经细胞瘤。荷兰每年有大约25-35名年龄中值为3岁的儿童被诊断为成神经细胞瘤，美国则有大约800名儿童。约50％的这些诊断的儿童落入高风险组并且经历强烈的多模式治疗。最近，将基于抗体的抗GD2免疫疗法整合到对患有成神经细胞瘤的患者的治疗方案中，从而改善了特别是高风险成神经细胞瘤患者的总体存活。作为作用机制，通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀死抗GD2调理的肿瘤细胞，这是由各种表达FcγR的免疫细胞(包括先天效应细胞嗜中性粒细胞、巨噬细胞和NK细胞)介导的过程。尽管通过将抗GD2抗体添加至治疗方案已经显著改善了存活率，但仍有约50％的患者将复发并死于该疾病。特别是这些高风险成神经细胞瘤患者因此需要更有效和靶向的方法，这种方法首次以嵌合抗原受体(CAR)T细胞的过继性转移的形式引入。虽然在早期临床试验中显示出有希望，但是针对成神经细胞瘤的CAR T细胞活性没有如在血液恶性肿瘤中使用它们的情况那样强劲。在使用针对成神经细胞瘤的CAR T细胞时，尤其是次优的T细胞持久性、效力和免疫抑制性肿瘤微环境被认为是严重挑战。由于嗜中性粒细胞、髓样和NK细胞被认为是驱动抗GD2治疗成功的重要效应细胞，因此它们对于根据本发明的治疗成神经细胞瘤是特别有用的。

在另一个优选的实施方式中，根据本发明治疗的癌症是黑色素瘤。

在另一个优选的实施方式中，根据本发明治疗的癌症是尤文肉瘤。

在另一个优选的实施方式中，根据本发明治疗的癌症是乳腺癌，特别是Her2/neu+和/或EGFR+乳腺癌。

本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体并且特别是表达多肽或CAR的细胞有利地与一种或多种另外的治疗剂或治疗组合。此类另外的疗法或治疗剂可以是本领域中已知的任何抗癌剂或免疫调节剂或治疗。在一个实施方式中，该CAR、核酸分子、载体或细胞与治疗性抗体、检查点抑制剂、细胞因子、化疗剂或基于T细胞的疗法组合。在优选的实施方式中，该组合是与免疫治疗剂或免疫疗法，特别是治疗性抗体、检查点抑制剂、细胞因子或基于T细胞的疗法的组合。

检查点的优选但非限制性的实例是细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、程序性死亡-1(PD-1)、PD-配体1(PD-L1)、PD-L2、信号调节蛋白α(SIRPα)、CD47、含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3的分子3(TIM3)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、CD276、CD272、A2AR、VISTA以及吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)。与根据本发明的多肽、CAR或表达多肽或CAR的细胞组合的治疗性抗体或检查点抑制剂优选地选自由以下各项组成的组：抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗SIRPα抗体、抗CD47抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗CD276抗体、抗CD272抗体、抗KIR抗体、抗A2AR抗体、抗VISTA抗体、抗TIGIT抗体、抗IDO抗体。

有利地与根据本发明的多肽、CAR或表达多肽或CAR的细胞组合的其他治疗性抗体是抗GD2抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/Neu抗体、抗CD20抗体、抗CD3抗体、抗TNFα抗体、抗CD147抗体、抗IL8抗体、抗MUC18抗体、抗MUC1、抗α-4-β-1(VLA-4)和α-4-β-7抗体、抗VLA-1整联蛋白抗体、抗淋巴毒素β受体(LTBR)抗体、抗TGF-β抗体、抗IL-12p40抗体、抗VEGF抗体、抗HER受体家族抗体、抗CD11a抗体、抗IL15抗体、抗CD40L抗体、抗CD80抗体、抗CD23抗体、抗巨噬细胞迁移因子(MIF)抗体、抗VE钙粘蛋白抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗IL15抗体、抗细胞间粘附分子-1(ICAM-1)(CD54)抗体、抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体、抗γ干扰素抗体、抗IL-12抗体、抗Ep-CAM抗体。用于与本发明的治疗组合的适合的抗体是地努妥昔单抗(dinutuximab)、纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、兰布罗利珠单抗(lambrolizumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、利瑞鲁单抗(lirilumab)、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕妥珠单抗(pertuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、奥拉单抗(olaratumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、ado-曲妥珠单抗美坦新(ado-trastuzumabemtansine)、地舒单抗(denosumab)、阿维单抗(avelumab)、西米普利单抗(cemipimab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、恩诺单抗(enfortumab vedotin)、德曲妥珠单抗(trastuzumabderuxtecan)、戈沙妥珠单抗(sacituzumab govitecan)。在一些优选的实施方式中，治疗性抗体是对由CAR的异源配体结合结构域识别的配体或抗原具有特异性的抗体。在其他优选的实施方式中，治疗性抗体是对除了由CAR的异源配体结合结构域识别的配体或抗原之外的另一种配体或抗原具有特异性的抗体。优选地，配体和/或抗原两者由被CAR靶向的特定细胞、特别是癌细胞或肿瘤细胞表达。例如，如在实施例中证明的，抗EGFR抗体有利地与Her2/Neu-CAR组合。

如在此使用的，术语“化疗剂”是指用于癌症的化疗的细胞毒性剂。有利地与根据本发明的多肽、CAR或表达多肽或CAR的细胞组合的化疗剂的非限制性实例包括烷化剂，例如环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、达卡巴嗪、亚硝基脲以及替莫唑胺；蒽环类药物，例如多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)以及戊柔比星(valrubicin)；细胞骨架破坏剂，例如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、白蛋白紫杉醇(abraxane)和泰索帝(taxotere)；拓扑异构酶1抑制剂，例如伊立替康(irinotecan)和拓扑替康(topotecan)；拓扑异构酶H抑制剂，例如依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)和他氟泊苷(tafluposide)；激酶抑制剂，例如硼替佐米(bortezomib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)、维莫非尼(vemurafenib)和维莫德吉(vismodegib)；核苷酸类似物，例如氮杂胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、巯基嘌呤、甲氨蝶呤和硫鸟嘌呤(tioguanine)；基于铂的试剂，例如顺铂、卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)；和长春花生物碱衍生物，例如长春碱(vinblastin)和长春新碱(vincristine)。

有利地与根据本发明的多肽、CAR或表达多肽或CAR的细胞组合的细胞因子的非限制性实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；白细胞介素(IL)-2、IL-3、IL-4、和IL-12；干扰素，例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-γ、IFN-κ、IFN-λ、IFN-τ和IFN-ω；肿瘤坏死因子α(TNFα)；G-CSF。

如在实施例中证明的(参见图5)，如果与靶向相应的肿瘤抗原或由靶细胞表达的另一种抗原的抗体组合治疗，则表达根据本发明的GD2-、EGFR-或Her2/neu-FcαR CAR的嗜中性粒细胞样细胞出人意料地分别显示出针对GD2+、EGFR+和Her2/neu+靶细胞的增加的细胞毒性。因此，在优选的实施方式中，特别是在免疫疗法(包括癌症的治疗)中，将本发明的细胞或细胞群与抗肿瘤抗原抗体组合。在一些优选的实施方式中，这样的抗肿瘤抗原抗体是对配体或抗原(特别是肿瘤抗原)具有特异性的抗体，该配体或抗原被CAR的异源配体结合结构域识别。在其他优选的实施方式中，治疗性抗体是对除了被CAR的异源配体结合结构域识别的配体或抗原之外的另一种配体或抗原具有特异性的抗体。优选地，配体和/或抗原两者由被CAR靶向的特定细胞、特别是癌细胞或肿瘤细胞表达。例如，如在实施例中证明的，抗EGFR抗体有利地与Her2/Neu-CAR组合。

