CN117467691A - 一种构建耐酸性工程藻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建耐酸性工程藻的方法，属于生物学和分子生物学领域。具体方法为：将序列结构如SEQ ID No.1所示的Phatr3_J33543、序列结构如SEQ ID No.2所示的Phatr3_J50516或序列结构如SEQ ID No.3所示的Phatr3_Jdraft1806作为目的基因，去除目的基因的终止密码子，并通过编码甘氨酸的DNA序列连接去除起始密码子的荧光蛋白基因，得到重组基因；将重组基因插入pPhaNR质粒的多克隆位点中，得到载体质粒；将载体质粒通过电穿孔导入硅藻细胞后接种至含博来霉素的ESAW固体选择培养基上，生长出现褐色藻落；挑选藻落中具有荧光蛋白信号的藻落，即为耐酸性的工程藻。本发明得到的工程藻相对野生藻种相比，耐酸性能力显著提高。本发明对于耐酸性硅藻培育具有重要借鉴意义。
Description
技术领域
本发明属于生物学和分子生物学领域，具体涉及一种构建耐酸性工程藻的方法。
背景技术
微藻作为可进行光合作用的单细胞微生物，其生物质生产效率和固碳效率远远超过陆生植物。生产微藻被认为是一种高效减少二氧化碳排放的途径，同时可转化为高附加值产品，因此，生产微藻的方法得到广泛关注。目前的主要研究方向是将微藻生产和废气废水处理结合，从而在减少二氧化碳排放和净化废水的同时产生经济效益。但是这种生产策略的技术瓶颈在于温室气体造成的酸性环境会阻碍微藻的生长，导致产量低下。因此需要改良藻种以提高微藻在酸性环境中的产量。
主要的微生物育种改良方法包括随机诱变，适应性实验室进化和基因工程。适应性实验室进化(Adaptive Laboratory Evolution,ALE)利用人工控制的胁迫环境筛选有益的自发突变，从而在种群中积累更能克服压力环境的变种。这种方法简单有效，可以系统性优化微生物在压力环境中的适应度，从而提升不利条件中的生物质产量。基于筛选种群中自发的有益随机突变这一原理，ALE可以培育抗逆性强的藻种。但是，不同种群理论上可能有不同的进化途径。如果单一恒定的选择压力导致具有类似抗逆表型的变种在不同的种群被筛选出来，那么不同种群中出现的相同的基因突变和差异调控更有可能对它们类似的表现型产生作用。我们用转录组揭示不同种群中相同的基因调控来指导基因工程改造。
三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是一种海洋硅藻。它生长快速，富含高价值生物活性成分，包括不饱和脂肪酸(如EPA)和类胡萝卜素(如岩藻黄素)，具有潜在的应用价值。但是海洋藻类最适合在弱碱性条件(一般海水pH为8.0左右)生长，而酸性条件会抑制硅藻生长，使它在直接利用工业废气二氧化碳生产高附加值藻类生物质的应用中受限。因此，微藻领域亟需开发获取耐酸性工程藻的方法。
发明内容
本发明的目的在于解决工业生产中硅藻生长受酸性环境抑制的问题，并提供一种构建耐酸性工程藻的方法。根据本方法，通过适应性进化可获得耐酸性的驯化种，通过基因工程构建耐酸性的工程藻种。
本发明所采用的具体技术方案如下：
本发明提供一种构建耐酸性工程藻的方法，具体步骤如下：
S1：将注释功能和离子通道、pH内稳态有关的基因作为目的基因；去除所述目的基因的终止密码子，并通过编码甘氨酸的DNA序列连接去除起始密码子的荧光蛋白基因，得到重组基因；所述目的基因为序列结构如SEQ ID No.1所示的Phatr3_J33543、序列结构如SEQID No.2所示的Phatr3_J50516或序列结构如SEQ ID No.3所示Phatr3_Jdraft1806；
S2：将所述重组基因插入具有抵抗抗生素基因的pPhaNR质粒的多克隆位点中，得到载体质粒；
S3：将所述载体质粒和鲑鱼精子DNA溶液混合，得到混合液；将所述混合液冰浴后，通过电穿孔导入已完成除盐预处理的硅藻细胞中，随后将硅藻细胞置于暗处，进行第一次培养；将第一次培养后的硅藻细胞接种至含博来霉素的ESAW固体培养基上，进行第二次培养，直至所述固体培养基上生长出现藻落；
S4：挑选步骤S3得到的藻落中具有荧光蛋白信号的藻落，即为耐酸性的工程藻。
