CN117460497A - 包含聚合物纳米盘的用于预防或治疗病毒感染症的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含脂质双分子层、两亲性聚合物的聚合物纳米盘以及包含上述聚合物纳米盘的药物组合物。在利用本发明的包含脂质双分子层、两亲性聚合物的聚合物纳米盘的情况下，可以通过示出抗病毒功效来用作预防或治疗病毒感染症的用途。

Description

包含聚合物纳米盘的用于预防或治疗病毒感染症的药物组 合物
技术领域
本发明涉及包含脂质双分子层、两亲性聚合物的聚合物纳米盘以及包含上述聚合物纳米盘的药物组合物。
背景技术
流感病毒(Influenza virus)为属于正粘病毒科(Family Orthomyxoviridae)的核糖核酸(RNA)病毒，血清型分为A型、B型、C型等三种。其中，确认B型和C型只感染人类，而A型感染人类、马、猪、其他哺乳动物以及多种家禽和野生鸟类。A型流感病毒的血清型使根据病毒表面的两种蛋白质，即血凝素(Hemagglutinin；HA)和神经氨糖酸苷酶(Neuraminidase；NA)的种类来区分的，迄今已知144种(16种HA蛋白和9种NA蛋白)。HA起到使病毒附着在体细胞的作用，NA则可以使病毒侵入细胞内。
至今开发的病毒感染症治疗剂已知有金刚烷胺(amantadine)或金刚乙胺(rimantadine)系列的M2离子通道抑制剂(M2 ion channel inhibitor)和奥司他韦(oseltamivir，商品名：达菲)或扎那米韦(zanamivir，商品名：乐感清)系列的神经氨糖酸苷酶(neuraminidase)抑制剂，但这些治疗剂具有效果受限的问题。即，对于金刚烷胺或金刚乙胺系列的衍生化合物，病毒很快生成具有耐药性的变种病毒，一部分地区中检出的H5N1型流感病毒已对金刚烷胺或金刚乙胺系列的化合物表现出耐药性，而且已知流感病毒B对金刚烷胺衍生物不敏感。并且，对于奥司他韦或扎那米韦系列的衍生化合物，具有耐药性的病毒也在逐渐增加，已知这些耐药病毒在儿童中频繁产生。
因此，用来开发不具有上述现有病毒感染症治疗的问题的新型治疗剂的研究症活跃地进行着，例如，韩国授权专利第1334143号公开了密花远志(Polygala karensium)提取物及含有从上述密花远志提取物中分离的氧杂蒽酮类化合物的用于预防或治疗感冒、禽流感、猪流感或甲型流感的组合物。然而，由于这些制剂的抗病毒活性低，对甲型流感等流感病毒引起的疾病表现不出有效的预防或治疗效果。
并且，2015年因冠状病毒引起的中东呼吸综合征、2020年至今仍在流行的因冠状病毒引起的COVID-19等由病毒引起的疾病近来仍在流行。
冠状病毒为属于冠状病毒科(Coronaviridae)的冠状病毒亚科(Coronavirinae)的核糖核酸病毒，在人和动物的呼吸系统和消化系统诱发感染。主要易于通过黏液传染、飞沫传播等来传染，通常给人带来轻微的呼吸系统感染，但也引起致命的感染，牛和猪发生腹泻，鸡发生呼吸系统疾病。冠状病毒为现代文明中引起致命的传染病的代表性的病毒。2003年4月，中华人民共和国流行严重急性呼吸综合征，又名SARS，死亡率高达9.6％，许多人因此而死亡。2015年，中东呼吸综合征，又名MERS，从中东向全世界扩散，死亡率约为36％，许多人因此而死亡。现在，正在探讨将卡莫司他、瑞德西韦、羟氯喹等用作其他疾病的治疗剂的药物用作冠状病毒治疗剂的可能性，但由于副作用和微乎其微的功效而处于临床失败或停止的状态。
水泡性口炎印第安纳病毒(Vesicular stomatitis Indiana virus,VSV)也称为印度水泡病毒(Indiana vesiculovirus)、原水泡性口炎病毒(formerly Vesicularstomatitis)，属于弹状病毒(Rhabdoviridae)家族。主要为家畜传染病，至今尚无对此的治疗剂。
上述病毒的共同点为都具有由脂质双分子膜构成的外壳。包括上述病毒在内的许多动物病毒(例如，人获得性免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒、中东呼吸综合征病毒(MERS)、疱疹病毒、埃博拉病毒等)具有膜蛋白和脂质双分子膜外壳。膜蛋白或表面抗原存在于病毒的外壳，具有与宿主的受体结合的特征，从而诱导病毒向细胞内侵入。并且，外壳不仅在病毒的感染途径中起到非常重要的作用，还起到在人体的免疫体系中保护自己的作用。因此，可以通过抑制上述病毒的膜蛋白与受体间的结合或损伤外壳来抑制病毒的感染。通过抑制病毒的膜蛋白来抑制病毒增殖(virustatic)的药物中的代表已知有奥司他韦，但上述抗病毒剂的效果为一时性的或复发性的或药效弱，之所以如此，是因为这些药物的作用方式为抑制病毒增殖的方式，若这些药物的浓度低，则病毒仍会增殖。并且，若增殖和停止随着药物浓度的变化而反复，则会因“适应进化(adaptive evolution)”的结果而产生耐药性病毒。并且，对奥司他韦(达菲)的耐药性病毒的报告也在逐渐增加。中和抗体也仅单纯地抑制病毒感染症循环而不充分，因此开发为治疗剂也不尽如意。减少外壳病毒的感染力的药物表示为杀病毒剂(virucide)，在日常生活中，将肥皂或消毒剂等用作代表性的杀病毒剂。然而，上述杀病毒剂不安全，因此在用作治疗剂方面受限。