本发明的多肽、CAR、核酸分子、载体并且特别是表达多肽或CAR的细胞也有利地用于治疗病原性感染。如在此使用的，“病原性抗原”是指由微生物或寄生虫表达的任何抗原，该微生物或寄生虫包括但不限于病毒、细菌、寄生虫、真菌以及寄生虫。可以根据本发明治疗的病原性细菌的实例包括但不限于李斯特氏菌属(Listeria)、埃希氏菌属(Escherichia)、衣原体属(Chlamydia)、立克次氏体属(Rickettsia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、脑膜炎球菌属(Meningococcus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、军团菌属(Legionella)、白喉菌属(Diphtheria)、沙门氏菌属(Salmonella)、弧菌属(Vibrio)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)以及钩端螺旋体菌属(Leptospira)的细菌。可以根据本发明治疗的病原性病毒的实例包括但不限于甲型、乙型或丙型肝炎、疱疹病毒(例如VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II、CMV、爱泼斯坦巴尔病毒(EpsteinBarr-virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒和人免疫缺陷病毒(HIV病毒；例如，I型和II型)。可以根据本发明处理的病原性真菌的实例包括但不限于念珠菌(Candida)(例如白色念珠菌(albicans)、克鲁斯念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis))、曲霉(Aspergillus)(例如烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger))、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粘膜菌(Mucorales)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)以及粗球孢子菌(Coccidioides immitis)。可以根据本发明处理的病原寄生虫的实例包括但不限于溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、疟原虫(Plasmodium)(例如恶性疟(falciparum)、间日疟(vivax))、内阿米巴(Entamoeba)、贾第鞭毛虫(Giarodia)、结肠小袋纤毛虫(Baldalium coli)、棘阿米巴(Acanthamoeba)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、卡氏肺孢菌(Pneumocystis carinii)、微小巴贝虫(Babesia microti)、锥虫(Trypanosoma)(例如布氏锥虫(brucei)、克氏锥虫(cruzi))、利什曼原虫(Leishmania)(例如杜氏利什曼原虫(donovani)、以及刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)。

在一个实施方式中，将核酸分子、载体或细胞包含在疫苗中或与疫苗组合使用。因此，提供了包含根据本发明的核酸分子、载体或细胞的疫苗，用于在需要其的受试者中诱导或刺激免疫应答的方法中使用。该方法包括将疫苗给予受试者。因此，还提供了包含根据本发明的核酸分子、载体或细胞的疫苗，用于在治疗或预防需要其的受试者中的病原性感染的方法中使用。该方法包括将疫苗给予受试者。根据本发明的疫苗优选地包含另外的组分，例如药学上可接受的载体或赋形剂以及一种或多种佐剂。

在一些实施方式中，将核酸分子、载体或细胞包含在另一种CAR中或与另一种CAR组合使用，所述另一种CAR包括非FcαR细胞内和跨膜结构域，优选具有FcγR细胞内和/或跨膜结构域的CAR，更优选FcγR细胞内和跨膜结构域两者。这样的FcγR-CAR的细胞外配体结合结构域和根据本发明的FcαR-CAR的异源配体结合结构域可以是相同或不同的。在一些优选的实施方式中，FcγR-CAR包含细胞外配体结合结构域，其识别由根据本发明的FcαR-CAR的异源配体结合结构域识别的相同配体或抗原。在进一步优选的实施方式中，识别由根据本发明的FcαR-CAR的异源配体结合结构域识别的相同配体或抗原的细胞外配体结合结构域包含相同的配体结合结构域或由其组成。在其他优选的实施方式中，治疗性抗体是对除了由CAR的异源配体结合结构域识别的配体或抗原之外的另一种配体或抗原具有特异性的抗体。优选地，配体和/或抗原两者由被CAR靶向的特定细胞、特别是癌细胞或肿瘤细胞表达。例如，如在实施例中证明的，抗EGFR抗体有利地与Her2/Neu-CAR组合。

还提供了一种生产根据本发明的细胞或根据本发明的细胞群的方法，包括

-将根据本发明的核酸分子或载体引入细胞群的一个或多个细胞中，以及

-使根据本发明的多肽或CAR表达。

所述细胞优选地是髓样细胞或髓样祖细胞、造血干细胞或先天淋巴样细胞，更优选地是人髓样细胞或髓样祖细胞、造血干细胞或先天淋巴样细胞。所述细胞优选地选自粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞及其组合。所述细胞进一步优选地是原代细胞，更优选地是从根据本发明待治疗的受试者中分离的自体细胞。在另一个实施方式中，该细胞是来自细胞系、例如NK-92细胞系的细胞。

为了清楚和简洁描述的目的，在本文中可将特征描述为本发明的相同或单独方面或实施方式的一部分。本领域技术人员将理解的是，本发明的范围可以包括将本文中描述的全部或一些特征的组合作为相同或单独实施方式的一部分的实施方式。

本发明将在以下非限制性实施例中更详细地解释说明。

附图说明

图1：Fcα受体(uniprot P24071-1)的氨基酸序列。

图2：A.GD2-CAR设计。B.示例性CAR的序列。

图3：GD2-FcαR-CAR在NB4细胞中的表达。通过用全反式视黄酸(指示为“atra”)刺激7天，NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化。通过流式细胞术定量GD2-FcαR-CAR的表达；n＝4(A)，并进一步通过蛋白质印迹分析(B)。使用第一抗体BiotinSP AffiniPure f(ab)2(Jackson Immunoresearch)和第二抗体链霉素Alexafluor 647(Thermo FischerScientific)将细胞染色。红色箭头表示预期分子量的CAR。底部的绿色片段是加载对照。

图4：通过亲本和表达FcαR-CAR的NB4细胞检测GD2阳性成神经细胞瘤细胞系LAN-1、NMB和IMR-32的细胞毒性。通过用全反式视黄酸刺激7天，NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化。收获肿瘤细胞并用⁵¹铬标记，此后将NB4细胞和肿瘤细胞以1:50的靶:效应物比率一起在37°下温育4小时。肿瘤细胞未处理[-]，或用抗GD2抗体地努妥昔单抗[Dimab]调理。与从肿瘤细胞中自发和最大释放⁵¹铬相比，确定了细胞毒性，并且计算为[(实验值-自发释放)/(最大释放-自发值)*100％]。显著性是通过Anova测试的；p<0.05被认为是统计学显著的。*＝p<0.05；**＝p<0.01；ns＝不显著。