作为优选，步骤S2中的pPhaNR质粒含有抗博来霉素抗性基因(ZeoR/bleoR)；插入的重组基因位于内源硝酸还原酶启动子和终止子之间，其基因表达受硝酸还原酶启动子(pNR)调控。
作为优选，步骤S2中所述的载体质粒通过导入大肠杆菌的方式进行扩增。
作为优选，步骤S3中所述的电穿孔导入采用电穿孔仪，设置参数如下：场强为0.5kV，电容为25μF，电阻为400 Ohm。
作为优选，步骤S3中所述的混合液中载体质粒和鲑鱼精子DNA的质量比为1：10。
作为优选，步骤S3中所述的硅藻细胞为野生型三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)细胞。
作为优选，步骤S3所述除盐预处理步骤如下：离心收集处于对数生长期的三角褐指藻细胞后，通过反复离心重悬，将沉淀的三角褐指藻细胞用山梨醇溶液洗涤除盐后重悬于山梨醇溶液中。
进一步的，上述山梨醇溶液的浓度为375 mM。
作为优选，上述第一次培养在暗处培养24 h，第二次培养进行2～3周。
作为优选，步骤S3中所述的ESAW固体选择培养基中博来霉素的浓度为100μg/L。
作为优选，步骤S4中荧光蛋白信号的强度为野生型藻细胞内绿色荧光的6～10倍。
本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
本发明提供了一种构建耐酸性工程藻的方法，能够增强海洋硅藻的耐酸性，使构建的工程藻在低pH压力环境中的生长提高。本发明通过在野生型三角褐指藻中分别插入三种目的基因构建工程藻，经过实验可得，三组工程藻对酸性刺激的耐受均显著提高，工程藻的最大生长速率是野生型的1.7到1.8倍。该方法对耐酸性硅藻培育具有重要借鉴意义。
附图说明
图1为实施例1中野生型三角褐指藻低pH环境压力下适应性进化过程曲线；
图2为实施例1中野生型和驯化型三角褐指藻在不同酸性条件下的比生长速率(**,p<0.01；*,p<0.05)；
图3为实施例2～4中构建耐酸性工程藻示意图(a)和绿色荧光信号相对强度对比图(b)；
图4为实施例2～4中构建耐酸性工程藻和野生型藻受pH＝5.0刺激的生长表现，其中(a)为生长曲线，(b)为荧光量子产率，(c)为在最适条件和低pH压力条件下最大比生长速率，(d)为转化子的最大比生长率相对野生型的提高倍数(与控制组对比：NS,无显著差异，***,p<0.001；**,p<0.01)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
实施例1育种耐酸性硅藻和获得耐酸性目的基因
(1)在人工控制恒定的环境压力下进行长时间的继代培养，驯化耐酸性藻种。
用40 mM MES缓冲液控制人工海水培养液中的pH保持稳定为弱酸性，人工海水培养液的pH＝6.0。用此培养液在持续的低pH压力下继代培养野生型三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)细胞，培养条件为：光强100μmol/m2/s，温度为22±1℃，继代培养的周期是5天。每个周期结束时通过离心收集适当的细胞，再重悬到相同体积(75mL)的新鲜培养液中，保持每个周期的初始细胞浓度一致。经过16次继代培养，三组藻液在五天时的平均生长率显著提高并达到稳定，如图1所示，得到在酸性条件下生长速率更高的三角褐指藻种群ALE1、ALE2和ALE3。
为测试ALE1、ALE2和ALE3三组驯化型三角褐指藻的稳定性，将ALE1、ALE2和ALE3均恢复到最适生长条件中培养两周。培养条件为：光强100μmol/m2/s，温度为22±1℃，加入40mM Tris-HCl缓冲液使人工海水培养液的pH在培养过程中值维持在8.0，然后离心收集适量的驯化型三角褐指藻细胞，每一组驯化型三角褐指藻细胞均分为三份，分别用pH 6.5、pH6.0和pH 5.5的酸性培养液洗涤一次后离心收集细胞，接种到对应pH值的培养液中，进行稳定性测试。培养5天后对比驯化型三角褐指藻和野生型三角褐指藻受酸性刺激的生长表现，结果如图2所示，驯化型三角褐指藻在所有测试条件中的生长率相对野生型均提高了，生长率提高了27.5～110.4％。
(2)通过转录组测序找出上述驯化型三角褐指藻中共同具有的耐酸性目的基因。
