JP2024517773A - キメラＦｃα受容体及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、Fcα受容体(FcαR)の細胞内ドメイン、FcαRの膜貫通ドメイン、及びリガンド結合ドメインを含むポリペプチド及びキメラ抗原受容体(CAR)、かかるポリペプチド及びCARを含む及び発現する細胞、並びにその使用に関する。

Description

本発明は、キメラ受容体、及び癌療法を含む療法の分野に関する。特に、本発明は、キメラFcα受容体に関する。

インビトロ増殖させた、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)又はキメラ抗原受容体(CAR)を発現しているT細胞の養子移入による腫瘍療法において、顕著な成功が得られている。CARは、例えばCD3ζのシグナル伝達ドメインに結合した、腫瘍に見られる抗原に特異的な外部ドメイン(抗体の一部)、及びCD28又は4-1BB等の共刺激受容体を含む。FcγRIIIA(CD16A)及びC型レクチン様受容体NKG2D若しくは二量体受容体DAP10等のFcγ受容体(FcγR)等の他のシグナル伝達ドメイン。T細胞中のCARの発現は、腫瘍抗原による、その活性化につながる。ある特定の血液系腫瘍におけるCAR T細胞で、90%までの完全寛解が得られている。T細胞トラフィッキングの限定及び腫瘍微小環境からの免疫耐性メカニズムにより、固形腫瘍の処置における成功はずっと少なかった。

効能及び安全性という点でのCAR療法の最適化、並びに他の悪性腫瘍へのその用途の拡大において、NK細胞及び骨髄細胞を含む他の白血球において上述のようなCARを使用する試みが為されている。NK細胞は、CAR研究において2番目に多く注目を集めており、血液系腫瘍の処置を主に目的とするが固形腫瘍の処置も目的とするNK細胞CAR療法に基づいて、いくつかの臨床試験が開始されている(Sieversら2020)。好中球及び単球等のCAR-骨髄細胞が記載されているが、これまで臨床試験は開始されていない。例えばCD34⁺ HSCに形質導入したCD19特異的CARについてDe Oliveraら(2013)に記載されているように、ヒト造血幹細胞(HSC)を形質導入し、その後増殖及び分化させてCAR発現顆粒球、単球、及びマクロファージを生じることも一案である。Robertsらは、抗CD4-CD3ζCARでのHSCの形質導入及びCAR発現好中球の単離を記載している(1998)。WO 2020/223550は、骨髄細胞、特に食細胞で発現されている、キメラ融合タンパク質又はCARを記載している。マクロファージ等の食細胞性の骨髄細胞を融合タンパク質で操作して食細胞活性を促進し得ることが記載されている。この目的のために、食細胞性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインが使用され、このドメインは好ましくはMegf1O、MerTk、FcRa、及びBail以外の受容体に由来する。骨髄細胞を操作してT細胞活性化を促進し得ることが更に記載されているが、この目的のために特定のキメラ融合タンパク質は記載されていない。実験の部分で、CD8膜貫通及びFcγR細胞内ドメインをPI3K動員ドメイン又はCD40細胞質部分等の更なる細胞質ドメインと共に有するキメラ融合タンパク質が調製され、単球及びマクロファージ細胞系が構築物と共に提供される。

当該分野には、特に固形腫瘍等の腫瘍の、免疫療法のための、新しく、改良された組成物及び方法の必要性が依然として存在する。

WO 2020/223550

Matlungら、Cell Rep. 2018;23(13):3946-3959.e6

本発明の目的は、改良されたキメラ受容体を提供することである。本発明の更なる目的は、一般には腫瘍、特に固形腫瘍の処置を改良するための方法を提供することである。

したがって、本発明は、
- Fcα受容体(FcαR)の細胞内ドメイン
- FcαRの膜貫通ドメイン、及び
- リガンド結合ドメイン
を含むポリペプチドを提供する。

好ましい実施形態では、ポリペプチドは、キメラ受容体、特にキメラFcαRである。ある好ましい実施形態では、ポリペプチドは、キメラ抗原受容体(CAR)である。

更なる態様では、本発明は、
- Fcα受容体(FcαR)の細胞内ドメイン
- FcαRの膜貫通ドメイン、及び
- リガンド結合ドメイン
を含むポリペプチドを含むキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。

ポリペプチド又はCARは、好ましくは、以下の順序で、示されるドメインを含む:3'-FcαR細胞内ドメイン-FcαR膜貫通ドメイン-リガンド結合ドメイン-5'。ある好ましい実施形態では、ポリペプチド又はCARは、好ましくは、以下の順序で、以下のドメインを含む:3'-FcαR細胞内ドメイン-FcαR膜貫通ドメイン-スペーサー-リガンド結合ドメイン-シグナルペプチド-5'。

更なる態様では、本発明は、本発明のポリペプチド又はCARをコードする配列を含む核酸分子を提供する。

更なる態様では、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。

更なる態様では、本発明は、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子又はベクターを含む細胞を提供する。前記細胞は、更に好ましくは、本発明の核酸分子又はベクターが導入された細胞である。前記細胞は、好ましくは、本発明のポリペプチド又はCARを発現する。前記細胞は、好ましくは造血幹細胞、骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、又は自然リンパ球系細胞、より好ましくはヒト造血幹細胞、ヒト骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、又はヒト自然リンパ球系細胞である。前記細胞は、更に好ましくは、顆粒球、好中球、単球、マクロファージ、NK細胞及びそれらの組合せから選択される。一実施形態では、前記細胞は、初代細胞、より好ましくは本発明に従って処置される対象から単離された自家細胞である。別の実施形態では、前記細胞は、NK-92細胞、好ましくは照射されたNK-92細胞等の細胞系の細胞である。

更なる態様では、本発明は、
- Fcα受容体(FcαR)の細胞内ドメイン
- FcαRの膜貫通ドメイン、及び
- 異種リガンド結合ドメイン
を含むポリペプチドを含むキメラ抗原受容体(CAR)を含む、細胞、好ましくは顆粒球、好中球、単球、マクロファージ又はNK細胞、より好ましくは好中球又はNK細胞を提供する。

更なる態様では、本発明は、Fcα受容体(FcαR)の細胞内ドメイン、FcαRの膜貫通ドメイン、及び異種リガンド結合ドメインを含むCARをコードする核酸分子を備えた、細胞、好ましくは顆粒球、好中球、単球、マクロファージ又はNK細胞、より好ましくは好中球又はNK細胞を提供する。

更なる態様では、本発明は、本発明の複数の細胞を含む細胞の集団を提供する。

更なる態様では、本発明は、本発明の核酸分子、ベクター、ポリペプチド又はCAR、及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。

更なる態様では、本発明は、療法における使用のため、特に免疫療法における使用のための、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団を提供する。前記細胞は、好ましくは骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、造血幹細胞又は自然リンパ球系細胞、より好ましくはヒト骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、ヒト造血幹細胞若しくはヒト自然リンパ球系細胞である。前記細胞は、好ましくは、顆粒球、好中球、単球、マクロファージ、NK細胞及びそれらの組合せから選択される。一実施形態では、前記細胞は、初代細胞、より好ましくは本発明に従って処置される対象から単離された自家細胞である。別の実施形態では、前記細胞は、NK-92細胞、好ましくは照射されたNK-92細胞等の細胞系の細胞である。

更なる態様では、本発明は、それを必要とする対象における免疫療法のための方法であって、その対象に、治療有効量の、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団を投与する工程を含む、方法を提供する。

更なる態様では、本発明は、免疫療法のための医薬の調製における、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団の使用を提供する。

更なる態様では、本発明は、免疫応答の誘導又は刺激における使用のための、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団を提供する。前記細胞は、好ましくは、骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、造血幹細胞又は自然リンパ球系細胞、より好ましくはヒト骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、造血幹細胞若しくは自然リンパ球系細胞である。前記細胞は、好ましくは、顆粒球、好中球、単球、マクロファージ、NK細胞及びそれらの組合せから選択される。前記細胞は、更に好ましくは初代細胞、より好ましくは本発明に従って処置された対象から単離された自家細胞である。別の実施形態では、前記細胞は、NK-92細胞系等の細胞系由来の細胞である。

更なる態様では、本発明は、対象に、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞集団を投与する工程を含む、それを必要とする対象において免疫応答を誘導又は刺激するための方法を提供する。

更なる態様では、本発明は、免疫応答を誘導又は刺激するための医薬の調製における、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団の使用を提供する。

更なる態様では、本発明は、対象における癌の処置における使用のための、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団を提供する。一実施形態では、対象、好ましくはヒトは、癌を患っている。前記細胞は、好ましくは骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、造血幹細胞又は自然リンパ球系細胞、より好ましくはヒト骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、造血幹細胞又は自然リンパ球系細胞である。前記細胞は、好ましくは、顆粒球、好中球、単球、マクロファージ、NK細胞及びそれらの組合せから選択される。前記細胞は、更に好ましくは初代細胞、より好ましくは本発明に従って処置される対象から単離された自家細胞である。別の実施形態では、細胞は、NK-92細胞系等の細胞系由来の細胞である。

更なる態様では、本発明は、対象に、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団を投与する工程を含む、それを必要とする対象における癌の処置のための方法を提供する。

更なる態様では、本発明は、癌の処置のための医薬の調製における、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団の使用を提供する。

更なる態様では、本発明は、病原体感染の処置又は予防における使用のための、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団を提供する。前記細胞は、好ましくは骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、造血幹細胞又は自然リンパ球系細胞、より好ましくはヒト骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、造血幹細胞又は自然リンパ球系細胞である。前記細胞は、好ましくは、顆粒球、好中球、単球、マクロファージ、NK細胞及びそれらの組合せから選択される。前記細胞は、更に好ましくは初代細胞、より好ましくは本発明に従って処置される対象から単離された自家細胞である。別の実施形態では、細胞は、NK-92細胞系等の細胞系由来の細胞である。

更なる態様では、本発明は、対象に、治療有効量の、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団を投与する工程を含む、それを必要とする対象における病原体感染の処置又は予防のための方法を提供する。

更なる態様では、本発明は、病原体感染の処置又は予防のための医薬の調製における、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団の使用を提供する。

更なる態様では、本発明は、
- 本発明の核酸分子又はベクターを、細胞又は細胞の集団の細胞に導入する工程、及び
- 本発明のポリペプチド又はCARを発現させる工程
を含む、本発明の細胞又は本発明の細胞の集団を生成する方法を提供する。前記細胞は、好ましくは骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、造血幹細胞又は自然リンパ球系細胞、より好ましくはヒト骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、造血幹細胞又は自然リンパ球系細胞である。前記細胞は、好ましくは、顆粒球、好中球、単球、マクロファージ、NK細胞及びそれらの組合せから選択される。前記細胞は、更に好ましくは初代細胞、より好ましくは本発明に従って処置される対象から単離された自家細胞である。別の実施形態では、細胞は、NK-92細胞系等の細胞系由来の細胞である。

本発明で使用される場合、「含む」及びその活用形は、非限定的な意味で、その単語の前の項目が含まれることを意味するよう使用されるが、特に言及されていない項目も排除されない。また、動詞「からなる」は、本明細書で定義される化合物又は補助的な化合物が特に同定されているもの以外に更なる成分を含み得、前記更なる成分は本発明の特有の特徴を変化させないことを意味する、「から本質的になる」で置換し得る。

冠詞「a」及び「an」は、本明細書で、冠詞の文法的な対象の1つ、又は1つより多く(即ち、少なくとも1つ)をいうよう使用される。例として、「要素」は、1つの要素又は1つより多い要素を意味する。

単語「およそ」又は「約」は、数値と関連して使用される場合(およそ10、約10)、好ましくは、値の大体1%の10の所定の値であり得ることを意味する。

選択肢(例えば、「又は」)の使用は、選択肢のいずれか一方、両方、又は選択肢のあらゆる組合せを意味すると理解されるべきである。

用語「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、処置される疾患又は状態の1つ以上の症状をある程度緩和するのに十分な、投与される化合物の量をいう。これは、症状の減少若しくは軽減、疾患若しくは状態の原因の減少若しくは軽減、又はあらゆる他の所望の治療効果であり得る。

本明細書で使用される場合、用語「予防」は、疾患の臨床症状を未だ経験していない対象において、疾患若しくは状態の発症及び/又は疾患若しくは状態の臨床症状の出現を防止するか、又は遅延させることをいう。

用語「処置」は、疾患又は障害を阻害すること、即ちその発生又は疾患若しくは障害の少なくとも1つの症状を停止又は減少させること、及び/又は疾患若しくは状態の症状を緩和することをいう。一部の実施形態では、処置は、1つ以上の症状が発生した後に投与され得る。他の実施形態では、処置は、症状がない場合に投与され得る。例えば、処置は、症状の発症の前に疑いのある個体に投与され得る(例えば、症状の病歴に照らして、及び/又は遺伝子若しくは他の感受性因子に照らして)。処置はまた、症状が解決した後も、例えばその再発を予防するか、又は遅延させるために、継続され得る。

本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒト及び動物、好ましくは哺乳動物を包含する。好ましくは、対象は哺乳動物、より好ましくはヒトである。

用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸を含む化合物をいう。核酸配列によってコードされるポリペプチドは、核酸配列によってコードされるアミノ酸配列に限定されず、ポリペプチドの翻訳後修飾を含み得る。

ポリペプチドのアミノ酸配列に関して本明細書で使用される場合、用語「N末端」及び「C末端」は、それぞれN末端及びC末端に向かうポリペプチドのアミノ酸配列中の相対的位置をいう。「N末端」及び「C末端」は、それぞれポリペプチドのアミノ及びカルボキシルの極端をいう。「すぐN末端側にある」及び「すぐC末端側にある」は、第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列とが共有結合して隣接するアミノ酸配列を提供する、第二のアミノ酸配列と関連した第一のアミノ酸配列の位置をいう。

本明細書で定義されるアミノ酸配列において、アミノ酸は、1文字表記によって表示される。これらの1文字表記、及び3文字表記は、当業者に周知であり、以下の意味を有する:A(Ala)はアラニンであり、C(Cys)はシステインであり、D(Asp)はアスパラギン酸であり、E(Glu)はグルタミン酸であり、F(Phe)はフェニルアラニンであり、G(Gly)はグリシンであり、H(His)はヒスチジンであり、I(Ile)はイソロイシンであり、K(Lys)はリシンであり、L(Leu)はロイシンであり、M(Met)はメチオニンであり、N(Asn)はアスパラギンであり、P(Pro)はプロリンであり、Q(Gln)はグルタミンであり、R(Arg)はアルギニンであり、S(Ser)はセリンであり、T(Thr)はスレオニンであり、V(Val)はバリンであり、W(Trp)はトリプトファンであり、Y(Tyr)はチロシンである。

本明細書で使用される場合、本発明の核酸分子又は核酸配列は、あらゆる長さのヌクレオチド、好ましくはDNA及び/又はRNAの鎖を含む。より好ましくは、本発明の核酸分子又は核酸配列は、下記に説明されるように、RNA干渉を使用して標的RNAを分解するために、二本鎖RNAを含む。他の実施形態では、本発明の核酸分子又は核酸配列は、例えばDNA/RNAヘリックス、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)及び/又はリボザイム等の他の種類の核酸構造を含む。用語、核酸分子は、組換え及び合成核酸分子を含む。