图5：与针对GD2+、EGFR+和Her2/neu+靶细胞的肿瘤抗原靶向抗体组合的FcαR CARNB4细胞的增加的细胞毒性。通过用全反式视黄酸刺激7天，使NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化。收获肿瘤细胞NMB、LAN-1、IMR-32、TC-71、A431和A431 Her2/neu并且用⁵¹铬标记，此后将NB4细胞和肿瘤细胞以多种靶:效应物比率(即1:25、1:50、1:100和1:200)一起在37°下温育4小时。肿瘤细胞未处理[-]，或用抗-GD2抗体地努妥昔单抗[Dimab]或抗-EGFR抗体西妥昔单抗[Cmab]调理。将细胞毒性与从肿瘤细胞自发和最大释放⁵¹铬进行比较，并且计算为[(实验值-自发释放)/(最大释放-自发值)*100％]。显著性是通过Anova测试的；p<0.05被认为是统计学显著的。*＝p<0.05；**＝p<0.01；ns＝不显著。

图6：NB4细胞的分化、ROS产生和粘附。通过用全反式视黄酸刺激7天，NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化。通过流式细胞术对多种表面标记物染色来分析分化水平；左图阳性细胞百分比，右图MFI，n＝4(A)。如通过Amplex Red测定法在酶标仪上测量的，通过由NB4细胞释放的过氧化氢的量来定量在使用不同刺激物时的ROS产生(B)。NB4细胞粘附至板的能力作为CD18功能的量度，其是通过在多种刺激物时粘附至96孔板的钙黄绿素标记的细胞的量进行测量，并且在酶标仪上进行检测；n＝3。添加NB4细胞的裂解液作为100％对照，以控制由钙黄绿素标记NB4细胞的效率；n＝3(C)。

图7：GD2-CAR是抗原依赖性的。通过用全反式视黄酸刺激7天，使NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化。通过流式细胞术定量LAN-1靶细胞中GD2和GD2 KO的表达；n＝1(A)。(B)收获肿瘤细胞(LAN-1WT和GD2 KO)并用⁵¹铬标记，此后将GD2-FcαR CAR NB4细胞和肿瘤细胞以多种靶:效应物比率(即1:25、1:50、1:100和1:200)一起在37°下温育4小时。将细胞毒性与从肿瘤细胞自发和最大释放⁵¹铬进行比较，并且计算为[(实验值-自发释放)/(最大释放-自发值)*100％]。N＝4次独立实验。(C)通过由流式细胞术定量膜摄取来测试NB4细胞的肿瘤细胞胞啃作用。用膜染料DiD染色LAN WT或GD2 KO细胞，并在37°下与WT NB4细胞或GD2-FcαR CAR NB4细胞一起温育90分钟。在共温育之后，将细胞固定并且在Canto流式细胞仪上测量。N＝3次独立实验。显著性是通过Anova测试的；p<0.05被认为是统计学显著的。*＝p<0.05；**＝p<0.01；ns＝不显著。

图8：GD2-FcαR CAR的功能性取决于FcαR细胞质尾的表达。通过用全反式视黄酸刺激7天，使NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化。GD2-FcαR(红色条)和GD2-FcαRΔcyt.CAR(蓝色条)在NB4细胞中的表达通过流式细胞术定量。因此，细胞用第一抗体BiotinSPAffiniPure F(ab’)₂(Jackson Immunoresearch)和链霉素Alexafluor 647(Lifetechnologies)染色。N＝2次独立实验(A)。(B)收获肿瘤细胞(LAN-1WT)并且用⁵¹铬标记，此后GD2-FcαR(红色条)和GD2-FcαRΔcyt.CAR(蓝色条)NB4细胞和肿瘤细胞以多种靶:效应物比率(即1:25、1:50、1:100和1:200)一起在37°下温育4小时。将细胞毒性与从肿瘤细胞自发和最大释放⁵¹铬进行比较，并且计算为[(实验值-自发释放)/(最大释放-自发值)*100％]。N＝8次独立实验。显著性是通过Anova测试的；p<0.05被认为是统计学显著的。*＝p<0.05；**＝p<0.01；ns＝不显著。

图9：FcαR CAR针对EGFR肿瘤抗原是有效的。通过用全反式视黄酸刺激7天，使NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化。(A)通过流式细胞术定量EGFR-FcαR在NB4细胞中的表达。因此，细胞用第一抗体BiotinSP AffiniPure F(ab’)₂(Jackson Immunoresearch)和链霉素Alexafluor647(Life technologies)染色。将WT NB4染色作为对照。染色直方图显示在左侧；2次独立实验的定量显示在右侧。(B)收获肿瘤细胞(A431)并用⁵¹铬标记，此后将WTNB4细胞(灰色条)和EGFR-FcαR(红色条)NB4细胞和肿瘤细胞以多种靶:效应物比率(即1:25、1:50、1:100和1:200)一起在37°下温育4小时。靶细胞未调理，或用抗-EGFR抗体西妥昔单抗(Cmab，1μg/ml)调理。将细胞毒性与从肿瘤细胞自发和最大释放⁵¹铬进行比较，并且计算为[(实验值-自发释放)/(最大释放-自发值)*100％]。N＝4次独立实验。(C)通过由流式细胞术定量膜摄取来测试NB4细胞的肿瘤细胞胞啃作用。A431细胞用膜染料DiD染色并与WTNB4细胞(灰色条)或EGFR-FcαR CAR NB4细胞(红色条)在37°下温育90分钟。靶细胞未调理，或用抗EGFR抗体西妥昔单抗(1μg/ml)调理。在共温育后，将细胞固定并在Canto流式细胞仪上测量。N＝9次独立实验。显著性是通过Anova测试的；p<0.05被认为是统计学显著的。*＝p<0.05；**＝p<0.01；ns＝不显著。

图10：FcαR CAR针对Her2/neu肿瘤抗原是有效的。通过用全反式视黄酸刺激7天，使NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化。(A)通过流式细胞术定量Her2/neu-FcαR在NB4细胞中的表达。因此，细胞用第一抗体BiotinSP AffiniPure F(ab’)₂(JacksonImmunoresearch)和链霉素Alexafluor 647(Life technologies)染色。将WT NB4染色作为对照。染色直方图显示在左侧；2次独立实验的定量显示在右侧。(B)收获肿瘤细胞(SKBR3)并用⁵¹铬标记，此后将WT NB4细胞(灰色条)和Her2/neu-FcαR(红色条)NB4细胞和肿瘤细胞以多种靶:效应物比率(即1:25、1:50、1:100和1:200)一起在37°下温育4小时。靶细胞未调理，或用抗Her2/neu抗体曲妥珠单抗(Tmab，1μg/ml)调理。将细胞毒性与从肿瘤细胞自发和最大释放⁵¹铬进行比较，并且计算为[(实验值-自发释放)/(最大释放-自发值)*100％]。N＝6次独立实验。(C)通过由流式细胞术定量膜摄取来测试NB4细胞的肿瘤细胞胞啃作用。用膜染料DiD染色SKBR3细胞并在37°下与WT NB4细胞(灰色条)或Her2/neu-FcαR CAR NB4细胞(红色条)温育90分钟。靶细胞未调理，或用抗Her2/neu抗体曲妥珠单抗(1μg/ml)调理。在共温育后，将细胞固定并在Canto流式细胞仪上测量。N＝10次独立实验。显著性是通过Anova测试的；p<0.05被认为是统计学显著的。*＝p<0.05；**＝p<0.01；ns＝不显著。

