KR20240022465A - 키메라 Fc-알파 수용체 및 그것의 용도 - Google Patents

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KR20240022465A
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행크 로티 매트룽
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산퀸 아이피 비.브이.
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Abstract

본 발명은 Fc 알파 수용체(FcαR)의 세포내 도메인, FcαR의 막통과 도메인, 및 리간드-결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 및 키메라 항원 수용체(CAR), 이러한 폴리 펩타이드 및 CAR를 포함하고 발현하는 세포 및 그것들의 용도에 대한 것이다.

Description

키메라 Fc-알파 수용체 및 그것의 용도
본 발명은 키메라 수용체 및, 암 요법을 포함하는 치료요법 영역에 대한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 Fcα 수용체에 대한 것이다.
시험관내 확장 종양 침투 림프구(Tumor Infiltrating Lymphocytes, TIL) 또는 T-세포 발현 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)의 입양 전달(adoptive transfer)에 의한 종양 요법에서 놀라운 성공이 얻어졌다. CAR는 종양 상에서 발견되는 항원에 특이적인 엑토도메인(항체의 일부), 예를 들어 CD3ξ의 신호전달 도메인에 결합된 엑토도메인, 및 CD28 또는 4-1BB와 같은 공동 자극 도메인을 포함한다. FcγRIIIA(CD16A)와 같은 Fc-감마 수용체(FcγR)와 같은 다른 신호전달 도메인, FcγRIIIA(CD16A) 및 C-형 렉틴-유사 수용체 NKG2D 또는 이량체 수용체 DAP10와 같은 것. T 세포 안에서의 CAR 발현은 종양 항원에 의한 그것들의 활성화를 일으킨다. CAR T 세포를 이용하여 특정 혈액학적 악성종양에서 최고 90%까지의 완전한 관해가 얻어졌다. 제한된 T-세포 트래피킹(trafficking) 및 종양 미세환경으로부터의 면역 저항 기전 때문에 고형 종양의 치료에서는 훨씬 덜한 성공이 얻어졌다.
유효성과 안전성의 관점에서 CAR 요법을 최적화하고 그것의 적용 범위를 다른 악성 종양으로 확대하려는 시도가 위에서 설명된 바와 같이 CAR를 NK 세포 및 골수 세포를 포함하는 다른 림프구에서 이용하여 이루어졌다. NK 세포는 CAR 연구에서 두 번째로 많은 관심을 받았고, 몇몇 임상 시험이 NK 세포 CAR 요법을 기반으로 시작되었는데, 주로 혈액학적 악성종양의 치료를 목적으로 하지만, 또한 고형 종양의 치료도 목적으로 한다 (Sievers et al. 2020). 호중구 및 단핵구와 같은 CAR-골수 세포가 알려졌지만 지금까지 임상시험은 시작되지 않았다. 하나의 가능성은 예를 들어, De Olivera et al. (2013)에 묘사된 것처럼, CD34+ HSC에 CD19-특이적 CAR를 형질도입(트랜스덕션)하기 위해 인간 조혈 줄기세포(human hematopoietic stem cell, HSC)를 트랜스덕션한 다음 CAR-발현 과립구, 단핵구 및 대식구를 생성하도록 증식 및 분화시키는 것이다. Roberts 등은 항-CD4-CD3ξ CAR의 HSC로의 트랜스덕션 및 CAR-발현 호중구의 분리에 대해 기술한 바 있다(1998). WO　2020/223550은 골수 세포, 구체적으로 탐식세포 상에 발현된 키메라 융합 단백질 또는 CAR에 대해 상술한다. 그것은 대식구와 같은 탐식 골수세포가 증강된 탐식효과를 가지도록 융합 단백질로 조작될 수 있다는 것을 기술한다. 이런 목적으로, 탐식 신호전달 도메인을 포함하는 세포 내 신호전달 도메인이 이용되며, 이런 도메인은 바람직하게는 MegflO, MerTk, FcRa, 및 Bail이 아닌 수용체로부터 유래된다. 또한 골수 세포가 T 세포 활성화를 촉진하도록 조작될 수 있다는 것이 알려져 있지만, 이런 목적으로 개시된 특이적인 키메라 융합 단백질은 없다. 실험 분야에서, PI3K 모집 도메인 또는 CD40 세포액 부분과 같은 추가적인 세포액 부분을 가지는 FcγR 세포 내 및 CD8 막통과 도메인을 가지는 키메라 융합 단백질이 제조되었고, 단핵구 및 대식구 세포주에 이 구성체가 제공되었다.
당업계에는 면역요법, 특히 고형 종양과 같은 종양에서의 면역 요법을 위한 새롭고 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요가 여전하다.
본 발명의 목적은 개선된 키메라 수용체를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 크게는 종양의, 구체적으로는 고형 종양의 개선된 치료를 위한 방법을 제공하는 것이다.
그에 따라 본 발명은 다음을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다:
- Fc 알파 수용체(FcαR)의 세포내 도메인(intracellular domain),
- FcαR의 막통과 도메인(transmembrane domain), 및
- 리간드-결합 도메인.
바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 키메라 수용체이고, 구체적으로 키메라 FcαR이다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)이다.
다른 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다:
- Fc 알파 수용체(FcαR)의 세포내 도메인,
- FcαR의 막통과 도메인, 및
- 리간드 결합 도메인.
상기 폴리펩타이드 또는 CAR는 바람직하게는 다음의 순서로 표시된 도메인을 포함한다: 3' - FcαR 세포내 도메인 - FcαR 막통과 도메인 - 리간드 결합 도메인 - 5'. 바람직한 일 구현예에서, 바람직하게는 폴리펩타이드 또는 CAR은 다음 순서로 다음 도메인을 포함한다: 3' - FcαR 세포내 도메인 - FcαR 막통과 도메인 - 스페이서 - 리간드 결합 도메인 - 신호 펩타이드 - 5'.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 CAR을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 더욱 바람직하게는 그 안에 본 발명에 따라 핵산 분자 또는 벡터가 도입된 세포이다. 상기 세포는 바람직하게는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 CAR을 발현한다. 상기 세포는 바람직하게는 조혈 줄기세포, 골수세포 또는 골수 전구 세포, 또는 선천성 림프구(innate lymphoid cell), 더욱 바람직하게는 인간 조혈 줄기 세포, 인간 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 또는 인간 선천성 림프구이다. 상기 세포들은 또한 바람직하게는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포, NK 세포 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 세포들은 1차 세포이고, 더욱 바람직하게는 본 발명에 따라 치료될 대상체로부터 분리된 자가 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 NK-92 세포와 같은 세포주의 세포, 바람직하게는 방사선 조사된 NK-92 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다음의 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 가지는 세포, 바람직하게는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포 또는 NK 세포, 더욱 바람직하게는 호중구 또는 NK 세포를 제공한다:
- Fc 알파 수용체(FcαR)의 세포내 도메인,
- FcαR의 막통과 도메인, 및
- 이종(heterologous) 리간드 결합 도메인.
다른 측면에서, 본 발명은 Fc 알파 수용체(FcαR)의 세포내 도메인, FcαR의 막통과 도메인 및 이종 리간드 결합 도메인을 포함하는 CAR을 인코딩하는 핵산 분자가 마련된 세포, 바람직하게는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포 또는 NK 세포, 더욱 바람직하게는 호중구 또는 NK 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 복수의 세포를 포함하는 세포 군집을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자, 벡터, 폴리펩타이드 또는 CAR 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 요법에서, 구체적으로 면역 요법에서 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집을 제공한다. 상기 세포는 바람직하게는 골수세포 또는 골수 전구 세포, 조혈 줄기 세포 또는 선천성 림프구이고, 더욱 바람직하게는 인간 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 인간 조혈 줄기 세포 또는 인간 선천성 림프구이다. 상기 세포들은 바람직하게는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포, NK 세포 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 상기 세포는 1차 세포이고, 바람직하게는 본 발명에 따라 치료받을 대상체로부터 분리된 자가 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 NK-92 세포와 같은 세포주의 세포이고, 바람직하게는 방사선 조사된 NK-92 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 필요로 하는 대상체에서의 면역치료 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 면역 요법을 위한 의약품의 제조에서의 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 면역 반응을 유도하거나 자극하는 데에 사용되기 위한 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집을 제공한다. 상기 세포는 바람직하게는 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 조혈 줄기 세포 또는 선천성 림프구이고, 더욱 바람직하게는 인간 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 조혈 줄기 세포 또는 선천성 림프구이다. 상기 세포는 바람직하게는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포, NK 세포 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 상기 세포는 또한 바람직하게는 1차 세포이고, 더욱 바람직하게는 본 발명에 따라 치료될 대상체로부터 분리된 자가 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 NK-92 세포주와 같은 세포주로부터의 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 자극하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 면역 반응을 유도하거나 자극하기 위한 약물을 제조하는 데 있어서 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서의 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집을 제공한다. 일 구현예에서, 대상체, 바람직하게는 인간은 암으로 고통받고 있다. 상기 세포는 바람직하게는 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 조혈 줄기 세포 또는 선천성 림프구이고, 더욱 바람직하게는 인간 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 조혈 줄기 세포 또는 선천성 림프구이다. 상기 세포는 바람직하게는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포, NK 세포 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 상기 세포는 또한 바람직하게는 1차 세포이고, 더욱 바람직하게는 본 발명에 따라 치료 받을 대상체로부터 분리된 자가 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 NK-92 세포주와 같은 세포주로부터의 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 병원체 감염의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집을 제공한다. 상기 세포는 바람직하게는 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 조혈 줄기 세포또는 선천성 림프구이고, 더욱 바람직하게는 인간 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 조혈 줄기 세포 또는 선천성 림프구이다. 상기 세포는 바람직하게는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포, NK 세포 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 상기 세포는 또한 바람직하게는 1차 세포이고, 더욱 바람직하게는 본 발명에 따라 치료될 대상체로부터 분리된 자가 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 NK-92 세포주와 같은 세포주로부터의 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체에서의 병원체 감염의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집의, 병원체 감염의 치료 또는 예방을 위한 의약 제조에서의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 세포 군집을 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은:
- 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터를 세포 또는 세포 군집에 도입하고, 그리고
- 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 CAR가 발현될 수 있게 하는
것을 포함한다. 상기 세포는 바람직하게는 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 조혈 줄기 세포 또는 선천성 림프구이고, 더욱 바람직하게는 인간 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 조혈 줄기 세포 또는 선천성 림프구이다. 상기 세포는 바람직하게는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포, NK 세포 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 상기 세포는 또한 바람직하게는 1차 세포이고, 더욱 바람직하게는 본 발명에 따라 치료 받을 대상체로부터 분리된 자가 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 NK-92 세포주와 같은 세포주로부터의 세포이다.
상세한 설명
여기서 사용되는 "포함하다" 및 그것의 활용형은 그 단어 뒤의 항목을 포함하지만 구체적으로 언급되지 않은 항목들을 배제하지 않는 그것의 비제한적인 의미로 사용된다. 또한, 동사 "구성되다"는 "본질적으로 구성되다"로 대체될 수 있으며, 여기 정의된 화합물 또는 부속 화합물이 구체적으로 특정되지 않은 부가적인 구성요소(들)를 포함할 수 있고, 상기 부가적인 구성요소(들)는 본 발명의 고유한 특성을 변경시키지 않음을 의미한다.
여기서 사용된 관사 "하나"는 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 이상(즉 최소한 하나)을 가리킨다. 예를 들어 "하나의 구성요소"는 하나의 구성요소 또는 하나 이상의 구성요소를 의미한다.
단어 "대략" 또는 "약"은 수치와 함께 사용될 때(대략 10, 약 10) 바람직하게는 주어진 값 10에서 1% 많거나 적은 값일 수 있는 값을 의미한다.
대안의 사용(예를 들어 "또는")은 대안들 중 하나, 둘, 또는 그들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
여기 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 치료될 질병 또는 상태의 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 경감시키기에 충분한 투여될 화합물의 양을 가리킨다. 이것은 질병 또는 상태의 증상의 감소 또는 완화, 원인의 감소 또는 경감, 또는 다른 임의의 바람직한 치료적 효과일 수 있다.
여기서 사용되는 용어 "예방"은 아직 질병의 임상적인 증상을 경험하지 않은 대상체에서의 질병 또는 상태의 시작 및/또는 질병 또는 상태의 임상 증상의 출현의 배제 또는 지연을 가리킨다.
용어 "치료"는 질병 또는 장애의 억제, 즉, 질병 또는 장애의 발달 또는 적어도 하나의 임상 증상의 중단 또는 감소, 및/또는 질병 또는 상태의 증상을 경감하는 것을 가리킨다. 몇몇 구현예에서, 치료는 하나 이상의 증상이 발달된 후에 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, 치료는 증상이 없을 때 수행될 수 있다. 예를 들어, 증상의 시작 전에 감수성 있는 개체에게(예를 들어 증상의 병력에 비추어 및/또는 유전적인 또는 다른 감수성 인자에 비추어) 치료가 수행될 수 있다. 치료는 또한 증상이 해결된 후에도 예를 들어 그것의 재발을 예방 또는 지연시키기 위해 계속될 수 있다.
여기 쓰이는 용어 "대상체"는 인간과 동물을 아우르고, 바람직하게는 포유동물이다. 바람직하게는 대상체는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간이다.
용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 연결된 아미노산들을 포함하는 화합물을 가리킨다. 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드는 그 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열에 한정되지 않고, 폴리펩타이드의 전사 후 변형을 포함할 수 있다.
여기서 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 대해 사용될 때, 용어 "N- 말단(의)" 및 "C-말단(의)"은 각각 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서의 N-말단 및 C-말단을 향한 상대적 위치를 가리킨다. "N-말단" 및 "C-말단"은 각각 폴리펩타이드의 끝 아미노 말단 및 카르복실 말단을 가리킨다. "바로 옆 N-말단" 및 "바로 옆 C-말단"은 두 번째 아미노산 서열에 대한 첫 번째 아미노산 서열의 위치를 가리키는데, 여기서 첫 번째 및 두 번째 아미노산 서열은 인접한(contiguous) 아미노산 서열을 제공하도록 공유결합된다.
여기서 정의되는 아미노산 서열에서, 아미노산은 단일-문자 기호로 표시된다. 세 글자 기호 뿐만 아니라 이 단일문자 기호도 당업자에게 잘 알려져 있으며 다음의 의미를 가진다: A (Ala)는 알라닌, C (Cys)는 시스테인, D (Asp)는 아스파르트산, E (Glu)는 글루탐산, F (Phe)는 페닐알라닌, G (Gly)는 글리신, H (His)는 히스티딘, I (Ile)는 이소류신, K (Lys)는 리신, L (Leu)은 류신, M (Met)는 메티오닌, N (Asn)은 아스파라긴, P (Pro)는 프롤린, Q (Gln)는 글루타민 , R (Arg)은 아르기닌, S (Ser)는 세린, T (Thr)는 트레오닌, V (Val)는 발린, W (Trp)는 트립토판, Y (Tyr)는 티로신이다.
여기서 사용될 때 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 서열은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 사슬, 바람직하게는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 서열은 아래에 설명될 바와 같이, 표적 RNA를 분해하기 위한 RNA 간섭을 사용하기 위한 이중 가닥 RNA를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 서열은 예를 들어 DNA/RNA 나선, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 잠긴 핵산(locked nucleic acid, LNA) 및/또는 리보자임과 같은 다른 종류의 핵산 구조를 포함한다. 핵산 분자라는 용어는 재조합 및 합성 핵산 분자를 포함한다.
아미노산 서열 또는 핵산 서열의 동일성의 퍼센티지, 또는 "% 서열 동일성"이라는 용어는 여기서 최대 퍼센트 동일성을 얻기 위해 두 서열을 정렬하고 필요하다면 간격을 도입한 후의 기준 아미노산 서열 또는 핵산 서열의 잔기와 동일한 전장 아미노산 서열 또는 핵산 서열의 잔기의 퍼센티지로 정의된다. 여기서 쓰이는 서열 동일성은 대상 아미노산 서열의 연속적인 아미노산을 기초로 하여 계산된다. 정렬 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 "Align 2"가 있다. 뉴클레오타이드 서열 동일성을 결정하기 위한 프로그램도 또한 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램이다. 이러한 프로그램은 제조사에 의해 추천되는 기본 변수를 바로 이용할 수 있다.
여기서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하다" 및 "특이적인"은 리간드 결합 도메인 및 그것의 리간드 사이의 상호작용을 가리키며, 항체 또는 그것의 항원 결합 부위, 및 그것의 에피토프 사이의 상호작용을 포함한다. 이 용어는 상기 리간드 결합 도메인이 다른 리간드보다 우선적으로 상기 리간드에 결합함을 의미한다. 리간드 결합 도메인이 다른 부분, 아미노산 서열 또는 리간드에 비-특이적으로 결합할 수 있다고 하더라도, 상기 리간드 도메인의 그것의 리간드에 대한 결합의 결합 친화도는 상기 리간드 결합 도메인의, 다른 부분, 아미노산 서열 또는 리간드와의 비-특이적 결합 친화도보다 상당히 높다.