アミノ酸配列又は核酸配列の同一性のパーセンテージ、又は用語「%配列同一性」は、本明細書で、必要に応じて最大の同一性パーセントを達成するために2つの配列を整列させてギャップを導入した後の、参照アミノ酸配列又は核酸配列の残基と同一なアミノ酸配列又は核酸配列の全長の残基のパーセンテージとして定義される。本明細書で使用される場合、配列同一性は、対象アミノ酸配列の連続したアミノ酸に基づいて計算される。整列のための方法及びコンピュータプログラムは当該分野で周知であり、例えば「Align 2」である。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムもまた、当該分野で周知であり、例えばBESTFIT、FASTA及びGAPプログラムである。これらのプログラムは、製造業者によって推奨されるデフォルトのパラメータで容易に利用される。

用語「特異的に結合する」及び「に特異的な」は、本明細書で使用される場合、抗体又はその抗原結合部分とエピトープとの間の相互作用を含む、リガンド結合ドメインとそのリガンドとの間の相互作用をいう。該用語は、前記リガンド結合ドメインが他のリガンドよりも優先的に前記リガンドに結合することを意味する。リガンド結合ドメインは非特異的に他の部分、アミノ酸配列又はリガンドに結合し得るが、前記リガンド結合ドメインの、そのリガンドに対する結合親和性は、前記リガンド結合ドメインの、他の部分、アミノ酸配列又はリガンドに対する非特異的結合親和性よりも有意に高い。

用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、少なくとも、標的エピトープに特異的な、軽鎖可変領域(VL)と対になった重鎖可変領域(VH)を含む、免疫グロブリンタンパク質をいう。

抗体の「抗原結合部分」は、本明細書で、前記抗体の、標的エピトープに特異的であるという特性を共有する部分として定義される。即ち、抗原結合部分は、必ずしも同じ程度ではないが、前記抗体と同じ抗原に結合することができる。一実施形態では、抗体の抗原結合部分は、少なくとも、重鎖可変ドメイン(VH)を含む。抗体の抗原結合部分の非限定的な例は、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、ナノボディ、ユニボディ(unibody)、単鎖可変断片(scFv)、Fab断片及びF(ab')₂断片である。

本明細書で使用される場合、用語「ナノボディ」又は「抗原結合ナノボディ」は、標的抗原に選択的に結合することができる単一の単量体可変抗体ドメインからなる単一ドメイン抗体をいう。

本明細書で使用される場合、用語「scFv」は、リンカーによって連結されていてもよい、抗体重鎖可変領域(VH)及び抗体軽鎖可変領域(VL)を含み、例えば一般構造NH₂-V_L-リンカー-V_H-COOH又はNH₂-V_H-リンカー-V_L-COOHを有する、分子をいう。

本明細書で使用される場合、用語「アフィマー」は、抗原に特異的に結合することができ、シスタチンシステインプロテアーゼ阻害剤スキャフォールドに基づく、単鎖ベースの抗体アナログをいう(参照によって本明細書に組み込まれるJohnsonら2012を参照のこと)。

本明細書で使用される場合、用語「スペーサー」は、ポリペプチド又はCAR中で2つのドメインを連結し、ポリペプチド又はCARの適切な発現及び機能性を提供し得る、アミノ酸配列をいう。

本明細書で使用される場合、用語「ドメイン」は、本発明のポリペプチド又はCAR中である特定の機能を有するアミノ酸配列をいう。かかるドメインの例としては、限定されないが、とりわけ、FcαR細胞内ドメイン、FcαR膜貫通ドメイン、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメインとリガンド結合ドメインとの間のスペーサー、シグナルペプチド、タグ及び二量体化ドメインが挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「キメラ受容体」及び「キメラ抗原受容体」又は「CAR」は、少なくとも、抗原又は標的等のリガンドに特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、組換えポリプロテインをいう。これらの少なくとも3つのドメインは、少なくとも2つの異なる天然起源のポリペプチド又はタンパク質に由来する。キメラ抗原受容体又はCARは、シグナルペプチド配列、1つ以上のスペーサードメイン、及び共刺激ドメイン等の、他の配列を含み得る。

本発明者らは、Fcα受容体(FcαR)の膜貫通及び細胞内部分並びに可変細胞外ドメインを含む、調節可能なCAR構築物を開発した。IgAアイソタイプ腫瘍抗原特異的抗体の結合による好中球のFcαRの活性化は、強い抗腫瘍効果をもたらし、これは一般に、現在臨床的に幅広く適用されている治療用抗体のアイソフォームであるIgGによって誘導されるFcγ受容体シグナル伝達と比較して、より強い。この活性化されたFcα受容体の細胞内ドメインを利用することによって、Fcγ受容体ベースのCARを使用したFcγ受容体シグナル伝達と比較して、CARの抗腫瘍エフェクター機能が増幅されると仮定される。

FcαR細胞内ドメインを有するCARを発現する好中球のエフェクター機能の1つが、最近記載されている、抗体オプソニン化腫瘍細胞に対する好中球のエフェクターメカニズムであるトロゴサイトーシスであると、更に仮定される。トロゴサイトーシスは、標的細胞の断片化によって特徴付けられ、好中球による標的細胞の膜断片の膜取り込みによって開始される、壊死性の溶解性細胞死である。

FcαR細胞内及び膜貫通ドメインを含む、本発明のCARは、造血器腫瘍の抗原及び固形腫瘍抗原を含む広範な抗原を認識するために調節し得、種々の起源の癌を標的化するための高い治療能力をもたらす。よって、CARは、最適な柔軟性のための、その細胞外腫瘍認識ドメインのモジュールである。更に、CAR技術は、好中球、単球/マクロファージ及びNK細胞を含む複数の生来のエフェクター細胞における使用に適用可能に設計される。

好中球及びマクロファージを含む生来の細胞は、免疫系の重要なエフェクターである。これらの生来の細胞を腫瘍細胞に対して利用することは、特に既存のT細胞療法の成功が限られている固形腫瘍の場合に、長年の関心事である。CARは、最初にT細胞活性を腫瘍抗原に特異的に向け直すように設計された受容体であり、血液癌の標的化においてうまく使用されてきたが、固形腫瘍においてはそれ程ではなかった。本CAR技術は、T細胞ベースの療法が限定される場合に、特に適しており、広範に適用可能であると考えられる。標的特異的CARの発現によって生来のエフェクター機能を特異的に腫瘍に方向付けることは、持続的腫瘍制御の新たな可能性を切り開く。特に、腫瘍関連マクロファージ(TAM)及び多形核細胞(PMN)は、固形腫瘍によく浸潤することが公知であり、CAR-TAM/PMNは、腫瘍微小環境(TME)を抗腫瘍対腫瘍促進に分極させると考えられている。また、CAR-TAM/PMNは、腫瘍抗原の交差提示又はT細胞の共刺激によって、直接の抗腫瘍効果の上に適応応答を生じさせる能力を有する。生来のCARの使用によって、それらの迅速なターンオーバーから生じる、耐久性のある応答の維持への障害物が提供され得るが、これは実際、CAR T細胞に見られるように、重大な副作用に制限を加え得る。

本明細書の例は、神経芽細胞腫細胞で発現されるGD2を標的とするCARの開発を記載している。CAR構築物は、市販の抗GD2抗体(クローン14.18)に由来する単鎖断片可変 (scFv)部分並びにFcα受容体(FcαR)の膜貫通及び細胞内部分からなるGD2-認識ドメインとして設計される。本明細書の例に示されるように、成熟誘導性細胞(maturation inducible cell)を、CARを発現するよううまく形質導入して(80%より多い陽性細胞)、好中球様細胞に分化させ得る。更に、GD2-CARを発現している好中球様細胞は、GD2+神経芽細胞腫細胞を特異的に殺すことができる。特に、該細胞は、抗GD2オプソニン化を必要とすることなく、GD2陽性神経芽細胞腫細胞の細胞傷害性を誘導することが示されている。FcαR細胞内ドメインは、GD2-CARの機能に必要であることが更に示されている。重要なことに、本発明者らは、好中球様細胞中にFcαR細胞内及び膜貫通ドメインを有するCAR構築物が、FcγRIIA細胞内及び膜貫通ドメインを有するCAR構築物よりもはるかにより良い有効性を示すことを見出した:GD2-FcαR CAR好中球様細胞は、試験された全ての標的対エフェクター細胞比においてGD2+標的細胞を効果的に殺すことができることが示されているが、これらの好中球様細胞のGD2-FcγR CARは、殺滅を誘導しなかった(図11Bを参照のこと)。際立ったことに、GD2-FcαR CARとGD2-FcγR CARとの組合せはまた、GD2-FcαR CAR単独と比較して、細胞傷害性の促進ももたらし、これは該組合せの相乗効果を証明する。

また、Her2/neu又はEGFR認識ドメインを有するCAR構築物が調製され、これらのCAR構築物を備えた好中球様細胞が、抗EGFR及び抗Her2/neuオプソニン化を必要とすることなく、それぞれEGFR+及びHer2/neu+類表皮癌腫及び乳癌細胞系A431及びSKBR3に対して効果的であることが示されている。非オプソニン化細胞に対するHer2/neu-FcαR CARの細胞傷害性能力は、驚くべきことに、トラスツズマブオプソニン化標的細胞に対する野生型好中球様細胞よりも高いことが見出された。

最終的に、本発明者らは、NK細胞中でGD2-CARを更にうまく発現させた。

したがって、第1の態様では、本発明は、
- Fcα受容体(FcαR)の細胞内ドメイン
- FcαRの膜貫通ドメイン、及び
- リガンド結合ドメイン
を含むポリペプチドを提供する。

好ましい実施形態では、ポリペプチドは、キメラ受容体、特にキメラFcαRである。ある好ましい実施形態では、ポリペプチドはキメラ抗原受容体(CAR)である。

- Fcα受容体(FcαR)の細胞内ドメイン
- FcαRの膜貫通ドメイン、及び
- リガンド結合ドメイン
を含むポリペプチドを含むキメラ抗原受容体(CAR)もまた提供される。

好ましい実施形態では、CARはポリペプチドからなり、即ちCARは、Fcα受容体(FcαR)の細胞内ドメイン、FcαRの膜貫通ドメイン、及びリガンド結合ドメインを含む。

本発明のポリペプチド及びCARは、Fcα受容体(FcαR)の細胞内及び膜貫通ドメインを含む。本発明のポリペプチド又はCARの細胞内及び膜貫通ドメインは、好ましくはヒトFcαRである。FcαRはまた、免疫グロブリンαFc受容体とも呼ばれ、ヒトFcαRは、アイソフォームA.1、アイソフォームA.2、アイソフォームA.3、アイソフォームB、アイソフォームB-Δ-S2、アイソフォームU02、アイソフォームL10、アイソフォームU09、アイソフォームU10、アイソフォームU11及びアイソフォームU13を含む複数のアイソフォームで存在する。これらのFcαRアイソフォーム及びそれらの配列は、当該分野で公知である。本明細書の例において、アイソフォームA.1の標準的なアイソフォームの細胞内及び膜貫通ドメインが使用される。FcαRアイソフォームA.1の配列を図1に示す。しかしながら、あらゆるFcαRの配列を、本発明のポリペプチド又はCARで使用し得る。好ましい実施形態では、ヒトFcαRはヒトFcαRアイソフォームA.1、アイソフォームA.2、アイソフォームA.3、アイソフォームU02、アイソフォームL10、アイソフォームU10、アイソフォームU11又はアイソフォームU13である。

「FcαRの細胞内ドメイン」は、本明細書で使用される場合、FcαRシグナル伝達を開始させることができる細胞内ドメインをいう。よって、本発明のポリペプチド又はCARは、FcαRシグナル伝達することができる。FcαRシグナル伝達は、リガンド結合ドメインがリガンドに結合した場合に開始される。よって、「FcαRシグナル伝達することができる」は、FcαRシグナル伝達が、ポリペプチド又はCARのリガンド結合ドメインがリガンドに結合した場合に開始されることを意味する。FcαR細胞内ドメインは、当業者に周知である。これは、ヒトFcαRの41個のC末端アミノ酸を含む。これらは、FcαRアイソフォームA.1のアミノ酸247～287、即ち、配列ENWHSHTALNKEASADVAEPSWSQQMCQPGLTFARTPSVCK、又は他のFcαRアイソフォームの対応するアミノ酸である。よって、本発明のポリペプチド又はCARに存在するFcαRの細胞内ドメインは、好ましくは図1に示されるFcαRアイソフォームA.1配列のアミノ酸247～287の配列、又はアイソフォームA.1以外のFcαRアイソフォームの対応する配列、又は前記配列に少なくとも90%同一な配列を含む。前記アイソフォームA.1以外のFcαRアイソフォームは、好ましくはアイソフォームA.2、アイソフォームA.3、アイソフォームU02、アイソフォームL10、アイソフォームU10、アイソフォームU11又はアイソフォームU13である。本発明のポリペプチド又はCARに存在する細胞内ドメインは、好ましくは、FcαRシグナル伝達を開始することができる。前記配列は、好ましくは、図1に示されるFcαRアイソフォームA.1の前記配列のアミノ酸247～287に少なくとも95%同一であり、より好ましくは97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%同一である。特に好ましい実施形態では、FcαRの細胞内ドメインは、図1に示されるFcαRアイソフォームA.1の前記配列のアミノ酸247～287を含み、より好ましくは図1に示されるFcαRアイソフォームA.1の前記配列のアミノ酸247～287からなる。

好ましい実施形態では、CARは、FcαRの細胞内ドメインに加えて、更なる細胞内ドメインを含まない。特に、CARは、FcαRの細胞内ドメインに加えて、更なる機能性細胞内ドメインを含まない。よって、CARが細胞、好ましくは顆粒球、好中球、単球、マクロファージ又はNK細胞、より好ましくは好中球又はNK細胞によって発現される場合、細胞内に更なる機能ドメインは存在しない。連結配列又はスペーサー等の非機能性配列が存在し得る。特に好ましい実施形態では、CARの細胞内及び膜貫通部分は、FcαRの細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインからなり、場合により連結配列又はスペーサーによって分離されている。更に好ましい実施形態では、CARの細胞内及び膜貫通部分は、FcαRの細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインからなる。「CARの細胞内及び膜貫通部分」は、本明細書で使用される場合、CARが細胞、好ましくは顆粒球、好中球、単球、マクロファージ又はNK細胞、より好ましくは好中球又はNK細胞によって発現される場合、細胞内及び膜貫通であるCARの部分をいう。

「FcαRの膜貫通ドメイン」は、本明細書で使用される場合、FcαRの膜貫通ドメインをいう。FcαR膜貫通ドメインは当業者に周知である。これは、FcαR細胞内ドメインのすぐN末端側にある19個のアミノ酸を含む。これらは、FcαRアイソフォームA.1のアミノ酸228～246、即ち配列LIRMAVAGLVLVALLAILV、又は他のFcαRアイソフォームの対応するアミノ酸である。よって、本発明のポリペプチド又はCARに存在するFcαRの膜貫通ドメインは、好ましくは図1に示されるFcαRアイソフォームA.1配列のアミノ酸228～246の配列、又はアイソフォームA.1以外のFcαRアイソフォームの対応する配列、又は前記配列に少なくとも90%同一な配列を含む。前記アイソフォームA.1以外のFcαRアイソフォームは、好ましくは、アイソフォームA.2、アイソフォームA.3、アイソフォームU02、アイソフォームL10、アイソフォームU10、アイソフォームU11又はアイソフォームU13である。前記配列は、好ましくは、図1に示されるFcαRアイソフォームA.1の前記配列のアミノ酸228～246に少なくとも95%同一であり、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%同一である。特に好ましい実施形態では、FcαRの膜貫通ドメインは、図1に示されるFcαRアイソフォームA.1の前記配列のアミノ酸228～246を含み、より好ましくは図1に示されるFcαRアイソフォームA.1の前記配列のアミノ酸228～246からなる。