因此，为了期待强力的效果，需要源自损伤病毒外壳的杀病毒剂的作用方式并且安全的能够对广泛的外壳病毒起作用的杀病毒剂。为此，关注病毒都具有的膜蛋白的上部区域带有正电荷的共同点来制备具有利用结构物的负电荷特性来诱导与病毒的结合后，钻进病毒外壳引起损伤的特性的纳米盘结构物。
破坏病毒外壳的药物具有能够同样适用于变种病毒的优点。这是因为与病毒蛋白发生变异相伴的，病毒的外壳源自细胞膜，因此不受病毒变异的影响。并且，与现有的抗病毒剂相比，破坏病毒外壳的药物可以表现出显著的强力功效。因此，本发明中欲通过开发通过静电引力与病毒结合后，非选择性地破坏病毒外壳的杀病毒剂来开发能够适用于多种外壳病毒的强力且安全的抗病毒剂。
发明内容
技术问题
本发明考虑到现有纳米穿孔器结构物内蛋白质(膜支架蛋白(Membrane scaffoldprotein，MSP))对热的稳定性和对体内蛋白酶的低抵抗性，着眼于使用两亲性聚合物替代其来改善结构物的稳定性并增进抗病毒活性。并且，为了使用膜支架蛋白(MSP)制备纳米盘，需经过利用胆碱钠等表面活性剂混合蛋白质与脂质后利用生物珠(BioBead SM2)等吸附剂来去除表面活性剂等复杂的工序，与之相反，聚合物纳米盘具有只需与脂质混合即可自动制备的优点。并且，聚合物纳米盘的侧面带有强的负电荷，但由膜支架蛋白制备的纳米盘却不是这样。带有强的负电荷的聚合物纳米盘与病毒表面的正电荷相互作用，因此能够轻易接近病毒，具有因纳米盘的活性而能够轻易使病毒灭活的可能性。这可以为开发对广泛的病毒具有活性的抗病毒剂提供线索，从而具有可以划时代地增大纳米盘的抗病毒活性的可能性。即，在纳米盘中使用两亲性聚合物替代膜支架蛋白时，可以制备为对广泛的病毒具有杀病毒活性的抗病毒剂，不仅具有比现有的纳米盘高的抗病毒性能，还具有制备工序简易的优点。并且，由于使用聚合物而不是蛋白质，因此判断为具有可以进行经济性突出的生产的优点。
如上所述，本发明人为开发能够替代现有的病毒抑制剂的新型杀病毒剂而多番努力研究，最终，查明在利用包含脂质双分子层、两亲性聚合物的基于聚合物的纳米盘的情况下，抗病毒效果优秀，从而完成本发明。
因此，本发明的目的在于，提供基于包含脂质双分子层、两亲性聚合物的聚合物的纳米盘。
本发明的再一目的在于，提供包含上述基于聚合物的纳米盘的用于预防或治疗病毒感染症的药物组合物。
本发明的还一目的在于，提供用于提高上述基于聚合物的纳米盘的功效的最优化的结构物。
课题解决手段
根据本发明的一实施方式，本发明提供由两亲性聚合物与通过两亲性脂质的疏水部分相互连接形成的脂质双分子层结合来形成的聚合物纳米盘。
在本发明的一实例中，优选地，上述聚合物纳米盘能够以如下方式形成：两亲性脂质的疏水部分相互连接形成排列为上下两层的圆盘形态的脂质双分子层，两亲性聚合物通过疏水键包裹暴露于上述脂质双分子层侧面的两亲性脂质的疏水部分。
在本发明的一实例中，优选地，上述两亲性脂质可以为磷脂，更优选地，上述磷脂可以为选自由磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)及磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine)组成的组中的一种以上。
在本发明的一实例中，优选地，上述两亲性聚合物可以为选自由苯乙烯-马来酸(Styrene-Maleic Acid，SMA)、二异丁烯-马来酸(Di-IsoButylene-Maleic Acid，DIBMA)、苯乙烯-马来酰亚胺(Styrene-Maleimide，SMI)、聚甲基丙烯酸甲酯(PolymethylMethacrylate，PMA)及它们的组合组成的组中的一种以上。
在本发明的一实例中，优选地，相对于上述聚合物纳米盘总量，可以包含0.1％至20％的上述两亲性聚合物。
在本发明的一实例中，确认到上述聚合物纳米盘穿孔病毒的脂质双分子层外壳。
在本发明的一实例中，优选地，上述病毒可以为属于选自由布尼亚病毒(Bunyaviridae)科、冠状病毒(Coronaviridae)科、丝状病毒(Filoviridae)科、黄病毒(Flaviviridae)科、嗜肝脱氧核糖核酸病毒(Hepadnaviridae)科、疱疹病毒(Herpesviridae)科、正粘病毒(Orthomyxoviridae)科、痘病毒(Poxviridae)科、弹状病毒(Rhabdoviridae)科、逆转录病毒(Retroviridae)科、披膜病毒(Togaviridae)科及疱疹病毒(Herpesviridae)科组成的组中的一种以上科的病毒。