여기서 사용되는 용어 "항체"는 경쇄 가변 구역(VL)과 짝을 이룬 적어도 하나의 중쇄 가변 구역(VH)을 포함하는 면역글로불린 단백질을 가리키며, 그것이 표적 에피토프에 특이적이다.
항체의 "항원 결합 부분"은 여기서 표적 에피토프에 특이적인 상기 항체의 특성을 공유하는 부분으로 정의된다. 즉, 항원 결합 부분은 꼭 동일한 정도까지일 필요는 없지만 상기 항체와 동일한 항원에 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 항체의 항원 결합 부분은 적어도 하나의 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 항체의 항원 결합 부분의 비-제한적인 예로, 단일 도메인 항체, 단일 사슬 항체, 나노체, 단일체(unibody), 단일 사슬 가변 단편(scFv), Fab 단편 및 F(ab')2 단편이 있다.
여기서 사용되는 용어 "나노체" 또는 "항원 결합 나노체"는 표적 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 구성된 단일-도메인 항체를 가리킨다.
여기서 사용되는 용어 "scFv"는 항체 중쇄 가변 구역(VH) 및 항체 경쇄 가변 구역(VL)을 포함하는 분자를 가리키며, 그것은 링커에 의해 연결되어 예를 들어 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH의 일반적인 구조를 가질 수 있다.
여기서 사용되는 용어 "애피머(affimer)"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 사슬 기반 항체 유사체를 가리키며, 그것은 시스타틴 시스테인 프로테아제 억제제 골격(cystatin cysteine protease inhibitor scaffold)을 기반으로 한다 (Johnson et al. 2012, 참조. 본원에 참조로서 포함됨).
여기서 사용되는 용어 "스페이서"는 폴리펩타이드 또는 CAR 안에서 두 개의 도메인을 연결하는 아미노산 서열을 가리키며, 폴리펩타이드 또는 CAR의 적절한 발현 및 기능성을 위해 마련될 수 있다.
여기서 사용되는 용어 "도메인"은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR에서 특정 기능을 가지는 아미노산 서열을 가리킨다. 이러한 도메인의 예는 FcαR 세포내 도메인, FcαR 막통과 도메인, 리간드 결합 도메인, 막통과 도메인 및 리간드 결합 도메인 사이의 스페이서, 신호 펩타이드, 태그 및 이량체화 도메인을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
여기서 사용되는 용어 "키메라 수용체" 및 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"는 항원 또는 표적과 같은 리간드에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 세포 외 리간드 결합 도메인, 막통과 도메인 및 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 재조합 폴리단백질을 가리킨다. 이 적어도 세 개의 도메인은 적어도 두 개의 서로 다른 자연 발생적인 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 유래된다. 키메라 항원 수용체 또는 CAR는 신호 펩타이드 서열, 하나 또는 그 이상의 스페이서 도메인 및 공동자극 도메인과 같은 다른 서열을 포함할 수 있다.
본 발명자들은 Fcα-수용체 (FcαR)의 막통과 및 세포내 부분과 가변 세포외 도메인을 포함하는 조절가능한 CAR 구성체를 개발했다. IgA-아이소타입 종양-항원 특이적 항체의 결합을 통한 호중구 상의 FcαR의 활성화는 강력한 항-종양 효과를 일으키고, 그것은 통상 현재 임상적으로 널리 사용되는 치료용 항원의 동형(isoform)인 IgG에 의해 유도되는 Fcγ-수용체 신호전달에 비해 강력하다. 이 활성화된 Fcα-수용체의 세포내 도메인을 사용함으로써, CAR의 항-종양 효과기 기능이 Fcγ-수용체 기반 CAR를 이용하는 Fcγ-수용체 신호전달에 비해 증폭될 것이라는 가설을 세웠다.
또한 FcαR 세포내 도메인을 가지는 CAR을 발현하는 호중구의 효과기 기능 중 하나가, 최근 알려진 항체-옵소닌화 종양 세포에 대한 호중구의 효과기 기전인 세포 갉아먹기(trogocytosis)라는 가설을 세웠다. 세포 갉아먹기(트로고사이토시스)는 표적 세포가 조각조각나는 것을 특징으로 하는 괴사성, 용해성 세포 사멸이고, 호중구에 의한 표적 세포의 막 단편의 막 섭취로 시작된다.
FcαR 세포 내 및 막통과 도메인을 포함하는 본 발명의 CAR는 조혈세포 악성 종양 및 고형 종양 항원을 포함하는 매우 다양한 항원을 인식하도록 조절될 수 있고, 결과적으로 다양한 기원의 암을 표적으로 높은 치료 잠재성을 가진다. 따라서, 상기 CAR는 최적화 유연성을 위한 세포외 종양 인식 도메인의 면에서 모듈 방식이다. 또한, 이 CAR 기술은 호중구, 단핵구/대식세포 및 NK 세포를 포함하는 다양한 선천성 효과기 세포에서 사용되기 위해 적용될 수 있게 설계된다.
호중구 및 대식세포를 포함하는 선천성 세포들은 면역계의 근본적인 효과기들이다. 종양세포에 대해 이런 선천성 세포들을 활용하는 것은 오랜 관심사인데, 특히 현존하는 T-세포 치료법이 제한적인 성공을 거둔 고형 종양에서 그러하다. 종양 항원을 향한 T 세포 활성을 특이적으로 재전송하도록 초기 설계된 수용체 CAR는 혈액암을 표적으로 하면서 성공적으로 사용되어 왔지만, 고형 종양에서는 그보다 덜했다. 현재의 CAR 기술은 T 세포 기반 요법이 제한된 경우에 특히 적합하고 넓게 적용될 수 있다고 믿어진다. 종양 특이적 CAR를 발현함으로써 종양에 대한 선천성 효과기 기능을 특이적으로 전송하는 것은 오래 지속되는 종양 제어를 위한 새로운 가능성을 열어 젖혔다. 특히, 종양 연관 대식세포(tumor-associated macrophage, TAM) 및 다형핵 세포(polymorphonuclear cell, PMN)가 고형 종양으로 잘 침투한다고 알려져 있고, CAR-TAM/PMN이 종양 미세환경(tumor microenvironment, TME)을 종양 우호(pro-tumor)로부터 종양-대항(anti-tumor)으로 편향시켜준다고 여겨진다. 또한, CAR-TAM/PMN는 종양 항원의 교차-제시 또는 T 세포의 공동-자극을 통해 직접적인 항-종양 효과의 최상단에서 적응 반응(adaptive response)을 생성할 잠재성을 가진다. 선천성 CAR를 이용하는 것은 그것들의 빠른 전환의 결과로 지속적인 반응을 유지하는 데 장애물이 될 수 있지만, 이것은 실제적으로 CAR T 세포에서 나타나는 것과 같은 심각한 부작용에 제한을 가할 수 있다.
여기의 실시예들은 신경아세포종 세포 상에 발현된 GD2를 표적으로 하는 CAR의 개발을 설명한다. 상기 CAR 구성체는 상업적으로 이용가능한 항-GD2 항체(clone 14.18)에서 유래된 단일 사슬 가변 단편(scFv) 부분 및 Fcα-수용체(FcαR)의 막통과 및 세포내 부분으로 구성되는 GD2-인식 도메인으로서 설계되었다. 본 발명의 실시예에서 보여지다시피, 성숙 유도가능 세포들은 CAR를 발현하도록 성공적으로 형질전환될 수 있고(양성 세포 80% 초과) 호중구-양 세포로 분화될 수 있다. 더욱이, GD2-CAR를 발현하는 호중구-양 세포는 특이적으로 GD2+ 신경아세포종 세포를 죽일 수 있다. 특히, 이 세포들은 항-GD2 옵소닌화에 대한 필요 없이 GD2-양성 신경아세포종 세포로의 세포 독성을 유도하는 것을 보여줬다. 또한 FcαR 세포내 도메인이 GD2-CAR의 기능을 위해 필요하다는 것을 보여줬다. 중요하게도, 본 발명자들은 호중구-양 세포 안에서 FcαR 세포내 및 막통과 도메인을 가지는 CAR 구성체가 FcγRIIA 세포내 및 막통과 도메인을 가지는 CAR 구성체보다 훨씬 좋은 효과를 나타내는 것을 발견했다: GD2-FcαR CAR 호중구 양 세포는 모든 시험한 표적 대 효과기 세포 비율에서 GD2+ 표적 세포를 효과적으로 사멸할 수 있음을 보여줬고, 한편 이 호중구 양 세포 안의 GD2-FcγR CAR는 사멸을 유도하지 않았다(도 11b 참조). 놀랍게도, GD2-FcαR CAR 및 GD2-FcγR CAR를 조합했을 때 또한, GD2-FcαR CAR 단독에 비해 향상된 세포 독성을 일으켰는데, 그것은 이 조합의 상승 효과를 증명한다.
추가로, Her2/neu 또는 EGFR 인식 도메인을 가지는 CAR 구성체를 제조했고, 이 CAR 구성체가 마련된 호중구 양 세포가, 항-EGFR 및 항-Her2/neu 옵소닌화 필요 없이 각각 EGFR+ 및 Her2/neu+ 표피모양 암종(epidermoid carcinoma) 및 유방암 세포주 A431 및 SKBR3에 대해 효과를 나타냈다. 비-옵소닌화 세포에 대한 Her2/neu-FcαR CAR의 세포 독성 효력은 트라츄주맙(trastuzumab)-옵소닌화 표적 세포에 대한 야생형 호중구 양 세포의 것보다 놀랍도록 높음이 발견되었다.
최종적으로, 본 발명자들은 또한 NK 세포 내에 GD2-CAR를 성공적으로 발현시켰다.
첫 번째 관점에서, 본 발명은 이와 같이:
- Fc 알파 수용체(FcαR)의 세포내 도메인,
- FcαR의 막통과 도메인, 및
- 리간드 결합 도메인:
을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 키메라 수용체, 구체적으로 키메라 FcαR이다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
또한
- Fc 알파 수용체(FcαR)의 세포내 도메인,
- FcαR의 막통과 도메인, 및
- 리간드 결합 도메인:
을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다.
바람직한 구현예에서, CAR는 상기 폴리펩타이드로 구성된다. 즉, CAR는 Fc 알파 수용체(FcαR)의 세포내 도메인, FcαR의 막통과 도메인 및 리간드 결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 CAR는 Fc 알파 수용체(FcαR)의 세포내 및 막통과 도메인을 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 CAR의 세포내 및 막통과 도메인은 바람직하게는 인간 FcαR의 것이다. FcαR는 또한 면역글로불린 알파 Fc 수용체로도 불리며, 인간 FcαR는 다양한 동형(isoform)으로 존재하는데, 동형 A.1, 동형 A.2, 동형 A.3, 동형 B, 동형 B-델타-S2, 동형 U02, 동형 L10, 동형 U09, 동형 U10, 동형 U11 및 동형 U13를 포함한다. 이 FcαR 동형 및 그것의 서열들은 당업계에 알려져 있다. 여기 실시예에서, 동형 A.1의 표준(canonical) 동형의 세포내 및 막통과 도메인이 사용되었다. FcαR 동형 A.1의 서열은 도 1에 도시되었다. 그러나, 임의의 FcαR 서열이 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR에 쓰일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 인간 FcαR은 인간 FcαR 동형 A.1, 동형 A.2, 동형 A.3, 동형 U02, 동형 L10, 동형 U10, 동형 U11 또는 동형 U13이다.
여기에서 쓰이는 "FcαR의 세포내 도메인"은 FcαR 신호전달을 시작할 수 있는 세포내 도메인을 가리킨다. 이와 같이 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR은 FcαR 신호전달을 할 수 있다. FcαR 신호전달은 리간드 결합 도메인이 리간드에 결합했을 때 시작된다. 따라서, "FcαR 신호전달을 할 수 있는"은, 상기 폴리펩타이드 또는 CAR의 리간드 결합 도메인이 리간드에 결합했을 때 FcαR 신호전달이 시작된다는 것을 의미한다. FcαR 세포내 도메인은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그것은 FcαR의 41개 C-말단 아미노산을 포함한다. 이것은 FcαR 동형 A.1의 아미노산 247-287, 즉 서열 ENWHSHTALNKEASADVAEPSWSQQMCQPGLTFARTPSVCK, 또는 다른 FcαR 동형에서의 대응하는 아미노산들이다. 이와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR에 존재하는 것과 같은 FcαR의 세포내 도메인은 바람직하게는 도 1에 도시된 것과 같은 FcαR 동형 A.1 서열의 아미노산 247-287의 서열을 포함하거나, 또는 동형 A.1이 아닌 다른 FcαR 동형의 대응하는 서열 또는, 상기 서열과 적어도 90% 일치하는 서열을 포함한다. 상기 동형 A.1이 아닌 FcαR 동형은 바람직하게는 동형 A.2, 동형 A.3, 동형 U02, 동형 L10, 동형 U10, 동형 U11 또는 동형 U13이다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR에 존재하는 세포내 도메인은 바람직하게는 FcαR 신호전달을 시작할 수 있다. 상기 서열은 바람직하게는 도 1에 나타낸 것과 같은 FcαR 동형 A.1의 아미노산 247-287 서열과 최소 95%, 더욱 바람직하게는 최소 97%, 더욱 바람직하게는 최소 98%, 더욱 바람직하게는 최소 99% 일치한다. 특히 바람직한 구현예에서, FcαR의 세포내 도메인은 도 1에 나타낸 것과 같은 FcαR 동형 A.1의 아미노산 247-287 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 도 1에 나타낸 것과 같은 FcαR 동형 A.1의 아미노산 247-287 서열로 구성된다.
바람직한 구현예에서, CAR는 FcαR의 세포내 도메인에 더해 추가적인 세포내 도메인을 포함하지 않는다. 구체적으로, CAR는 FcαR의 세포내 도메인에 더해 추가적인 기능성 세포내 도메인을 더 포함하지 않는다. 이와 같이, CAR가 세포, 바람직하게는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포 또는 NK 세포, 더욱 바람직하게는 호중구 또는 NK 세포에 의해 발현될 때 추가적인 기능성 도메인은 세포 내에 존재하지 않는다. 연결 서열 또는 스페이서와 같은 비-기능성 서열은 존재할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, CAR의 세포내 및 막통과 부분은 FcαR의 세포내 도메인 및 막통과 도메인으로 구성되고, 선택적으로 연결 서열 또는 스페이서로 분리된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, CAR의 세포내 및 막통과 부분은 FcαR의 세포내 도메인 및 막통과 도메인으로 구성된다. 여기 쓰이는 "CAR의 세포내 및 막통과 부분"은 CAR가 세포, 바람직하게는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포 또는 NK 세포, 더욱 바람직하게는 호중구 또는 NK 세포에 의해 발현될 때의 CAR의 세포내 및 막통과 부분을 가리킨다.
여기 쓰이는 "FcαR의 막통과 도메인"은 FcαR의 막통과 도메인을 가리킨다. 이 FcαR 막통과 도메인은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그것은 FcαR 세포내 도메인의 N-말단 바로 옆 19개 아미노산을 포함한다. 이것은 FcαR 동형 A.1의 아미노산 228-246, 즉 서열 LIRMAVAGLVLVALLAILV, 또는 다른 FcαR 동형의 대응하는 아미노산이다. 이와 같이 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR에 존재하는 FcαR의 막통과 도메인은 바람직하게는 도 1에 나타낸 바와 같은 FcαR 동형 A.1 서열의 228-246 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 동형 A.1이 아닌 다른 FcαR 동형의 대응하는 서열, 또는 상기 서열에 최소 90% 일치하는 서열을 포함한다. 상기 동형 A.1 이 아닌 다른 FcαR 동형은 바람직하게는 동형 A.2, 동형 A.3, 동형 U02, 동형 L10, 동형 U10, 동형 U11 또는 동형 U13이다. 상기 서열은 바람직하게는 도 1에 나타낸 바와 같은 FcαR 동형 A.1 서열의 228-246 아미노산 서열에 최소한 95% 일치하고, 더욱 바람직하게는 최소 97%, 더욱 바람직하게는 최소 98%, 더욱 바람직하게는 최소 99% 일치한다. 특히 바람직한 구현예에서, FcαR의 막통과 도메인은 도 1에 나타낸 바와 같은 FcαR 동형 A.1 서열의 228-246 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 도 1에 나타낸 바와 같은 FcαR 동형 A.1 서열의 228-246 아미노산 서열로 구성된다.