よって、本発明の好ましいポリペプチド又はCARは、図1に示されるFcαRアイソフォームA.1配列のアミノ酸228～287の配列、又はアイソフォームA.1以外のFcαRアイソフォームの対応する配列、又は前記配列に少なくとも90%同一な配列を含む。前記アイソフォームA.1以外のFcαRアイソフォームは、好ましくは、アイソフォームA.2、アイソフォームA.3、アイソフォームU02、アイソフォームL10、アイソフォームU10、アイソフォームU11又はアイソフォームU13である。前記配列は、好ましくは、図1に示されるFcαRアイソフォームA.1の前記配列のアミノ酸228～287に少なくとも95%同一であり、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%同一である。特に好ましい実施形態では、FcαRの膜貫通ドメインは、図1に示されるFcαRアイソフォームA.1の前記配列のアミノ酸228～287を含み、より好ましくは図1に示されるFcαRアイソフォームA.1の前記配列のアミノ酸228～287からなる。

本発明のポリペプチド又はCARは、FcαRの細胞外ドメインの一部等の、FcαRの更なる部分配列を含み得る。例えば、本発明のポリペプチド又はCARは、場合により、FcαRの細胞外ドメインの1～50個の間の連続したアミノ酸、好ましくはFcαRの膜貫通ドメインのすぐN末端側にある1～50個の連続したアミノ酸を含む。これは、図1に示されるFcαRアイソフォームA.1配列のアミノ酸178～227に相当するが、A.1以外のFcαRアイソフォームの178～227でもあり得る。一実施形態では、本発明のポリペプチド又はCARは、5～30個の間の、FcαRの膜貫通ドメインのすぐN末端側にあるアミノ酸、即ち、図1に示されるFcαRアイソフォームA.1の膜貫通ドメインのすぐN末端側にある5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20個の連続したアミノ酸、又はA.1以外のFcαRアイソフォームの対応するアミノ酸等の、図1に示されるFcαRアイソフォームA.1の膜貫通ドメインのすぐN末端側にあるアミノ酸198～227の少なくとも5つの連続したアミノ酸、又はA.1以外のFcαRアイソフォームの対応するアミノ酸を含む。かかる膜貫通ドメインのすぐN末端側にある更なるアミノ酸は、本発明のポリペプチド又はCARの柔軟性を提供し得る。

用語「リガンド結合ドメイン」は、本明細書で使用される場合、リガンドに特異的に結合するドメインをいう。リガンド結合ドメインは、本明細書で使用される場合、FcαRの細胞外ドメイン以外のリガンド結合ドメインであることを意味する異種リガンド結合ドメインである。リガンド結合ドメインは、最適なリガンドに結合され得るあらゆるドメインであり得る。特に、リガンド結合ドメインは、あらゆる細胞表面抗原の結合パートナー又はあらゆる可溶性リガンドであり得る。リガンド結合ドメインの多用性によって、あらゆる特定の用途のための適切なリガンドを選択することが可能になる。このようにして、本発明のポリペプチド又はCARによるFcαRシグナル伝達の活性化が、選択された時間に、選択された位置/細胞型、又は両方で開始され得る。適切な細胞外リガンド結合ドメインの好ましい例は、可溶性リガンドに特異的なリガンド結合ドメイン、細胞表面抗原に特異的なリガンド結合ドメイン及びそれらの組合せである。細胞表面抗原の好ましい例は、腫瘍抗原、骨髄系由来サプレッサー細胞抗原及び病原抗原である。本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原」は、腫瘍の細胞で発現されるあらゆる抗原をいう。腫瘍抗原はまた、腫瘍関連抗原(TAA)とも呼ばれる。本明細書で使用される場合、「骨髄系由来サプレッサー細胞抗原」はMDSCで発現されるあらゆる抗原をいう。本明細書で使用される場合、「骨髄系由来サプレッサー細胞で発現される抗原」は、癌及び慢性感染症等の病的状況で増殖し、免疫抑制作用を有する、骨髄細胞系列由来の免疫細胞をいう。これにより、MDSCは、環境に依存して感染又は腫瘍促進活性を有する。ある好ましい実施形態では、MDSCは、腫瘍微小環境に存在するMDSC等の、腫瘍関連MDSCである。本明細書で使用される場合、「病原抗原」は、微生物又は寄生生物によって発現されるあらゆる抗原をいい、限定されないが、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌及び寄生生物を含む。好ましい実施形態では、リガンド結合ドメインは、腫瘍抗原又は骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)抗原に特異的である。以下のタイプの細胞表面抗原が、本発明のポリペプチド又はCARのリガンド結合ドメインの標的であり得る:腫瘍又はMDSC特異的抗原;非腫瘍細胞及び非MDSCでの発現レベルと比較して、腫瘍細胞又はMDSCでの発現のレベルがより高い抗原;腫瘍細胞又はMDSC並びに非腫瘍細胞及び非MDSCの両方で発現されるが、それによって非腫瘍細胞及び非MDSCによって誘導される本発明のポリペプチド又はCARを発現している細胞の活性化が許容され得る副作用をもたらす、抗原;腫瘍細胞又はMDSC及び非腫瘍細胞又は非MDSCの両方で発現されるが、1つ以上の他の抗原との組合せで腫瘍細胞又はMDSCに特異的である、抗原;並びに腫瘍の周囲の細胞で発現される抗原。

一実施形態では、リガンド結合ドメインは、
・細胞表面抗原に特異的な、抗体、又は単鎖可変断片(scFv)、ナノボディ若しくはアフィマー等の抗体の抗原結合部分;
・Fc受容体の細胞外Fc結合ドメイン又はそのリガンド結合断片、
・可溶性リガンドに特異的なリガンド結合ドメイン、
・表面抗原又は分子の関与なしにポリペプチド又はCARを架橋し得る抗体のエピトープ;
・腫瘍抗原等の細胞表面抗原に特異的な分子(例えば抗体又はscFv)に結合し得るビオチン、FITC又はペプチドエピトープ等の部分を、認識するドメイン、
・ストレプトアビジン等の、その部分の複数の結合部位を有する薬剤によって架橋され得る、ビオチン等の部分(前記薬剤の添加の際に複数のポリペプチド又はCARのクラスター化をもたらす)
からなる群から選択される部分を含む。

ある好ましい実施形態では、細胞表面抗原は腫瘍抗原である。

ある好ましい実施形態では、リガンド結合ドメインは、前記腫瘍抗原に特異的なscFv及びナノボディ又はアフィマーを含む、抗体、又は抗体の抗原結合部分である。例えば、腫瘍抗原に特異的なあらゆる公知の治療用抗体、又はscFv等のその抗原結合部分は、本発明のポリペプチド又はCARのリガンド結合ドメインとして使用され得る。腫瘍抗原の好ましい例は、GD2、EGFR、HER2/Neu、TAG-72、カルシウム活性化クロライドチャネル2であり、TMEM16A、9D7、Ep-CAM、EphA3、メソテリン、SAP-1、BAGEファミリー、MC1R、プロテアーゼ特異的抗原、CML66、TGF-βRII、MUC1、CD5、CD19、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD152(CTLA-4)、CD274(PD-L1)、CD273(PD-L2)、CD340(ErbB-2)、TPBG、CA-125、MUC1、及び未成熟ラミニン受容体が挙げられる。

ある好ましい実施形態では、腫瘍抗原は、GD2、EGFR及びHER2/Neuから選択される。GD2は、ヒト神経芽細胞腫(患者の約91～100%)及び黒色腫(患者の約2.4～14%)を含む神経外胚葉由来の腫瘍で発現される、ジシアロガングリオシドである。GD2は更に、小細胞肺癌(SCLC;患者の約>50%)、ユーイング肉腫(患者の約40～90%)、骨肉腫(患者の約88%)、神経膠腫(患者の約80%)、網膜芽細胞腫(患者の約40%)及び乳癌、膀胱癌で発現される(発現はステージ及びサブタイプに依存する)。上皮成長因子受容体(EGFR)は、膜貫通タンパク質である。EGFR過剰発現をもたらす変異は、結腸直腸癌腫、頭頸部癌(患者の約80～100%)、非小細胞肺癌(NSCLC;患者の約40%)、特に転移性NSCLC、肛門癌及び神経膠芽腫(患者の約50%)を含む多数の癌と関連付けられている。HER2/Neuは、ある特定のタイプの乳癌によって発現される発癌遺伝子である。

当業者は、本発明のポリペプチド又はCARにおいてリガンド結合ドメインとして使用し得る、可溶性リガンド及びそれらの結合パートナーを十分同定することができる。可溶性リガンドとして、例えば、本発明のポリペプチド又はCARのリガンド結合ドメインに結合する可溶性形態のリガンドを使用し得、このようにして、ポリペプチド発現細胞又はCAR発現細胞に停止信号を提供する。

一実施形態では、リガンド結合ドメインは、Fc受容体の細胞外Fc結合ドメイン又はそのリガンド結合断片を含む。リガンド結合ドメインとしての細胞表面抗原の代わりに、ポリペプチド又はCARは、Fc受容体の抗体認識ドメイン、即ちCD16を細胞外に含む。このようにして、ポリペプチド又はCARは、腫瘍細胞又はMDSCに対する治療用抗体を認識するが、同時にポリペプチド又はCARの膜貫通及び細胞内FcαRドメインによって誘導されるシグナル伝達の増幅から利益を得るよう、設計される。

本発明のポリペプチド又はCARに含まれる可溶性リガンドに特異的なリガンド結合ドメインと、腫瘍抗原等の細胞表面抗原に特異的な別の分子(例えば、抗体又はscFv)に含まれるリガンド結合ドメインとの組合せもまた、可能である。この場合、FcαRシグナル伝達は、可溶性リガンドと細胞表面抗原の両方が存在する場合にのみ誘導される。例えば、本発明のポリペプチド又はCARのリガンド結合ドメインは、例えばペプチドネオエピトープ又はビオチン若しくはFITC部分を認識するドメインを含み得る。次いで、ペプチドネオエピトープ、ビオチン又はFITC部分を含む、腫瘍の(腫瘍)表面抗原に対する別の抗体(「スイッチ」抗体)が利用される。結果として、FcαRシグナル伝達の活性化は、スイッチ抗体の標的である細胞表面抗原に加えて、スイッチ抗体自体もまた存在する場合にのみ起こる。本発明のポリペプチド又はCARと共に使用され得るかかる技術の例は、参照によって本明細書に組み込まれるMaら(2016)及びMitwasiら(2020)に記載されており、受容体の一時的な制御(所望の場合にのみスイッチを入れたり切ったりする)及び量的制御(スイッチ抗体の濃度の増減によって)を可能にする。

本発明のポリペプチド又はCARは、FcαRの細胞内ドメイン、FcαRの膜貫通ドメイン、及びリガンド結合ドメインに加えて、更なる配列又はドメインを含み得る。かかる配列及びドメインの例は、FcαR細胞内ドメインとFcαR膜貫通ドメインとの間及び/又はFcαR膜貫通ドメインとリガンド結合ドメインとの間の1つ以上の連結配列又はスペーサー、シグナルペプチド配列、1つ以上のタグ及び二量体化モチーフである。

ある好ましい実施形態では、スペーサーは、FcαR膜貫通ドメインとリガンド結合ドメインとの間に位置する。かかるスペーサーは、好ましくは、10～300個のアミノ酸等の、300個までのアミノ酸を含む。ある好ましい実施形態では、スペーサーは、少なくとも200個のアミノ酸からなる。原則として、かかるスペーサーは、あらゆるランダムなアミノ酸配列であり得る。適切なスペーサー配列の例は、例えば場合によりFcγ受容体への結合を減少させる1つ以上の変異を含むCH₂CH₃ヒンジ領域、並びにCD28及びCD8αドメイン等の、FcγR結合活性を欠く細胞外ドメインに基づく、IgG1、IgG2又はIgG4ベースのスペーサーである。適切な例は、参照によって本明細書に組み込まれるGuedanら(2019)に記載されている。適切なスペーサーの他の例は、Siglec-4ベースのスペーサーである(参照によって本明細書に組み込まれるSchaferら(2020)に記載されている)。ある好ましい実施形態では、スペーサーは、場合により1つ以上の変異を含む、ヒトIgG、好ましくはIgG1、IgG2又はIgG4、より好ましくはIgG1のCH₂CH₃ヒンジ領域を含むか、又はそのものである。このヒトIgGのCH₂CH₃ヒンジ領域及びその配列は当該分野で周知であり、例えば、GenBank受託番号AAC82527.1の配列のアミノ酸98～329である。

ある好ましい実施形態では、本発明のポリペプチド又はCARは、シグナルペプチドを含む。ポリペプチドを細胞膜に方向付けることができるシグナルペプチドは、細胞がポリペプチド又はCARを細胞膜に転位置させるよう刺激するように存在し得る。シグナルペプチドは当該分野で周知であり、当業者は、適切なシグナルペプチドを十分選択することができる。かかるシグナルペプチドは、好ましくは、50個までのアミノ酸を含む。ある好ましい実施形態では、シグナルペプチドは、10～40個のアミノ酸又は15～35個のアミノ酸からなる。一実施形態では、シグナルペプチドは、配列MEFGLSWLFLVAILKGVQCE(GenBank受託番号AAA587335.1の配列のアミノ酸1～19)を有するヒト免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドである。

別の実施形態では、本発明のポリペプチド又はCARは、低分子ペプチドエピトープ等の、好ましくは細胞外ドメインに含まれる、タグを含む。タグを特異的に標的とすることによって、かかるタグを使用して、本発明のポリペプチド又はCARを発現している細胞、例えばタグに特異的なCAR T細胞を排除し得る。適切なタグは当業者によって同定され得、本発明のポリペプチド又はCARで使用し得る、CAR発現細胞を排除するためのある適切なタグ及び手順は、参照によって本明細書に組み込まれるKoristkaら(2019)に記載されている。別の例として、かかるタグを使用して、タグを認識する部分を含むリガンド結合ドメインを、ポリペプチド又はCARの残りの部分に結合させ得る。

好ましい実施形態では、CARは、FcαRの細胞内ドメインに加えて、更なる細胞内ドメインを含まない。特に、CARは、FcαRの細胞内ドメインに加えて、更なる機能性細胞内ドメインを含まない。よって、CARが細胞、好ましくは顆粒球、好中球、単球、マクロファージ又はNK細胞、より好ましくは好中球又はNK細胞によって発現される場合、更なる機能性ドメインは細胞内に存在しない。連結配列又はスペーサー等の非機能性配列が存在し得る。特に好ましい実施形態では、CARの細胞内及び膜貫通部分は、場合により連結配列又はスペーサーによって分離されている、FcαRの細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインからなる。

本発明のポリペプチド又はCARをコードする配列を含む核酸分子が、更に提供される。本発明の核酸分子を含むベクターもまた提供される。好ましい実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである。別の好ましい実施形態では、ベクターは、トランスポゾンを含むか、又はトランスポゾンである。前記核酸分子又はベクターは、ベクターが導入された特定の細胞中の発現を指示する、例えばウイルス起源の強力なプロモーター等の、高い発現レベルのための手段、及びシグナル配列等の、他の成分を更に含み得る。好ましい実施形態では、核酸分子又はベクターは、以下の成分の1つ以上を含む:SFFVプロモーター等の、生来の細胞での発現を駆動するプロモーター、形質膜を標的とするためのGMCSFタンパク質又はCD8タンパク質由来等のC末端シグナルペプチド、及びポリアデニル化シグナル。