在本发明的一实例中，优选地，上述病毒可以为选自由流感病毒、冠状病毒及水泡性口炎病毒组成的组中的一种以上病毒。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含上述聚合物纳米盘的用于预防或治疗病毒感染症的药物组合物。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供预防或治疗病毒感染症的方法，包括向个体(subject)给药上述包含聚合物纳米盘的用于预防或治疗病毒感染症的药物组合物的步骤。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供筛选最优化的纳米盘结构物的组合物的方法，包括：步骤(a)，使目标病毒与上述聚合物纳米盘反应；以及步骤(b)，确认上述聚合物纳米盘是否对目标病毒表现出抗病毒活性。
发明的效果
概述本发明的特征及优点如下。
(a)本发明提供包含脂质双分子层、两亲性聚合物的聚合物纳米盘。
(b)本发明提供包含上述聚合物纳米盘的用于预防或治疗病毒感染症的药物组合物。
(c)在利用本发明包含脂质双分子层、两亲性聚合物的聚合物纳米盘的情况下，可以通过表现出抗病毒功效来应用为预防或治疗病毒感染症的用途。
(d)通过本发明中使用两亲性聚合物的结果可以确认，与使用现有ApoA1或膜支架蛋白的情况相比，显著提高抗病毒活性。
(e)本发明提供筛选最优化的纳米盘结构物的组合物的方法，包括使聚合物纳米盘反应的步骤以及确认是否表现出抗病毒活性的步骤。
附图说明
图1的(A)部分为通过尺寸排阻色谱(SEC)纯化的聚合物(SMA2∶1)纳米盘(lipid(脂质)∶SMA＝1∶2)的大小分布状态，(B)部分为通过SEC纯化的聚合物(SMA3∶1)纳米盘(lipid∶SMA＝1∶2)的大小分布状态。
图2的(A)部分为通过动态光散射(DLS)测量的聚合物(SMA2∶1)纳米盘(lipid∶SMA＝1∶2)的直径分布图，(B)部分为通过动态光散射测力量的聚合物(SMA3∶1)纳米盘(lipid∶SMA＝1∶2)的直径分布图。图2的(C)部分为通过透射电子显微镜拍摄的聚合物(SMA2∶1)纳米盘(lipid∶SMA＝1∶2)的结构形态，(D)部分为通过透射电子显微镜拍摄的聚合物(SMA3∶1)纳米盘(lipid∶SMA＝1∶2)的结构形态。
图3示出在犬肾细胞(MDCK cell)内确认聚合物(SMA3∶1((A)部分)、SMA2∶1((B)部分))与聚合物纳米盘的细胞毒性的实验结果。
图4的(A)部分示出确认聚合物(SMA2∶1)、聚合物纳米盘、基于蛋白质的纳米盘(MSP-NDG)以及肝素对流感病毒的抗病毒功效的实验结果，(B)部分为通过透射电子显微镜拍摄的由聚合物(SMA2∶1)和聚合物纳米盘引起的流感病毒的形态变化的结果。
图5为以POPC、DPPC、DMPC、DOTAP、POPE制备纳米盘的磷脂构成后比较对流感病毒的抗病毒功效的实验结果。
图6为确认聚合物纳米盘的结构中利用POPE磷脂的结构形态增大对热的稳定性的实验结果。
图7为用来在不同温度(4℃(上)，37℃(下))环境中比较聚合物和聚合物纳米盘对流感病毒的抗病毒功效的实验结果。
图8为用来比较聚合物、聚合物纳米盘(POPC、POPE构成)以及肝素药物的杀病毒功效的实验结果。
图9示出为了确认冠状病毒内是否存在mCherry-荧光素酶病毒核糖核酸(mCherry-Luciferase viral RNA)及刺突蛋白而实施的聚合酶链式反应(PCR，PolymeraseChain Reaction)及蛋白印迹法的结果。
图10为确认聚合物和聚合物纳米盘对多种变种的流感病毒的抗病毒功效的实验结果。
图11为确认聚合物和聚合物纳米盘对水泡性口炎病毒(VSV)-假病毒的抗病毒功效的实验结果。
图12为确认聚合物和聚合物纳米盘对冠状病毒-假病毒的抗病毒功效的实验结果。
图13的(A)部分示出通过动物实验(存活率)来确认聚合物纳米盘的抗病毒功效的实验结果，(B)部分示出通过动物实验(体重变化)来确认聚合物纳米盘的抗病毒功效的实验结果。
图14为本发明的聚合物纳米盘的示意图。
具体实施方式
根据本发明的一实施方式，本发明提供包含脂质双分子层、两亲性聚合物的聚合物纳米盘。
本说明书中的术语“纳米盘”是指包含脂质双分子层的单层(unilamellar)的圆盘(disc)形态物质，其特征在于，具有上述脂质双分子层的亲水性两面都暴露于外部的开放系统(open system)。即，可以表示本发明的纳米盘因上述脂质双分子层而不形成具有内核的密闭空间。
本说明书中的术语“聚合物”是指一种或数种结构单位(单体)相互间通过许多化学键聚合形成连接的分子的化合物。根据聚合物结构有链状聚合物、桥接聚合物以及网状聚合物等，有两种以上单体构成的聚合物称为共聚物或co-聚合物，由一种单体构成的聚合物称为单聚物或均聚物。在这些聚合物中，本发明使用两亲性聚合物。