이렇게, 본 발명의 바람직한 폴리펩타이드 또는 CAR는 도 1에 도시된 바와 같은 FcαR 동형 A.1 서열의 아미노산 228-287 서열을 포함하거나, 또는 동형 A.1이 아닌 다른 FcαR 동형의 대응하는 서열, 또는 상기 서열에 최소 90% 일치하는 서열을 포함한다. 상기 동형 A.1이 아닌 다른 FcαR 동형은 바람직하게는 동형 A.2, 동형 A.3, 동형 U02, 동형 L10, 동형 U10, 동형 U11 또는 동형 U13이다. 상기 서열은 바람직하게는 도 1에 도시된 바와 같은 FcαR 동형 A.1의 상기 서열의 아미노산 228-287와 최소 95% 일치하고, 더욱 바람직하게는 최소 97%, 더욱 바람직하게는 최소 98%, 더욱 바람직하게는 99% 일치한다. 특히 바람직한 일 구현예에서, FcαR의 막통과 도메인은 도 1에 도시된 바와 같은 FcαR 동형 A.1의 서열의 228-287 아미노산을 포함하고, 더욱 바람직하게는 그것은 도 1에 도시된 바와 같은 FcαR 동형 A.1의 서열의 228-287 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR는 FcαR의 세포외 도메인의 일부와 같은 FcαR의 부분 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드 또는CAR는 선택적으로 FcαR의 세포외 도메인의 1 내지 50개의 연속적인 아미노산을 포함하고, 바람직하게는 FcαR의 막통과 도메인의 N-말단 바로 옆 50개의 연속 아미노산을 포함한다. 이것은 도 1에 나타낸 바와 같은 FcαR 동형 A.1 서열의 아미노산 178-227에 해당하는데, A.1이 아닌 다른 FcαR 동형의 아미노산 178-227일 수도 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR는 FcαR의 막통과 도메인의 N-말단 바로 옆 5 내지 30개의 아미노산을 포함하는데, 즉, 최소한 도 1에 나타낸 FcαR 동형 A.1의 막통과 도메인의 N-말단 바로 옆 198-227 아미노산의 적어도 5개의 연속 아미노산, 또는 A.1가 아닌 FcαR 동형의 대응하는 아미노산을 포함한다. 예컨대 도 1에 나타낸 바와 같은 FcαR 동형 A.1의 막통과 도메인의 N-말단 바로 옆 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속 아미노산, 또는 A.1가 아닌 다른 FcαR 동형의 대응하는 아미노산이다. 이러한 추가적인 막통과 도메인 N-말단 바로 옆 아미노산은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR에 유연성을 제공할 수 있다.
여기서 쓰이는 용어 "리간드 결합 도메인"은 특이적으로 리간드에 결합하는 도메인을 가리킨다. 여기서 쓰이는 리간드 결합 도메인은 이종 리간드 결합 도메인이고, FcαR의 세포외 도메인이 아닌 다른 리간드 결합 도메인임을 의미한다. 이 리간드 결합 도메인은 선택 리간드에 의해 결합될 수 있는 임의의 도메인일 수 있다. 구체적으로, 리간드 결합 도메인은 임의의 세포 표면 항원 또는 임의의 가용성 리간드의 결합 부분일 수 있다. 리간드 결합 도메인의 다능성(versatility)은 임의의 특정 용도를 위한 적당한 리간드를 선택할 수 있게 한다. 이런 방식으로, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR에 의한 FcαR 신호전달의 활성화가, 선택된 시간, 선택된 위치/세포 유형, 또는 두 개 모두에서 시작될 수 있다. 적절한 세포외 리간드-결합 도메인의 바람직한 예로, 가용성 리간드 특이적 리간드 결합 도메인, 세포 표면 항원 특이적 리간드 결합 도메인 및 이들의 조합이 있다. 세포 표면 항원의 바람직한 예는 종양 항원, 골수 유래 억제 세포 항원 및 병원체 항원이다. 여기 쓰이는 "종양 항원"은 종양의 세포 상에 발현되는 임의의 항원을 지칭한다. 종양 항원은 또한 종양-연관 항원(tumor-associated antigen, TAA)도 가리킨다. 여기 쓰이는 "골수 유래 억제 세포 항원"은 MDSC(myeloid derived suppressor cell) 상에 발현되는 임의의 항원을 가리킨다. 여기 쓰이는 "골수 유래 억제 세포 상에 발현되는 항원"은 암과 만성 감염과 같은 병리적인 상황일 때 늘어나고 면역 억제 특성을 가지는 골수 계통으로부터의 면역 세포를 가리킨다. 이와 같이, MDSC는 환경에 따라 감염 또는 종양-촉진 활성을 가진다. 바람직한 일 구현예에서, MDSC는 종양 미세환경에 존재하는 MDSC와 같은 종양-연관 MDSC이다. 여기 쓰이는 "병원성(병원체) 항원"은 바이러스, 세균, 기생충, 곰팡이 및 기생 생물을 포함하나 이에 한정되지 않는 미생물 또는 기생 생물에 의해 발현되는 임의의 항원을 가리킨다. 바람직한 일 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 종양-항원 또는 골수 유래 억제 세포(MDSC) 항원 특이적이다. 세포 표면 항원의 다음과 같은 유형이 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR의 리간드 결합 도메인의 표적일 수 있다: 종양 또는 MDSC 특이 항원; 비-종양 세포 또는 비-MDSC 상의 발현 수준에 비해 종양 세포 또는 MDSC에서 높은 발현 수준을 갖는 항원; 종양 세포 또는 MDSC 및 비-종양 세포 또는 비-MDSC에 모두 발현되지만 비-종양 세포 또는 비-MDSC에 의해 유도되는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR를 발현하는 세포의 활성이 받아들일만한 부작용을 일으키는 항원; 종양 세포 또는 MDSC 및 비-종양 세포 또는 비-MDSC에 모두 발현되지만 하나 이상의 다른 항원과 조합하면 종양 세포 또는 MDSC에 특이적인 항원; 및 종양을 둘러싸는 세포들에 발현되는 항원.
일 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 다음으로 구성되는 모둠으로부터 선택되는 조각(moiety)을 포함한다:
· 세포 표면 항원 특이적 항체 또는, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 나노체 또는 애피머와 같은 항체의 항원 결합 부분;
· Fc 수용체 또는 그것의 리간드 결합 단편의 세포외 Fc-결합 도메인;
· 가용성 리간드 특이적 리간드 결합 도메인;
· 표면 항원 또는 분자의 개입이 없이 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR와 교차 결합할 수 있는 항체에 대한 에피토프;
· 비오틴, FITC 또는 펩타이드 에피토프와 같은 도메인 인식 조각으로서, 종양 항원과 같은 세포 표면 항원에 특이적인 분자(예: 항체 또는 scFv)에 결합할 수 있는 조각;
·비오틴과 같은 조각으로, 그 조각에 여러 결합 부위에서 스트렙타비딘과 같은 약물에 의해 교차 결합될 수 있는 조각(결과적으로 상기 약물의 추가에 의해 여러 폴리펩타이드 또는 CAR의 뭉침을 일으킴).
바람직한 일 구현예에서, 세포 표면 항원은 종양 항원이다.
바람직한 일 구현예에서, 리간드 결합 도메인은 상기 종양 항원에 특이적인, 항체 또는, scFv 및 나노체, 또는 애피머를 포함하는 항체의 항원 결합 부분이다. 예를 들어, 임의의 알려진 종양 항원 특이 치료용 항체, 또는 scFv와 같은 그것의 항원 결합 부분이 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR의 리간드 결합 도메인으로서 쓰일 수 있다. 종양 항원의 바람직한 예로, GD2, EGFR, HER2/Neu, TAG-72, TMEM16A를 포함하는 칼슘 활성화 염화물 통로 2, 9D7, Ep-CAM, EphA3, 메소델린(mesothelin), SAP-1, BAGE 가족, MC1R, 전립선-특이 항원, CML66, TGF-βRII, MUC1, CD5, CD19, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD152 (CTLA-4), CD274 (PD-L1), CD273 (PD-L2), CD340 (ErbB-2), TPBG, CA-125, MUCl, 및 미성숙 라미닌 수용체가 있다.
바람직한 일 구현예에서, 종양 항원은 GD2, EGFR 및 HER2/Neu로부터 선택된다. GD2는 인간 신경아세포종(환자의 약 91-100%) 및 흑색종(환자의 약 2.4-14%)을 포함하는 신경외배엽 기원 종양 상에 발현되는 디시알로강글리오사이드(disialoganglioside)이다. GD2는 또한 소세포폐암(small cell lung cancer, SCLC; 환자의 약 >50%), 유잉육종(Ewing sarcoma)(환자의 약 40-90%), 골육종(환자의 약 88%), 교세포종(환자의 약 80%), 망막아세포종(환자의 약 40%) 및 유방암, 방광암(단계 및 하위 유형에 따라 발현됨)에서도 발현된다. 상피 성장 인자 수용체(Epidermal growth factor receptor, EGFR)는 막통과 단백질이다. EGFR 과발현을 일으키는 돌연변이는 결장직장암종, 두경부암(환자의 약 80-100%), 비소세포폐암(NSCLC; 환자의 약 40%), 특히 전이성 NSCLC, 항문암 및 교모세포종(glioblastoma)(환자의 약 50%)을 포함하는 다수의 암과 관련이 있다. HER2/Neu는 특정 유형의 유방암에서 발현되는 발암유전자이다.
당업자는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 CAR의 리간드 결합 도메인으로서 쓰일 수 있는 가용성 리간드 및 그것의 결합 짝을 잘 동정할 수 있다. 예를 들어, 가용성 리간드로서 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR의 리간드 결합 도메인에 결합하고 폴리펩타이드- 또는 CAR-발현 세포에 중단 신호를 제공하는 리간드의 가용성 형태가 쓰일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 리간드 결합 도메인은 Fc 수용체 또는 그것의 리간드-결합 단편의 세포외 Fc-결합 도메인을 포함한다. 폴리펩타이드 또는 CAR는 리간드 결합 도메인으로서 세포 표면 항원 대신에 Fc-수용체의 세포외 항체-인식 도메인, 즉, CD16을 포함한다. 이런 식으로, 상기 폴리펩타이드 또는 CAR는 종양 세포 또는 MDSC를 향하는 치료용 항체를 인식하도록 설계되고, 동시에 폴리펩타이드 또는 CAR의 막통과 및 세포내 Fcα 도메인에 의해 유도되는 증폭된 신호전달의 장점을 갖는다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR에 포함되는 가용성 리간드 특이적 리간드 결합-도메인과, 종양 항원과 같은 세포 표면 항원에 특이적인 별도 분자(예: 항체 또는 scFv)에 포함된 리간드 결합 도메인와의 조합도 역시 가능하다. 그런 경우에, FcαR 신호전달은 오직 가용성 리간드와 세포 표면 항원이 모두 존재할 때만 유도될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR의 리간드 결합 도메인은, 예를 들어 펩타이드 네오-에피토프 또는 비오틴 또는 FITC 조각을 인식하는 도메인을 포함할 수 있다. 그 다음 종양 상의 (종양) 표면 항원을 향하는, 펩타이드 네오-에피토프, 비오틴 또는 FITC 조각을 함유하는 다른 항체("스위치" 항체)로 만들어진 것을 사용할 것이다. 결과적으로, FcαR 신호전달의 활성화는 오직, 스위치 항체가 표적으로 하는 세포 표면 항원에 더해 스위치 항체 그 자체가 또한 존재해야만 일어날 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR과 함께 사용될 수 있는 이러한 기술의 예는 Ma et al. (2016) 및 Mitwasi et al. (2020)에 기술되어 있고, 그것은 여기에 참조로서 포함되며, 양적인 조절(스위치 항체의 농도를 늘리거나 줄임으로써) 뿐만 아니라 수용체의 시기적인 조절(원할 때만 그것을 켜거나 끔으로써)을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 CAR은 FcαR의 세포내 도메인, FcαR의 막통과 도메인 및 리간드 결합 도메인에 더해 추가적인 서열 또는 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 서열 또는 도메인의 예로 하나 이상의 연결 서열, 또는 FcαR 세포내 도메인 및 FcαR 막통과 도메인 사이 및/또는 FcαR 막통과 도메인 및 리간드 결합 도메인 사이의 스페이서, 신호 펩타이드 서열, 하나 이상의 태그 및 이량체화 모티프가 있다.
바람직한 일 구현예에서, 스페이서가 FcαR 막통과 도메인 및 리간드 결합 도메인 사이에 자리 잡는다. 이러한 스페이서는 바람직하게는, 10-300개의 아미노산과 같이 최대 300개까지의 아미노산을 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 스페이서는 최소 200개의 아미노산으로 구성된다. 원칙적으로 이러한 스페이서는 임의의 무작위 아미노산 서열일 수 있다. 적당한 스페이서 서열의 예로, 예를 들어 CH2CH3 힌지 구역을 기반으로 하고 선택적으로 Fcγ 수용체로의 결합을 줄이는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 기반 스페이서 및, CD28 및 CD8α도메인과 같은 FcγR 결합 활성이 없는 세포외 도메인이 있다. 적절한 예는 Guedan et al. (2019)에 설명되어 있으며, 그것은 여기에 참조로서 영입된다. 적당한 스페이서의 다른 예로, Siglec-4 기반 스페이서(Schafer et al.(2020)에 기술된 것과 같고 이것은 여기에 참조로 포함된다)가 있다. 바람직한 일 구현예에서, 스페이서는 인간 IgG의, 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4의, 더욱 바람직하게는 IgG1의 CH2CH3, 힌지 구역을 포함하거나 힌지구역이고, 선택적으로 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이 인간 IgG의 CH2CH3 힌지 구역과 그것의 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 GenBank 접근번호 no. AAC82527.1의 서열의 아미노산 98-329이다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR은 신호 펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드를 세포막으로 향하게 할 수 있는 신호 펩타이드가 폴리펩타이드 또는 CAR를 세포막으로 전위시키도록 세포를 자극하기 위해 존재할 수 있다. 신호 펩타이드는 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자는 적절한 신호 펩타이드를 잘 고를 수 있다. 이러한 신호 펩타이드는 바람직하게는 최대 50개까지의 아미노산을 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 신호 펩타이드는 10-40개의 아미노산으로 구성되거나 또는 15-35개의 아미노산으로 구성된다. 일 구현예에서, 신호 펩타이드는 MEFGLSWLFLVAILKGVQCE 서열을 가지는 인간 면역글로불린 중쇄 신호 펩타이드이다(GenBank accession no. AAA587335.1 서열의 아미노산 1-19).
다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR는 작은 펩타이드 에피토프와 같은 태그를 포함하고, 바람직하게는 세포외 도메인에 포함된다. 이러한 태그는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR을 발현하는 세포를, 특이적으로 태그를 표적으로 함으로써, 예를 들어 태그 특이적인 CAR T 세포를, 제거하기 위해 사용될 수 있다. 적당한 태그는 당업자가 확인할 수 있고, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR에 쓰일 수 있는, CAR 발현 세포를 제거하기 위한 적당한 태그 및 공정은 Koristka et al. (2019)에 기술되어 있으며, 그것은 여기에 참조로서 영입된다. 다른 예로, 이러한 태그가 폴리펩타이드 또는 CAR의 나머지 부분에, 태그를 인식하는 조각을 포함하는 리간드 결합 도메인을 부착하기 위해 쓰일 수 있다.
바람직한 구현예에서, CAR는 FcαR의 세포내 도메인에 더해 추가적인 세포내 도메인을 포함하지 않는다. 구체적으로 CAR는, FcαR의 세포내 도메인에 더해 추가적인 기능성 세포내 도메인을 포함하지 않는다. 이와 같이, CAR가 세포, 바람직하게는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포 또는 NK 세포, 더욱 바람직하게는 호중구 또는 NK 세포에 의해 발현될 때 추가적인 기능성 도메인이 세포내에 존재하지 않는다. 연결 서열 또는 스페이서와 같은 비-기능성 서열은 존재할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, CAR의 세포내 및 막통과 부분은, 선택적으로 연결 서열 스페이서에 의해 분리되는 FcαR의 세포내 도메인 및 막통과 도메인으로 구성된다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 CAR를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자가 또한 제공된다. 또한 본 발명에 따른 핵산분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 바람직한 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다. 다른 바람직한 구현예에서, 벡터는 트랜스포존(transposon)을 포함하거나 트랜스포존이다. 상기 핵산 분자 또는 벡터는 추가적으로 다른 성분, 예를 들어 바이러스 유래인, 벡터가 도입되는 특정 세포에서 발현을 지시하는, 예를 들어 강력한 프로모터과 같은 높은 발현값을 위한 수단 및 신호 서열과 같은 것을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 핵산 분자 또는 벡터가 다음 성분 중 하나 이상을 포함한다: SFFV 프로모터와 같은, 선천성 세포에서의 발현을 촉발하는 프로모터, 원형질막을 표적화하기 위한 GMCSF 단백질 또는 CD8 단백질과 같은 것으로부터의 C-말단 신호 펩타이드 및 폴리아데닐화 신호.
또한 세포에 의해 발현되었을 때의 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR가 제공된다. 또한 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 세포, 바람직하게는 분리된 세포가 제공된다. 또한 본 발명에 따른 세포들의 군집이 제공된다. 상기 세포 군집은 바람직하게는 본 발명에 따른 복수의 세포를 포함한다. 상기 세포는 바람직하게는 인간 세포이다. 세포 군집 안의 세포는 바람직하게는 인간 세포이다.