图11：GD2-FcαR CAR优于GD2-FcγR CAR。通过用全反式视黄酸刺激7天，使NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化。(A)通过流式细胞术定量GD2-FcαR CAR和GD2-FcγRIIACAR在NB4细胞中的表达。因此，细胞用第一抗体BiotinSP AffiniPure F(ab’)₂(Jackson Immunoresearch)和链霉素Alexafluor 647(Life technologies)染色。将WTNB4染色为对照(B)。收获肿瘤细胞(LAN-1)并用⁵¹铬标记，此后将GD2-FcαR NB4细胞(红色条)和GD2-FcγR CAR(灰色条)NB4细胞和肿瘤细胞以多种靶:效应物比率(即1:25、1:50、1:100和1:200)一起在37°下温育4小时。将细胞毒性与从肿瘤细胞自发和最大释放⁵¹铬进行比较，并且计算为[(实验值-自发释放)/(最大释放-自发值)*100％]。N＝4次独立实验。显著性是通过Anova测试的；p<0.05被认为是统计学显著的。*＝p<0.05；**＝p<0.01；ns＝不显著。

图12：GD2-FcαR CAR和GD2-FcγR CAR的双重表达增强了针对GD2+肿瘤的细胞毒性。通过用全反式视黄酸刺激7天，使NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化。(A)通过流式细胞术分析双CAR构建体在NB4细胞中的表达。N＝2次独立实验。(B)细胞毒性测定：收获肿瘤细胞并用⁵¹铬标记，此后将NB4细胞和肿瘤细胞以多种靶:效应物比率(即1:25、1:50、1:100和1:200)一起在37°下温育4小时。肿瘤细胞未处理[-]，或用抗GD2抗体地努妥昔单抗[Dimab]调理。将细胞毒性与从肿瘤细胞自发和最大释放⁵¹铬进行比较，并且计算为[(实验值-自发释放)/(最大释放-自发值)*100％]。N＝6次独立实验。显著性是通过Anova测试的；p<0.05被认为是统计学显著的。*＝p<0.05；**＝p<0.01；ns＝不显著。

图13：与通过mAb的FcγR激活相比，FcαR CAR导致另外的β2-整联蛋白激活。通过用全反式视黄酸刺激7天，使NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化。细胞毒性测定：收获肿瘤细胞并用⁵¹铬标记，此后将WT NB4细胞(A)或GD2-FcαR CAR NB4细胞(B)和肿瘤细胞以多种靶:效应物比率(即1:25、1:50、1:100和1:200)一起在37°下温育4小时。肿瘤细胞未处理[-]，或用抗GD2抗体地努妥昔单抗[Dimab]调理。CD11b被饱和量的抗CD11b(44A，10μg/ml)封闭；CD18被饱和量的抗CD18抗体(IB4，10μg/ml)封闭。与从肿瘤细胞自发和最大释放⁵¹铬相比确定细胞毒性，并且计算为[(实验值-自发释放)/(最大释放-自发值)*100％]。N＝3次独立实验。显著性是通过Anova测试的；p<0.05被认为是统计学显著的。*＝p<0.05；**＝p<0.01；ns＝不显著。

图14：GD2-FcαR CAR在NK-92细胞中表达。将NK-92细胞慢病毒转导以表达GD2-FcαR CAR。通过流式细胞术分析表达。因此，细胞用第一抗体BiotinSP AffniniPure F(ab’)₂(Jackson Immunoresearch)和链霉素Alexafluor 647(Life technologies)染色。

实施例

材料和方法

细胞、培养物和抗体

将NB4、NK-92、成神经细胞瘤细胞系LAN-1、IMR-32、NMB、尤文肉瘤细胞系TC-71以及乳腺癌细胞系SKBR3(ATCC)在补充有20％(v/v)胎牛血清、青霉素(Sigma Aldrich，100U/mL)、链霉素(Sigma Aldrich，100μg/mL)以及ι-谷氨酰胺(Sigma Aldrich，2mM)的IMDM培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养，并且在37℃下在5％ CO₂中培养。NK-92细胞的培养基补充有IL-2(Peprotech，100单位/mL)。将表皮样癌细胞系A431(ATCC)在补充有10％(v/v)胎牛血清、青霉素(Sigma Aldrich，100U/mL)、链霉素(Sigma Aldrich，100μg/mL)以及ι-谷氨酰胺(Sigma Aldrich，2mM)的RPMI培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养，并且在37℃下在5％ CO₂中培养。通过全反式视黄酸(ATRA)(Sigma Aldrich，0.5*10⁶个细胞/mL，用5μmol ATRA/L)将NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化7天。通过慢病毒转导产生过表达Her2/neu的A431细胞。简言之，Her2/neu编码序列在Thermo Fisher Scientific订购并且将其克隆至pENTR1A中。在与慢病毒载体pRRL PPT SFFV prester SIN-Gateway B重组之后，创建慢病毒构建体pSin-Her2/neu，将其用于A431细胞的转导。通过细胞分选选择表达Her2/neu的细胞。将A431细胞保持在补充有10％(v/v)胎牛血清、青霉素(SigmaAldrich，100U/mL)、链霉素(Sigma Aldrich，100μg/mL)以及ι-谷氨酰胺(Sigma Aldrich，2mM)的RPMI培养基(Thermo Fisher Scientific)中的培养物中并且在37℃下在5％ CO₂中培养。对于在WT NB4细胞中的GD2-CAR表达，经由接头连接抗GD2抗体地努妥昔单抗的重链和轻链可变区(scFv)的编码序列并且偶联至FcαR的细胞内部分的细胞内尾部(参见图2A的示意性概述和图2B的序列的细节)。对于WT NB4细胞中的Her2/neu-CAR表达，如上文针对GD2-CAR所描述的，将抗Her2/neu抗体曲妥珠单抗的scFv的编码序列连接至FcαR的细胞内部分的细胞内尾部。对于NB4细胞中的EGFR-CAR表达，如上文针对GD2-CAR所描述的，将抗EGFR抗体西妥昔单抗的scFv的编码序列连接至FcαR的细胞内部分的细胞内尾部。

CAR构建体

合成序列在Thermo Fisher Scientific订购。使用由公司网站提供的密码子优化服务对序列进行密码子优化以便在人细胞中表达。

首先，将FcαR(跨膜和细胞内)克隆至pENTR1A的EcoRI-EcoRV位点中，并且还引入Bsp119I限制性位点。通过在琼脂糖凝胶上进行限制性酶分析来检查正确的克隆。接下来，将GD2-CAR-接头、Her2/neu-CAR-接头或EGFR-CAR-接头片段(各自具有人IgG1的CH2CH3结构域(铰链))克隆至pENTR1A-FcαR(跨膜和细胞内)的SalI-Bsp119I位点中，并且通过在琼脂糖凝胶上限制性酶分析来检查正确的克隆。通过交换Bsp119I-EcoRV片段，将构建体pENTR1A-GD2-CAR-接头-铰链-FcαR(跨膜和细胞内)构建体用于产生与FcαR(跨膜)或FcγRIIa(跨膜和细胞内)的GD2-CAR融合体。为了产生IRES GFP构建体，首先将LZRS mcs IRESGFP的IRES GFP序列(也包含5’SnaBI限制性位点)克隆至pENTR1A的EcoRI-NotI位点中。所有CAR-IRES GFP构建体的随后克隆与针对没有IRES GFP的构建体所描述的相似，除了使用SnaBI限制性位点代替EcoRV限制性位点。使用以下这些引物，通过PCR扩增铰链，将V5标签引入pENTR1A-GD2-CAR-接头-铰链-FcαR(跨膜和细胞内)IRES GFP中：