本说明书中的术语“聚合物纳米盘”是指在上述纳米盘中追加两亲性聚合物来构成的纳米盘。
在本发明的一实例中，优选地，上述聚合物纳米盘以如下方式形成：两亲性脂质的疏水部分相互连接形成排列为上下两层的圆盘形态的脂质双分子层，两亲性聚合物层(图14的两亲性聚合物(amphipathic polymer)部分)通过疏水键暴露于包裹上述脂质双分子层侧面的两亲性脂质的疏水部分(图14)。
本发明中使用的两亲性聚合物具有两亲性，起到防止疏水性尾部(acyl tail)直接暴露在水中的作用。若该两亲性聚合物以规定比例存在，则聚合物包裹形成脂质双分子膜的磷脂的中间层(2层的疏水性酰基尾部)。结果，使圆盘形态的脂质双分子膜形状在水溶液相中稳定化。在此情况下，脂质双分子膜圆盘的大小取决于磷脂∶聚合物的比例。
构成上述聚合物纳米盘的脂质可以为磷脂，可以包含碳原子数为1个至50个的脂质尾部，更具体地，可以包含碳原子数为5个至30个的脂质尾部。
在本发明的一实例中，优选地，上述两亲性脂质可以为磷脂，更优选地，上述磷脂可以为选自由磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺及磷酯酰丝氨酸组成的组中的一种以上，但不限定于此，可以选择所有能够用作细胞膜成分的脂质。
上述磷脂酰胆碱可以为1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC，1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC，1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC，1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC，1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC，1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、C13PC、1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DDPC，1,2-Didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC，1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC，1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLOPC，1,2-Dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、蛋黄磷脂酰胆碱(EPC，Eggphosphatidylcholine)、1-肉豆蔻酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(MSPC，1-Myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PMPC，1-Palmitoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PSPC，1-Palmitoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SMPC，1-Stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)或1-硬脂酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SPPC，1-Stearoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。
上述磷脂酰甘油可以为1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油)](DMPG，1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)])、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油)](DPPG，1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)])、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油)(DSPG，1,2-Distearoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol))、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油)](