세포는 바람직하게는 조혈 줄기 세포, 성숙 유도가능 세포, 인간 다분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC), 유도 다분화능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC), 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 또는 선천성 림프구이다. 선천성 림프구(ILC)는 다른 선천성 및 적응 면역 세포의 기능을 조절하고 효과기 사이토카인을 분비함으로써 면역 반응에 기여하는 T-세포의 선천성 상대자이고, NK 세포, ILC1, ILC2, ILC3 및 림포이드 조직 유도자(lymphoid tissue inducer, LTi) 세포를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포는 조혈 줄기 세포, hPSC, iPSC, 호중구, 호염구 및 호산구를 포함하는 과립구, 단핵구, 대식세포, 골수아세포, 적혈구, 수지상 세포 또는 비만세포, 또는 NK 세포, 또는 이들의 조합이다. 세포 군집 안의 세포는 바람직하게는 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 인간조혈 줄기 세포, hPSC, 인간 iPSC, 및/또는 선천성 림프구이고, 더욱 바람직하게는 조혈 줄기 세포, 호중구, 호염구 및 호산구를 포함하는 과립구, 단핵구, 대식세포, 골수아세포, 적혈구, 수지상 세포, 비만세포, NK 세포 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 세포는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포 또는 NK 세포 또는 이들의 조합이다. 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 호중구이다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 NK 세포이다. 바람직한 일 구현예에서, 세포 군집 안의 세포는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포, NK 세포, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 세포 군집 안의 세포는 호중구이다. 다른 바람직한 구현예에서, 세포 군집 안의 세포는 NK 세포이다. 세포, 특히 호중구 또는 NK 세포는 세포주의 세포, 1차 세포, 또는 임의의 성숙 유도가능 세포, hPSC 또는 iPSC로부터 분화된 세포를 포함하는 아무 유래라도 가능하다. 여기 쓰이는 "1차 세포"는 유기체, 바람직하게는 인간으로부터 바로 얻어진 세포를 가리킨다. 1차 세포는 증식 또는 확장되도록 배양될 수 있고, 또는 아래에 설명되는 것처럼 세포들이 바로 변형되어 쓰일 수 있다. 일 구현예에서, 1차 세포는 바로 변형된다. 1차 세포, 바람직하게는 조혈 줄기 세포, 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 또는 선천성 림프구, 더욱 바람직하게는 조혈 줄기 세포, 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포 또는 NK 세포, 또는 이들의 조합이 예를 들어 대상체의 혈액 또는 건강한 조직으로부터 분리된다. 혈액 또는 건강한 조직으로부터의 세포 분리는 이러한 세포를 분리하는 당업계의 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 세포주의 바람직한 예는 NK 세포주, 더욱 바람직하게는 NK-92 세포주이다. 이 세포주는 CAR 요법에 대해 적절하고, Tang et al.(2018)에 설명되어 있으며, 그것은 여기에 참조로서 영입된다. 만약 세포가 조혈 줄기 세포, 골수 전구 세포, 성숙 유도가능 세포, hPSC 또는 iPSC라면, 세포는, 바람직하게는, 분화되거나 확장되거나 또는 CAR-발현 골수 세포, 구체적으로 과립구, 호중구, 단핵구, 및/또는 대식세포 또는 NK 세포를 생성하도록 분화될 수 있고, 바람직하게는 분화된다.
세포, 바람직하게는 조혈 줄기 세포, 성숙 유도가능 세포, hPSC, iPSC, 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 또는 선천성 림프구는 바람직하게는 조작된 세포 또는 재조합 변형 세포이다. 여기 쓰이는 용어 "조작된 세포" 및 "재조합 변형 세포"는 외래의, 즉 비-천연 발생의 핵산이 도입되는 세포, 특히 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터가 도입되는 세포를 가리킨다. 즉, 상기 세포는 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터가 도입된 세포이다. 핵산 분자 또는 벡터는 트랜스펙션, 트랜스덕션, 예를 들어 렌티바이러스 트랜스덕션 또는 레트로바이러스 트랜스덕션, DNA 전기 천공법, 또는 RNA 전기천공법과 같은 당업계에 알려진 임의의 방법을 통해 세포로, 바람직하게는 면역 세포로 도입될 수 있다. 핵산 분자 또는 벡터는 일시적으로, 또는 안정적으로 세포에 마련될 수 있다. 핵산을 가지고 하는 트랜스펙션, 트랜스덕션 또는 세포의 전기천공 방법은 당업자에게 알려져 있다.
본 발명의 세포는 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR를 포함하고, 더욱 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR를 발현한다. 또한, 이와 같이 Fc 알파 수용체(FcαR)의 세포내 도메인, FcαR의 막통과 도메인, 및 이종 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 세포가 제공된다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR는 바람직하게는 세포 표면에서 발현된다. 즉, 세포는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR 안의 FcαR의 세포내 도메인은 상기 폴리펩타이드 또는 CAR가 세포에 의해 발현될 때 바람직하게는 세포 내에 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR 안의 FcαR의 막통과 도메인은 세포에 의해 상기 폴리펩타이드 또는 CAR가 발현될 때 바람직하게는 막관통이다. 리간드 결합 도메인은 세포에 의해 폴리펩타이드 또는 CAR가 발현될 때 바람직하게는 세포외에 있다.
일 구현예에서, 세포는 환자, 구체적으로 본 발명에 따라 치료 받을 환자로부터 분리된 자가 세포이다. 일 구현예에서, 세포의 군집은 환자, 구체적으로 본 발명에 따라 치료 받을 환자로부터 분리된 자가 세포의 군집이다. 일 구현예에서, 상기 환자는 암으로 고통받고 있는, 구체적으로 본 발명에 따라 치료될 암으로 고통받고 있는 환자이다. 다른 구현예에서, 세포는 NK-92 세포주와 같은 세포주로부터의 세포이다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 분자, 벡터, 폴리펩타이드 또는 CAR을 포함하는 약학적 조성물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명에 따른 세포 또는 세포 군집 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. "약학적으로 허용가능한"은 담체, 희석제, 또는 부형제가 제제의 다른 성분과 호환성이 있어야만 하고 그것의 수용자에게 나쁘지 않은, 예를 들어 독성이 없어야 함을 의미한다. 일반적으로, 활성 화합물의 기능을 방해하지 않는 임의의 약학적으로 적절한 첨가제가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 바람직하게는 인간 사용에 적합하다.
적당한 담체의 예는 용액, 유당, 전분, 셀룰로오스 유도체 등과 그것의 혼합물을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 적당한 담체는 용액, 예를 들면 식염수이다. 본 약학적 조성물은 바람직하게는 비경구 투여에 적합한 제제, 특히 혈관 주입용(transfusion) 제제이다. 비경구 투여용 제형은 관절내, 근육내, 정맥, 심실내, 동맥, 척추강 및 피하 투여용을 포함한다. 또한, 본 약학적 조성물은 건강 관리 전문가에 의해 주입 또는 주사를 통해 병원에서 대상체에게 투여될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 조성물은 예를 들어 본 발명의 핵산 분자, 벡터, 폴리펩타이드, CAR, 세포 또는 세포 군집의 멸균 등장 수성 완충액의 용액일 수 있다. 필요한 경우, 비경구 제제는 예를 들어 가용화제, 안정화제 및/또는 주사 부위의 통증을 경감하기 위한 국소 마취제를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 및 세포 군집은 치료요법, 바람직하게는 면역 요법에서 유용하게 쓰인다. 그러므로, 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집이 치료요법에서의 사용 및 면역요법에서의 사용을 위해 제공된다. 또한, 치료적 유효량의 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체의 면역 요법 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 상기 면역 요법은 종양 면역요법이다. 또한 면역 반응의, 특히 암의 치료에 있어서, 유도 또는 자극에서의 사용을 위해 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집이 제공된다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는, 특히 암의 치료에서 대상체에서 면역 반응을 유도 또는 자극하는 방법이 제공된다. 바람직한 구현예에서, 이러한 임의의 방법은 본 발명에 따른 세포 또는 세포의 군집의 투여를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 면역요법, 구체적으로 종양 면역 요법은 입양 세포 전달(adoptive cell transfer)을 포함하고, 더욱 바람직하게는 입양 골수 세포 전달 또는 입양 선천성 림프구 전달을 포함하며, 여기서 골수 세포 또는 선천성 림프구는 위에서 정의된 바와 같은 세포이다. 바람직하게는 상기 골수 세포 및/또는 선천성 림프구는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포, NK 세포 또는 그들의 조합으로부터 선택된다.
여기 쓰이는 "입양 세포 전달"은 본 발명의 세포를 환자, 특히 암으로 고통받는 환자에게 전달하는 것을 가리킨다. 구체적으로, "입양 골수 세포 전달"은 본 발명의 골수세포를 환자에게 전달하는 것을 가리키고, "입양 선천성 림프구 전달"은 본 발명의 선천성 림프구를 환자에게 전달하는 것을 가리킨다. 상기 세포들은 환자 자신으로부터 유래되거나 다른 개체로부터 올 수도 있다. 상기 세포는 본 발명에 따라 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR를 발현하도록 조작되거나 재조합 변형되었다. 입양 골수 세포 전달은 바람직하게는 치료될 대상체 또는 환자로부터 유래되는 자가 골수 세포 전달을 포함한다. 입양 선천성 림프구 전달은 바람직하게는 치료될 대상체 또는 환자로부터 유래된 자가 선천성 림프구, 특히 NK 세포, 또는 NK-92 세포주로부터의 세포 전달을 포함한다.
여기 쓰이는 "면역요법"은 질병 또는 장애로 고통받는 개체를 상기 개체에서의 면역 반응을 유도하거나 향상시킴으로써 치료하는 것을 가리킨다. 종양 면역요법은 종양 및/또는 상기 종양의 세포를 향한 개체의 면역 반응을 유도 또는 향상시키는 것과 관련된다. 본 발명에 따른 면역요법은 치료 또는 예방을 위한 것일 수 있는데, 바람직하게는 그것은 치료, 구체적으로 암 또는 종양의 치료를 위한 것이다.
또한 대상체 안의 암의 치료에 사용하기 위해 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집이 제공된다. 일 구현예에서, 상기 대상체는 바람직하게 인간이고, 암으로 고통받는다. 또한 본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터, 세포 또는 세포 군집을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법이 제공된다. 상기 암의 치료는 바람직하게는 본 발명의 세포, 즉 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR를 발현하는 세포의 유효량을 대상체, 바람직하게는 암으로 고통받는 인간에게 투여하는 것을 포함한다. 상기 세포는 바람직하게는 골수 세포 또는 선천성 림프구이고, 더욱 바람직하게는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포, NK 세포 또는 그들의 조합으로부터 선택되는 세포이다. 상기 세포는 또한 바람직하게는 대상체로부터 분리된 자가 세포이고, 여기에 그 다음 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터가 도입되어 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR를 발현하는 자가 세포가 제공된다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 NK-92 세포주와 같은 세포주로부터의 세포이다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 CAR 및/또는, 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터가 도입되거나 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR를 발현하는 세포, 바람직하게는 골수 세포, 또는 선천성 림프구, 더욱 바람직하게는 자가 또는 세포주의 골수 세포 또는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포, NK 세포 또는 이들의 조합과 같은 선천성 림프구를 기반으로 하는 치료요법을 사용하여 치료될 수 있는 암은, 임의의 종양일 수 있고, 고형 종양, 혈액학적 종양, 1차 종양, 2차 종양, 후기 종양(advanced tumor) 및 전이를 포함한다. 본 발명에 따라 치료 또는 예방될 수 있는 종양의 비제한적 예로, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia, AML), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 급성 림프아구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성 골수단핵구 백혈병(chronic myelomonocytic leukemia, CMML), 림프종, 다발성 골수종, 호산구 백혈병(eosinophilic leukemia), 모양세포 백혈병(hairy cell leukemia), 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 비호지킨 림프종, 거대세포 면역아세포 림프종(large cell immunoblastic lymphoma), 형질세포종(plasmacytoma), 폐 종양, 소세포폐암, 비소세포폐암, 췌장 종양, 유방 종양, 간 종양, 뇌 종양, 피부 종양, 유잉육종(Ewing sarcoma) 및 골육종을 포함하는 뼈 종양, 결장 종양, 직장 종양, 항문 종양, 소장 종양, 위장 종양, 신경교종, 내분비계 종양, 부신 종양, 신경아세포종, 갑상선 종양, 식도 종양, 위 종양, 자궁 종양, 요도 종양 및 방광 종양, 신장 종양, 신장세포암종, 전립선 종양, 담낭 종양, 두경부 종양, 난소 종양, 자궁경부 종양, 망막아종을 포함하는 눈의 종양, 교모세포종(glioblastoma), 흑색종, 연골육종(chondrosarcoma), 섬유육종(fibrosarcoma), 자궁내막, 식도, 눈 또는 위장관 실질 종양, 지방육종(liposarcoma), 비인두 종양, 갑상선 종양, 질 종양 및 외음부 종양이 있다.
일 구현예에서, 상기 종양은 고형 종양이다. 본 발명자들은 본 발명의 CAR 기술이 고형 종양의 치료에 특히 적합하다는 것을 발견했다. 특히, 종양 연관 대식세포(TAM) 및 다형핵세포(PMN)와 같은 골수세포가 고형 종양으로 잘 침투하는 것이 알려져 있고, CAR-TAM/PMN는 종양 미세 환경(TME)을 친-종양에서 항-종양으로 편향시킨다고 여겨진다. 그에 더해, 리간드 결합 도메인이 결합되면 FcαR 신호전달이 시작되고 결과적으로 선천성 효과기가 기능한다. 이와 같이, 바람직한 일 구현예에서, 상기 암은 신경아세포종, 흑색종, 소세포폐암(SCLC), 유잉육종, 골육종, 교세포종, 망막아세포종, 유방암, 방광암, 결정암, 두경부암, 비소세포폐암(NSCLC), 항문암 및 교모세포종으로 구성되는 모둠으로부터 선택된다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명에 따라 치료되는 암은 신경아세포종이다. 네덜란드에서는 매년 중간 연령 3세인 대략 25-35명의 아이들이 신경아세포종으로 진단 받고, 미국에서는 약 800명의 아이들이 진단 받는다. 이 진단 받은 아이들의 약 50%는 고위험군에 속하며, 강도 높은 다양한 치료를 경험하게 된다. 최근에, 항체 기반 항-GD2 면역 요법이 신경아세포종을 가지는 환자의 치료 프로토콜에 도입되었으며, 특히 고위험 신경아세포종 환자에서의 전체 생존(overall survival)을 향상시켰다. 작용 기전으로서, 항-GD2-옵소닌화 종양세포가 항체-의존성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 통해 살해되는데, 효과기 세포들, 호중구, 대식세포 및 NK 세포를 포함하는 다양한 FcγR-발현 면역 세포에 의해 매개되는 과정이다. 치료 요법에 항-GD2 항체를 더함으로써 생존율이 상당히 향상되었지만, 여전히 약 50%의 환자는 재발하고 이 질병에 무릎을 꿇는다. 특히 이 고위험 신경아세포종 환자들은 그래서, 초기에 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 입양 세포 전달의 형태로 도입되는 더 강력하고 표적화된 치료법을 필요로 한다. 초기 단계 임상 시험에서 장래성을 보여주긴 하지만, 신경아세포종에 대한 CAR T 세포 활성은 혈액학적 암에서의 그것의 사용에 대한 경우만큼 강력하지 않았다. 특히 최적이 아닌 T 세포 지속성, 효능, 및 면역 억제 종양 미세 환경은 신경아세포종에 대한 CAR T 세포의 사용에 심각한 장애로 여겨진다. 호중구, 골수 및 NK 세포가 항-GD2 치료의 성공을 견인하는 중요한 효과기 세포로 여겨지기 때문에, 그것들은 본 발명에 따라 신경아세포종의 치료에 특히 유용하다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 치료될 암은 흑색종이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 치료될 암은 유잉육종이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 치료될 암은 유방암, 특히 Her2/neu+ 및/또는 EGFR+ 유방암이다.
본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터 및 특히 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR을 발현하는 세포는 하나 이상의 추가적인 치료제 또는 치료법과 유용하게 조합된다. 이러한 추가적인 요법 또는 치료제는 당업계에 알려진 임의의 항암 또는 면역 조절제 또는 치료법일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 CAR, 핵산 분자, 벡터 또는 세포는 치료용 항체, 체크포인트 억제제, 사이토카인, 화학요법제, 또는 T 세포 기반 치료법과 조합된다. 바람직한 일 구현예에서, 면역요법제 또는 면역 요법, 특히 치료용 항체, 체크포인트 억제제, 사이토카인, 또는 T 세포 기반 치료법과 조합된다.