将驯化株和野生藻株从pH＝8.0的最适生长条件转到pH＝6.0的低pH受迫环境。培养条件为：光强100μmol/m2/s，温度为22±1℃，加入40 mM MES缓冲液使pH在培养过程中值维持在6.0。在第5天收集细胞，提取总RNA进行二代转录组测序。以野生型三角褐指藻受酸性刺激的转录组为对照组，对三组驯化型三角褐指藻在相同条件的转录组进行差异表达分析。
在两组以上驯化型三角褐指藻中有突出差异表达(变化倍数>1)的基因中，挑选若干个注释功能和离子通道、pH内稳态有关的基因作为目的基因。挑选的目的基因分别为序列结构如SEQ ID No.1所示的Phatr3_J33543、序列结构如SEQID No.2所示的Phatr3_J50516和序列结构如SEQ ID No.3所示Phatr3_Jdraft1806。
实施例2构建工程藻HI3310
本实施例提供一种利用序列结构如SEQ ID No.1所示的Phatr3_J33543构建耐酸性工程藻的方法，具体步骤如下：
(1)去除序列结构如SEQ ID No.1所示的Phatr3_J33543基因3’端的终止密码子，并通过编码5个甘氨酸的DNA序列的连接去除起始密码子的荧光蛋白(GFP)基因，得到重组基因。由于该重组基因编码的重组蛋白中含有荧光蛋白序列，方便后续通过荧光显微镜进行筛选。
将上述重组基因粒插入pPhaNR质粒(NCBI编号：JN180663.1)多克隆位点中，得到载体质粒。pPhaNR质粒是一种具有扩增能力的质粒，且该质粒中含有一段能够抵抗博来霉素的基因。博来霉素是一种抗生素，能够杀死野生型三角褐指藻细胞。
将构建的载体质粒导入大肠杆菌，让载体质粒在大肠杆菌中扩增。载体质粒自大肠杆菌扩增后提纯备用。
(2)将步骤(1)所得表达的载体质粒用电穿孔仪导入野生型三角褐指藻细胞，方法如下：
首先采用1000 x g离心10分钟，收集大约2×108 CFU对数生长期的三角褐指藻细胞。将离心后的沉淀物用375 mM山梨醇溶液洗涤三次，反复的离心重悬，进行除盐预处理。最后将预处理之后的细胞重悬在100μL浓度为375 mM的山梨醇溶液中，加入4μg步骤(1)中得到的载体质粒和40μg的鲑鱼精子DNA，得到混合液。将混合液进行冰水浴10分钟，转移至2mm电穿孔专用比色皿中。鲑鱼精子DNA有助于载体质粒进入藻细胞。
将上述混合液用穿孔仪(Bio-Rad)导入野生型三角褐指藻细胞，设置参数如下：场强为0.5 kV，电容为25μF，电阻为400 Ohm。将导入载体质粒的野生型三角褐指藻细胞在暗处静置24小时后，接种至含有100μg/mL博来霉素的ESAW固体培养基中，2～3周后选择培养基上出现的褐色藻落，挑到装有人工海水培养液的试管。培养条件为：光强100μmol/m2/s，温度为22±1℃，加入40mMTris-HCl缓冲液使pH在培养过程中值维持在8.0。
ESAW固体培养基是按以下配方配制ESAW人工海水培养液，将pH调至8.0，加入1％(w/v)琼脂粉，在121℃高温灭菌30分钟得到的。ESAW人工海水培养液具体成分如表1所示。
表1 ESAW人工海水培养液组成
为了避免上述含博来霉素的ESAW固体培养基中挑选出来的褐色藻落出现假阳性的情况，还需要通过荧光显微镜观察上述藻细胞。荧光显微镜的激发波长为488 nm，探测波长为525 nm，挑选具有荧光蛋白(GFP)信号的藻种，即为构建的耐酸性工程藻，记为HI3310。
实施例3构建工程藻HI5021
本实施例提供一种利用序列结构如SEQ ID No.2所示的Phatr3_J50516构建耐酸性工程藻的方法，具体步骤如下：
(1)去除序列结构如SEQ ID No.2所示的Phatr3_J50516基因3’端的终止密码子，并通过编码5个甘氨酸的DNA序列连接去除起始密码子的荧光蛋白(GFP)基因，得到重组基因。由于该重组基因编码的重组蛋白中含有荧光蛋白序列，方便后续通过荧光显微镜进行筛选。
将上述重组基因插入pPhaNR质粒(NCBI编号：JN180663.1)多克隆位点中，得到载体质粒。pPhaNR质粒是一种具有扩增能力的质粒，且该质粒中含有一段能够抵抗博来霉素的基因。博来霉素是一种抗生素，能够杀死野生型三角褐指藻细胞。