POPG，1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)])、1,2-二二酰基-sn-甘油-3[磷酸-(1-甘油)](DEPG，1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3[Phosphorac-(1-glycerol)])、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油)(DLPG，1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)])、1,2-二油酰-snglycero-3[磷酸-rac-(1-甘油)](DOPG，1,2-Dioleoyl-snglycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)])或1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3[磷酸-rac-(1-甘油)](DSPG，1,2-Distearoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)])。
上述磷脂酰乙醇胺可以为1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE，1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE，1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、1,2-二硬脂酰-单甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE，1,2-Distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE，1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE，1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE，1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)或1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE，1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)。
上述磷酯酰丝氨酸可以为1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(DOPS，1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(DLPS，1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoserine)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(DMPS，1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoserine)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(DPPS，1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoserine)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(DSPS，1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine)或POPS(1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸)。
构成上述聚合物纳米盘的两亲性脂质还可以在上述磷脂中包含选自由例如甘油三酯、胆固醇等中性脂肪以及例如神经节苷脂等糖脂(saccharolipid)组成的组中的一种以上。
从具有脂质双分子层的亲水性两面都暴露于外部的开放系统的圆盘形态方面来看，上述聚合物纳米盘有别于内部包含亲水性核(core)且具有脂质双分子层的两面中只有一面暴露于外部的封闭系统(closed system)的球(sphere)形态的脂质体(liposome)。上述脂质体可以通过脂质双分子层形成具有内核的封闭空间。
在本发明的一实例中，上述两亲性聚合物可以为选自由苯乙烯-马来酸、二异丁烯-马来酸、苯乙烯-马来酰亚胺、聚甲基丙烯酸甲酯及它们的组合组成的组中的一种以上。