비제한적인 바람직한 체크포인트의 예로, 세포독성 T-림프구 항원-4(cytotoxic T-lymphocyte antigen-4, CTLA-4), 계획사멸-1(programmed death-1, PD-1), PD-리간드 1(PD-L1), PD-L2, 신호 조절 단백질 알파(Signal-regulatory protein alpha, SIRPα), CD47, T-세포 면역글로불린- 및 뮤신 도메인-3-함유 분자 3(T-cell immunoglobulin- and mucin domain-3-containing molecule 3, TIM3), 림프구 활성화 유전자 3(lymphocyte-activation gene 3, LAG3), 살해세포 면역글로불린-양 수용체(killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR), CD276, CD272, A2AR, VISTA 및 인돌아민-2,3-디옥시게나제(indoleamine 2,3 dioxygenase, IDO)가 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드, CAR, 또는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 CAR를 발현하는 세포와 조합되는 치료용 항체 또는 체크포인트 억제제는 바람직하게는 항-CTLA4 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-SIRPα 항체, 항-CD47 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-CD276 항체, 항-CD272 항체, 항-KIR 항체, 항-A2AR 항체, 항-VISTA 항체, 항-TIGIT 항체 및 항-IDO 항체로 구성되는 모둠으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드, CAR, 또는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 CAR를 발현하는 세포와 유용하게 조합되는 추가적인 치료용 항체는 항-GD2 항체, 항-EGFR 항체, 항-Her2/Neu 항체, 항-CD20 항체, 항-CD3 항체, 항-TNF 알파 항체, 항-CD147 항체, 항-IL8 항체, 항-MUC18 항체, 항-MUC1, 항-알파-4-베타-1 (VLA-4) 및 알파-4-베타-7 항체, 항-VLA-1 인테그린 항체, 항-림포톡신 베타 수용체(lymphotoxin beta receptor, LTBR) 항체, 항-TGF-베타 항체, 항-IL-12 p40 항체, 항-VEGF 항체, 항-HER 수용체 가족 항체, 항-CD11a 항체, 항-IL15 항체, 항-CD40L 항체, 항-CD80 항체, 항-CD23 항체, 항-대식세포 이동 인자(migration factor, MIF) 항체, 항-VE 카드헤린 항체, 항-CD22 항체, 항-CD30 항체, 항-IL15 항체, 항-세포간 부착 분자-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)(CD54) 항체, 항-섬유아세포 성장 인자 수용체 3(fibroblast growth factor receptor 3, FGFR-3) 항체, 항-감마 인터페론 항체, 항-IL-12 항체, 항-Ep-CAM 항체이다. 본 발명의 치료와 조합하여 쓰이는 적당한 항체는 디누툭시맙(dinutuximab), 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 람브롤리주맙(lambrolizumab), 이필리무맙(ipilimumab), 리릴루맙(lirilumab), 트라츄주맙(trastuzumab), 세툭시맙(cetuximab), 페르투주맙(pertuzumab), 파니투무맙(panitumumab), 네시투무맙(necitumumab), 베바시주맙(bevacizumab), 라무시루맙(ramucirumab), 올라라투맙(olaratumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 아도-트라츄주맙 엠타신(ado-trastuzumab emtansine), 데노수맙(denosumab), 아멜루맙(avelumab), 세미플리맙(cemiplimab), 두르발루맙(durvalumab), 엔포르투맙 베도틴(enfortumab vedotin), 트라츄주맙 데룩스테칸(trastuzumab deruxtecan), 사시투주맙 고비테칸 (sacituzumab govitecan)이다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 치료용 항체는 CAR의 이종 리간드 결합 도메인에 의해 인지되는 리간드 또는 항원에 특이적인 항체이다. 다른 바람직한 구현예에서, 치료용 항체는 CAR의 이종 리간드 결합 도메인에 의해 인지되는 리간드 또는 항원이 아닌 다른 리간드 또는 항원에 특이적인 항체이다. 바람직하게는 양 리간드 및/또는 항원은 특정 세포, 특히 암 또는 종양 세포에 의해 발현되고, CAR가 표적으로 한다. 예를 들어, 실시예에서 설명되는 바와 같이, 항-EGFR 항체가 Her2/Neu-CAR와 함께 유용하게 조합된다.
여기 쓰이는 용어 "화학요법제"는 암의 화학요법에서 사용되는 세포독성 약물을 가리킨다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드, CAR, 또는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 CAR를 발현하는 세포와 이롭게 조합되는 화학요법제의 비제한적 예는 알킬화제, 예를 들어 사이클로포스파미드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란(melphalan), 다카르바진, 니트로소우레아 및 테모졸로미드, 그리고 안트라사이클린, 예를 들어 독소루비신, 도노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론 및 발루비신, 세포 골격 교란물질(disruptor), 예를 들어 도세탁셀, 파클리탁셀, 아브락산 및 탁소테르, 토포이소머라제 1 억제제, 예를 들어 이리노테칸 및 토포테칸, 토포이소머라제 H 억제제, 예를 들어 에토포시드, 테니포시드 및 타플루포시드, 키나아제 억제제, 예를 들어 보르테조밉, 에를로티닙, 게피티닙, 이매티닙, 베무라페닙 및 비스모데깁, 뉴클레오타이드 유사체, 예를 들어 아자시티딘, 아자티오프린, 카페시타빈, 시타라빈, 독시플루리딘, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트 및 티오구아닌, 백금-기반 약물, 예를 들어 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴, 및 빈카 알칼로이드 유도체, 예를 들어 빈블라스틴 및 빈크리스틴을 포함한다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드, CAR, 또는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 CAR를 발현하는 세포와 이롭게 조합되는 사이토카인의 비제한적 예는 과립구-대식세포 집락 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 인터루킨(IL)-2, IL-3, IL-4, 및 IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-γ, IFN-κ, IFN-λ, IFN-τ 및 IFN-ω와 같은 인터페론, 종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis factor alpha, TNFα) 및 G-CSF를 포함한다.
실시예에서 설명된 바와 같이(도 5 참조) 본 발명에 따른 GD2-, EGFR- 또는 Her2/neu-FcαR CAR를 발현하는 호중구-양 세포는 놀랍게도, 각 종양 항원 또는 표적 세포가 발현하는 다른 항원을 표적으로 하는 항체와 조합하여 치료하는 경우 각각 GD2+, EGFR+ 및 Her2/neu+ 표적세포에 대해 증가된 세포 독성을 나타낸다. 이와 같이, 바람직한 구현예에서, 특히 암의 치료를 포함하는 면역 요법 시에 본 발명의 세포 또는 세포 군집을 항-종양 항원 항체와 조합한다. 일부 바람직한 구현예에서, 이러한 항-종양 항원 항체는 CAR의 이종 리간드 결합 도메인에 의해 인지되는 리간드 또는 항원, 특히 종양 항원에 특이적인 항체이다. 다른 바람직한 구현예에서, 치료용 항체는 CAR의 이종 리간드 결합 도메인에 의해 인지되는 리간드 또는 항원이 아닌 다른 리간드 또는 항원에 특이적인 항체이다. 바람직하게는, 두 리간드 및/또는 항원 모두 CAR가 표적으로 하는 특정 세포, 특히 암 또는 종양세포에 의해 발현된다. 예를 들어, 실시예에서 설명된 바와 같이, 항-EGFR 항체가 Her2/Neu-CAR와 유용하게 조합된다.
본 발명의 폴리펩타이드, CAR, 핵산 분자, 벡터 및 특히 본 발명의 폴리펩타이드 또는 CAR를 발현하는 세포는 병원체 감염의 치료에 또한 유용하게 쓰일 수 있다. 여기에 쓰이는 "병원성 항원"은 미생물 또는 기생 생물에 의해 발현되는 임의의 항원을 가리키며, 그것은 바이러스, 세균, 기생충, 곰팡이 및 기생 생물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 병원성 세균의 예는 리스테리아(Listeria), 대장균속(Escherichia), 클라미디아(Chlamydia), 리켓차(Rickettsia), 마이코박테리아(Mycobacterium), 포도상구균(Staphylococcus), 연쇄상구균(Streptococcus), 폐렴구균(Pneumococcus), 수막구균(Meningococcus), 크렙시엘라균(Klebsiella), 슈도모나스균(Pseudomonas), 레지오넬라균(Legionella), 디프테리아균(Diphtheria), 살모넬라(Salmonella), 비브리오(Vibrio), 클로스트리디움(Clostridium), 바실러스균(Bacillus), 여시니아( Yersinia), 및 렙토스피라(Leptospira) 세균을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 병원성 바이러스의 예는 A, B 또는 C형 간염, 헤르페스 바이러스(예를 들어 VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, CMV, 엡스타인바르 바이러스(EpsteinBarrr-virus)), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV), 로타바이러스, 모르빌리바이러스, 루벨라 바이러스, 파보바이러스, 박시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스, 유두종 바이러스(papillomavirus), 폴리오바이러스, 광견병 바이러스(rabies virus) 및 인간 면역 결핍증 바이러스(human immunodeficiency virus(HIV) ; 예로 I형 및 II형)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 병원성 곰팡이의 예는 칸디다류(Candida (예: albicans, krusei, glabrata, tropicalis), 아스퍼질러스류(Aspergillus (예: fumigatus, niger), Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Mucorales, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, 및 Coccidioides immitis를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 병원성 기생충의 예는 이질 아메바(Entamoeba histolytica), 말라리아충(Plasmodium, 예: falciparum, vivax), 엔트아메바(Entamoeba), 지아르디아(Giardia), 대장섬모충(Balantidium coli), 가시아메바(Acanthamoeba), 와포자충속(Cryptosporidium), 폐포자충(Pneumocystis carinii), 바베시아 마이크로티(Babesia microti), 트리파노조마충(Trypanosoma)(예: brucei, cruzi), 리슈마니아(Leishmania)(예: donovani), 및 톡소포자충(Toxoplasma gondii)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 핵산 분자, 벡터 또는 세포는 백신에 포함되거나 또는 백신과 조합되어 사용된다. 이와 같이, 본 발명에 따른 핵산 분자, 벡터 또는 세포를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 자극하기 위한 방법에서 사용되기 위한 백신이 제공된다. 상기 방법은 대상체에게 백신을 투여하는 것을 포함한다. 또한 이와 같이 본 발명에 따른 핵산 분자, 벡터 또는 세포를 포함하는 백신이 필요로 하는 대상체에서의 병원성 감염을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 사용되기 위해 제공된다. 상기 방법은 백신을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 백신은 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 및 하나 이상의 아쥬번트와 같은 성분을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자, 벡터 또는 세포가 비-FcαR 세포내 및 막통과 도메인을 포함하는 다른 CAR, 바람직하게는 FcγR 세포내 및/또는 막통과 도메인을 구비한 CAR, 더욱 바람직하게는 FcγR 세포내 및 막통과 도메인 둘 다를 구비한 다른 CAR에 포함되거나 조합하여 사용된다. 이러한 FcγR-CAR의 세포외 리간드 결합 도메인 및 본 발명에 따른 FcαR-CAR의 이종 리간드 결합 도메인은 같거나 또는 다를 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, FcγR-CAR는 본 발명에 따른 FcαR-CAR의 이종 리간드 결합 도메인에 의해 인지되는 것과 동일한 리간드 또는 항원을 인지하는 세포외 리간드 결합 도메인을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 FcαR-CAR의 이종 리간드 결합 도메인에 의해 인지되는 동일한 리간드 또는 항원을 인지하는 세포외 리간드 결합 도메인은 동일한 리간드 결합 도메인을 포함되거나 그것으로 구성된다. 다른 바람직한 구현예에서, 치료용 항체는 CAR의 이종 리간드 결합 도메인에 의해 인지되는 리간드 또는 항원이 아닌 다른 리간드 또는 항원에 특이적인 항체이다. 바람직하게는, 두 리간드 및/또는 항원은 CAR가 표적으로 하는 특정 세포, 특히 암 또는 종양 세포에 의해 발현된다. 예를 들어, 실시예에서 기술된 바와 같이, 항-EGFR 항체가 Her2/Neu-CAR와 이롭게 조합된다.
또한 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 세포 군집을 생산하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은
- 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터를 세포 또는 세포 군집의 세포에 도입하고, 그리고
- 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 CAR이 발현되도록 하는 것을 포함한다.
상기 세포는 바람직하게는 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 조혈 줄기 세포 또는 선천성 림프구이고, 더욱 바람직하게는 인간 골수 세포 또는 골수 전구 세포, 조혈 줄기 세포 또는 선천성 림프구이다. 상기 세포는 바람직하게는 과립구, 호중구, 단핵구, 대식세포, NK 세포 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 상기 세포는 또한 바람직하게는 1차 세포, 더욱 바람직하게는 본 발명에 따라 치료받을 대상체로부터 분리된 자가 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 NK-92 세포주와 같은 세포주로부터의 세포이다.
본 발명의 특징들이 구현예와 동일한 또는 별개의 측면의 일부로서 명확하고 간결한 설명의 목적으로 여기서 설명될 것이다. 구현예들과 동일한 또는 별개의 구현예의 일부로서 여기 설명된 특징들의 전부 또는 일부의 조합을 가지는 구현예도 본 발명의 범위에 포함되는 것을 당업자는 이해할 것이다.
본 발명은 다음의 비제한적 실시예에서 더 자세히 설명될 것이다.
도 1: Fcα 수용체의 아미노산 서열(uniprot P24071-1).
도 2: A. GD2-CAR 설계. B. 예시적인 CAR의 서열.
도 3: NB4 세포에서의 GD2-FcαR-CAR의 발현. NB4 세포는 전체-트랜스 레티노산(All-Trans Retinoic Acid, "atra"로 표시)로 7일 자극한 후에 호중구-양 세포로 분화되었다. GD2-FcαR-CAR의 발현을 유세포 분석기로 정량하였고; n=4(A), 추가로 웨스턴 블롯으로 분석했다(B). 세포를 1차 항체 BiotinSP AffiniPure f(ab)2 (Jackson Immunoresearch) 및 2차 항체 스트렙타비딘 알렉사플루오르 647(Streptavidin Alexafluor 647)(Thermo Fischer Scientific)을 이용하여 염색했다. 빨간 화살표는 예상 분자량에서의 CAR를 가리킨다. 아래의 녹색 부분은 로딩 대조이다.
도 4: 모세포 및 FcαR-CAR-발현 NB4 세포에 의한 GD2-양성 신경아세포종 세포주 LAN-1, NMB 및 IMR-32의 세포 독성. NB4 세포는 전체-트랜스 레티노산으로 7일간 자극하여 호중구-양 세포로 분화되었다. 종양세포들을 수확하고 51크롬으로 표지한 다음, NB4 세포와 종양세포를 표적:효과기의 비율을 1:50으로 하여 37도씨에서 4시간 동안 함께 배양했다. 종양세포는 처치되지 않은 상태[-]거나 또는 항-GD2 항체 디누툭시맙[Dimab]으로 옵소닌화하였다. 세포 독성은 종양세포로부터의 51크롬의 자연 방출 및 최대 방출을 비교하여 측정하였고, [(실험값-자연 방출)/(최대방출 - 자연 방출 값) * 100%]으로 계산했다. 유의성은 Anova로 검정했다; p<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. * = p<0.05; ** = p<0.01; ns = 유의적이지 않음.
도 5: GD2+, EGFR+ 및 Her2/neu+ 표적 세포를 표적으로 하는 종양 항원 표적 항체와 조합한 FcαR CAR NB4 세포의 증가된 세포 독성. NB4 세포는 전체-트랜스 레티노산으로 7일간 자극하여 호중구-양 세포로 분화되었다. NMB, LAN-1, IMR-32, TC-71, A431 및 A431 Her2/neu 종양세포를 수확하고 51크롬으로 표지한 다음 NB4 세포 및 종양세포를 여러 표적:효과기 비율로, 즉 1:25, 1:50, 1:100 및 1:200 비율로 37도씨에서 4시간 동안 함께 배양했다. 종양세포는 처치되지 않은 상태[-]거나, 또는 항-GD2 항체 디누툭시맙[Dimab] 또는 항-EGFR 항체 세툭시맙[Cmab]으로 옵소닌화하였다. 세포 독성은 종양세포로부터의 51크롬의 자연 방출 및 최대 방출을 비교하여 측정하였고, [(실험값-자연 방출)/(최대 방출 - 자연 방출 값) * 100%]으로 계산했다. 유의성은 Anova로 검정했다; p<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. * = p<0.05; ** = p<0.01; ns = 유의적이지 않음.
도 6: NB4 세포의 분화, ROS 생산 및 부착. NB4 세포는 전체-트랜스 레티노산으로 7일간 자극하여 호중구-양 세포로 분화되었다. 분화의 수준은 몇몇 표면 마커를 염색함으로써 유세포분석기로 분석했다: 왼쪽 패널은 양성 세포의 퍼센티지, 오른쪽 패널은 MFI, n=4 (A). 다양한 자극을 이용한 ROS 생산은 NB4 세포로부터 방출되는 과산화수소의 양을 플레이트 판독기 상에서 암플렉스 레드 분석(Amplex Red assay)을 통해 정량했다(B). NB4 세포가 플레이트에 부착하는 능력은 CD18 기능에 대한 측정이며, 다양한 자극에 대해 96-웰 플레이트에 부착하는 칼세인 표지 세포의 양으로 측정하였고, 플레이트 판독기 상에서 검출했다; n=3. NB4 세포의 용해를 칼세인에 의한 NB4 세포의 표지 효과에 대한 대조를 위한 100% 대조군으로 추가했다; n=3 (C).