正向：5’aatagctggaccgaccagg 3’，在GD2 CAR的VL区中退火

反向： Bsp119I限制性位点为粗体，AgeI限制性位点为斜体，V5序列(针对在人细胞中表达优化的密码子)加下划线，并且在铰链中退火的序列为粗体和加下划线。

在pENTR1A-GD2-CAR-接头-铰链-FcαR(跨膜和细胞内)IRES GFP上使用这些引物的PCR产生含有GD2-CAR VL的部分、内部SmaI限制位点、铰链、V5标签和Bsp119I限制位点的片段。将该SmaI-Bsp119I片段克隆至pENTR1A-GD2-CAR-接头-铰链-FcγRIIa(跨膜和细胞内)IRES GFP的SmaI-Bsp119I位点中，从而将原始铰链取代为包括V5标签的铰链。通过在琼脂糖凝胶上限制酶分析和测序来检查正确的克隆。

通过添加具有IVS IRES Cherry的V5标记的构建体产生双CAR构建体。首先，使用以下这些引物PCR扩增pIRESPour2(Clontech)的IVS IRES序列：

正向：EcoRI限制性位点为粗体

反向：AgeI限制位点为斜体(IVS＝合成内含子，已知增加mRNA的稳定性，参见Clontech的手册)

消化和凝胶纯化后，将PCR产物克隆到pmCherry-N1(Clontech)的EcoRI-AgeI位点中。通过在琼脂糖凝胶上限制酶分析和测序来检查正确的克隆。接下来，使用寡5’aattccggatatccgg 3’，将EcoRV限制性位点引入pmCherry-N1-IVS IRES的EcoRI位点中。在退火之后，这个片段将产生具有EcoRI悬垂(overhang)的dsDNA片段。通过在琼脂糖凝胶上限制性酶分析来检查正确的克隆。接下来，将含有IVS IRES Cherry的EcoRV-NotI片段克隆至pENTR1A-GD2-CAR-接头-铰链-V5-FcγRIIa(跨膜和细胞内)IRES GFP的SnaBI-NotI位点中，由此将IRES GFP替换为IVS IRES Cherry。通过在琼脂糖凝胶上限制性酶分析来检查正确的克隆。

所得的构建体pENTR1A-GD2-CAR-FcαR(跨膜和细胞内)所有最终的pENTR1A构建体随后与pRRL PPT SFFV prester SIN-Gateway B重组。

对于克隆消化，在37℃下，用1x Fast Digest缓冲液中的FastDigest酶(ThermoFisher Scientific)消化约1μg的质粒超过20分钟。将消化物在1％琼脂糖上运行；用干净的外科手术刀片切掉正确的片段并且使用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Biorad)进行纯化；作为最终步骤，将DNA在H₂O中洗脱。

对于连接，将载体和插入物与在1x快速连接缓冲液(Rapid Ligation Buffer)中的Rapid T4连接酶(Thermo Fisher Scientific)在室温下温育超过10分钟。对于Gateway重组，将约150ng的pRRL PPT SFFV prester SIN-Gateway B和约100ng的pENTR1A构建体添加至Tris-EDTA(TE)缓冲液(pH 8，0)中，之后添加LR CLonase II(Thermo FisherScientific)，并且在轻轻混合之后，将反应在25℃下温育过夜。

为了转化大肠杆菌DH5α，将连接产物加入DH5α，并在冰上温育8分钟，随后在42℃热休克45秒。然后将反应在冰上温育2分钟，其后添加溶原性肉汤(Lysogeny broth)(LB)并在37℃和200rpm下温育约30-60分钟，其后将整个反应铺板在含有30μg/ml卡那霉素(对于pENTR1A构建体)或100μg/ml氨苄青霉素(对于pRRL PPT SFFV构建体)的LB-琼脂上，并将板在37℃下温育过夜。

挑取单个菌落并且将其用于接种LB+30μg/ml卡那霉素或100μg/ml氨苄青霉素，并且在37℃和200rpm下生长过夜。第二天，使用Nucleospin Plasmid EasyPure试剂盒(Bioké)使用过夜培养物分离小量制备(miniprep)DNA。为了检查小量制备物，在37℃下，用在1xFastDigest缓冲液中的FastDigest酶消化小量制备DNA超过20分钟，并在1％琼脂糖凝胶上运行消化物。使用Nucleobond Xtra Maxi试剂盒(Bioké)在过夜培养物上进行大量制备(Maxiprep)。

为了检查大量制备物(maxiprep)，在37℃下，用在1x FastDigest缓冲液中的FastDigest酶消化约400ng的大量制备物DNA超过20分钟，并在1％琼脂糖凝胶上运行消化物。构建体未另外测序。

使用HEK293T细胞产生慢病毒颗粒，并用在IMDM培养基(具有如上所述的添加剂)中的慢病毒载体、pMDLgp、pRSCrev和pCMV-VSVg共转染。转染后两天，通过0.45μM过滤器过滤含有慢病毒的上清液并添加至NB4细胞，此后在两天后在无慢病毒培养基中传代细胞。在用于测定之前，使用BiotinSP AffiniPure F(ab’)2(Jackson Immunoresearch，1μg/mL)和链霉素Alexafluor 647(Life technologies，10μg/mL)，通过流式细胞术在scFv抗GD2抗体表达上分选细胞。

粘附性

用钙黄绿素-AM(Molecular Probes，1μmol/L)在37℃下荧光标记NB4细胞(5*10⁶细胞/mL)30分钟，并在未涂覆的96孔MaxiSorp板(Nunc，2*10⁶细胞/mL)中在HEPES⁺(7.7gNaCl(Fagron)，4,775g HEPES(Sigma Aldrich)，450mg KCl(Merck)，250mg MgSO₄(Merck)，275mg K₂HPO₄(Merck)，H₂O(Gibco)，pH 7.4，具有10mol/L NaOH)(具有白蛋白(Albuman，Sanquin Plasma Products，200μg/mL)、葡萄糖(Merck，1mg/mL)和钙(Calbiotech，cat.208291，1mol/L))中温育。将细胞在37℃下在5％ CO₂中在以下不同刺激物存在下温育30分钟：二硫苏糖醇(DTT)(Sigma Aldrich，10mmol/L)、Pam3Cys(EMN Microcollections，20mg/mL)、C5a(Sigma Aldrich，10nmol/L)、肿瘤坏死因子α(TNFα)(Peprotech，10ng/mL)、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)(Sigma Aldrich，100ng/mL)、血小板活化因子(PAF)(Sigma Aldrich，100nmol/L)、N-甲酰基甲硫氨酸-亮氨酰基-苯丙氨酸(fMLP)(SigmaAldrich，30nmol/L)、或HEPES⁺培养基。将板用PBS洗涤两次并且将细胞在室温下用Triton(Sigma Aldrich，0.5％ X-100)溶解10分钟。使用100％溶解输入的钙黄绿素标记的NB4细胞作为对照。在Genios酶标仪(Tecan)中以485nm的激发波长和535nm的发射波长测定粘附。