細胞によって発現された場合に、本発明のポリペプチド又はCARが、更に提供される。本発明の核酸分子又はベクターを含む、細胞、好ましくは単離された細胞もまた提供される。本発明の細胞の集団もまた提供される。前記細胞の集団は、好ましくは、本発明の複数の細胞を含む。細胞は、好ましくは、ヒト細胞である。細胞の集団の細胞は、好ましくはヒト細胞である。

細胞は、好ましくは、造血幹細胞、成熟誘導性細胞、ヒト多能性幹細胞(hPSC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、又は自然リンパ球系細胞である。自然リンパ球系細胞(ILC)は、エフェクターサイトカインを分泌すること並びに他の自然及び適応免疫細胞の機能を調節することによって免疫応答に寄与するT細胞の生来の対応物であり、NK細胞、ILC1、ILC2、ILC3及びリンパ組織誘導(LTi)細胞を含む。より好ましくは、細胞は造血幹細胞、hPSC、iPSC、好中球、好塩基球及び好酸球を含む顆粒球、単球、マクロファージ、骨髄芽細胞、赤血球、樹状細胞若しくは肥満細胞、又はNK細胞、又はそれらの組合せである。細胞の集団の細胞は、好ましくは、骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、ヒト造血幹細胞、hPSC、ヒトiPSC、及び/又は自然リンパ球系細胞であり、より好ましくは、造血幹細胞、好中球、好塩基球、及び好酸球を含む顆粒球、単球、マクロファージ、骨髄芽細胞、赤血球、樹状細胞並びに肥満細胞、NK細胞、並びにそれらの組合せから選択される。ある好ましい実施形態では、細胞は、顆粒球、好中球、単球、マクロファージ若しくはNK細胞、又はそれらの組合せである。好ましい実施形態では、細胞は好中球である。他の好ましい実施形態では、細胞はNK細胞である。ある好ましい実施形態では、細胞の集団の細胞は、顆粒球、好中球、単球、マクロファージ、NK細胞、又はそれらの組合せから選択される。好ましい実施形態では、細胞の集団の細胞は好中球である。他の好ましい実施形態では、細胞の集団の細胞はNK細胞である。細胞、特に好中球又はNK細胞は、細胞系の細胞、初代細胞又はあらゆる成熟誘導性細胞から分化した細胞、hPSC又はiPSCを含む、あらゆる起源のものであり得る。本明細書で使用される場合、「初代細胞」は、生物、好ましくはヒトから直接得られた細胞をいう。初代細胞を培養して、増殖若しくは拡大を経るか、又は本明細書で後述されるように細胞を直接修飾及び使用してもよい。一実施形態では、初代細胞は直接修飾される。初代細胞は、好ましくは造血幹細胞、骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、又は自然リンパ球系細胞、より好ましくは造血幹細胞、顆粒球、好中球、単球、マクロファージ又はNK細胞、又はそれらの組合せは、例えば、対象の血液又は健康な組織から単離される。血液又は健康な組織からの細胞の単離は、かかる細胞の単離のための当該分野の標準的な方法を使用して行い得る。細胞系の好ましい例は、NK細胞系、より好ましくはNK-92細胞系である。この細胞系はCAR療法に適しており、参照によって本明細書に組み込まれるTangら(2018)に記載されている。細胞が造血幹細胞、骨髄系前駆細胞、成熟誘導性細胞、hPSC又はiPSCである場合、細胞は、分化又は増殖し、CAR発現骨髄細胞、特に顆粒球、好中球、単球、及び/又はマクロファージ若しくはNK細胞を生じるよう分化し得、好ましくは分化又は増殖し、CAR発現骨髄細胞、特に顆粒球、好中球、単球、及び/又はマクロファージ若しくはNK細胞を生じるよう分化する。

細胞、好ましくは造血幹細胞、成熟誘導性細胞、hPSC、iPSC、骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、又は自然リンパ球系細胞は、好ましくは操作された細胞又は組換え修飾された細胞である。本明細書で使用される場合、用語「操作された細胞」及び「組換え修飾された細胞」は、外来の、即ち非天然起源の核酸が、導入された細胞、特に本発明の核酸分子又はベクターが導入された細胞をいう。即ち、細胞は、好ましくは、本発明の核酸分子又はベクターが導入された細胞である。核酸分子又はベクターは、トランスフェクション、形質導入、例えばレンチウイルス遺伝子導入若しくはレトロウイルス形質導入、DNAエレクトロポレーション、又はRNAエレクトロポレーション等による、当該分野で公知のあらゆる方法によって、細胞、好ましくは免疫細胞に導入され得る。核酸分子又はベクターは、一時的に、又は安定的に細胞に供給される。核酸での細胞のトランスフェクション、形質導入又はエレクトロポレーションのための方法は、当業者に公知である。

本発明の細胞は、好ましくは、本発明のポリペプチド又はCARを含み、より好ましくは本発明のポリペプチド又はCARを発現する。したがって、Fcα受容体(FcαR)の細胞内ドメイン、FcαRの膜貫通ドメイン、及び異種リガンド結合ドメインを含むポリペプチドを含むキメラ抗原受容体(CAR)を含む細胞もまた提供される。

本発明のポリペプチド又はCARは、好ましくは、細胞表面で発現される。即ち、細胞は、一般に、本発明のポリペプチド又はCARを発現するよう修飾される。本発明のポリペプチド又はCARのFcαRの細胞内ドメインは、好ましくは、ポリペプチド又はCARが細胞によって発現される場合に細胞内にある。本発明のポリペプチド又はCARのFcαRの膜貫通ドメインは、好ましくは、ポリペプチド又はCARが細胞によって発現される場合に膜貫通している。リガンド結合ドメインは、好ましくは、ポリペプチド又はCARが細胞によって発現される場合に細胞外にある。

一実施形態では、細胞は、患者、特に本発明に従って処置される患者から単離された自家細胞である。一実施形態では、細胞の集団は、患者、特に本発明に従って処置される患者から単離された自家細胞の集団である。一実施形態では、前記患者は、癌を患っている患者、特に本発明に従って処置される癌を患っている患者である。別の実施形態では、細胞は、NK-92細胞系等の細胞系由来の細胞である。

本発明の核酸分子、ベクター、ポリペプチド又はCAR、及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物もまた提供される。本発明の細胞又は細胞の集団、並びに少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤を含む、医薬組成物もまた提供される。「薬学的に許容される」は、担体、希釈剤又は賦形剤が製剤の他の成分と適合性でなければならず、その受容者にとって有害、例えば毒性でないことを意味する。一般に、活性化合物の機能に干渉しないあらゆる薬学的に適切な添加剤を使用し得る。本発明の医薬組成物は、好ましくは、ヒトの使用に適している。

適切な担体の例は、溶液、ラクトース、デンプン、セルロース誘導体等、又はそれらの混合物を含む。好ましい実施形態では、前記適切な担体は、溶液、例えば生理食塩水である。医薬組成物は、好ましくは、非経口投与のための製剤、特に輸液製剤である。非経口投与のための製剤としては、関節内、筋肉内、静脈内、心室内、動脈内、髄腔内及び皮下投与が挙げられる。更に、医薬組成物は、医療従事者から、点滴を介して、又は注射を介して、病院で対象に投与され得る。非経口投与のための組成物は、例えば、無菌等張水性緩衝液中の、本発明の核酸分子、ベクター、ポリペプチド、CAR、細胞又は細胞の集団の溶液であり得る。必要に応じて、非経口製剤は、例えば、可溶化剤、安定化剤及び/又は注射の部位の痛みを和らげるための局所麻酔を含み得る。

本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞及び細胞の集団は、療法、好ましくは免疫療法において有利に使用される。したがって、療法における使用のため、及び免疫療法における使用のための、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団が提供される。それを必要とする対象における免疫療法のための方法であって、その対象に、治療有効量の本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団を投与する工程を含む、方法もまた提供される。一実施形態では、前記免疫療法は、腫瘍免疫療法である。特に癌の処置における、免疫応答の誘導又は刺激における使用のための、本発明ポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団もまた提供される。特に癌の処置において、それを必要とする対象において免疫応答を誘導又は刺激するための方法であって、対象に、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団を投与する工程を含む、方法もまた提供される。好ましい実施形態では、あらゆるかかる方法は、本発明の細胞又は細胞の集団の投与を含む。好ましい実施形態では、前記免疫療法、特に腫瘍免疫療法は、養子細胞移入、より好ましくは養子骨髄細胞移入若しくは養子自然リンパ球系細胞移入を含み、ここで骨髄細胞又は自然リンパ球系細胞は、本明細書で先に定義された細胞である。好ましくは、前記骨髄細胞及び/又は自然リンパ球系細胞は、顆粒球、好中球、単球、マクロファージ、NK細胞又はそれらの組合せから選択される。

本明細書で使用される場合、「養子細胞移入」は、患者、特に癌を患っている患者への、本発明の細胞の移入をいう。特に、「養子骨髄細胞移入」は、患者への本発明の骨髄細胞の移入をいい、「養子自然リンパ球系細胞移入」は、患者への本発明の自然リンパ球系細胞の移入をいう。細胞は、患者自身に由来してもよく、別の個体に由来してもよい。細胞は、本発明に従って、本発明のポリペプチド又はCARを発現するよう操作されていてもよく、組換え修飾されていてもよい。養子骨髄細胞移入は、好ましくは、処置される対象又は患者由来の自家骨髄細胞の移入を含む。養子自然リンパ球系細胞移入は、好ましくは、処置される対象又は患者由来の、自家自然リンパ球系細胞、特にNK細胞、又はNK-92細胞系の細胞の、移入を含む。

本明細書で使用される場合、「免疫療法」は、疾患又は障害を患っている個体の、前記個体における免疫応答を誘導又は促進することによる、処置をいう。腫瘍免疫療法は、腫瘍及び/又は前記腫瘍の細胞に対する個体の免疫応答の誘導又は促進に関する。本発明の免疫療法は、処置又は予防のいずれかのためであり得、好ましくは、これは処置、特に癌又は腫瘍の処置のためである。

対象における癌の処置における使用のための、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団もまた提供される。一実施形態では、対照、好ましくはヒトは、癌を患っている。対象に、本発明のポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、細胞又は細胞の集団を投与する工程を含む、それを必要とする対象における癌の処置のための方法もまた提供される。前記癌の処置は、好ましくは、対象、好ましくは癌を患っているヒトに、有効量の、本発明の細胞、即ち本発明のポリペプチド又はCARを発現する細胞を投与する工程を含む。前記細胞は、好ましくは骨髄細胞又は自然リンパ球系細胞であり、より好ましくは顆粒球、好中球、単球、マクロファージ、NK細胞又はそれらの組合せから選択される細胞である。前記細胞は、更に好ましくは対象から単離された自家細胞であり、ここでその後に本発明の核酸分子又はベクターが導入されており、それによって本発明のポリペプチド又はCARを発現する自家細胞が提供される。別の実施形態では、細胞は、NK-92細胞系等の細胞系由来の細胞である。

本発明のポリペプチド若しくはCAR及び/又は本発明の核酸分子又はベクターを導入された、又は本発明のポリペプチド又はCARを発現している、細胞、好ましくは骨髄細胞若しくは自然リンパ球系細胞、より好ましくは自家若しくは細胞系の、顆粒球、好中球、単球、マクロファージ、NK細胞若しくはそれらの組合せ等の骨髄細胞若しくは自然リンパ球系細胞に基づいた療法を使用して処置され得る癌は、あらゆるタイプの腫瘍であり得、固形腫瘍、血液腫瘍、原発腫瘍、続発性腫瘍、進行性腫瘍及び転移を含む。本発明に従って処置又は予防され得る非限定的な腫瘍の例は、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)、リンパ腫、多発性骨髄腫、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、大細胞型免疫芽球性リンパ腫、形質細胞腫、肺腫瘍、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵腫瘍、乳腺腫瘍、肝腫瘍、脳腫瘍、皮膚腫瘍、ユーイング肉腫及び骨肉腫を含む骨腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、肛門腫瘍、小腸腫瘍、胃腫瘍(stomach tumor)、神経膠腫、内分泌系腫瘍、神経芽細胞腫を含む副腎腫瘍、甲状腺腫瘍、食道腫瘍、胃腫瘍(gastric tumor)、子宮腫瘍、尿路腫及び膀胱腫瘍、腎腫瘍、腎細胞癌腫、前立腺腫瘍、胆嚢腫瘍、頭頚部腫瘍、卵巣腫瘍、頸部腫瘍、網膜芽細胞腫を含む眼腫瘍、神経膠芽腫、黒色腫、軟骨肉腫、線維肉腫、子宮内膜、食道、眼若しくは消化管間質腫瘍、脂肪肉腫、上咽頭、甲状腺、膣及び外陰部腫瘍である。

一実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。本発明者らによって、本発明のCAR技術が固形腫瘍の処置に特に適していることが見出された。特に、腫瘍関連マクロファージ(TAM)及び多形核細胞(PMN)等の骨髄細胞は、固形腫瘍によく浸潤することが公知であり、CAR-TAM/PMNは腫瘍微小環境(TME)を抗腫瘍対腫瘍促進に分極させると考えられている。それに加えて、FcαRシグナル伝達は、リガンド結合ドメインが結合した場合に開始され、その結果生来のエフェクターが機能する。よって、ある好ましい実施形態では、癌は、神経芽細胞腫、黒色腫、小細胞肺癌(SCLC)、ユーイング肉腫、骨肉腫、神経膠腫、網膜芽細胞腫、乳癌、膀胱癌、結腸癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肛門癌、及び神経膠芽腫からなる群から選択される。

ある好ましい実施形態では、本発明に従って処置される癌は、神経芽細胞腫である。オランダでは毎年、年齢中位数が3歳のおよそ25～35人の小児が、米国では800人の小児が、神経芽細胞腫と診断されている。これらの診断された小児の約50%が高リスク群に分類され、集中的集学的処置を経る。最近、抗体ベースの抗GD2免疫療法が、特に高リスク神経芽細胞腫患者の全生存を向上させる、神経芽細胞腫の患者のための処置プロトコルに組み込まれた。作用機序として、抗GD2オプソニン化腫瘍細胞が、生来のエフェクター細胞の好中球、マクロファージ及びNK細胞を含む種々のFcγR発現免疫細胞によって媒介されるプロセスである、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を通して殺される。生存率は、処置レジメンに抗GD2抗体を加えることによって有意に向上したが、依然として約50%の患者は疾患を再発し、疾患のために死ぬ。したがって、特にこれらの高リスク神経芽細胞腫患者は、より強力で標的化されたアプローチを必要とし、これは最初はキメラ抗原受容体(CAR)T細胞の養子移入の形で導入された。早期の臨床試験では見込みを示したものの、神経芽細胞腫に対するCAR T細胞活性は、それらの血液系腫瘍における使用の場合ほど強くなかった。特に最適以下のT細胞持続性、能力、及び免疫抑制性の腫瘍微小環境は、神経芽細胞腫に対するCAR T細胞の使用の困難な課題であると考えられていた。好中球、骨髄細胞及びNK細胞は抗GD2処置の成功を駆動する重要なエフェクター細胞であると考えられるので、これらは本発明に従った神経芽細胞腫の処置に特に有用である。

別の好ましい実施形態では、本発明に従って処置される癌は、黒色腫である。

別の好ましい実施形態では、本発明に従って処置される癌は、ユーイング肉腫である。

別の好ましい実施形態では、本発明に従って処置される癌は、乳癌、特にHer2/neu+及び/又はEGFR+乳癌である。

ポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター及び特に本発明のポリペプチド又はCARを発現する細胞は、1つ以上の更なる治療剤又は処置と、有利に組み合わせられる。かかる更なる療法又は治療剤は、当該分野で公知の、あらゆる抗癌又は免疫節剤又は処置であり得る。一実施形態では、CAR、核酸分子、ベクター又は細胞は、治療用抗体、チェックポイント阻害剤、サイトカイン、化学療法剤、又はT細胞ベースの療法と組み合わせられる。好ましい実施形態では、組合わせは、免疫療法剤又は免疫療法、特に治療用抗体、チェックポイント阻害剤、サイトカイン、又はT細胞ベースの療法とである。