将构建的载体质粒导入大肠杆菌，让载体质粒在大肠杆菌中扩增。载体质粒自大肠杆菌扩增后提纯备用。
(2)将步骤(1)所得表达的载体质粒用电穿孔仪导入野生型三角褐指藻细胞，方法如下：
首先采用1000 x g离心10分钟，收集大约2×108 CFU对数生长期的三角褐指藻细胞。将离心后的沉淀物用375 mM山梨醇溶液洗涤三次，反复的离心重悬，进行除盐预处理。最后将预处理之后的细胞重悬在100μL浓度为375 mM的山梨醇溶液中，加入4μg步骤(1)中得到的载体质粒和40μg的鲑鱼精子DNA，得到混合液。将混合液进行冰水浴10分钟，转移至2mm电穿孔专用比色皿中。鲑鱼精子DNA有助于载体质粒进入藻细胞。
将上述混合液用穿孔仪(Bio-Rad)导入野生型三角褐指藻细胞，设置参数如下：场强为0.5 kV，电容为25μF，电阻为400 Ohm。将导入载体质粒的野生型三角褐指藻细胞在暗处静置24小时后，接种至含有100μg/mL博来霉素的ESAW固体培养基中，2～3周后选择培养基上出现的褐色藻落，挑到装有人工海水培养液的试管。培养条件为：光强100μmol/m2/s，温度为22±1℃，加入40 mMTris-HCl缓冲液使pH在培养过程中值维持在8.0。
ESAW固体培养基是按以下配方配制ESAW人工海水培养液，将pH调至8.0，加入1％(w/v)琼脂粉，在121℃高温灭菌30分钟得到的。ESAW人工海水培养液具体成分如表1所示。
为了避免上述含博来霉素的ESAW固体培养基中挑选出来的褐色藻落出现假阳性的情况，还需要通过荧光显微镜观察上述藻细胞。荧光显微镜的激发波长为488 nm，探测波长525 nm，挑选具有荧光蛋白(GFP)信号的藻种，即为构建的耐酸性工程藻，记为HI5021。
实施例4构建工程藻HI1831
本实施例提供一种利用序列结构如SEQ ID No.3所示的Phatr3_Jdraft1806构建耐酸性工程藻的方法，具体步骤如下：
(1)去除序列结构如SEQ ID No.3所示的Phatr3_Jdraft1806基因3’端的终止密码子，并通过编码5个甘氨酸的DNA序列连接去除起始密码子的荧光蛋白(GFP)基因，得到重组质粒。由于该重组基因编码的重组蛋白中含有荧光蛋白序列，方便后续通过荧光显微镜进行筛选。
将上述重组基因插入pPhaNR质粒(NCBI编号：JN180663.1)多克隆位点中，得到载体质粒。pPhaNR质粒是一种具有扩增能力的质粒，且该质粒中含有一段能够抵抗博来霉素的基因。博来霉素是一种抗生素，能够杀死野生型三角褐指藻细胞。
将构建的载体质粒导入大肠杆菌，让载体质粒在大肠杆菌中扩增。载体质粒自大肠杆菌扩增后提纯备用。
(2)将步骤(1)所得表达的载体质粒用电穿孔仪导入野生型三角褐指藻细胞，方法如下：
首先采用1000 x g离心10分钟，收集大约2×108 CFU对数生长期的三角褐指藻细胞。将离心后的沉淀物用375 mM山梨醇溶液洗涤三次，反复的离心重悬，进行除盐预处理。最后将预处理之后的细胞重悬在100μL浓度为375 mM的山梨醇溶液中，加入4μg步骤(1)中得到的载体质粒和40μg的鲑鱼精子DNA，得到混合液。将混合液进行冰水浴10分钟，转移至2mm电穿孔专用比色皿中。鲑鱼精子DNA有助于载体质粒进入藻细胞。
将上述混合液用穿孔仪(Bio-Rad)导入野生型三角褐指藻细胞，设置参数如下：场强为0.5 kV，电容为25μF，电阻为400 Ohm。将导入载体质粒的野生型三角褐指藻细胞在暗处静置24小时后，接种至含有100μg/mL博来霉素的ESAW固体培养基中，2～3周后选择培养基上出现的褐色藻落，挑到装有人工海水培养液的试管。培养条件为：光强100μmol/m2/s，温度为22±1℃，加入40 mMTris-HCl缓冲液使pH在培养过程中值维持在8.0。
ESAW固体培养基是按以下配方配制ESAW人工海水培养液，将pH调至8.0，加入1％(w/v)琼脂粉，在121℃高温灭菌30分钟得到的。ESAW人工海水培养液具体成分如表1所示。
为了避免上述含博来霉素的ESAW固体培养基中挑选出来的褐色藻落出现假阳性的情况，还需要通过荧光显微镜观察上述藻细胞。荧光显微镜的激发波长为488 nm，探测波长525 nm，挑选具有荧光蛋白(GFP)信号的藻种，即为构建的耐酸性工程藻，记为HI1831。