NADPH氧化酶活性

使用Amplex Red测定法测量ROS产生，测定刺激后NB4细胞的细胞外过氧化氢释放。在37℃下，将NB4细胞(1*10⁶细胞/mL)与Amplex Red(Molecular Probes，20mM)和辣根过氧化物酶(Sigma Aldrich，200U/mL)温育5分钟。用未调理的酵母聚糖(MP Biomedicals，1mg/mL)、血清处理的酵母聚糖(STZ)37、PMA(Sigma Aldrich，100ng/mL)、fMLP(SigmaAldrich，30nmol/L)、PAF(Sigma Aldrich，100nmol/L)/fMLP(Sigma Aldrich，30nmol/L)来激活细胞，并且HEPES⁺作为阴性对照。用Genios酶标仪(Tecan)以30秒间隔测量荧光30分钟。在535nm的激发波长和595nm的发射波长下以2分钟的间隔从校准曲线测定产生的H₂O₂浓度。结果表示为以相对荧光单位/分钟计的最大斜率。

蛋白质印迹

在蛋白质印迹(western blot)上检查NB4 GD2-CAR的抗GD2抗体的scFv的表达。将5*10⁶个NB4细胞在PBS中洗涤并且在95℃下再悬浮于50μL完全蛋白酶抑制剂混合物(Complete Protease Inhibitor Cocktail)(Roche diagnostics)/乙二胺四乙酸(EDTA)(0.45mol/L)和50μL的2x样品缓冲液(25mL Tris B(Invitrogen)、20mL 100％甘油(SigmaAldrich)、5g十二烷基硫酸钠(SDS)(Serva)、1.54g DTT(Sigma Aldrich)、20mg溴酚蓝(Sigma Aldrich)、1.7mLβ-巯基乙醇(Bio-Rad)以及H₂O补至50mL(Gibco))中30分钟，同时每10分钟涡旋。对于电泳，将1*10⁶个细胞加载到10％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶中并且在80至120伏特下运行。使用硝酸纤维素膜(GE Healthcare Life Science)来转移蛋白，以0.33安培进行1小时。将膜封闭，并且在室温下在5％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)/Tris-缓冲盐水、0.1％ Tween 20(TBST)中染色1小时。使用BiotinSP AffiniPuref(ab)2(Jackson Immunoresearch，0.1μg/mL，在4℃下过夜)来检测GD2-CAR的f(ab)2区，并且使用IRDYE 680链霉素(LI-COR，0.4μg/mL，在室温下1小时)进行Odyssey(LI-CORBiosciences)分析。

流式细胞术

用第一抗体BiotinSP AffiniPure f(ab)2抗小鼠(Jackson Immunoresearch，1μg/mL，在4℃下30分钟)检测抗GD2抗体的scFv的表达，并且在BD FACSCantoII上用链霉素Alexafluor 647(Life technologies，10μg/mL，在4℃下30分钟)可视化。抗Her2/neu和抗EGFR抗体的scFv的表达用第一抗体BiotinSP AffiniPure f(ab)2抗人(JacksonImmunoresearch，1μg/mL，在4℃下30分钟)来检测，并且在BD FACSCantoII上用第二抗体链霉素Alexafluor 647(Life technologies，10μg/mL，在4℃下30分钟)可视化。

在每次ADCC测定之前用流式细胞术测试分化标志物CD11b、FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)、FcγRI(CD64)的表达以确保NB4细胞的成熟。简言之，将细胞与针对上述标记的荧光标记的抗体在PBS/0.5％人血清白蛋白(HSA)中在冰上温育30分钟。洗涤两次后，将细胞重悬于100μL PBS/0.5％ HSA中并且在BD FACSCantoII上测量。

细胞毒性测定

成神经细胞瘤细胞系LAN-1、IMR-32、NMB、尤文肉瘤细胞系TC-71、乳腺癌细胞系SKBR3和表皮样癌A431用作靶细胞。通过胰蛋白酶(1％，在PBS中)处理收获靶细胞系，之后在37℃下在150μL IMDM/RPMI培养基(如上所述)中用50μCi ⁵¹Cr(Perkin-Elmer，USA)标记0.5*10⁶个细胞90分钟。对于指定的实验，用在IMDM培养基(如上所述)中的地努妥昔单抗(Unituxin，ch14.18，United Therapeutics，1μg/mL)调理LAN-1、IMR-32、NMB和TC-71细胞。SKBR3细胞如所示用曲妥珠单抗(Herceptin，Roche，1μg/mL)调理，A431如所示用西妥昔单抗(Erbitux，Merck，1μg/mL)调理。在37℃和5％ CO₂下，将靶细胞(5*10³细胞/孔)和效应细胞(2.5*10⁵细胞/孔)(1:50靶细胞:效应细胞(T:E)比率，或如图中指示的其他T:E比率)在96孔U底组织培养板中在IMDM(如上所述)中共温育4小时。通过0.1％triton(SigmaAldrich，TX-100)将细胞毒性归一化至100％⁵¹Cr释放。在microbeta2酶标仪(PerkinElmer)中分析30μL上清液的放射性。细胞毒性的百分比被确定为[(实验值-自发释放)/(最大释放-自发值)*100％]。条件一式两份或三份进行测试。

胞啃作用测定

使用流式细胞术定量分化的NB4细胞对靶细胞的胞啃作用并且通过由NB4细胞摄取肿瘤细胞膜进行测量。肿瘤细胞用2μM亲脂性膜染料DiD(1,1-二(十八烷基)-3,3,3,3-四甲基吲哚二羰花青，Invitrogen)染色。标记后，用PBS洗涤靶细胞两次。将细胞以1:5的T:E比率(即，50,000:250,000个细胞)如所示在U形底96孔板(Greiner Bio-One)中在存在或不存在0.5μg/mL地努妥昔单抗、曲妥珠单抗或西妥昔单抗的情况下在37℃和5％ CO₂下在IMDM完全培养基中共温育60分钟。温育后，将细胞用STOPbuffer(含有20mM NaF、0.5％ PFA和1％ BSA的PBS)固定并且使用流式细胞仪Canto II(BD Biosciences)进行分析。评估NB4细胞群的膜染料DiO的平均荧光强度(MFI)。

数据分析和统计

使用Flowjo软件(Tree Star，Inc，Ashland，OR，USA)来分析流式细胞术数据，并且使用Graphpad Prism版本8(Graphpad software)来可视化粘附性、Amplex Red、NB4细胞分化、流式细胞术、以及ADCC结果。使用Prism进行统计分析。对于粘附性、Amplex Red和分化标记的表达，使用双向ANOVA测试，随后是Sidak事后测试。对于细胞毒性测定，使用单向ANOVA测试，接着Sidak事后测试。