上述SMA为苯乙烯(Styrene)与马来酸(maleic acid)以2∶1或3∶1的比例聚合的共聚物，可以通过相关领域广为人知的聚合方法聚合，SMA还可以使用乙醇胺、乙二胺、季铵盐、巯基等来修饰。
在本发明的一实例中，优选地，相对于上述聚合物纳米盘总量，可以包含0.1％至20％的上述两亲性聚合物。更具体地，相对于上述聚合物纳米盘总量，可以包含0.2％至5％、0.3％至5％、0.4％至5％、0.1％至4％、0.2％至4％、0.3％至4％、0.4％至4％、0.1％至3％、0.2％至3％、0.3％至3％、0.4％至3％、0.1％至2％、0.2％至2％、0.3％至2％、0.4％至2％的上述两亲性聚合物。
根据本发明的实施例，上述两亲性聚合物为SMA，优选地，相对于上述聚合物纳米盘总量，可以包含0.3％至0.7％的上述SMA。
在本发明的一实例中，上述聚合物纳米盘的直径可以为2nm至50nm，但不限定于此。更具体地，上述聚合物纳米盘的直径为2nm至40nm、2nm至30nm、3nm至50nm、3nm至40nm、3nm至30nm、4nm至50nm、4nm至40nm、4nm至30nm、5nm至50nm、5nm至40nm、5nm至30nm，但不限定于此。根据本发明的实施例，上述聚合物纳米盘的聚合物的种类可以为SMA，直径可以为10nm至20nm。
在本发明的一实例中，确认到上述聚合物纳米盘穿孔脂质双分子层外壳。
在本发明的一实例中，上述病毒可以为属于选自由布尼亚病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、嗜肝脱氧核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、痘病毒科、弹状病毒科、逆转录病毒科、披膜病毒科及疱疹病毒科组成的组中的一种以上科的病毒。更具体地，上述病毒可以为：属于布尼亚病毒科的汉坦病毒(Sin Nombre Hantavirus)等；属于冠状病毒科的有关多种急性呼吸系统综合征的冠状病毒(Coronavirus)等；属于丝状病毒科的埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)等；属于黄病毒科的西尼罗河病毒(West Nile virus)、黄热病毒(Yellow Fever virus)、登革热病毒(Dengue Fevervirus)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)等；属于嗜肝脱氧核糖核酸病毒科的乙型肝炎病毒(Hepatitis B)等；属于疱疹病毒科的1型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex 1virus)、2型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex 2virus)等；属于正粘病毒科的流感病毒(Influenzavirus)等；属于痘病毒科的天花病毒(Smallpox virus)、牛痘病毒(Vaccinia virus)、传染性软疣病毒(Molluscumcontagiosum virus)、猴痘病毒(Monkeypox virus)等；属于弹状病毒科的水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)；属于逆转录病毒科的人获得性免疫缺陷病毒(HIV，Human Immunodeficiency virus)等；属于披膜病毒科的奇昆古尼亚病毒(Chikungunya virus)等；属于疱疹病毒科的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)、人类疱疹病毒(HHV)等。
在本发明的一实例中，上述病毒可以为选自由流感病毒、冠状病毒及水泡性口炎病毒组成的组中的一种以上病毒。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含上述聚合物纳米盘的用于预防或治疗病毒感染症的药物组合物。
本发明的上述药物组合物包含作为本发明一实施方式的聚合物纳米盘，为避免本说明书过度的重复性，将省略重复的内容。
本说明书中的术语“病毒感染症”是指通过具有脂质双分子层的外壳的病毒的感染发病的疾病，作为一例，可以为：通过布尼亚病毒科的病毒感染发病的肾综合征出血热(流行性出血热)；通过冠状病毒科的病毒感染发病的伤风等呼吸系统疾病或冠状病毒感染症；通过黄病毒科的病毒感染发病的丙型肝炎；通过嗜肝脱氧核糖核酸病毒科的病毒感染发病的乙型肝炎；通过疱疹病毒科的病毒感染发病的带状疱疹；通过正粘病毒科的病毒感染发病的流行性感冒或流感病毒感染症；通过痘病毒科的病毒感染发病的天花；通过弹状病毒科的病毒感染发病的狂犬病或水泡性口炎；通过逆转录病毒科的病毒感染发病的获得性免疫缺陷综合征等。作为其他例，可以为通过术语正粘病毒的流感病毒感染发病的流行性感冒或流感病毒感染症。