チェックポイントの、好ましいが限定的でない例は、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA-4)、プログラム細胞死1(PD-1)、PDリガンド1(PD-L1)、PD-L2、シグナル調節タンパク質α(SIRPα)、CD47、T細胞免疫グロブリン-ムチンドメイン3含有分子3(TIM3)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)、CD276、CD272、A2AR、VISTA及びインドールアミン2,3ジオキシゲナーゼ(IDO)である。本発明のポリペプチド、CAR、又はポリペプチド若しくはCARを発現する細胞と組み合わせられる治療用抗体又はチェックポイント阻害剤は、好ましくは、抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗SIRPα抗体、抗CD47抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗CD276抗体、抗CD272抗体、抗KIR抗体、抗A2AR抗体、抗VISTA抗体、抗TIGIT抗体、抗IDO抗体からなる群から選択される。

本発明のポリペプチド、CAR、又はポリペプチド若しくはCARを発現する細胞と有利に組み合わせられる更なる治療用抗体は、抗GD2抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/Neu抗体、抗CD20抗体、抗CD3抗体、抗TNFα抗体、抗CD147抗体、抗IL8抗体、抗MUC18抗体、抗MUC1、抗α-4-β-1(VLA-4)及びα-4-β-7抗体、抗VLA-1インテグリン抗体、抗リンホトキシンβ受容体(LTBR)抗体、抗TGF-β抗体、抗IL-12 p40抗体、抗VEGF抗体、抗HER受容体ファミリー抗体、抗CD11a抗体、抗IL15抗体、抗CD40L抗体、抗CD80抗体、抗CD23抗体、抗マクロファージ遊走阻止因子(MIF)抗体、抗VEカドヘリン抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗IL15抗体、抗細胞間接着分子1(ICAM-1)(CD54)抗体、抗線維芽細胞増殖因子受容体3(FGFR-3)抗体、抗γインターフェロン抗体、抗IL-12抗体、抗Ep-CAM抗体である。本発明の処置との組合せのために使用される適切な抗体は、ジヌツキシマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ランブロリズマブ、イピリムマブ、リリルマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、ペルツズマブ、パニツムマブ、ネシツムマブ、ベバシズマブ、ラムシルマブ、オララツマブ、アテゾリズマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、デノスマブ、アベルマブ、セミプリマブ、デュルバルマブ、エンホルツマブベドチン、トラスツズマブデルクステカン、サシツズマブゴビテカンである。一部の好ましい実施形態では、治療用抗体は、CARの異種リガンド結合ドメインによって認識される、リガンド又は抗原に特異的な抗体である。他の好ましい実施形態では、治療用抗体は、CARの異種リガンド結合ドメインによって認識されるリガンド又は抗原以外の別のリガンド又は抗原に特異的な抗体である。好ましくは、両方のリガンド及び/又は抗原は、CARに標的とされる、特定の細胞、特に癌又は腫瘍細胞によって発現される。例えば、実施例で証明されるように、抗EGFR抗体は、Her2/Neu-CARと有利に組み合わせられる。

本明細書で使用される場合、用語「化学療法剤」は、癌の化学療法に使用される、細胞傷害剤をいう。本発明のポリペプチド、CAR、又はポリペプチド若しくはCARを発現する細胞と有利に組み合わせられる化学療法剤の非限定的な例としては、アルキル化剤、例えばシクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ダカルバジン、ニトロソウレア及びテモゾロミド、アントラサイクリン、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン及びバルルビシン、細胞骨格崩壊剤、例えばドセタキセル、パクリタキセル、アブラキサン及びタキソテール、トポイソメラーゼ1阻害剤、例えばイリノテカン及びトポテカン、トポイソメラーゼH阻害剤、例えばエトポシド、テニポシド及びタフルポシド、キナーゼ阻害剤、例えばボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ及びビスモデギブ、ヌクレオチドアナログ、例えばアザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メルカプトプリン、メトトレキサート及びチオグアニン、白金系薬剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチン、並びにビンカアルカロイド誘導体、例えばビンカブラスチン及びビンクリスチンが挙げられる。

本発明のポリペプチド、CAR、又はポリペプチド若しくはCARを発現する細胞と有利に組み合わせられるサイトカインの非限定的な例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン(IL)-2、IL-3、IL-4、及びIL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-γ、IFN-κ、IFN-λ、IFN-τ及びIFN-ω等のインターフェロン、腫瘍壊死因子α(TNFα)、G-CSFが挙げられる。

実施例で証明されるように(図5を参照のこと)、本発明のGD2、EGFR又はHer2/neu-FcαR CARを発現する好中球様細胞は、驚くべきことに、処置が、標的細胞によって発現されるそれぞれの腫瘍抗原又は別の抗原を標的とする抗体と組み合わせられた場合に、それぞれGD2+、EGFR+及びHer2/neu+標的細胞に対する細胞傷害性の増大を示す。よって、好ましい実施形態では、特に癌の処置を含む免疫療法において、本発明の細胞又は細胞の集団は、抗腫瘍抗原抗体と組み合わせられる。一部の好ましい実施形態では、かかる抗腫瘍抗原抗体は、CARの異種リガンド結合ドメインによって認識される、リガンド又は抗原、特に腫瘍抗原に特異的な抗体である。他の好ましい実施形態では、治療用抗体は、CARの異種リガンド結合ドメインによって認識されるリガンド又は抗原以外の別のリガンド又は抗原に特異的な抗体である。好ましくは、両方のリガンド及び/又は抗原は、CARに標的とされる、特定の細胞、特に癌又は腫瘍細胞によって発現される。例えば、実施例で証明されるように、抗EGFR抗体は、Her2/Neu-CARと有利に組み合わせられる。

本発明の、ポリペプチド、CAR、核酸分子、ベクター、及び特にポリペプチド又はCARを発現する細胞もまた、病原体感染の処置において有利に使用される。本明細書で使用される場合、「病原抗原」は、微生物又は寄生生物によって発現されるあらゆる抗原をいい、限定されないが、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌及び寄生生物を含む。本発明に従って処置され得る病原性細菌の例としては、限定されないが、リステリア属、大腸菌属、クラミジア属、リケッチア属、マイコバクテリウム属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、肺炎球菌属、髄膜炎菌、クレブシエラ属、シュードモナス属、レジオネラ属、ジフテリア菌、サルモネラ属、ビブリオ属、クロストリジウム属、バチルス属、エルシニア属、及びレプトスピラ属の細菌が挙げられる。本発明に従って処置され得る病原性ウイルスの例としては、限定されないが、A、B又はC型肝炎、ヘルペスウイルス(例えばVZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、CMV、エプスタイン・バーウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合抱体ウイルス(RSV)、ロタウイルス、モルビリウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、HTLVウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス及びヒト免疫不全ウイルス(HIVウイルス、例えばI型及びII型)が挙げられる。本発明に従って処置され得る病原性真菌の例としては、限定されないが、カンジダ(例えば、アルビカンス(albicans)、クルセイ(krusei)、グラブラタ(glabrata)、トロピカリス(tropicalis))、アスペルギルス(例えば、フミガーツス(fumigatus)、ニガー(niger)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、ケカビ目、ブラストミセス・デルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)、南アメリカ分芽菌(Paracoccidioides brasiliensis)、及びコクシジオイデス・イミチス(Coccidiodes immitis)が挙げられる。本発明に従って処置され得る病原性寄生生物の例としては、限定されないが、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、マラリア原虫属(例えば、熱帯マラリア原虫(falciparum)、3日熱マラリア原虫(vivax))、エントアメーバ属、ジアルジア属、大腸バランチジウム(Balantidium coli)、アカントアメーバ属、クリプトスポリジウム属、ニューモシスチス・カリニ(Pneumocystis carinii)、ネズミバベシア(Babesia microti)、トリパノソーマ属(例えば、ブルーセイ(brucei)、クルージ(cruzi))、リーシュマニア属(例えば、ドノバンリーシュマニア(donovani))、及びトキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii)が挙げられる。

一実施形態では、核酸分子、ベクター又は細胞は、ワクチンに含まれるか、又はワクチンと組み合わせて使用される。したがって、それを必要とする対象において免疫応答を誘導又は刺激するための方法における使用のための、本発明の核酸分子、ベクター又は細胞を含むワクチンが提供される。方法は、対象にワクチンを投与する工程を含む。したがって、それを必要とする対象における病原体感染の処置又は予防のための方法における使用のための、本発明の核酸分子、ベクター又は細胞を含むワクチンもまた提供される。方法は、対象にワクチンを投与する工程を含む。本発明のワクチンは、好ましくは、薬学的に許容される担体又は賦形剤及び1つ以上のアジュバント等の、更なる構成要素を含む。

一部の実施形態では、核酸分子、ベクター又は細胞は、非FcαR細胞内及び膜貫通ドメインを含む別のCAR、好ましくはFcγR細胞内及び/若しくは膜貫通ドメイン、より好ましくはFcγR細胞内及び膜貫通ドメインの両方を有するCARに含まれるか、又はこれと組み合わせて使用される。かかるFcγR-CARの細胞外リガンド結合ドメイン及び本発明のFcαR-CARの異種リガンド結合ドメインは、同じでも異なってもよい。一部の好ましい実施形態では、FcγR-CARは、本発明のFcα-CARの異種リガンド結合ドメインによって認識される同じリガンド又は抗原を認識する細胞外リガンド結合ドメインを含む。更に好ましい実施形態では、本発明のFcαR-CARの異種リガンド結合ドメインによって認識される同じリガンド又は抗原を認識する細胞外リガンド結合ドメインは、同じリガンド結合ドメインを含むか、又は同じリガンド結合ドメインからなる。他の好ましい実施形態では、治療用抗体は、CARの異種リガンド結合ドメインによって認識されるリガンド又は抗原以外の別のリガンド又は抗原に特異的な抗体である。好ましくは、両方のリガンド及び/又は抗原は、CARに標的とされる、特定の細胞、特に癌又は腫瘍細胞によって発現される。例えば、実施例で証明されるように、抗EGFR抗体は、Her2/Neu-CARと有利に組み合わせられる。

- 本発明の核酸分子又はベクターを、細胞又は細胞の集団の細胞に導入する工程、及び
- 本発明のポリペプチド又はCARを発現させる工程
を含む、本発明の細胞又は本発明の細胞の集団を生成する方法もまた提供される。

前記細胞は、好ましくは骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、造血幹細胞又は自然リンパ球系細胞、より好ましくはヒト骨髄細胞若しくは骨髄系前駆細胞、造血幹細胞又は自然リンパ球系細胞である。前記細胞は、好ましくは、顆粒球、好中球、単球、マクロファージ、NK細胞及びそれらの組合せから選択される。前記細胞は、更に好ましくは、初代細胞、より好ましくは本発明に従って処置される対象から単離された自家細胞である。別の実施形態では、細胞は、NK-92細胞系等の細胞系由来の細胞である。

特徴は、明確さ及び簡潔な説明のために、本発明の同じ若しくは別の態様又は実施形態の一部として、本明細書に記載され得る。本発明の範囲が、同じ又は別の実施形態の一部として、本明細書に記載されている特徴の全て又は一部の組合せを有する実施形態を含み得ることが、当業者に認識されるであろう。