结果

由分化的NB4细胞表达GD2-FcαR-CAR

通过用ATRA刺激7天，使NB4朝向嗜中性粒细胞样细胞分化，此后通过流式细胞术评估GD2-FcαR-CAR的表达。图3A示出超过80％的NB4细胞对于GD2 FcαR-CAR是阳性的。而且，转导以表达GD2-FcαR-CAR的NB4细胞显示出CAR的高表达(如通过MFI确定的并且与WTNB4细胞相比)。蛋白质印迹(图3B)显示GD2-FcαR-CAR仅在被转导以表达CAR构建体的ATRA分化的NB4细胞中的表达(处于约83kDa的预期高度)。

表达GD2-FcαR-CAR的NB4细胞能够杀死GD2⁺成神经细胞瘤细胞系

通过ATRA刺激7天使NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化并且用于针对GD2阳性成神经细胞瘤细胞系的细胞毒性测定中。如图4所示，表达GD2-FcαR-CAR构建体的NB4细胞能够杀死GD2⁺成神经细胞瘤细胞系LAN-1、NMB和IMR-32，而不需要抗GD2调理作用。在非调理条件下测试的GD2 FcαR CAR针对所有成神经细胞瘤细胞系的细胞毒性能力与WT NB4细胞针对地努妥昔单抗调理的成神经细胞瘤细胞的杀伤能力相似。非调理的成神经细胞瘤细胞没有被WT NB4细胞杀死。从1:25至1:200的T:E比率的滴定显示对成神经细胞瘤细胞系LAN-1和NMB的细胞毒性的浓度依赖性作用。再次地，表达GD2-FcαR-CAR的NB4细胞能够杀死GD2⁺成神经细胞瘤细胞系，而不需要用抗GD2抗体地努妥昔单抗的调理作用。WT NB4不能以任何T:E比率杀死非调理的成神经细胞瘤细胞系。用地努妥昔单抗对成神经细胞瘤细胞系进行调理导致对LAN-1和NMB细胞的增强的细胞毒性(在增加NB4 WT细胞的T:E比率的情况下)。当在表达GD2-FcαR-CAR的NB4细胞的存在下共培养靶细胞时，针对调理的成神经细胞瘤细胞的这种浓度依赖性细胞毒性甚至更显著(图5)。

在ATRA分化7天之后，通过流式细胞术检查NB4细胞(具有和不具有表达GD2-FcαR-CAR)的分化。图6A显示了多种膜标志物(包括CD11b和Fc受体)的表面表达，作为NB4细胞的充分分化的量度。总的来说，在WT NB4细胞和表达GD2-FcαR-CAR的NB4细胞之间没有检测到上述表面标志物的表达的差异，表明CAR的表达不妨碍这些细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞的分化过程。此外，我们评估了两种抗微生物效应子功能：产生ROS的能力，以及CD11b/CD18介导的粘附。如图6B和图6C中所描绘的，如通过Amplex Red测定所测量的ROS产生和粘附性两者在WT NB4细胞和GD2-FcαR-CAR NB4细胞之间没有显著差异。

总之，我们的数据表明GD2-FcαR-CAR表达不妨碍NB4细胞的分化和效应子功能。此外，在NB4细胞上表达的GD2-FcαR-CAR诱导GD2阳性成神经细胞瘤细胞系的细胞毒性，而不需要抗GD2调理作用。

与针对多种不同GD2⁺、EGFR⁺和Her2/neu⁺靶细胞的肿瘤抗原靶向抗体组合的FcαR CAR NB4细胞的增加的细胞毒性

随着如图5中所示的NMB和LAN-1细胞系的数据集的扩展，我们增加了靶细胞系的数目。对于EGFR⁺表皮样癌以及所有GD2⁺成神经细胞瘤和尤文肉瘤细胞系测试了在NB4细胞中的EGFR/GD2-FcαR CAR和分别在肿瘤细胞上的抗-EGFR或抗-GD2调理抗体的组合显著增加了对于肿瘤细胞的细胞毒性的量(对于最高T:E比率(1:200))(图5)。对于A431，在与抗EGFR抗体组合后，对于所有T:E比率，EGFR-FcαR CAR的杀伤能力增加。在LAN-1的情况下，接续1:200的T:E比率，在上述GD2-FcαR CAR和抗GD2-调理抗体的组合之后，1:100的T:E比率也显著增强了细胞毒性(参见图5)。在GD2⁺靶细胞的情况下，对于较低的T:E比率(1:25，1:50)，观察到朝向增加杀死的趋势，但是这些条件在测试的环境下没有达到显著性。对于靶向Her2/neu的FcαR CAR，表达CAR的NB4细胞的杀伤能力可以通过与除了CAR scFv抗原识别部分中所使用(在这种情况下是抗EGFR抗体西妥昔单抗)之外的肿瘤靶向抗体组合来进一步增强(参见图5)。

GD2-FcαR-CAR是抗原特异性的

通过ATRA刺激7天使NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化并且用于针对GD2阳性和敲除的成神经细胞瘤细胞系LAN-1的细胞毒性测定中(参见图7A)。图7B示出表达GD2-FcαR-CAR构建体的NB4细胞能够杀死GD2⁺成神经细胞瘤细胞系LAN-1，但不能杀死GD2KO LAN-1细胞，表明GD2-FcαR-CAR是抗原特异性的。胞啃作用是最近描述的嗜中性粒细胞对抗抗体调理的肿瘤细胞的效应机制(Matlung et al.,Cell Rep.2018；23(13):3946-3959.e6)，显示出如使用GD2-FcαR-CAR的细胞毒性测定中观察到的类似的抗原特异性和总体模式(图7C)。

GD2-FcαR CAR的功能性取决于FcαR细胞质尾的表达

接续亲本GD2-FcαR-CAR构建体，我们表达了缺少FcαR的胞质结构域的GD2-FcαR-CAR(GD2-FcαRΔcyt CAR，图8A)。通过ATRA刺激7天使这些表达GD2-FcαRΔcyt CAR的NB4细胞朝向嗜中性粒细胞样细胞分化，并且用于针对GD2阳性成神经细胞瘤细胞系LAN-1的细胞毒性测定中。图8B示出，与GD2-FcαR CAR NB4细胞施加的杀伤相比，这些表达GD2-FcαRΔcyt CAR的NB4细胞的细胞毒性完全消除，表明FcαR胞质结构域是GD2-FcαR CAR的功能不可或缺的。

FcαR CAR针对另外的肿瘤抗原是有效的

除了GD2靶向FcαR CAR之外，我们在NB4细胞中产生了靶向肿瘤抗原EGFR(图9A)和Her2/neu(图10A)的FcαR CAR。如在图9B和图10B中所见，表达EGFR和Her2/neu-FcαR-CAR构建体的NB4细胞能够分别杀死EGFR⁺和Her2/neu⁺表皮样癌和乳腺癌细胞系A431和SKBR3，而不需要抗EGFR和抗Her2/neu调理作用。在非调理条件下EGFR-FcαR CAR的细胞毒性能力与WT NB4细胞针对西妥昔单抗调理的A431细胞的杀伤能力相似(图9B)，并且甚至优于曲妥珠单抗调理的SKBR3细胞的杀伤(图10B)。在任何T:E比率下，WT NB4细胞不杀死非调理的靶细胞。胞啃作用显示如在使用EGFR-FcαR-CAR(图9C)和Her2/neu-FcαR-CAR(图10C)的细胞毒性测定中观察到的类似的总体模式。