对实施例2～4构建的工程藻进行酸性刺激实验验证。首先对比三组工程藻和野生型三角褐指藻在最适生长条件下的生长表现。培养条件为：光强100μmol/m2/s，温度为22±1℃，加入40 mM Tris-HCl缓冲液的人工海水的pH在培养过程中维持在8.0。
然后离心收集适量的细胞，用pH＝5.0的酸性培养液洗涤一次。再次离心收集细胞，接种到pH＝5的人工海水培养液中。培养5天后，对比三组工程藻和野生型三角褐指藻受酸性刺激的生长表现，具体如图4所示。实验结果表明野生型三角褐指藻在pH＝5.0的环境中受到强烈抑制，而三组工程藻对酸性刺激的耐受均显著提高，工程藻的最大生长速率是野生型的1.7到1.8倍。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1：将注释功能和离子通道、pH内稳态有关的基因作为目的基因；去除所述目的基因的终止密码子，并通过编码甘氨酸的DNA序列连接去除起始密码子的荧光蛋白基因，得到重组基因；所述目的基因为序列结构如SEQ ID No.1所示的Phatr3_J33543、序列结构如SEQ IDNo.2所示的Phatr3_J50516或序列结构如SEQ ID No.3所示Phatr3_Jdraft1806；
S2：将所述重组基因插入具有抵抗抗生素基因的pPhaNR质粒的多克隆位点中，得到载体质粒；
S3：将所述载体质粒和鲑鱼精子DNA溶液混合，得到混合液；将所述混合液冰浴后，通过电穿孔导入已完成除盐预处理的硅藻细胞中，随后将硅藻细胞放入ESAW培养液置于暗处，进行第一次培养；将第一次培养后的硅藻细胞接种至含博来霉素的ESAW固体选择培养基上，进行第二次培养，直至所述固体培养基上生长出现藻落；
S4：挑选步骤S3得到的藻落中具有荧光蛋白信号的藻落，即为耐酸性的工程藻。
2.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S2中所述的pPhaNR质粒含有抗博来霉素抗性基因ZeoR/bleoR；插入的重组基因位于内源硝酸还原酶启动子和终止子之间，其基因表达受硝酸还原酶启动子pNR调控。
3.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S3中所述的电穿孔导入采用电穿孔仪，设置参数如下：场强为0.5kV，电容为25μF，电阻为400Ohm。
4.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S3中所述的混合液中载体质粒和鲑鱼精子DNA的质量比为1：10。
5.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S3中所述的硅藻细胞为野生型三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)细胞。
6.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S3所述除盐预处理步骤如下：离心收集处于对数生长期的三角褐指藻细胞后，通过反复离心重悬，将沉淀的三角褐指藻细胞用山梨醇溶液洗涤除盐后重悬于山梨醇溶液中。
7.根据权利要求6所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，所述山梨醇溶液的浓度为375mM。
8.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，所述第一次培养在暗处培养24h；所述第二次培养进行2～3周。
9.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S3中所述的ESAW固体选择培养基中博来霉素的浓度为100μg/L。
10.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S4中荧光蛋白信号的强度为野生型藻细胞内绿色荧光的6～10倍。
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