도 7: GD2-CAR는 항원 의존성이다. NB4 세포는 전체-트랜스 레티노산으로 7일간 자극하여 호중구-양 세포로 분화되었다. LAN-1 표적 세포에서의 GD2 및 GD2 KO의 발현을 유세포분석기로 정량했다; n=1 (A). (B) 종양 세포(LAN-1 WT 및 GD2 KO)를 수확하고 51크롬으로 표지한 후에, GD2-FcαR CAR NB4 세포 및 종양 세포를 여러 표적:효과기 비율로, 즉 1:25, 1:50, 1:100 및 1:200의 비율로 4시간 동안 37도씨에서 함께 배양했다. 세포 독성은 종양세포로부터의 51크롬의 자연 방출 및 최대 방출을 비교하였고, [(실험값-자연 방출)/(최대 방출 - 자연 방출 값) * 100%]으로 계산했다. N=4 독립 실험. (C) NB4 세포에 의한 종양 세포 갉아먹기(trogocytosis)를 유세포 분석기로 세포막 섭취 정량 분석을 통해 실험했다. LAN WT 또는 GD2 KO 세포를 막 염료 DiD로 염색하고 WT NB4 세포 또는 GD2-FcαR CAR NB4 세포와 함께 37도씨에서 90분간 배양했다. 함께 배양한 후에 세포를 고정하고 칸토(Canto) 유세포 분석기로 측정했다. N=3 독립 실험. 유의성은 Anova로 검정했다; p<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. * = p<0.05; ** = p<0.01; ns = 유의적이지 않음.
도 8: GD2-FcαR CAR의 기능성은 FcαR 원형질막 꼬리의 발현에 달렸다. NB4 세포는 전체-트랜스 레티노산으로 7일간 자극하여 호중구-양 세포로 분화되었다. NB4 세포에서의 GD2-FcαR (빨간 막대) 및 GD2-FcαR Δcyt CAR (파란 막대)의 발현을 유세포 분석기로 정량분석 했다. 그 다음 세포들을 1차 항체 BiotinSP AffiniPure F(ab')2 (Jackson Immunoresearch) 및 스트렙타비딘 알렉사플루오르 647(Life technologies)로 염색했다. N=2 독립 실험(A). (B) 종양 세포(LAN-1 WT) 를 수확하고 51크롬으로 표지한 후에 GD2-FcαR (빨간 막대) 및 GD2-FcαR Δcyt CAR(파란 막대) NB4 세포와 종양 세포를 여러 표적:효과기 비율, 즉 1:25, 1:50, 1:100 및 1:200 비율로 4시간 동안 37도씨에서 함께 배양했다. 세포 독성은 종양세포로부터의 51크롬의 자연 방출 및 최대 방출을 비교하였고, [(실험값-자연 방출)/(최대 방출 - 자연 방출 값) * 100%]으로 계산했다. N=8 독립 실험. 유의성은 Anova로 검정했다; p<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. * = p<0.05; ** = p<0.01; ns = 유의적이지 않음.
도 9: FcαR CAR는 EGFR 종양 항원에 대해 효과적이다. NB4 세포는 전체-트랜스 레티노산으로 7일간 자극하여 호중구-양 세포로 분화되었다. (A) NB4 세포에서의 EGFR-FcαR의 발현을 유세포 분석기로 정량 분석했다. 그 다음 세포를 1차 항체 BiotinSP AffiniPure F(ab')2 (Jackson Immunoresearch) 및 스트렙타비딘 알렉사플루오르 647(Life technologies)로 염색했다. WT NB4를 대조군으로서 염색했다. 염색의 히스토그램은 왼쪽에 도시했다; 2개의 독립 실험의 정량 분석은 오른쪽에 도시했다. (B) 종양 세포(A431)를 수확하고 51크롬으로 표지한 후에, WT NB4 세포(회색 막대) 및 EGFR-FcαR (빨간 막대) NB4 세포와 종양 세포를 여러 표적:효과기 비율, 즉 1:25, 1:50, 1:100 및 1:200의 비율로 4시간 동안 37도씨에서 함께 배양했다. 표적 세포는 옵소닌화 되지 않은 상태거나, 또는 항-EGFR 항체 세툭시맙(Cmab, 1 μg/ml)으로 옵소닌화되었다. 세포 독성은 종양세포로부터의 51크롬의 자연 방출 및 최대 방출을 비교하였고, [(실험값-자연 방출)/(최대 방출 - 자연 방출 값) * 100%]으로 계산했다. N=4 독립 실험. (C) NB4 세포에 의한 종양 세포 갉아먹기(trogocytosis)를 유세포 분석기로 세포막 섭취 정량 분석을 통해 실험했다. A431 세포를 막 염료 DiD로 염색하고 WT NB4 세포(회색 막대) 또는 EGFR-FcαR CAR NB4 세포(빨간 막대)와 함께 37도씨에서 90분간 배양했다. 표적 세포는 옵소닌화 되지 않은 상태거나, 또는 항-EGFR 항체 세툭시맙(Cmab, 1 μg/ml)으로 옵소닌화되었다. 공-배양 후에 세포를 고정하고 칸토 유세포 분석기로 측정했다. N=9 독립 실험. 유의성은 Anova로 검정했다; p<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. * = p<0.05; ** = p<0.01; ns = 유의적이지 않음.
도 10: FcαR CAR는 Her2/neu 종양 항원에 대해 효과적이다. NB4 세포는 전체-트랜스 레티노산으로 7일간 자극하여 호중구-양 세포로 분화되었다. (A) NB4 세포에서의 Her2/neu-FcαR의 발현을 유세포 분석기로 정량 분석했다. 그 다음 세포를 1차 항체 BiotinSP AffiniPure F(ab')2 (Jackson Immunoresearch) 및 스트렙타비딘 알렉사플루오르 647(Life technologies)로 염색했다. WT NB4을 대조군으로서 염색했다. 염색의 히스토그램은 왼쪽에 나타냈다; 2개의 독립 실험의 정량 분석은 오른쪽에 나타냈다. (B) 종양세포(SKBR3)를 수확하고 51크롬으로 표지한 다음, WT NB4 세포(회색 막대) 및 Her2/neu-FcαR (빨간 막대) NB4 세포와 종양 세포를 여러 표적:효과기 비율로, 즉 1:25, 1:50, 1:100 및 1:200 비율로 4시간 동안 37도씨에서 함께 배양했다. 표적 세포는 옵소닌화 되지 않은 상태거나, 또는 항-Her2/neu 항체 트라츄주맙(Tcmab, 1 μg/ml)으로 옵소닌화되었다. 세포 독성은 종양세포로부터의 51크롬의 자연 방출 및 최대 방출에 비교하였고, [(실험값-자연 방출)/(최대방출 - 자연 방출 값) * 100%]으로 계산했다. N=6 독립 실험. (C) NB4 세포에 의한 종양 세포 갉아먹기(trogocytosis)를 유세포 분석기로 세포막 섭취 정량분석을 통해 실험했다. SKBR3 세포를 막 염료 DiD로 염색하고 WT NB4 세포(회색 막대) 또는 Her2/neu-FcαR CAR NB4 세포(빨간 막대)와 함께 37도씨에서 90분간 배양했다. 표적 세포는 옵소닌화 되지 않은 상태거나, 또는 항-Her2/neu 항체 트라츄주맙(1 μg/ml)으로 옵소닌화되었다. 공-배양 후에 세포를 고정하고 칸토 유세포 분석기로 측정했다. N=10 독립 실험. 유의성은 Anova로 검정했다; p<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. * = p<0.05; ** = p<0.01; ns = 유의적이지 않음.
도 11: GD2-FcαR CAR는 GD2-FcγR CAR보다 성능이 뛰어나다. NB4 세포는 전체-트랜스 레티노산으로 7일간 자극하여 호중구-양 세포로 분화되었다. (A) NB4 세포에서의 GD2-FcαR CAR 및 GD2-FcγRIIA CAR의 발현을 유세포 분석기로 정량 분석했다. 그 다음 세포를 1차 항체 BiotinSP AffiniPure F(ab')2 (Jackson Immunoresearch) 및 스트렙타비딘 알렉사플루오르 647(Life technologies)로 염색했다. WT NB4을 대조군으로서 염색했다. (B) 종양 세포(LAN-1)를 수확하고 51크롬으로 표지한 다음, GD2-FcαR NB4 세포(빨간 막대) 및 GD2-FcγR CAR(회색 막대) NB4 세포와 종양 세포를 여러 표적:효과기 비율, 즉 1:25, 1:50, 1:100 및 1:200의 비율로 4시간 동안 37도씨에서 함께 배양했다. 세포 독성은 종양세포로부터의 51크롬의 자연 방출 및 최대 방출을 비교하였고, [(실험값-자연 방출)/(최대 방출 - 자연 방출 값) * 100%]으로 계산했다. N=4 독립 실험. 유의성은 Anova로 검정했다; p<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. * = p<0.05; ** = p<0.01; ns = 유의적이지 않음.
도 12: GD2-FcαR CAR 및 GD2-FcγR CAR의 이중 발현은 GD2+ 종양에 대한 세포 독성을 향상시킨다. NB4 세포는 전체-트랜스 레티노산으로 7일간 자극하여 호중구-양 세포로 분화되었다. (A) NB4 세포에서의 이중 CAR 구성체의 발현을 유세포 분석기로 분석했다. N=2 독립 실험. (B) 세포 독성 분석: 종양 세포를 수확하고 51크롬으로 표지한 다음, NB4 세포와 종양 세포를 여러 표적:효과기 비율, 즉 1:25, 1:50, 1:100 및 1:200의 비율로 4시간 동안 37도씨에서 함께 배양했다. 종양 세포는 옵소닌화 되지 않은 상태[-]거나, 또는 항-GD2 항체 디누툭시맙[Dimab]으로 옵소닌화되었다. 세포 독성은 종양세포로부터의 51크롬의 자연 방출 및 최대 방출을 비교하였고, [(실험값-자연 방출)/(최대방출 - 자연 방출 값) * 100%]으로 계산했다. N=6 독립 실험. 유의성은 Anova로 검정했다; p<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. * = p<0.05; ** = p<0.01; ns = 유의적이지 않음.
도 13: FcαR CAR는 mAb에 의한 FcγR 활성화에 비해 추가적인 β2-인테그린 활성화를 일으킨다. NB4 세포는 전체-트랜스 레티노산으로 7일간 자극하여 호중구-양 세포로 분화되었다. 세포 독성 분석: 종양 세포를 수확하고 51크롬으로 표지한 다음, WT NB4 세포(A) 또는 GD2-FcαR CAR NB4 세포(B)와 종양 세포를 여러 표적:효과기 비율, 즉 1:25, 1:50, 1:100 및 1:200의 비율로 4시간 동안 37도씨에서 함께 배양했다. 종양 세포는 옵소닌화 되지 않은 상태[-]거나, 또는 항-GD2 항체 디누툭시맙[Dimab]으로 옵소닌화되었다. CD11b를 포화량의 항-CD11b (44A, 10 μg/ml)로 차단하였고; CD18은 포화량의 항-CD18 항체 (IB4, 10 μg/ml)로 차단했다. 세포 독성은 종양세포로부터의 51크롬의 자연 방출 및 최대 방출과 비교하여 측정하였고, [(실험값-자연 방출)/(최대 방출 - 자연 방출 값) * 100%]으로 계산했다. N=3 독립 실험. 유의성은 Anova로 검정했다; p<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. * = p<0.05; ** = p<0.01; ns = 유의적이지 않음.
도 14: GD2-FcαR CAR가 NK-92 세포에서 발현된다. NK-92 세포를 GD2-FcαR CAR를 발현하도록 렌티바이러스로 트랜스덕션시켰다. 발현은 유세포 분석기로 분석했다. 세포를 그 다음 1차 항체 BiotinSP AffiniPure F(ab')2 (Jackson Immunoresearch) 및 스트렙타비딘 알렉사플루오르 647(Life technologies)로 염색했다.
실시예
재료 및 방법
세포, 배지, 및 항체
NB4, NK-92, 신경아세포종 세포주 LAN-1, IMR-32, NMB, 유잉육종 세포주 TC-71, 및 유방암 세포주 SKBR3(ATCC)를 20% (v/v) 우태혈청, 페니실린(Sigma Aldrich, 100 U/mL), 스트렙토마이신(Sigma Aldrich, 100 μg/mL), 및 l-글루타민 (Sigma Aldrich, 2 mM)이 보충된 IMDM 배지(Thermo Fisher Scientific)에 37도씨, 5% CO2에서 배양했다. NK-92의 배양 배지는 IL-2 (Peprotech, 100 유닛/mL)를 보충했다. 표피모양암종 세포주 A431(ATCC)는 10% (v/v) 우태혈청, 페니실린(Sigma Aldrich, 100 U/mL), 스트렙토마이신(Sigma Aldrich, 100 μg/mL), 및 l-글루타민 (Sigma Aldrich, 2 mM)이 보충된 RPMI 배지(Thermo Fisher Scientific)에 37도씨, 5% CO2에서 배양했다. NB4 세포는 7일간 전체 트랜스 레티노산(ATRA)(Sigma Aldrich, 0.5*106 세포/mL에 5 μmol ATRA/L)으로 호중구-양 세포로 분화시켰다.
Her2/neu를 과발현하는 A431 세포를 렌티바이러스 트랜스덕션을 통해 생성했다. 요약하면, Thermo Fisher Scientific에 Her2/neu 코딩 서열을 주문하고 pENTR1A으로 클로닝했다. 렌티바이러스 벡터 pRRL PPT SFFV 프레스터(prester) SIN - 게이트웨이 B로 재조합한 후에, 렌티바이러스 구성체 pSin-Her2/neu가 형성되었고, 그것을 A431 세포의 트랜스덕션에 사용했다. 세포 분류를 통해 Her2/neu를 발현하는 세포를 선별했다. A431 세포를 10% (v/v) 우태혈청, 페니실린(Sigma Aldrich, 100 U/mL), 스트렙토마이신(Sigma Aldrich, 100 μg/mL), 및 l-글루타민 (Sigma Aldrich, 2 mM)이 보충된 RPMI 배지(Thermo Fisher Scientific)에 37도씨, 5% CO2에서 배양했다.
WT NB4 세포에서의 GD2-CAR 발현을 위해서, 항-GD2 항체 디누툭시맙의 중쇄 및 경쇄 가변 구역(scFv)을 코딩하는 서열을 링커로 연결하고, FcαR의 세포내부분의 세포내 꼬리에 연결했다(도 2A의 대략적인 개요도 및 도 2B의 상세 서열 참조). WT NB4 세포에서 Her2/neu-CAR을 발현시키기 위해, 위에서 GD2-CAR에 대해 기술한 것과 같이 항-Her2/neu 항체 트라츄주맙의 scFv의 코딩 서열을 FcαR의 세포내부분의 세포내 꼬리에 연결했다. NB4 세포에서 EGFR-CAR를 발현시키기 위해, 위에서 GD2-CAR에 대해 기술한 것과 같이 항-EGFR 항체 세툭시맙의 scFv의 코딩 서열을 FcαR의 세포내 부분의 세포내 꼬리에 연결했다.
CAR 구성체
합성 서열은 Thermo Fisher Scientific에 주문했다. 회사 웹사이트에서 제공되는 코돈 최적화 서비스를 이용하여 인간 세포에서 발현되도록 서열을 코돈 최적화했다.
우선, FcαR(막통과 및 세포내)을 pENTR1A의 EcoRI-EcoRV 위치로 클로닝하고, Bsp119I 제한 위치 또한 도입했다. 클로닝이 제대로 됐는지 아가로즈겔 상에서 제한 효소 분석을 통해 확인했다. 그 다음, GD2-CAR-링커, Her2/neu-CAR-링커, 또는 EGFR-CAR-링커 단편(모두 인간 IgG1의 CH2CH3 도메인(힌지)를 가짐)을 pENTR1A - FcαR(막통과 및 세포내)의 SalI-Bsp119I 위치로 클로닝하고, 클로닝이 제대로 됐는지 아가로즈겔 상에서 제한 효소 분석을 통해 확인했다. pENTR1A-GD2-CAR-링커-힌지-FcαR(막통과 및 세포내) 구성체를 Bsp119I-EcoRV 단편을 교체함(swapping)으로써 FcαR(막통과) 또는 FcγRIIa(막통과 및 세포내)와 융합시켜 GD2-CAR 융합체를 생성하기 위해 사용했다.
IRES GFP 구성체의 생성을 위해, 우선 LZRS mcs IRES GFP의 IRES GFP 서열(5' SnaBI 제한 위치도 포함)을 pENTR1A의 EcoRI-NotI 위치로 복제했다. 전체 CAR-IRES GFP 구성체의 후속 복제는 EcoRV 제한 위치 대신 SnaBI 제한 위치가 사용된 것을 제외하고는 IRES GFP가 없는 구성체에 대해 기술한 것과 유사하다.
V5 태그를 힌지의 PCR 증폭을 통해 pENTR1A-GD2-CAR-링커-힌지-FcαR(막통과 및 세포내) IRES GFP로 다음의 프라이머를 사용하여 도입했다:
정방향: 5' aatagctggaccgaccagg 3', GD2 CAR의 VL 구역에서 어닐링,
역방향: 5' gagatc ttcgaa ggt gga gtc gag gcc cag cag agg atta gg aat ggg ctt gcc accggt ctt gcc ggg gct cag aga cag 3', 굵은 글씨체의 Bsp119I 제한 위치, 이탤릭체의 AgeI 제한 위치, 밑줄 친 V5 서열(인간 세포에서 발현되도록 코돈 최적화됨), 및 밑줄 친 굵은 글씨체의 힌지 내의 서열 어닐링을 포함.