GD2-FcαR CAR优于GD2-FcγR CAR

为了研究它们的细胞毒性能力，我们产生了两种不同的CAR构建体：包含FcαR或FcγRIIA的胞质结构域的GD2靶向CAR构建体。如通过流式细胞术检测的，对于GD2-FcγRIIACAR，两个CAR构建体的表达是相似的(如果不是更高的话)(图11A)。如从图11B可以清楚地看出，对于所有T:E比率，由NB4细胞中的GD2-FcαR CAR诱导的细胞毒性优于NB4细胞中的GD2-FcγRIIA CAR。更具体地，GD2-FcγIIA CAR在NB4细胞中的表达不诱导GD2⁺靶细胞的杀伤。

GD2-FcαR CAR和GD2-FcγR CAR的双重表达增强了针对GD2⁺肿瘤细胞的细胞毒性

此外，为了研究FcαR和FcγR信号传导之间可能的串扰(cross-talk)，我们在相同的NB4细胞培养物中表达了多个CAR。图12A示出了GD2-FcαR CAR和GD2-FcγRIIA CAR在NB4细胞中的成功双重表达。此外，我们在NB4细胞中表达了含有FcαR的截短的细胞质结构域的GD2-FcαRΔcyt CAR连同GD2-FcγRIIA CAR(参见图12A)。

如先前所示，单独的GD2-FcγRIIA CAR在NB4细胞中的表达不诱导对GD2⁺LAN-1靶细胞的抗体非依赖性杀伤，而仅在LAN-1细胞用地努妥昔单抗调理时，表达GD2-FcγRIIACAR的NB4细胞能够发挥它们的效应子功能(图12B)。与单独的GD2-FcαR CAR相比，GD2-FcαRCAR和GD2-FcγRIIA CAR在NB4细胞中的双重表达增强了对LAN-1细胞的杀伤能力；不需要抗体调理作用。在抗体调理作用之后，最可能诱导这些表达双重GD2-FcαR CAR和GD2-FcγRIIA CAR的NB4细胞的杀伤能力的进一步增加，尽管由除FcαR CAR之外的另一种Fc受体同时进行信号传导。由于截短的GD2-FcαR CAR的表达将LAN-1细胞的杀伤降低回到基线，因此观察到的抗体依赖性以及抗体非依赖性杀伤的增加进一步依赖于功能性FcαR信号传导。

与FcγR激活后的抗体诱导的杀死相比，在与肿瘤抗原调理抗体组合后，对于在NB4细胞中的FcαR CAR观察到的增强的杀死背后的作用模式似乎与另外的β2-整联蛋白的激活相关。图13A和图13B示出针对CD11b和CD18任一者的阻断抗体可以完全抑制抗GD2和FcγR诱导的杀伤，而在GD2-FcαR CAR诱导的杀伤的情况下，这种细胞毒性在抗CD11b治疗之后被降低但不被完全抑制。另一方面，抗CD18治疗能够完全消除由GD2-FcαR CAR诱导的抗体依赖性和非依赖性杀伤(图13B)。

由NK-92细胞表达GD2-FcαR-CAR

最后，通过流式细胞术评价了GD2-FcαR-CAR在NK-92细胞中的表达。图14示出被转导以表达GD2-FcαR-CAR的NK-92细胞示出CAR的高表达(如通过MFI确定的并与WT NK-92细胞比较)(图14)。

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Claims (25)

1.一种包含嵌合抗原受体(CAR)的嗜中性粒细胞或NK细胞，所述嵌合抗原受体包含多肽，所述多肽包含：

-Fcα受体(FcαR)的细胞内结构域，

-FcαR的跨膜结构域，和

-异源配体结合结构域。

2.根据权利要求1所述的嗜中性粒细胞或NK细胞，其中所述多肽进一步包括位于所述FcαR的跨膜结构域和所述配体结合结构域之间的间隔子。

3.根据前述权利要求中任一项所述的嗜中性粒细胞或NK细胞，其中所述配体结合结构域是对细胞表面抗原具有特异性的结构域，如对肿瘤抗原或髓源性抑制细胞抗原具有特异性的结构域。

4.根据前述权利要求中任一项所述的嗜中性粒细胞或NK细胞，其中所述配体结合结构域包括抗体或其抗原结合部分、纳米抗体或其抗原结合片段或者亲和体。

5.根据前述权利要求中任一项所述的嗜中性粒细胞或NK细胞，其中所述配体结合结构域对GD2、EGFR或HER2/Neu具有特异性。

6.根据前述权利要求中任一项所述的嗜中性粒细胞或NK细胞，其中所述多肽包含图1中所示的FcαR的氨基酸序列的氨基酸228至287。

7.一种嗜中性粒细胞或NK细胞，提供有编码权利要求1-6中任一项所限定的CAR的核酸分子。

8.根据权利要求7所述的嗜中性粒细胞或NK细胞，提供有包含所述核酸分子的载体。

9.根据权利要求7或8所述的嗜中性粒细胞或NK细胞，其中所述核酸分子或载体被引入所述嗜中性粒细胞或NK细胞中。

10.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细胞是从患有癌症的患者分离的自体细胞。

11.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，表达权利要求1-6中任一项所限定的CAR。

12.一种细胞群，包含多个根据前述权利要求中任一项所述的细胞。

13.一种药物组合物，包含根据前述权利要求中任一项所述的细胞或细胞群以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

14.根据权利要求1-12中任一项所述的细胞或细胞群，用于在治疗、优选免疫治疗中使用。

15.根据权利要求1-12中任一项所述的细胞或细胞群，用于在诱导或刺激免疫应答中使用。

16.根据权利要求1-12中任一项所述的细胞或细胞群，用于在治疗受试者中的癌症的方法中使用。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的用于使用的细胞或细胞群，其中所述CAR、核酸分子、载体或细胞与治疗性抗体、检查点抑制剂、细胞因子、化疗剂或基于T细胞的疗法组合，优选与治疗性抗体组合。

18.根据权利要求1-12中任一项所述的细胞或细胞群，用于在治疗或预防病原性感染中使用。

19.一种用于在需要其的受试者中免疫治疗的方法，包括给予其受试者治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的细胞或细胞群。

20.根据权利要求19所述的方法，用于在需要其的受试者中诱导或刺激免疫应答，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的细胞或细胞群。

21.根据权利要求19所述的方法，用于治疗需要其的受试者中的癌症，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的细胞或细胞群。

22.根据权利要求19所述的方法，用于治疗或预防需要其的受试者中的病原性感染，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的细胞或细胞群。

23.根据权利要求16所述的细胞或细胞群或者根据权利要求21所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。

24.根据权利要求23所述的细胞或细胞群或方法，其中所述癌症选自由以下各项组成的组：成神经细胞瘤、黑色素瘤、小细胞肺癌(SCLC)、尤文肉瘤、骨肉瘤、神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肛门癌和成胶质细胞瘤。

25.一种产生根据权利要求9至12中任一项所述的细胞群的方法，包括：

-将编码权利要求1-6中任一项所限定的嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子引入嗜中性粒细胞群或NK细胞群的细胞中，以及-使所述CAR表达。