除作为有效成分的上述组合物以外，本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物中包含的药学上可接受的载体为配制时通常使用的，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油等，但不限定于此。
除上述成分以外，本发明的药物组合物还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、助悬剂、保存剂等。适当的药学上可接受的载体及制剂详细记录在Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中。
本发明的药物组合物可以口服或胃肠外给药，例如，可以通过脊髓腔内给药、静脉内给药、皮下给药、皮内给药、肌肉内给药、腹腔内给药、胸骨内给药、肿瘤内给药、鼻内给药、脑室内给药、颅骨内给药、肺内给药及直肠内给药等来给药，但不限定于此。
本发明的药物组合物的适当给药量根据配制方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、疾病状态、饮食、给药时间、给药途径、代谢速度及反应敏感度等因素的不同而多种多样，具有通常熟练度的医生可以轻易确定及处方用来获得所希望的治疗或预防效果的有效给药量(药学上有效的量)。根据本发明的优选实例，本发明的药物组合物的一天给药量为0.0001mg/kg-100mg/kg。
本说明书中的术语“药学上有效的量”是指用于预防或治疗上述疾病的充分的量。
本说明书中的术语“预防”是指防止疾病或疾病状态或者保护性的治疗。本说明书中的术语“治疗”是指疾病状态的减少、抑制、改善或根除。
本发明的药物组合物可以根据本发明所属技术领域的普通技术人员容易实施的方法，利用药学上可接受的载体和/或赋形剂来配制为单位剂量形态或装入多剂量容器内来制备。在此情况下，剂型可以多种多样地制备为口服药、注射剂等，也可以制备微油或水性溶剂的溶液、悬混液或乳化液形态，或者萃取剂、散剂、栓剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂等形态，还可以包含分散剂或稳定剂。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供预防或治疗病毒感染症的方法，包括向个体给药上述本发明的包含聚合物纳米盘的用于预防或治疗病毒感染症的药物组合物的步骤。
本说明书中使用的术语“给药”或“施予”是指向患有对象疾病或可能患病的对象(个体)直接给药本发明的组合物的治疗性或预防性有效量来在对象体内形成相同的量。
上述组合物的“治疗性有效量”是指向所要给药组合物的对象提供治疗或预防效果的充分的组合物的含量，这其中包含“预防性有效量”的含义。
并且，本说明书中使用的术语“个体(对象)”可以为包括人类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴、黑猩猩、狒狒及恒河猴在内的哺乳动物。最具体地，本发明的个体可以为人类。
本发明的上述预防或治疗病毒感染症的方法为包括给药作为本发明的一实施方式的药物组合物的步骤的方法，为避免本说明书过度的重复性，将省略重复的内容。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供筛选最优化的纳米盘结构物的组合物的方法，包括：步骤(a)，使目标病毒与上述聚合物纳米盘反应；以及步骤(b)，确认上述聚合物纳米盘是否对目标病毒表现出抗病毒活性。
另一方面，在上述步骤(b)中，用于确认上述聚合物纳米盘是否对病毒表现出抗病毒活性的方法可以为单独或组合来使用NA活性抑制分析、血细胞凝集反应抑制分析、核糖核酸释放分析、板块减少分析等公知方法的方法，但不限定于此。
另一方面，本申请人通过实验确认到本发明的聚合物纳米盘：i)不表现出细胞毒性；ii)稳定性优秀；iii)对流感病毒、冠状病毒、水泡性口炎病毒等多种病毒表现出抗病毒功效。并且，确认到在具体的组成中，通过使磷脂与聚合物的种类多样化来增大抗病毒功效。
因此，本发明的聚合物纳米盘可以通过优秀的稳定性、制备便利性、优秀的抗病毒功效以及低细胞毒性来在体内发挥优秀的抗病毒功能。
以下，通过实施例更为详细地说明本发明。但本发明所属技术领域的普通技术人员应该自明的是，这些实施例仅用于更为具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不限定于这些实施例。
在本说明书全文中，若无其他说明，则用来表示特定物质的浓度的“％”，固体/固体为(重量/重量)％，固体/液体为(重量/体积)％，液体/液体为(体积/体积)％。
[实施例1：制备聚合物纳米盘]