이 프라이머들을 pENTR1A-GD2-CAR-링커-힌지-FcαR(막통과 및 세포내) IRES GFP 상에서 이용한 PCR로 GD2-CAR VL의 일부, 내부 SmaI 제한 위치, 힌지, V5 태그 및 Bsp119I 제한 위치를 포함하는 단편을 형성했다. 이 SmaI-Bsp119I 단편을 pENTR1A-GD2-CAR-링커-힌지-FcγRIIa(막통과 및 세포내) IRES GFP의 SmaI-Bsp119I 위치로 복제하여 V5 태그를 포함하는 힌지로 원래의 힌지를 대체했다. 클로닝이 제대로 됐는지 아가로즈겔 상에서 제한 효소 분석 및 서열 분석을 통해 확인했다.
이중 CAR 구성체는 IVS IRES 체리를 포함하는 V5-태그 구성체를 추가함으로써 생성했다. 우선, pIRESPuro2(Clontech)의 IVS IRES 서열을 다음 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭했다:
정방향: 5' gagatcgaattcgaattaattcgctgtctgcga 3'-굵은 글씨체의 EcoRI 제한 위치 포함,
역방향: 5' gagatcaccggtcatggaaggtcgtctccttg 3'-이탤릭체의 AgeI 제한 위치 포함,
(IVS = 합성 인트론. Clontech사의 매뉴얼에 따르면 mRNA의 안정성을 높이는 것으로 알려짐).
소화 및 젤 정제 후에, PCR 산물을 pmCherry-N1(Clontech)의 EcoRI-AgeI 위치로 복제했다. 아가로즈 겔 상에서의 제한 효소 분석 및 서열 분석을 통해 바르게 복제됐는지 확인했다. 그 다음, EcoRV 제한 위치를 올리고 5' aattccggatatccgg 3'를 사용하여 pmCherry-N1 - IVS IRE의 EcoRI 위치에 도입했다. 어닐링 후에, 이 단편으로 EcoRI 돌출(overhang) dsDNA 단편이 형성된다. 아가로즈 겔 상에서의 제한 효소 분석을 통해 바르게 복제됐는지 확인했다. 그 다음, IVS IRES 체리를 포함하는 EcoRV-NotI 단편을 pENTR1A-GD2-CAR-링커-힌지-V5-FcγRIIa (막통과 및 세포내) IRES GFP의 SnaBI-NotI 위치로 복제하여 IRES GFP를 IVS IRES 체리로 대체했다. 아가로즈 겔 상에서의 제한 효소 분석을 통해 바르게 복제됐는지 확인했다.
결과로 나온 pENTR1A-GD2-CAR-FcαR (막통과 및 세포내) 전체 최종 pENTR1A 구성체를 그 다음 pRRL PPT SFFV 프레스터 SIN - 게이트웨이 B와 재결합시켰다.
클로닝 소화를 위해, 약 1 ㎍의 플라스미드를 1x Fast Digest 완충액 내의 FastDigest 효소(Thermo Fisher Scientific)로 37oC에서 20분 이상 소화시켰다. 1% 아가로즈 상에서 소화를 지속했다; 제대로 된 단편을 깨끗한 외과용 날로 슬라이스로 만든 다음, QiaQuick Gel 추출키트(Biorad)를 사용하여 정제했다. 마지막 단계로 상기 DNA를 H2O에서 용출시켰다.
연결(ligation)을 위해서, 벡터 및 삽입물을 1x 쾌속 연결 완충액(Rapid Ligation Buffer)(Thermo Fisher Scientific) 내의 Rapid T4 리가아제와 함께, 실온에서 10분 이상 배양했다. 관문(Gateway) 재조합을 위해서, ~150 ng의 pRRL PPT SFFV 프레스터 SIN - 게이트웨이 B 및 ~100 ng의 상기 pENTR1A 구성체를 Tris-EDTA(TE) 완충액(pH 8.0)에 넣은 후에, LR CLonase II(Thermo Fisher Scientific)를 넣고, 그 다음 반응물을 부드럽게 혼합하면서 25oC에서 밤새 배양했다.
E.coli DH5α의 형질전환을 위해, 연결 산물을 DH5α에 넣고, 얼음 위에서 8분간 배양한 다음, 42oC에서 42초간 열충격을 가했다. 반응물을 그 다음 얼음 위에서 2분간 배양한 후에, Lysogeny broth(LB)를 첨가하고 37oC 및 200 rpm에서 30-60분간 배양한 다음 전체 반응물을 30 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는(pENTR1A 구성체의 경우) 또는 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는(pRRL PPT SFFV 구성체의 경우) LB-아가 상에 도포하고 플레이트를 37oC에서 밤새 배양했다.
단일 군집을 채취하여 LB + 30 ㎍/ml 카나마이신 또는 100 ㎍/ml 암피실린을 접종하기 위해 사용하고, 37oC 및 200 rpm에서 밤새 배양했다. 다음 날 밤새 배양한 것을 Nucleospin Plasmid EasyPure 키트(Bioke)를 이용하여 미니프렙(miniprep) DNA를 분리하기 위해 사용했다. 미니프렙을 확인하기 위해, 미니프렙 DNA를 1x FastDigest 완충액 내 FastDigest 효소로 37oC에서 20분 이상 소화시키고, 소화된 것을 1% 아가로즈 겔 상에 전개시켰다. Nucleobond Xtra Maxi 키트(Bioke)를 이용하여 밤새 배양한 것에 맥시프렙(Maxiprep)을 수행했다.
맥시프렙을 확인하기 위해 약 400 ng의 맥시프렙 DNA를 1x FastDigest 완충액 내 FastDigest 효소로 37oC에서 20분 이상 소화시키고, 소화물을 1% 아가로즈 겔 상에 전개시켰다. 구성체는 추가적인 서열을 가지지 않았다.
HEK293T 세포를 렌티바이러스 입자를 생산하기 위해 사용했고, IMDM 배지(상기 설명된 첨가제들을 함유하는) 안에서 렌티바이러스 벡터, pMDLgp, pRSCrev 및 pCMV-VSVg로 공동-트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 2일 뒤에, 렌티바이러스 함유 상층액을 0.45μM 필터로 여과하고, NB4 세포에 넣은 다음, 그 세포들을 2일 뒤에 렌티바이러스가 없는 배지에 통과시켰다. 세포들을 분석에서 사용하기 전에, BiotinSP AffiniPure F(ab')2 (Jackson Immunoresearch, 1 BiotinSP AffiniPure F(ab')2 (Jackson Immunoresearch, 1 μg/mL) 및 Streptavidin Alexafluor 647 (Life technologies, 10 μg/mL)을 이용하는 유세포 분석을 통해 scFv 항-GD2 항체 발현에 대해 세포들을 분류했다.
부착
NB4 세포(5*106 세포/mL)를 칼세인-AM(Molecular Probes, 1 μmol/L)으로 37oC에서 30분간 형광표지하고, 코팅되지 않은 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, 2*106 세포/mL) 안의, 알부민(Albuman, Sanquin Plasma Products, 200 μg/mL), 포도당(Merck, 1 mg/mL), 및 칼슘(Calbiotech, cat. 208291, 1 mol/L)을 함유하는 HEPES+(7.7 g NaCl(Fagron), 4,775 g HEPES(Sigma Aldrich), 450 mg KCl(Merck), 250 mg MgSO4(Merck), 275 mg K2HPO4(Merck), H2O(Gibco), 10 mol/L NaOH로 pH 7.4로 조정)에서 배양했다. 세포들을 37oC, 5% CO2에서 여러 가지 자극원의 존재 하에 30분간 배양했다: 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)(Sigma Aldrich, 10 mmol/L), Pam3Cys(EMN Microcollections, 20 mg/mL), C5a(Sigma Aldrich, 10 nmol/L), 종양 괴사 인자 α(TNFα)(Peprotech, 10 ng/mL), 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)(Sigma Aldrich, 100 ng/mL), 혈소판-활성화 인자(PAF)(Sigma Aldrich, 100 nmol/L), N-포르물메티오닌-류실-페닐알라닌(N-formulmethionine-leucyl-phenylalanine, fMLP) (Sigma Aldrich, 30 nmol/L), 또는 HEPES+ 배지. 플레이트를 PBS로 두 번 씻고, 세포들을 Triton(Sigma Aldrich, 0.5% X-100)으로 실온에서 10분간 분해했다. 칼세인-표지 NB4 세포의 100% 분해 산물을 대조군으로 사용했다. 게니오스(Genios) 플레이트 판독기(Tecan)로 485 nm에서의 여기 파장과 535 nm의 방출 파장에서 부착을 측정했다.
NADPH 옥시다제 활성
ROS 생산은 NB4 세포의 자극 후에 세포외 과산화수소 방출을 측정함으로써 Amplex Red 분석으로 측정했다. NB4 세포(1*106 세포/mL)를 Amplex Red (molecular probes, 20mM) 및 서양고추냉이 퍼옥시다제(Sigma Aldrich, 200 U/mL)와 함께 37oC에서 5분간 배양했다. 세포를 비옵소닌화 자이모산(zymosan)(MP Biomedicals, 1 mg/mL), 혈청 처리 자이모산(STZ)37, PMA (Sigma Aldrich, 100 ng/mL), fMLP(Sigma Aldrich, 30 nmol/L), PAF(Sigma Aldrich, 100 nmol/L)/fMLP (Sigma Aldrich, 30 nmol/L), 및 음성 대조군으로서 HEPES+로 활성화시켰다. 게니오스 플레이트 판독기(Tecan)로 30초 간격으로 30분간 형광을 측정했다. 생산된 H2O2의 농도는 2분 간격으로 535 nm의 여기 파장 및 595 nm의 방출 파장에서의 교정곡선(calibration curve)으로부터 결정했다. 결과는 상대 형광 유닛/분의 최대 기울기로 나타냈다.
웨스턴 블롯
항-GD2 항체의 scFv가 발현되었는지 NB4 GD2-CAR를 웨스턴블롯으로 검사했다. 5*106 NB4 세포를 PBS로 씻고 50μL의 완전 프로테아제 억제제 칵테일(Roche diagnostics)/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(0.45 mol/L) 및 50 μL의 2x 시료 완충액(25 mL Tris B)(Invitrogen), 20 mL 100% 글리세롤(Sigma Aldrich), 5g 도데실황산나트륨(SDS) (Serva), 1.54 g DTT(Sigma Aldrich), 20 mg 브로모페놀 블루(Sigma Aldrich), 1.7 mL β 머캅토에탄올(Bio-Rad) 및 50 mL까지의 H2O(Gibco)에 95oC에서 30분간, 매 10분마다 흔들어 혼합(vortexing)하면서 재현탁했다. 전기영동을 위해서, 1*106 세포를 10% SDS-폴리아미드 전기영동(PAGE) 겔 상에 장전하고, 80 내지 120 볼트로 전개시켰다. 니트로셀룰로오스 막(GE Healthcare Life Science)을 0.33 암페어에서 1시간 동안 단백질을 전달하기 위해 사용했다. 막을 5% 소의 혈청 알부민(BSA) (Sigma)/Tris-완충 식염수, 0.1% Tween 20 (TBST)에서 실온에서 1시간 동안 차단하고 염색했다. BiotinSP Affinipure f(ab)2 (Jackson Immunoresearch, 0.1μg/mL, 4oC에서 밤새)을 GD2-CAR의 f(ab)2 구역을 탐지하기 위해 사용했고, IRDYE 680 스트렙타비딘(LI-COR, 0.4 μg/mL, 실온에서 한 시간)을 오디세이(LI-COR Biosciences) 분석을 위해 사용했다.
유세포 분석
항-GD2 항체의 scFv 발현을 1차 항체 BiotinSP Affinipure f(ab)2 항-마우스(Jackson Immunoresearch, 1 μg/mL, 4℃에서 30 분)로 탐지하고, BD FACSCantoII 상에서 Streptavidin alexafluor 647(Life technologies, 10 μg/mL, 4℃에서 30 분)로 가시화했다. 항-Her2/neu 및 항-EGFR 항체의 scFv 발현을 1차 항체 BiotinSP Affinipure f(ab)2 항-인간(Jackson Immunoresearch, 1 μg/mL, 4℃에서 30 분)로 탐지하고, BD FACSCantoII 상에서 2차 항체 Streptavidin alexafluor 647(Life technologies, 10 μg/mL, 4℃에서 30 분)로 가시화했다.
분화 마커 CD11b, FcγRIII (CD16), FcγRII (CD32), FcγRI (CD64)의 발현을 NB4 세포의 성숙을 확인하기 위해 매 ADCC 분석 전에 유세포 분석기로 시험했다. 간단히, 세포를 앞서 언급한 마커들에 대한 형광 표지된 항체와 함께 PBS/0.5% 인간 혈청 알부민(HSA)에서 얼음 위에서 30분간 배양했다. 두 번 씻은 다음, 세포를 100 μL PBS/0.5% HSA 안에 재현탁 하고 BD FACSCantoII 상에서 측정했다.
세포 독성 분석
신경아세포종 세포주 LAN-1, IMR-32, NMB, 유잉육종 세포주 TC-71, 유방암 세포주 SKBR3 및 표피모양 암종 A431을 표적 세포로 사용했다. 표적 세포주를 트립신(1%, PBS 내) 처리하여 수확한 후에, 0.5*106 세포를 150 μL IMDM/RPMI 배지(상기 기술)안에서 50 μCi 51Cr (Perkin-Elmer, USA)으로 37℃에서 90분간 표지했다. 지시된 실험을 위해서, LAN-1, IMR-32, NMB 및 TC-71 세포를 IMDM 배지(상기 기술) 안에서 디누툭시맙(Unituxin, ch14.18, United Therapeutics, 1 μg/mL)으로 옵소닌화했다. SKBR3 세포는 트라츄주맙(허셉틴, Roche, 1 μg/mL)에 지시된 것과 같이 옵소닌화하였다. A431은 세툭시맙(Erbitux, Merck, 1 μg/mL)에 지시된 것과 같이 옵소닌화했다. 표적 세포(5*103 세포/웰) 및 효과기 세포(2.5*105 세포/웰)(1:50 표적 세포:효과기 세포(T:E) 비율 또는 도면에 표시된 바와 같은 다른 T:E 비율)를 96-웰 U-바닥 조직 배양 플레이트에서 IMDM (상기 설명됨)에서 37℃, 5% CO2 하에서 4시간 동안 함께 배양했다. 세포 독성은 0.1% 트리톤(Sigma Aldrich, TX-100)에 의한 100% 51Cr 방출에 대해 정규화했다. 30 μL의 상층액을 방사능에 대한 마이크로베타2 판독기(PerkinElmer)에서 분석했다. 세포 독성의 퍼센티지는 [(실험값-자연 방출)/(최대 방출-자연 방출) * 100%]으로 결정했다. 두 번 또는 세 번 시험 조건이었다.
세포 갉아먹기(Trogocytosis) 분석
분화된 NB4 세포에 의한 표적 세포 갉아먹기를 유세포 분석을 사용하여 정량 분석하였고, NB4 세포에 의한 종양 세포막의 섭취로 측정했다. 종양 세포를 2 μM 친유성 막 염료 DiD(1,1-Dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine, Invitrogen)로 염색했다. 표지 후에, 표적 세포를 PBS로 두 번 씻어냈다. 세포를 T:E 비율 1:5(즉, 50,000:250,000 세포)로 표시된대로 0.5 μg/mL의 디누툭시맙, 트라츄주맙 또는 세툭시맙의 부재 또는 존재 하에 U-바닥 96-웰 플레이트(Greiner Bio-One) 안의 IMDM 완전 배지에서 37°C 및 5% CO2로 60분간 함께 배양했다. 배양 후에, 세포를 STOP 완충액(20 mM NaF, 0.5% PFA 및 1% BSA를 함유하는 PBS)으로 고정하고 유세포 분석기 Canto II (BD Biosciences)를 사용하여 분석했다. NB4 세포 군집은 막 염료 DiO의 평균 형광 강도로 측정했다.
데이터 분석 및 통계
Flowjo 소프트웨어(Tree Star, Inc, Ashland, OR, USA)를 유세포 분석 데이터를 분석하는 데 사용했고 Graphpad Prism 버전 8(Graphpad software)을 부착, Amplex Red, NB4 세포 분화, 유세포 분석 및 ADCC 결과를 가시화하는 데 사용했다. 통계 분석은 Prism을 사용하여 수행했다. 부착, Amplex Red 및 분화 마커 발현에 대해서는 양 방향 ANOVA-검정법을 사용한 후에 Sidak 사후검정법을 사용했다. 세포 독성 분석에 대해서는 일방향 ANOVA-검정법을 사용한 후에 Sidak 사후검정법을 사용했다.