本発明は、下記の非限定的な実施例において、より詳細に説明される。

Fcα受容体(UniProt P24071-1)のアミノ酸配列を示す図である。 GD2-CAR設計を示す図である。 例示的なCARの配列を示す図である。 NB4細胞中のGD2-FcαR-CARの発現を示す図である。全トランス型レチノイン酸(「atra」と示される)での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞に分化させた。GD2-Fcα-CARの発現をフローサイトメトリーによって定量化した;n=4。 NB4細胞中のGD2-FcαR-CARの発現を示す図である。全トランス型レチノイン酸(「atra」と示される)での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞に分化させた。GD2-Fcα-CARの発現を、ウエスタンブロットによって更に解析した。 NB4細胞中のGD2-FcαR-CARの発現を示す図である。全トランス型レチノイン酸(「atra」と示される)での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。一次抗体BiotinSP AffiniPure f(ab)2(Jackson ImmunoResearch社)及び二次抗体ストレプトアビジンAlexa Flour 647(Thermo Fisher Scientific社)を使用して、細胞を染色した。赤色の矢印は、予想される分子量でのCARを示す。下部の緑色の断片は、ローディング対照を示す。 親細胞及びFcαR-CAR発現NB4細胞による、GD2陽性神経芽細胞腫細胞系LAN-1、NMB及びIMR-32の細胞傷害性を示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。腫瘍細胞を収集し、51クロムで標識し、その後NB4細胞及び腫瘍細胞を、1:50の標的:エフェクター比で、37度で4時間、共にインキュベートした。腫瘍細胞は未処置のままにするか[-]、又は抗GD2抗体ジヌツキシマブ[Dimab]でオプソニン化するかのいずれかであった。腫瘍細胞からの51クロムの自発的及び最大放出と比較し、[(実験値-自発的放出)/(最大放出-自発的値)*100%]として計算した、細胞傷害性を決定した。有意性をAnovaによって試験した;p<0.05は統計的に有意とした。*=p<0.05;**=p<0.01;ns=有意でない。 GD2+、EGFR+及びHer2/neu+標的細胞に対する、腫瘍抗原標的化抗体と組み合わせたFcαR CAR NB4細胞の細胞傷害性の増大を示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。腫瘍細胞NMB、LAN-1、IMR-32、TC-71、A431及びA431 Her2/neuを収集し、⁵¹クロムで標識し、その後NB4細胞及び腫瘍細胞を、いくつかの標的:エフェクター比、即ち1:25、1:50、1:100及び1:200で、37度で4時間、共にインキュベートした。腫瘍細胞は未処置のままにするか[-]、又は抗GD2抗体ジヌツキシマブ[Dimab]若しくは抗EGFR抗体セツキシマブ[Cmab]でオプソニン化するかのいずれかであった。細胞傷害性を腫瘍細胞からの51クロムの自発的及び最大放出と比較し、[(実験値-自発的放出)/(最大放出-自発的値)*100%]として計算した。有意性をAnovaによって試験した;p<0.05は統計的に有意とした。*=p<0.05;**=p<0.01;ns=有意でない。 NB4細胞の分化、ROS生成及び接着を示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。フローサイトメトリーによっていくつかの表面マーカーを染色することによって、分化のレベルを解析した;左のパネルは陽性細胞のパーセンテージ、右のパネルはMFI、n=4。 NB4細胞の分化、ROS生成及び接着を示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。プレートリーダーでのAmplex Redアッセイによって測定される、NB4細胞によって放出された過酸化水素の量によって、種々の刺激の使用の際のROS生成を定量化した。 NB4細胞の分化、ROS生成及び接着を示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。いくつかの刺激の際の96ウェルプレートに接着しているカルセイン標識細胞の量によって、CD18機能の尺度としての、NB4細胞がプレートに接着する能力を測定し、プレートリーダーで検出した;n=3。NB4細胞の溶解を100%対照に加えて、カルセインによるNB4細胞の標識効率を制御した;n=3。 GD2-CARは抗原依存的であることを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。フローサイトメトリーによって、LAN-1標的細胞におけるGD2及びGD2 KOの発現を定量化した;n=1。 GD2-CARは抗原依存的であることを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。腫瘍細胞(LAN-1 WT及びGD2 KO)を収集し、51クロムで標識し、その後GD2-FcαR CAR NB4細胞及び腫瘍細胞を、いくつかの標的:エフェクター比、即ち1:25、1:50、1:100及び1:200で、37度で4時間、共にインキュベートした。細胞傷害性を腫瘍細胞からの⁵¹クロムの自発的及び最大放出と比較し、[(実験値-自発的放出)/(最大放出-自発的値)*100%]として計算した。N=4の独立した実験。 GD2-CARは抗原依存的であることを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。NB4細胞による腫瘍細胞トロゴサイトーシスを、フローサイトメトリーによる膜取り込みの定量化によって試験した。LAN WT又はGD2 KO細胞を膜色素DiDで染色し、WT NB4細胞又はGD2-FcαR CAR NB4細胞と共に37度で90分間インキュベートした。コインキュベーションの後、細胞を固定し、Cantoフローサイトメーターで測定した。N=3の独立した実験。有意性をAnovaによって試験した;p<0.05は統計的に有意とした。*=p<0.05;**=p<0.01;ns=有意でない。 GD2-FcαR CARの機能性はFcαR細胞質尾部の発現に依存することを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。NB4細胞におけるGD2-FcαR(赤色のバー)及びGD2-FcαR Δcyt. CAR(青色のバー)の発現を、フローサイトメトリーによって定量化した。細胞を、そのために一次抗体BiotinSP AffiniPure F(ab')₂(Jackson ImmunoResearch社)及びストレプトアビジンAlexa Flour 647(Life Technologies社)で染色した。N=2の独立した実験。 GD2-FcαR CARの機能性はFcαR細胞質尾部の発現に依存することを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。腫瘍細胞(LAN-1 WT)を収集し、⁵¹クロムで標識し、その後GD2-FcαR(赤色のバー)及びGD2-FcαR Δcyt. CAR(青色のバー)NB4細胞及び腫瘍細胞を、いくつかの標的:エフェクター比、即ち1:25、1:50、1:100及び1:200で、37度で4時間、共にインキュベートした。細胞傷害性を腫瘍細胞からの51クロムの自発的及び最大放出と比較し、[(実験値-自発的放出)/(最大放出-自発的値)*100%]として計算した。N=8の独立した実験。有意性をAnovaによって試験した;p<0.05は統計的に有意とした。*=p<0.05;**=p<0.01;ns=有意でない。 FcαR CARがEGFR腫瘍抗原に対して有効であることを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。フローサイトメトリーによって、NB4細胞におけるEGFR-FcαRの発現を定量化した。細胞を、そのために一次抗体BiotinSP AffiniPure F(ab')₂(Jackson ImmunoResearch社)及びストレプトアビジンAlexa Flour 647(Life Technologies社)で染色した。WT NB4を対照として染色した。染色のヒストグラムを左に示す;2つの独立した実験の定量化を右に示す。 FcαR CARがEGFR腫瘍抗原に対して有効であることを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。腫瘍細胞(A431)を収集し、⁵¹クロムで標識し、その後WT NB4細胞(灰色のバー)及びEGFR-FcαR(赤色のバー)NB4細胞及び腫瘍細胞を、いくつかの標的:エフェクター比で、即ち1:25、1:50、1:100及び1:200で、37度で4時間、共にインキュベートした。標的細胞は、オプソニン化しないままでもよく、抗EGFR抗体セツキシマブでオプソニン化してもよかった(Cmab、1μg/ml)。細胞傷害性を腫瘍細胞からの⁵¹クロムの自発的及び最大放出と比較し、[(実験値-自発的放出)/(最大放出-自発的値)*100%]として計算した。N=4の独立した実験。 FcαR CARがEGFR腫瘍抗原に対して有効であることを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。NB4細胞による腫瘍細胞トロゴサイトーシスを、フローサイトメトリーによる膜取り込みの定量化によって試験した。A431細胞を膜色素DiDで染色し、WT NB4細胞(灰色のバー)又はEGFR-FcαR CAR NB4細胞(赤色のバー)と共に37度で90分間インキュベートした。標的細胞は、オプソニン化しないままでもよく、抗EGFR抗体セツキシマブでオプソニン化してもよかった(1μg/ml)。コインキュベーションの後、細胞を固定し、Cantoフローサイトメーターで測定した。N=9の独立した実験。有意性をAnovaによって試験した;p<0.05は統計的に有意とした。*=p<0.05;**=p<0.01;ns=有意でない。 FcαR CARがHer2/neu腫瘍抗原に対して有効であることを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。フローサイトメトリーによって、NB4細胞におけるHer2/neu-FcαRの発現を定量化した。細胞を、そのために一次抗体BiotinSP AffiniPure F(ab')₂(Jackson ImmunoResearch社)及びストレプトアビジンAlexa Flour 647(Life Technologies社)で染色した。WT NB4を対照として染色した。染色のヒストグラムを左に示す;2つの独立した実験の定量化を右に示す。 FcαR CARがHer2/neu腫瘍抗原に対して有効であることを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。腫瘍細胞(SKBR3)を収集し、⁵¹クロムで標識し、その後WT NB4細胞(灰色のバー)及びHer2/neu-FcαR(赤色のバー)NB4細胞及び腫瘍細胞を、いくつかの標的:エフェクター比で、即ち1:25、1:50、1:100及び1:200で、37度で4時間、共にインキュベートした。標的細胞は、オプソニン化しないままでもよく、抗Her2/neu抗体トラスツズマブでオプソニン化してもよかった(Tmab、1μg/ml)。細胞傷害性を腫瘍細胞からの⁵¹クロムの自発的及び最大放出と比較し、[(実験値-自発的放出)/(最大放出-自発的値)*100%]として計算した。N=6の独立した実験。 FcαR CARがHer2/neu腫瘍抗原に対して有効であることを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。NB4細胞による腫瘍細胞トロゴサイトーシスを、フローサイトメトリーによる膜取り込みの定量化によって試験した。SKBR3細胞を膜色素DiDで染色し、WT NB4細胞(灰色のバー)又はHer2/neu-FcαR CAR NB4細胞(赤色のバー)と共に37度で90分間インキュベートした。標的細胞は、オプソニン化しないままでもよく、抗Her2/neu抗体トラスツズマブでオプソニン化してもよかった(1μg/ml)。コインキュベーションの後、細胞を固定し、Cantoフローサイトメーターで測定した。N=10の独立した実験。有意性をAnovaによって試験した;p<0.05は統計的に有意とした。*=p<0.05;**=p<0.01;ns=有意でない。 GD2-FcαR CARがGD2-FcγR CARより優れていることを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。フローサイトメトリーによって、NB4細胞におけるGD2-FcαR CAR及びGD2-FcγRIIA CARの発現を定量化した。細胞を、そのために一次抗体BiotinSP AffiniPure F(ab')₂(Jackson ImmunoResearch社)及びストレプトアビジンAlexa Flour 647(Life Technologies社)で染色した。WT NB4を対照として染色した。 GD2-FcαR CARがGD2-FcγR CARより優れていることを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。腫瘍細胞(LAN-1)を収集し、⁵¹クロムで標識し、その後GD2-FcαR NB4細胞(赤色のバー)及びGD2-FcγR CAR(灰色のバー)NB4細胞及び腫瘍細胞を、いくつかの標的:エフェクター比で、即ち1:25、1:50、1:100及び1:200で、37度で4時間、共にインキュベートした。細胞傷害性を腫瘍細胞からの⁵¹クロムの自発的及び最大放出と比較し、[(実験値-自発的放出)/(最大放出-自発的値)*100%]として計算した。N=4の独立した実験。有意性をAnovaによって試験した;p<0.05は統計的に有意とした。*=p<0.05;**=p<0.01;ns=有意でない。 GD2-FcαR CAR及びGD2-FcγR CARの二重の発現によってGD2+腫瘍に対する細胞傷害性が促進されることを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。フローサイトメトリーによって解析された、NB4細胞における二重のCAR構築物の発現。N-2の独立した実験。 GD2-FcαR CAR及びGD2-FcγR CARの二重の発現によってGD2+腫瘍に対する細胞傷害性が促進されることを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。細胞傷害性アッセイ: 腫瘍細胞を収集し、⁵¹クロムで標識し、その後NB4細胞及び腫瘍細胞を、いくつかの標的:エフェクター比で、即ち1:25、1:50、1:100及び1:200で、37度で4時間、共にインキュベートした。腫瘍細胞は、未処置のままにするか[-]、又は抗GD2抗体ジヌツキシマブ[Dimab]でオプソニン化するかのいずれかであった。細胞傷害性を腫瘍細胞からの⁵¹クロムの自発的及び最大放出と比較し、[(実験値-自発的放出)/(最大放出-自発的値)*100%]として計算した。N=6の独立した実験。有意性をAnovaによって試験した;p<0.05は統計的に有意とした。*=p<0.05;**=p<0.01;ns=有意でない。 FcαR CARが、mAbによるFcγR活性化と比較して、更なるβ2-インテグリン活性化をもたらすことを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。細胞傷害性アッセイ: 腫瘍細胞を収集し、⁵¹クロムで標識し、その後WT NB4細胞及び腫瘍細胞を、いくつかの標的:エフェクター比で、即ち1:25、1:50、1:100及び1:200で、37度で4時間、共にインキュベートした。腫瘍細胞は、未処置のままにするか[-]、又は抗GD2抗体ジヌツキシマブ[Dimab]でオプソニン化するかのいずれかであった。飽和量の抗CD11b(44A、10μg/ml)によって、CD11bをブロックした;飽和量の抗CD18抗体(IB4、10μg/ml)によって、CD18をブロックした。腫瘍細胞からの⁵¹クロムの自発的及び最大放出と比較し、[(実験値-自発的放出)/(最大放出-自発的値)*100%]として計算した、細胞傷害性を決定した。N=3の独立した実験。有意性をAnovaによって試験した;p<0.05は統計的に有意とした。*=p<0.05;**=p<0.01;ns=有意でない。 FcαR CARが、mAbによるFcγR活性化と比較して、更なるβ2-インテグリン活性化をもたらすことを示す図である。全トランス型レチノイン酸での7日間の刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。細胞傷害性アッセイ: 腫瘍細胞を収集し、⁵¹クロムで標識し、その後GD2-FcαR CAR NB4細胞及び腫瘍細胞を、いくつかの標的:エフェクター比で、即ち1:25、1:50、1:100及び1:200で、37度で4時間、共にインキュベートした。腫瘍細胞は、未処置のままにするか[-]、又は抗GD2抗体ジヌツキシマブ[Dimab]でオプソニン化するかのいずれかであった。飽和量の抗CD11b(44A、10μg/ml)によって、CD11bをブロックした;飽和量の抗CD18抗体(IB4、10μg/ml)によって、CD18をブロックした。腫瘍細胞からの⁵¹クロムの自発的及び最大放出と比較し、[(実験値-自発的放出)/(最大放出-自発的値)*100%]として計算した、細胞傷害性を決定した。N=3の独立した実験。有意性をAnovaによって試験した;p<0.05は統計的に有意とした。*=p<0.05;**=p<0.01;ns=有意でない。 NK-92細胞においてGD2-FcαR CARが発現されることを示す図である。NK-92細胞に、レンチウイルスにより形質導入して、GD2-FcαR CARを発現させた。フローサイトメトリーによって発現を解析した。細胞を、そのために一次抗体BiotinSP AffiniPure F(ab')₂(Jackson ImmunoResearch社)及びストレプトアビジンAlexa Flour 647(Life Technologies社)で染色した。

材料及び方法
細胞、培養物、及び抗体
20%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン(Sigma Aldrich社、100U/mL)、ストレプトマイシン(Sigma Aldrich社、100μg/mL)、及びι-グルタミン(Sigma Aldrich社、2mM)を補充したIMDM培地(Thermo Fisher Scientific社)中で、NB4、NK-92、神経芽細胞腫細胞系LAN-1、IMR-32、NMB、ユーイング肉腫細胞系TC-71、及び乳癌細胞系SKBR3(ATCC)を培養し、5% CO2中、37℃で培養した。NK-92細胞の培地にIL-2(PeproTech社、100単位/mL)を補充した。10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン(Sigma Aldrich社、100U/mL)、ストレプトマイシン(Sigma Aldrich社、100μg/mL)、及びι-グルタミン(Sigma Aldrich社、2mM)を補充したRPMI培地(Thermo Fisher Scientific社)中で、類表皮癌腫細胞系A431(ATCC)を培養し、5% CO2中、37℃で培養した。全トランス型レチノイン酸(ATRA)(Sigma Aldrich社、5μmol ATRA/Lを有する細胞0.5*10⁶個/mL)によって、7日間でNB4細胞を好中球様細胞へと分化させた。レンチウイルス形質導入によって、Her2/neuを過剰発現しているA431細胞を生じた。簡潔に述べると、Her2/neuコード配列をThermo Fisher Scientific社に注文し、pENTR1Aにクローニングした。レンチウイルスベクターpRRL PPT SFFV prester SIN-Gateway Bでの組換えの後、レンチウイルス構築物pSin-Her2/neuを作出し、これをA431細胞の形質導入に使用した。Her2/neuを発現している細胞を、細胞選別によって選択した。A431細胞を、10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン(Sigma Aldrich社、100U/mL)、ストレプトマイシン(Sigma Aldrich社、100μg/mL)、及びι-グルタミン(Sigma Aldrich社、2mM)を補充したRPMI培地(Thermo Fisher Scientific社)中の培養物で維持し、5%CO2中、37℃で培養した。WT NB4細胞でのGD2-CAR発現のために、抗GD2抗体ジヌツキシマブの重鎖及び軽鎖可変(scFv)のコード配列を、リンカーを介して結合させ、FcαRの細胞内部分の細胞内尾部に結合させた(図式的概観については図2A、配列の詳細については図2Bを参照のこと)。GD2-CARについて上述したように、WT NB4細胞でのHer2/neu-CAR発現のために、抗Her2/neu抗体トラスツズマブのscFvのコード配列を、FcαRの細胞内部分の細胞内尾部に結合させた。GD2-CARについて上述したように、NB4細胞でのEGFR-CAR発現のために、抗EGFR抗体セツキシマブのscFvのコード配列を、FcαRの細胞内部分の細胞内尾部に結合させた。

CAR構築物
合成配列を、Thermo Fisher Scientific社に注文した。配列は、会社ウェブサイトによって提供されているコドン最適化サービスを使用して、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化された。

まず、FcαR(膜貫通及び細胞内)を、pENTR1AのEcoRI-EcoRV部位にクローニングし、Bsp119I制限酵素部位もまた、導入した。アガロースゲル上での制限酵素解析によって、正しいクローニングをチェックした。次に、それぞれがヒトIgG1のCH2CH3ドメイン(ヒンジ)を有するGD2-CAR-リンカー、Her2/neu-CAR-リンカー、又はEGFR-CAR-リンカー断片を、pENTR1A-FcαR(膜貫通及び細胞内)のSalI-Bsp119I部位にクローニングし、アガロースゲル上での制限酵素解析によって、正しいクローニングをチェックした。構築物pENTR1A-GD2-CAR-リンカー-ヒンジ-FcαR(膜貫通及び細胞内)構築物を使用して、Bsp119I-EcoRV断片を交換することによってFcαR(膜貫通)又はFcγRIIa(膜貫通及び細胞内)のいずれかとのGD2-CAR融合体を生じた。IRES GFP構築物を生じるために、まずLZRS mcs IRES GFPのIRES GFP配列(5'SnaBI制限酵素部位も含む)を、pENTR1AのEcoRI-NotI部位にクローニングした。その後の全てのCAR-IRES GFP構築物のクローニングは、EcoRV制限酵素部位の代わりにSnaBI制限酵素部位が使用された点を除いて、IRES GFPなしの構築物について記載されているものと同様であった。これらのプライマー:
GD2 CARのVL領域でアニーリングしている、フォワード:5'aatagctggaccgaccagg3'
Bsp119I制限酵素部位が太字、AgeI制限酵素部位がイタリック体、V5配列(ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている)が下線、ヒンジでアニーリングしている配列が太字且つ下線である、リバース:

を使用して、ヒンジのPCR増幅によって、V5タグをpENTR1A-GD2-CAR-リンカー-ヒンジ-FcαR(膜貫通及び細胞内)IRES GFPに導入した。

pENTR1A-GD2-CAR-リンカーヒンジ-FcαR(膜貫通及び細胞内)IRES GFPでこれらのプライマーを使用したPCRによって、GD2-CAR VLの一部、内部SmaI制限酵素部位、ヒンジ、V5タグ及びBsp119I制限酵素部位を含む断片を生じた。このSmaI-Bsp119I断片を、pENTR1A-GD2-CAR-リンカー-ヒンジ-FcγRIIa(膜貫通及び細胞内)IRES GFPのSmaI-Bsp119I部位にクローニングし、それによって元のヒンジを、V5タグを含むヒンジと置換した。アガロースゲル上での制限酵素解析、及び配列決定によって、正しいクローニングをチェックした。

IVS IRES CherryでのV5タグ構築物の付加によって、二重のCAR構築物を生じた。まず、これらのプライマー:
太字のEcoRI制限酵素部位を有する、フォワード:

イタリック体のAgeI制限酵素部位(IVS=mRNAの安定性を増大させることが公知である合成イントロン、Clontech社のマニュアルに従う)を有するリバース:

を使用して、pIRESPuro2(Clontech社)のIVS IRES配列をPCR増幅した。

消化及びゲル精製の後、pmCherry-N1(Clontech社)のEcoRI-AgeI部位にPCR産物をクローニングした。アガロースゲル上での制限酵素解析、及び配列決定によって、正しいクローニングをチェックした。次に、オリゴ5' aattccggatatccgg3'を使用して、EcoRV制限酵素部位を、pmCherry-N1-IVS IRESのEcoRI部位に導入した。この断片は、アニーリングの後、EcoRIオーバーハングを有するdsDNA断片を生じる。アガロースゲル上での制限酵素解析によって、正しいクローニングをチェックした。次に、IVS IRES Cherryを含むEcoRV-NotI断片を、pENTR1A-GD2-CAR-リンカー-ヒンジ-V5-FcγRIIa(膜貫通及び細胞内)IRES GFPのSnaBI-NotI部位にクローニングし、それによってIRES GFPをIVS IRES Cherryと置換した。アガロースゲル上での制限酵素解析によって、正しいクローニングをチェックした。

得られた構築物pENTR1A-GD2-CAR-リンカー-FcαR(膜貫通及び細胞内)全ての最終的なpENTR1A構築物を、その後pRRL PPT SFFV prester SIN-Gateway Bで組み換えた。

クローニング消化のために、およそ1μgのプラスミドを、1x Fast Digestバッファー中、37℃で20分以上にわたってFastDigest酵素(Thermo Fisher Scientific社)で消化した。消化物を1%アガロース上で泳動した;正しい断片を清浄な外科用ブレードで切り出し、QiaQuickゲル抽出キット(Biorad社)を使用して精製した;最終工程として、H₂O中でDNAを溶出させた。

ライゲーションのために、ベクター及びインサートを、1x Rapid Ligation Buffer(Thermo Fisher Scientific社)中、室温で10分以上にわたってRapid T4リガーゼと共にインキュベートした。Gateway組換えのために、約150ngのpRRL PPT SFFV prester SIN-Gateway B及び約100ngのpENTR1A構築物をTris-EDTA(TE)バッファー(pH8,0)に加え、その後LR Clonase II(Thermo Fisher Scientific社)を加え、反応物を穏やかに混合した後、25℃で一晩インキュベートした。

大腸菌(E.coli)DH5αの形質転換のために、ライゲーション産物をDH5αに加え、氷上で8分間インキュベートし、その後42℃で45秒間ヒートショックを与えた。次いで、反応物を氷上で2分間インキュベートし、その後溶原培地(LB)を加え、37℃且つ200rpmで約30～60分間インキュベートし、その後反応物全体を、30μg/mlカナマイシン(pENTR1A構築物について)又は100μg/mlアンピシリン(pRRL PPT SFFV構築物について)を含むLBアガーにプレーティングし、プレートを37℃で一晩インキュベートした。

単一のコロニーを選び、使用して、LB+30μg/mlカナマイシン又は100μg/mlアンピシリンに植え付け、37℃且つ200rpmで一晩増殖させた。翌日、一晩培養物を使用し、NucleoSpin Plasmid EasyPureキット(Bioke社)を使用してミニプレップDNAを単離した。ミニプレップをチェックするために、ミニプレップDNAを、1x FastDigestバッファー中、37℃で20分以上にわたって、FastDigest酵素で消化し、消化物を1%アガロースゲル上で泳動した。NucleoBond Xtra Maxiキット(Bioke)を使用して、一晩培養物にマキシプレップを行った。

マキシプレップをチェックするために、約400ngのマキシプレップDNAを、1x FastDigestバッファー中、37℃で20分以上にわたって、FastDigest酵素で消化し、消化物を1%アガロースゲル上で泳動した。構築物は、更なる配列決定に供さなかった。

HEK293T細胞を使用して、レンチウイルス粒子を生成し、IMDM培地中(上述のような添加剤を含む)でレンチウイルスベクターpMDLgp、pRSCrev及びpCMV-VSVgと同時トランスフェクトした。トランスフェクションの2日後に、レンチウイルス含有上清を、0.45μMフィルターを通して濾過し、NB4細胞に加え、その後細胞をレンチウイルス不含培地中で2日後に受け継がせた。細胞を、アッセイでの使用の前に、BiotinSP AffiniPure F(ab')2(Jackson ImmunoResearch社、1μg/mL)及びストレプトアビジンAlexa Flour 647(Life Technologies社、10μg/mL)の使用を伴うフローサイトメトリーによって、scFv抗GD2抗体発現に関して分類した。

接着
NB4細胞(細胞5*10⁶個/mL)を、カルセイン-AM(Molecular Probes社、1μmol/L)で、37℃で30分間蛍光標識し、アルブミン(Albuman、Sanquin Plasma Products社、200μg/mL)、グルコース(Merck社、1mg/mL)、及びカルシウム(Calbiotech社、カタログ208291、1mol/mL)を含むHEPES⁺(7.7g NaCl(Fagron社)、4,775g HEPES(Sigma Aldrich社)、450mg KCl(Merck社)、250mg MgSO4 (Merck社)、275mg K2HPO4(Merck社)、H2O(Gibco社)、10mol/mL NaOHでpH7.4)中、非コート96ウェルMaxiSorpプレート(Nunc、細胞2*10⁶個/mL)中でインキュベートした。細胞を、異なる刺激:ジチオスレイトール(DTT)(Sigma Aldrich社、10mmol/L)、Pam3Cys(EMN microcollections社、20mg/mL)、C5a(Sigma Aldrich社、10nmol/L)、腫瘍壊死因子α(TNFα)(PeproTech社、10ng/mL)、ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)(Sigma Aldrich社、100ng/mL)、血小板活性化因子(PAF)(Sigma Aldrich社、100nmol/L)、N-ホルミルメチオニン-ロイシル-フェニルアラニン(fMLP)(Sigma Aldrich社、30nmol/L)、又はHEPES⁺培地の存在下で、5%CO2中、37℃で30分間インキュベートした。プレートをPBSで2回洗浄し、細胞を室温で10分間、Triton(Sigma Aldrich社、0.5% X-100)で溶解させた。100%溶解された投入量のカルセイン標識NB4細胞を、対照として使用した。接着を、485nmの励起波長及び535nmの発光波長で、Geniosプレートリーダー(Tecan社)で決定した。

NADPHオキシダーゼ活性
Amplex RedアッセイでROS生成を測定し、刺激後のNB4細胞の細胞外過酸化水素放出を決定した。NB4細胞(細胞1*10⁶個/mL)を、Amplex Red(Molecular Probes社、20mM)及びホースラディッシュペルオキシダーゼ(Sigma Aldrich社、200U/mL)と共に37℃で5分間インキュベートした。細胞を、非オプソニン化ザイモサン(MP Biomedicals社、1mg/mL)、血清処理ザイモサン(STZ)37、PMA(Sigma Aldrich社、100ng/mL)、fMLP(Sigma Aldrich社、30nmol/L)、PAF(Sigma Aldrich社、100nmol/L)/fMLP(Sigma Aldrich社、30nmol/L)、及び陰性対照としてのHEPES⁺で活性化した。蛍光を、Geniosプレートリーダー(Tecan社)で30分間、30秒間隔で測定した。生成されたH₂O₂の濃度を、535nmの励起波長及び595nmの発光波長で、2分間隔での検量線から決定した。結果を、相対的蛍光単位/分の最大の勾配として表わす。

ウエスタンブロット
抗GD2抗体のscFvの発現について、ウエスタンブロットでNB4 GD2-CARを調べた。5*10⁶個のNB4細胞をPBSで洗浄し、50μLのcOmpleteプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Diagnostics社)/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(0.45mol/L)及び50μLの2x試料バッファー(25mL Tris B(Invitrogen社)、20mL 100%グリセリン(Sigma Aldrich社)、5gドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(Serva社)、1.54g DTT(Sigma Aldrich社)、20mgブロモフェノールブルー(Sigma Aldrich社)、1.7mL β-メルカプトエタノール(Bio-Rad社))並びに50mLまでのH2O(Gibco)に、95℃で30分間、10分毎にボルテックスしながら再懸濁した。電気泳動のために、1*10⁶個の細胞を10% SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲルにロードし、80～120ボルトで泳動した。ニトロセルロース膜(GE Healthcare Life Science社)を使用して、タンパク質を0.33アンペアで1時間転写した。5%ウシ胎仔血清(BSA)(Sigma社)/Tris緩衝生理食塩水、0.1% Tween20(TBST)中、室温で1時間、膜をブロック及び染色した。BiotinSP AffiniPure f(ab)2(Jackson ImmunoResearch社、0.1μg/mL、4℃で一晩)を使用してGD2-CARのf(ab)2領域が検出され、Odyssey(LI-COR Biosciences社)解析のためにIRDYE 680ストレプトアビジン(LI-COR社、0.4μg/mL、室温で1時間)が使用された。

フローサイトメトリー
一次抗体BiotinSP AffiniPure f(ab)2抗マウス(Jackson ImmunoResearch社、1μg/mL、4℃で30分間)で抗GD2抗体のscFvの発現を検出し、BD FACSCantoII上で、ストレプトアビジンAlexa Flour 647(Life Technologies社、10μg/mL、4℃で30分間)で可視化した。一次抗体BiotinSP AffiniPure f(ab)2抗ヒト(Jackson ImmunoResearch社、1μg/mL、4℃で30分間)で、抗Her2/neu及び抗EGFR抗体のscFvの発現を検出し、BD FACSCantoII上で、二次抗体ストレプトアビジンAlexa Flour 647(Life Technologies社、10μg/mL、4℃で30分間)可視化した。

分化マーカーCD11b、FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)、FcγRI(CD64)の発現を、全てのADCCアッセイの前にフローサイトメトリーで試験して、NB4細胞の成熟を確実にした。要するに、細胞を、PBS/0.5%ヒト血清アルブミン(HSA)中、氷上で30分間、上述のマーカーに対する蛍光標識された抗体と共にインキュベートした。2回洗浄した後、細胞を100μL PBS/0.5% HSA中で再懸濁し、BD FACSCantoII上で測定した。

細胞傷害性アッセイ
神経芽細胞腫細胞系LAN-1、IMR-32、NMB、ユーイング肉腫細胞系TC-71、乳癌細胞系SKBR3及び類表皮癌腫A431を、標的細胞として使用した。標的細胞系をトリプシン(1%、PBS中)処置によって収集し、その後0,5*10⁶個の細胞を、150μL IMDM/RPMI培地(上述)中、37℃で90分間、50μCi ⁵¹Cr(Perkin-Elmer社、USA)で標識した。示された実験のために、LAN-1、IMR-32、NMB及びTC-71細胞を、IMDM培地(上述)中のジヌツキシマブ(ユニツキシン、ch14.18、United Therapeutics社、1μg/mL)でオプソニン化した。SKBR3細胞を、示されたようにトラスツズマブ(ハーセプチン、Roche社、1μg/mL)でオプソニン化し、A431を、示されたようにセツキシマブ(アービタックス、Merck社、1μg/mL)でオプソニン化した。標的細胞(細胞5*10³個/ウェル)及びエフェクター細胞(細胞2,5*10⁵個/ウェル)(1:50標的細胞:エフェクター細胞(T:E)比、又は図に示される他のT:E比)を、IMDM中(上述)、37℃且つ5% CO₂で4時間、96ウェルU底組織培養プレートでコインキュベーションした。細胞傷害性を、0.1% triton(Sigma Aldrich社、TX-100)による100% ⁵¹Cr放出に対して正規化した。放射能について、MicroBeta²リーダーで30μLの上清を解析した(Perkin Elmer社)。細胞傷害性のパーセンテージを、[(実験値-自発的放出)/(最大放出-自発的値)*100%]として決定した。条件を、2回又は3回繰り返して試験した。

トロゴサイトーシスアッセイ
分化したNB4細胞による標的細胞のトロゴサイトーシスを、フローサイトメトリーを使用して定量化し、NB4細胞による腫瘍細胞膜の取り込みによって測定した。腫瘍細胞を、2μM親油性膜色素DiD(1,1-ジオクタデシル-3,3,3,3-テトラメチルインドジカルボシアニン、Invitrogen社)で染色した。標識の後、標的細胞をPBSで2回洗浄した。細胞を、示されるように、U底96ウェルプレート(Greiner Bio-One社)で、IMDM完全培地中、37℃且つ5%CO₂で60分間、0.5μg/mLジヌツキシマブ、トラスツズマブ又はセツキシマブの非存在下又は存在下で、1:5のT:E比(即ち50.000:250.000個の細胞)でコインキュベーションした。インキュベーションの後、細胞をSTOPbuffer(20mM NaF、0.5% PFA及び1%BSAを含むPBS)で固定し、フローサイトメーターCanto II(BD Biosciences社)を使用して解析した。膜色素DiOの平均蛍光強度(MFI)について、NB4細胞集団を評価した。

データ解析及び統計
FlowJoソフトウェア(Tree Star社、アシュランド、OR、USA)を使用して、フローサイトメトリーデータを解析し、GraphPad Prismバージョン8(GraphPad Software社)を使用して、接着、Amplex Red、NB4細胞分化、フローサイトメトリー、及びADCC結果を可視化した。Prismを使用して、統計解析を行った。接着、Amplex Red及び分化マーカーの発現について、二元配置分散分析試験を使用し、その後Sidak事後検定を使用した。細胞傷害性アッセイについて、一元配置分散分析を使用し、その後Sidak事後検定を使用した。