결과
GD2- FcαR-CAR가 분화된 NB4 세포에 의해 발현된다
NB4는 ATRA로 7일간 자극하여 호중구-양 세포로 분화되었고, 그 후에 GD2-FcαR-CAR의 발현을 유세포 분석으로 평가했다. 도 3A는 80%를 넘는 NB4 세포가 GD2 FcαR-CAR 양성임을 보여준다. 또한, GD2-FcαR-CAR를 발현하도록 트랜스덕션된 NB4 세포는, MFI로 측정하고 WT NB4 세포와 비교했을 때 CAR를 높게 발현했다. 웨스턴 블롯(도 3B) 결과는 GD2-FcαR-CAR가 오직, 예상 높이 ~83 kDa의 CAR 구성체를 발현하도록 트랜스덕션된 ATRA 분화 NB4 세포에서만 발현됨을 보여준다.
GD2-FcαR-CAR 발현 NB4 세포는 GD2+ 신경아세포종 세포주를 사멸할 수 있다.
NB4 세포는 ATRA로 7일 자극하여 호중구-양 세포로 분화되었고, GD2-양성 신경아세포종 세포주에 대한 세포 독성 분석에 쓰였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, GD2-FcαR-CAR 구성체를 발현하는 NB4 세포는 항-GD2 옵소닌화의 필요 없이 GD2+ 신경아세포종 세포주 LAN-1, NMB 및 IMR-32를 사멸할 수 있었다. 비-옵소닌화 조건에서 실험한 모든 신경아세포종 세포주에 대한 GD2 FcαR CAR의 세포 독성 효능은 디누툭시맙-옵소닌화 신경아세포종 세포에 대한 WT NB4 세포의 사멸 효능과 유사했다. 비-옵소닌화 신경아세포종 세포는 WT NB4 세포에 의해 사멸되지 않았다. T:E 비율 1:25 내지 1:200의 적정으로 신경아세포종 세포주 LAN-1 및 NMB에 대한 농도 의존적 세포 독성 효과를 확인했다. 다시, GD2-FcαR-CAR 발현 NB4 세포는 항-GD2 항체 디누툭시맙으로 옵소닌화할 필요 없이 GD2+ 신경아세포종 세포주를 사멸할 수 있었다. WT NB4는 어떠한 T:E 비율에서도 비-옵소닌화 신경아세포종 세포주를 사멸할 수 없었다. 신경아세포종 세포주를 디누툭시맙으로 옵소닌화하면 NB4 WT 세포의 높은 T:E 비율에서 LAN-1 및 NMB 세포에 대해 증강된 세포 독성을 일으켰다. 이러한 옵소닌화 신경세포종 세포에 대한 농도 의존성 세포 독성은 표적 세포가 GD2-FcαR-CAR 발현 NB4 세포와 함께 배양되었을 때 훨씬 더 뚜렷했다(도 5).
GD2-FCαR-CAR를 발현하거나 발현하지 않는 NB4 세포의 분화를 7일의 ATRA 분화 후에 유세포 분석으로 확인했다. 도 6A는 CD11b 및 Fc-수용체를 포함하는, NB4 세포의 충분한 분화의 척도로서 몇몇 세포막 마커의 표면 발현을 나타낸다. 앞서 언급한 표면 마커의 발현에서 전체적으로 WT NB4 세포 및 GD2-FcαR-CAR 발현 NB4 세포 사이에 차이는 탐지되지 않았고, CAR의 발현이 이 세포의 호중구-양 세포로의 분화 과정을 방해하지 않음을 나타낸다. 또한, 우리는 두 가지 항-미생물 효과기 기능을 평가했다: ROS를 생산하는 능력, 및 CD11b/CD18-매개 부착. 도 6B 및 C에 나타낸 바와 같이, Amplex Red 분석으로 측정한 ROS 생산 및 부착 모두 WT NB4 세포와 GD2-FcαR-CAR NB4 세포 사이에 유의적으로 다르지 않았다.
종합하면, 우리의 데이터는 GD2-FcαR-CAR 발현이 NB4 세포의 분화와 효과기 기능을 망치지 않는다는 것을 보여준다. 또한, NB4 세포 상에서 발현된 GD2-FcαR-CAR가 항-GD2 옵소닌화할 필요 없이 GD2-양성 신경아세포종 세포주에 대해 세포 독성을 유도한다.
여러 가지 다양한 GD2+, EGFR+ 및 Her2/neu+ 표적 세포에 대한 종양 항원 표적 항체와 조합한 FcαR CAR NB4 세포의 세포 독성 증가
도 5에 나타낸 바와 같이, NMB 및 LAN-1 세포주에 대한 데이터 세트의 확장으로, 우리는 표적 세포주의 수를 늘렸다. EGFR+ 표피모양암종 및 모든 GD2+ 신경아세포종 및 유잉육종 세포주를 NB4 세포 안의 EGFR/GD2-FcαR CAR와 종양 세포 상의 항-EGFR 또는 항-GD2 옵소닌화 항체와 각각 조합하여 실험했고, 가장 높은 T:E 비율(1:200)에서 종양 세포에 대해 유의적으로 증가된 세포 독성을 보였다(도 5). A431에 대해서는 EGFR-FcαR CAR의 사멸 효능이 항-EGFR 항체와 조합한 후에 모든 T:E 비율에서 증가했다. LAN-1의 경우, 1:200 T:E 비율, 또한 1:100의 T:E 비율에서 앞서 언급된 GD2-FcαR CAR 및 항-GD2-옵소닌화 항체를 조합한 후에 유의적으로 증강된 세포 독성을 나타냈다(도 5 참조). GD2+ 표적 세포의 경우, 낮은 T:E 비율(1:25, 1:50)에서도 사멸이 증가되는 경향이 관찰되었지만, 이 조건은 실험한 환경 하에서는 유의적이지는 않았다. Her2/neu-표적 FcαR CAR에 대해서는, CAR-발현 NB4 세포의 사멸 효능이 CAR scFv 항원 인식 부분에서 사용된 것이 아닌 종양 표적 항체와 함께 조합했을 때 더 향상되었고, 이 경우 항-EGFR 항체 세툭시맙이었다(도 5 참조).
GD2-FcαR-CAR는 항원 특이적이다.
NB4 세포는 7일의 ATRA 자극에 의해 호중구-양 세포로 분화되었고, GD2-양성 세포 및 녹아웃 신경아세포종 세포주 LAN-1에 대한 세포 독성 분석에 사용되었다(도 7A 참조). 도 7B는 GD2-FcαR-CAR 구성체를 발현하는 NB4 세포가 GD2+ 신경아세포종 세포주 LAN-1를 사멸할 수 있지만, GD2KO LAN-1 세포는 사멸할 수 없음을 보여주는데, GD2-FcαR-CAR가 항원 특이적임을 나타낸다. 세포 갉아먹기(트로고사이토시스)에 대해서는, 항체-옵소닌화 종양 세포에 대한 호중구의 효과기 기전으로 최근에 알려진 것으로(Matlung et al., Cell Rep. 2018;23(13):3946-3959.e6), GD2-FcαR-CAR를 사용한 세포 독성 분석에서 관찰된 것과 유사한 항원 특이성 및 전체적인 유형을 나타낸다(도 7C).
GD2-FcαR CAR의 기능성은 FcαR 세포질 꼬리의 발현에 의존한다.
모 GD2-FcαR-CAR 구성체 다음으로, 우리는 FcαR의 세포질 도메인 결여 GD2-FcαR-CAR를 발현시켰다(GD2-FcαR Δcyt CAR, 도 8A). 이 GD2-FcαR Δcyt CAR 발현 NB4 세포를 7일의 ATRA 자극으로 호중구-양 세포로 분화시키고, GD2-양성 신경아세포종 세포주 LAN-1에 대한 세포 독성 분석에 사용했다. 도 8B는 이 GD2-FcαR Δcyt CAR 발현 NB4 세포의 세포 독성이 GD2-FcαR CAR NB4 세포에 의해 수행되는 사멸에 비해 완전히 소멸된 것을 보여주는데, FcαR 세포질 도메인이 GD2- FcαR CAR의 기능에 필수불가결함을 나타낸다.
FcαR CAR는 추가적인 종양 항원에 대해 효과적이다.
GD2-표적화 FcαR CAR에 더해, 우리는 NB4 세포 내에 종양 항원 EGFR(도 9A) 및 Her2/neu(도 10A)를 표적으로 하는 FcαR CAR를 만들었다. 도 9B 및 10B에 나타낸 바와 같이, EGFR 및 Her2/neu- FcαR-CAR 구성체를 발현하는 NB4 세포는 항-EGFR 및 항-Her2/neu 옵소닌화 필요 없이, EGFR+ 및 Her2/neu+ 표피모양암종 및 유방암 세포주 A431 및 SKBR3를 각각 사멸할 수 있었다. 비-옵소닌화 조건에서 EGFR-FcαR CAR의 세포 독성 효능은 세툭시맙-옵소닌화 A431 세포에 대한 WT NB4 세포의 사멸 능력과 유사했고(도 9B), 트라츄주맙-옵소닌화 SKBR3 세포에 대한 사멸보다는 심지어 뛰어났다(도 10B). 비-옵소닌화 표적 세포는 어떤 비율의 T:E에서도 WT NB4 세포에 의해 사멸되지 않았다. 세포 갉아먹기에서 EGFR-FcαR-CAR (도 9C) 및 Her2/neu-FcαR-CAR (도 10C)를 사용한 세포 독성 분석에서와 유사한 전체 유형을 보였다.
GD2-FcαR CAR는 GD2-FcγR CAR보다 뛰어난 효과를 보인다.
우리는 세포 독성 효능을 연구하기 위해 두 개의 다른 CAR 구성체를 제작했다: FcαR 또는 FcγRIIA의 세포질 도메인을 포함하는 GD2-표적화 CAR 구성체. 두 CAR 구성체의 발현은 유세포 분석으로 확인했을 때 GD2-FcγRIIA CAR에 대해 더 높지 않았다면, 유사했다(도 11A). 도 11B에서 명확하게 볼 수 있다시피, NB4 세포 내의 GD2-FcαR CAR에 의해 유도되는 세포 독성이 NB4 세포 내의 GD2-FcγRIIA CAR 에 의해 유도되는 세포 독성보다 모든 T:E 비율에서 뛰어났다. 더 구체적으로, NB4 세포 내의 GD2-FcγRIIA CAR 발현은 GD2+ 표적 세포의 사멸을 유도하지 않았다.
GD2-FcαR CAR 및 GD2-FcγR CAR의 이중 발현은 GD2+ 종양 세포에 대한 세포 독성을 향상시킨다.
추가로, FcαR 및 FcγR 신호전달 사이의 가능성 있는 응수(cross-talk)를 연구하기 위해 우리는 동일한 NB4 세포 배양물에 여러 CAR를 발현시켰다. 도 12A는 NB4 세포에서 GD2-FcαR CAR 및 GD2-FcγRIIA CAR가 성공적으로 이중 발현되었음을 보여준다. 또한, 우리는 NB4 세포에서 FcαR의 절단된 세포질 도메인을 포함하는 GD2-FcαR Δcyt CAR를 발현시키고, GD2-FcγRIIA CAR와 연결했다(도 12A).
앞에서 보여진 바와 같이, NB4 세포 내의 GD2-FcγRIIA CAR 단독 발현은 GD2+ LAN-1 표적세포의 항체-의존성 사멸을 유도하지 않았고, 한편 GD2-FcγRIIA CAR 발현 NB4 세포는 오직 LAN-1 세포가 디누툭시맙으로 옵소닌화 되었을 때만 효과기 기능을 발휘할 수 있었다(도 12B). NB4 세포 내의 GD2-FcαR CAR 및 GD2-FcγRIIA CAR의 이중 발현은 GD2-FcαR CAR 단독에 비해, 항체 옵소닌화에 대한 필요 없이 LAN-1 세포를 향한 사멸 효능을 향상시켰다. 항체-옵소닌화 이후 이 GD2-FcαR CAR 및 GD2-FcγRIIA CAR 이중 발현 NB4 세포의 사멸 효능의 추가적인 향상은 FcαR CAR에 더한 다른 Fc-수용체에 의한 동시 신호전달에 의해 유도된 것으로 강하게 추정된다. 항체-의존성 및 항체-비의존성 사멸의 관찰된 증가는 또한 기능적인 FcαR 신호전달에 의존하는데, 왜냐하면, 절단된 GD2-FcαR CAR는 LAN-1 세포에 대한 사멸을 기준선으로 되돌렸기 때문이다.
종양-항원 옵소닌화 항체와의 조합 후의 NB4 세포에서 관찰된 FcαR CAR에 대한 증강된 사멸의 뒤에 있는 작용 기전은 FcγR 활성화 후의 항체-유도 사멸에 비해 추가적인 β2-인테그린 활성화와 관련 있는 것으로 보인다. 도 13A 및 B는 CD11b나 CD18에 대한 차단 항체가 항-GD2 및 FcγR-유도 사멸을 완전히 억제할 수 있음을 보여주는 한편, 이 세포 독성은 GD2-FcαR CAR 유도 사멸의 경우에는 항-CD11b 처치 후에 감소되지만 완전히 억제되지는 않는다. 다른 한편, 항-CD18 처치는 GD2-FcαR CAR에 의해 유도되는 항체-의존성 및 항체-비의존성 사멸을 완전히 제거했다(도 13B).
GD2- FcαR-CAR는 NK-92 세포에 의해 발현된다.
마지막으로 NK-92 세포에서의 GD2-FcαR-CAR의 발현을 유세포 분석으로 평가했다. 도 14는 GD2-FcαR-CAR를 발현하도록 트랜스덕션된 NK-92 세포가 MFI로 측정하고 WT NK-92 세포와 비교했을 때 CAR를 높게 발현함을 보여준다(도 14).
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Claims (25)

  1. - Fc 알파 수용체(FcαR)의 세포내 도메인,
    - FcαR의 막통과(transmembrane) 도메인, 및
    - 이종 리간드-결합 도메인:
    을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 호중구 또는 NK 세포.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 FcαR의 막통과 도메인 및 리간드-결합 도메인 사이에 자리 잡은 스페이서를 더 포함하는 것인 호중구 또는 NK 세포.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드-결합 도메인은 종양 항원 또는 또는 골수 유래 억제 세포 항원 특이적 도메인과 같은 세포 표면 항원에 특이적인 도메인인 것인 호중구 또는 NK 세포.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드-결합 도메인은 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 나노체 또는 그것의 항원 결합 단편, 또는 애피머를 포함하는 것인 호중구 또는 NK 세포.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드-결합 도메인은 GD2, EGFR 또는 HER2/Neu 특이적인 것인 호중구 또는 NK 세포.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 도 1에 도시된 FcαR의 아미노산 서열의 아미노산 228 내지 287을 포함하는 것인 호중구 또는 NK 세포.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 CAR를 인코딩하는 핵산 분자가 마련된 것인 호중구 또는 NK 세포.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터가 마련된 것인 호중구 또는 NK 세포.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 핵산 분자 또는 벡터가 상기 호중구 또는 NK 세포로 도입되는 것인 호중구 또는 NK 세포.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 암으로 고통받는 환자로부터 분리된 자가 세포인 것인 세포.
  11. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 정의된 CAR를 발현하는 세포.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 복수의 세포를 포함하는 세포 군집.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포 군집, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  14. 치료 요법, 바람직하게는 면역 요법에 사용되기 위한 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포 군집.
  15. 면역 반응을 유도하거나 자극하기 위해 사용되기 위한 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 NK 세포 또는 세포 군집.
  16. 대상체에서 암을 치료하는 방법에 사용되기 위한 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포 군집.
  17. 제 14 항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR, 핵산 분자, 벡터 또는 세포는 치료용 항체, 체크포인트 억제제, 사이토카인, 화학요법제, 또는 T-세포 기반 치료제와, 바람직하게는 치료용 항체와 조합되는 것인 사용되기 위한 세포 또는 세포 군집.
  18. 병원체 감염의 치료 또는 예방에 사용되기 위한 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포 군집.
  19. 필요로 하는 대상체의 면역 치료 방법으로서, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포 군집의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포 군집의 치료적 유효량을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 자극하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포 군집의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체의 암을 치료하기 위한 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포 군집의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 개체의 병원체 감염을 치료 또는 예방하기 위한 방법.
  23. 제 16 항에 따른 세포 또는 세포 군집, 또는 제 21 항에 따른 방법에 있어서, 상기 암은 고형 종양인 것인 세포 또는 세포 군집 또는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 암은 신경아세포종(neuroblastoma), 흑색종, 소세포폐암(small cell lung cancer, SCLC), 유잉육종(Ewing sarcoma), 골육종, 신경교종(glioma), 망막아세포종, 유방암, 방광암, 결장암, 두경부암, 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 항문암, 및 교모세포종(glioblastoma)으로 구성되는 모둠으로부터 선택되는 것인, 세포 또는 세포 군집 또는 방법.
  25. 제 9 항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 세포의 군집을 생산하는 방법으로서:
    - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 분자를 호중구 또는 NK 세포의 군집에 도입하고, 그리고,
    - CAR가 발현되도록 하는 것을 포함하는 방법.
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