結果
分化したNB4細胞によってGD2-FcαR-CARが発現される
ATRAでの7日間の刺激によって、NB4を好中球様細胞に分化させ、その後GD2-FcαR-CARの発現を、フローサイトメトリーによって評価した。図3Aは、NB4細胞の80%より多くがGD2 FcαR-CARに陽性であったことを示す。また、GD2-FcαR-CARを発現するよう形質導入されたNB4細胞は、MFIによって決定してWT NB4細胞と比較して、高いCARの発現を示した。ウエスタンブロット(図3B)は、予想される大きさ約83kDaで、CAR構築物を発現するよう形質導入されたATRA分化NB4細胞でのみ、GD2-FcαR-CARの発現を示した。

GD2-FcαR-CAR発現NB4細胞は、GD2+神経芽細胞腫細胞系を殺すことができる
7日間のATRA刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞に分化させ、GD2陽性神経芽細胞腫細胞系に対する細胞傷害性アッセイで使用した。図4に見られるように、GD2-FcαR-CAR構築物を発現しているNB4細胞は、抗GD2オプソニン化を必要とすることなく、GD2+神経芽細胞腫細胞系LAN-1、NMB及びIMR-32を殺すことができた。非オプソニン化条件下で試験された全ての神経芽細胞腫系に対するGD2 FcαR CARの細胞傷害性能力は、ジヌツキシマブオプソニン化神経芽細胞腫細胞に対するWT NB4細胞の殺滅能力と同様であった。非オプソニン化神経芽細胞腫細胞は、WT NB4細胞によって殺されなかった。1:25～1:200のT:E比のタイトレーションから、神経芽細胞腫細胞系LAN-1及びNMBの細胞傷害性に対する濃度依存的効果が明らかになった。更に、GD2-FcαR-CAR発現NB4細胞は、抗GD2抗体ジヌツキシマブでのオプソニン化を必要とすることなく、GD2+神経芽細胞腫細胞系を殺すことができた。WT NB4は、いずれのT:E比でも非オプソニン化神経芽細胞腫細胞系を殺すことができなかった。ジヌツキシマブでの神経芽細胞腫細胞系のオプソニン化は、NB4 WT細胞のT:E比の増大と共に、LAN-1及びNMB細胞に対する細胞傷害性の増大をもたらした。オプソニン化神経芽細胞腫細胞に対するこの濃度依存的細胞傷害性は、標的細胞がGD2-FcαR-CAR発現NB4細胞の存在下で共培養された場合に、更により著しかった(図5)。

GD2-FcαR-CARの発現あり及びなしでのNM4細胞の分化を、7日間のATRA分化の後にフローサイトメトリーによってチェックした。図6Aは、NB4細胞の十分な分化の尺度としての、CD11b及びFc受容体を含むいくつかの膜マーカーの表面発現を示す。WT NB4細胞とGD2-FcαR-CARを発現しているNB4細胞との間に、上述の表面マーカーの発現に総体的な差は検出されず、CARの発現がこれらの細胞の好中球様細胞への分化プロセスを妨げないことが示された。更に、本発明者らは、2つの抗微生物エフェクター機能:ROSを生成する能力、及びCD11b/CD18媒介性接着を評価した。図6B及び図6Cに示されるように、Amplex Redアッセイによって測定されるROS生成、及び接着は共に、WT NB4細胞及びGD2-FcαR-CAR NB4細胞の間で有意に異ならなかった。

まとめると、本発明者らのデータから、GD2-FcαR-CAR発現によってNB4細胞の分化及びエフェクター機能が妨げられないことが示される。更に、NB4細胞で発現されたGD2-FcαR-CARは、抗GD2オプソニン化を必要とすることなく、GD2陽性神経芽細胞腫細胞系の細胞傷害性を誘導する。

いくつかの異なるGD2+、EGFR+及びHer2/neu+標的細胞に対する腫瘍抗原標的化抗体と組み合わせたFcαR CAR NB4細胞の細胞傷害性の増大
図5に示されるNMB及びLAN-1細胞系のデータセットの拡大のように、本発明者らは、標的細胞系の数を増やした。試験されたEGFR+類表皮癌腫、及び全てのGD2+神経芽細胞腫及びユーイング肉腫細胞系について、NB4細胞でのEGFR/GD2-FcαR CARと、それぞれ腫瘍細胞での抗EGFR又は抗GD2オプソニン化抗体との組合せは、最も高いT:E比で(1:200)腫瘍細胞に対する細胞傷害性の量を有意に増大させた(図5)。A431について、EGFR-FcαR CARの殺滅能力は、全てのT:E比について、抗EGFR抗体との組合せの後に増大した。LAN-1の場合、1:200 T:E比の次に、1:100のT:E比もまた、上述のGD2-FcαR CARと抗GD2オプソニン化抗体との組合せの後に、細胞傷害性を有意に増大させた(図5を参照のこと)。GD2+標的細胞の場合は、T:E比が低い程(1:25、1:50)殺滅が増大する傾向が観察されたが、これらの条件は、試験された環境下で有意性に達しなかった。Her2/neu標的化FcαR-CARについて、CAR発現NB4細胞の殺滅能力は、CAR scFv抗原認識部分で使用されたもの以外の腫瘍標的化抗体、この場合は抗EGFR抗体セツキシマブと組み合わせることによって、更に促進され得た(図5を参照のこと)。

GD2-FcαR-CARは抗原特異的である
7日間のATRA刺激によって、NB4細胞を好中球様細胞に分化させ、GD2陽性及びノックアウト神経芽細胞腫細胞系LAN-1に対する細胞傷害性アッセイに使用した(図7Aを参照のこと)。図7Bは、GD2-FcαR-CAR構築物を発現しているNB4細胞は、GD2+神経芽細胞腫細胞系LAN-1を殺すことができたが、GD2KO LAN-1細胞は殺すことができなかったことを示し、GD2-FcαR-CARが抗原特異的であることが示された。トロゴサイトーシスは、最近記載されている、抗体オプソニン化腫瘍細胞に対する好中球のエフェクターメカニズムであり(Matlungら、Cell Rep. 2018;23(13):3946-3959.e6)、GD2-FcαR-CARを使用した細胞傷害性アッセイで観察されたものと同様の抗原特異性及び全体的なパターンを示した(図7C)。

GD2-FcαR CARの機能性は、FcαR細胞質尾部の発現に依存している
親GD2-FcαR-CAR構築物の次に、本発明者らは、FcαRの細胞質ドメインを欠くGD2-FcαR-CAR(GD2-FcαRΔcyt CAR、図8A)を発現させた。7日間のATRA刺激によって、これらのGD2-FcαΔcyt CAR発現NB4細胞を好中球様細胞に分化させ、GD2陽性神経芽細胞腫細胞系LAN-1に対する細胞傷害性アッセイで使用した。図8Aは、これらのGD2-FcαRΔcyt CAR発現NB4細胞の細胞傷害性が、GD2-FcαR CAR NB4細胞によって発揮された殺滅と比較して完全に抑制されていたことを示し、GD2-FcαR CARの機能にFcαR細胞質ドメインが絶対必要であったことが示された。

FcαR CARは、更なる腫瘍抗原に対して効果的である
GD2標的化FcαR CARに加えて、本発明者らは、NB4細胞中に腫瘍抗原EGFR(図9A)及びHer2/neu(図10A)を標的とするFcαR CARを生成した。図9B及び図10Bに見られるように、EGFR及びHer2/neu-FcαR-CAR構築物を発現しているNB4細胞は、抗EGFR及び抗Her2/neuオプソニン化を必要とすることなく、EGFR+及びHer2/neu+類表皮癌腫及び乳癌細胞系A431及びSKBR3を、それぞれ殺すことができた。非オプソニン化条件でのEGFR-FcαR CARの細胞傷害性能力は、セツキシマブオプソニン化A431細胞に対するWT NB4細胞の殺滅能力と同様であり(図9B)、更にトラスツズマブオプソニン化SKBR3細胞の殺滅より優れていた(図10B)。非オプソニン化標的細胞は、いずれのT:E比でもWT NB4細胞によって殺されなかった。トロゴサイトーシスは、EGFR-FcαR-CAR(図9C)及びHer2/neu-FcαR-CAR(図10C)を使用した細胞傷害性アッセイで観察されたものと同様の全体的なパターンを示した。

GD2-FcαR CARはGD2-FcγR CARより優れている
本発明者らは、2つの異なるCAR構築物:FcαR又はFcγRIIAのいずれかの細胞質ドメインで構成されるGD2標的化CAR構築物を、それらの細胞傷害性能力を調べるために、生成した。2つのCAR構築物の発現は、フローサイトメトリーによって検出すると、GD2-FcγRIIA CARについてより高くなければ、同様であった(図11A)。図11Bから明らかに分かるように、NB4細胞中でGD2-FcαR CARによって誘導される細胞傷害性は、全てのT:E比について、NB4細胞中のGD2-FcγRIIA CARより優れている。より具体的には、NB4細胞におけるGD2-FcγRIIA CARの発現は、GD2+標的細胞の殺滅を誘導しなかった。

GD2-FcαR CAR及びGD2-FcγR CARの二重発現は、GD2+腫瘍細胞に対する細胞傷害性を促進する
更に、FcαR及びFcγRのシグナル伝達の間の可能なクロストークを調べるために、本発明者らは、同じNB4細胞培養物中で複数のCARを発現させた。図12Aは、NB4細胞におけるGD2-FcαR CAR及びGD2-FcγRIIA CARの二重発現の成功を示す。更に、本発明者らは、NB4細胞中のGD2-FcγRIIA CARと併せて、短縮されたFcαRの細胞質ドメインを含むGD2-FcαRΔcyt CARを発現させた(図12Aを参照のこと)。

以前に示されたように、NB4細胞におけるGD2-FcγRIIA CAR単独の発現は、GD2+ LAN-1標的細胞の抗体非依存的殺滅を誘導しなかったが、GD2-FcγRIIA CAR発現NB4細胞は、LAN-1細胞がジヌツキシマブでオプソニン化された場合にのみ、それらのエフェクター機能を発揮できた(図12B)。NB4細胞におけるGD2-FcαR CAR及びGD2-FCγRIIA CARの二重発現によって、GD2-FcαR CAR単独と比較して、抗体オプソニン化を必要とすることなく、LAN-1細胞に対する殺滅能力が促進された。抗体オプソニン化の後の、これらの二重GD2-FcαR CAR及びGD2-FcγRIIA CAR発現NB4細胞の殺滅能力の更なる増大は、FcαR CARに加えて、別のFc受容体による同時のシグナル伝達を通して誘導されている可能性が最も高い。短縮されたGD2-FcαR CARの発現によってLAN-1細胞の殺滅がベースラインまで減少して戻ったので、観察された抗体依存的な増大及び抗体非依存的な殺滅は、更に、機能的FcαRシグナル伝達に依存する。

腫瘍抗原オプソニン化抗体との組合せの後のNB4細胞におけるFcαR CARについて観察された殺滅の増大の背後にある作用様式は、FcγR活性化の後の抗体誘導性殺滅と比較して、更なるβ2インテグリンの活性化と関連があるようである。図13A及び図13Bは、CD11b又はCD18のいずれかに対する抗体をブロッキングすることによって、抗GD2及びFcγR誘導性殺滅を完全に阻害し得るが、この細胞傷害性はGD2-FcαR CAR誘導性殺滅の場合は抗CD11b処置の後に減少するが完全には阻害されないことを示す。一方の抗CD18処置は、GD2-FcαR CARによって誘導される抗体依存的及び非依存的殺滅を完全に抑制することができる(図13B)。

GD2-FcαR-CARは、NK-92細胞によって発現される
最後に、NK-92細胞におけるGD2-FcαR-CARの発現を、フローサイトメトリーによって評価した。図14は、GD2-FcαR-CARを発現するよう形質導入されたNK-92細胞が、MFIで決定すると、WT NK-92細胞と比較して、高いCARの発現を示したことを示す(図14)。

［参考文献］

Claims (25)

1. - Fcα受容体(FcαR)の細胞内ドメイン
   - FcαRの膜貫通ドメイン、及び
   - 異種リガンド結合ドメイン
   を含むポリペプチドを含むキメラ抗原受容体(CAR)を含む、好中球又はNK細胞。
2. ポリペプチドが、FcαRの膜貫通ドメインとリガンド結合ドメインとの間に位置するスペーサーを更に含む、請求項1に記載の好中球又はNK細胞。
3. リガンド結合ドメインが、腫瘍抗原又は骨髄系由来サプレッサー細胞抗原に特異的なドメイン等の、細胞表面抗原に特異的なドメインである、請求項1又は2に記載の好中球又はNK細胞。
4. リガンド結合ドメインが、抗体若しくはその抗原結合部分、そのナノボディ若しくはその抗原結合断片、又はアフィマーを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の好中球又はNK細胞。
5. リガンド結合ドメインが、GD2、EGFR又はHER2/Neuに特異的である、請求項1から4のいずれか一項に記載の好中球又はNK細胞。
6. ポリペプチドが、図1に示されるFcαRのアミノ酸配列のアミノ酸228～287を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の好中球又はNK細胞。
7. 請求項1から6のいずれか一項に規定のCARをコードする核酸分子を備えた、好中球又はNK細胞。
8. 核酸分子を含むベクターを備えた、請求項7に記載の好中球又はNK細胞。
9. 核酸分子又はベクターが前記好中球又はNK細胞に導入されている、請求項7又は8に記載の好中球又はNK細胞。
10. 前記細胞が、癌を患っている患者から単離された自家細胞である、請求項1から9のいずれか一項に記載の細胞。
11. 請求項1から6のいずれか一項に規定のCARを発現する、請求項1から10のいずれか一項に記載の細胞。
12. 請求項1から11のいずれか一項に記載の複数の細胞を含む、細胞の集団。
13. 請求項1から12のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団、及び少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物。
14. 療法、好ましくは免疫療法における使用のための、請求項1から12のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団。
15. 免疫応答の誘導又は刺激における使用のための、請求項1から12のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団。
16. 対象において癌を処置する方法における使用のための、請求項1から12のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団。
17. 前記CAR、核酸分子、ベクター又は細胞が、治療用抗体、チェックポイント阻害剤、サイトカイン、化学療法剤、又はT細胞ベースの療法と、好ましくは治療用抗体と組み合わせられる、請求項14から16のいずれか一項に規定の使用のための細胞又は細胞の集団。
18. 病原体感染の処置又は予防における使用のための、請求項1から12のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団。
19. それを必要とする対象における免疫療法のための方法であって、その対象に、治療有効量の、請求項1から12のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団を投与する工程を含む、方法。
20. 対象に、治療有効量の、請求項1から12のいずれか一項に記載の細胞又は細胞集団を投与する工程を含む、それを必要とする対象において免疫応答を誘導又は刺激するための請求項19に記載の方法。
21. 対象に、治療有効量の、請求項1から12のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団を投与する工程を含む、それを必要とする対象における癌の処置のための請求項19に記載の方法。
22. 対象に、治療有効量の、請求項1から12のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団を投与する工程を含む、それを必要とする対象における病原体感染の処置又は予防のための請求項19に記載の方法。
23. 前記癌が固形腫瘍である、請求項16に記載の細胞若しくは細胞の集団又は請求項21に記載の方法。
24. 癌が、神経芽細胞腫、黒色腫、小細胞肺癌(SCLC)、ユーイング肉腫、骨肉腫、神経膠腫、網膜芽細胞腫、乳癌、膀胱癌、結腸癌、頭頚部癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肛門癌、及び神経膠芽腫からなる群から選択される、請求項23に記載の細胞若しくは細胞の集団又は方法。
25. - 好中球又はNK細胞の集団の細胞中で、請求項1から6のいずれか一項に規定のキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸分子を導入する工程、及び
    - CARを発現させる工程
    を含む、請求項9から12のいずれか一項に記載の細胞の集団を生成する方法。

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