为了制备聚合物纳米盘，聚合物使用SMA(苯乙烯-马来酸(Styrene-MaleicAcid))中苯乙烯∶马来酸的比例分别为2∶1和3∶1的两种聚合物，构成脂质使用16∶0-18∶1的磷脂酰胆碱(POPC，Phosphatidylcholine，以下简称为POPC)、16∶0的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC，Dipalmitoylphosphatidylcholine，以下简称为DPPC)、14∶0的1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC，1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，以下简称为DMPC)、18∶1的二油酰基-3-三甲基丙烷铵(DOTAP，Dioleoyl-3-trimethylammoniumpropane，以下简称为DOTAP)、16∶0-18∶1的1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE，1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine以下简称为POPE)。本实验中使用的各组成如下。
[表1]
*ND＝纳米盘(NanoDisc)，聚合物纳米穿孔器的制备方法具体如下。
首先，将固体形态的脂质溶于有机溶剂后，在玻璃管中混合上述表1所示组成的脂质后，利用氮气和真空管使有机溶剂完全气化来只剩下薄膜形态的脂质。利用水合缓冲液(10mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、150mM的氯化钠(NaCl)；pH7.4)使薄膜形态的脂质充分溶解5分钟以上后，利用液氮和50℃的水重复冷冻和融解的过程5次以上来生产脂质体。然后，以0.5％-2％(w/v)的量加入聚合物后，利用液氮和50℃的超声仪重复冷冻及声波处理的过程5次以上。通过此，在聚合物钻入脂质体的同时使水分子挤入来在脂质层之间形成孔(pore)，从而最终形成纳米盘结构。为了去除未形成纳米盘的聚合物和直径较大的脂质体，进行超离心过滤(Ultracentrifugal filtration)。通过尺寸排阻色谱(SizeExclusion Chromatography)根据尺寸纯化完成的纳米盘的浓缩液，浓缩获得的样品(图1的(A)部分、(B)部分)。利用纸质定量检测试剂盒(lipid quantification assay kit)测量纳米盘内的脂质浓度，样品的浓度以脂质的浓度为基准来表示。
[实施例2：确认聚合物纳米盘的结构及形态]
1)确认聚合物纳米盘的结构
通过动态光散射(DLS，Dynamic Light Scattering)测量上述实施例1中制备的聚合物纳米盘的直径。通过动态光散射测量纳米盘的直径的结果为，在向10mM的脂质(100％的POPC)加入1.2％的SMA(2∶1)时，平均直径为13.4nm，占总质量的80.9％(图2的(A)部分)。并且，在向10mM的脂质(100％的POPC)加入1.2％的SMA(3∶1)时，平均直径为15.6nm，占总质量的87.4％(图2的(B)部分)。
2)确认聚合物纳米盘的形态
为了观察在上述内容中确认直径的聚合物纳米盘的结构形态，以脂质与聚合物的浓度总和为20nmol/100μl的方式稀释并利用透射电子显微镜(Transmission ElectronMicroscope)拍照(图2的(C)部分为为SMA 2∶1，(D)部分为SMA 3∶1)。本发明中使用SMA来制备微圆盘形态的内容可以通过论文“Tanaka M et al.,Effects of charged lipids onthe physicochemical and biological properties of lipid-styrene maleic acidcopolymer discoidal particles.Biochim Biophys Acta Biomembr.(2020)3-4.”中记录的在以与本发明相似的方法组合磷脂与SMA来制备结构物后，将使用透射电子显微镜拍摄的结构物形态称为盘状(discoidal shape)(圆盘形)的内容来确认。
[实施例3：检验聚合物纳米盘的细胞毒性]
若将不在体内合成的聚合物当作药物注入体内，则可能因将聚合物识别为外部抗原而诱发免疫反应或诱发毒性。顾虑到这一点，分别确认两种聚合物以及由其制备的聚合物纳米盘是否具有细胞毒性。
在96孔培养板中接种2×104cells/100μl的MDCK细胞，24小时后当细胞的密集度(confluency)达到90％以上时，在聚合物的情况下，从最高浓度5μM以1/5连续稀释至最低浓度为0.00032mM并处理细胞，在纳米盘的情况下，以磷脂为基准从最高浓度50μM以1/5连续稀释至最低浓度为0.0032mM来处理细胞。这是考虑到直径10nm左右的纳米盘内聚合物的构成比例为1/10的结构。24小时后，当向每孔处理100μl的作为水溶性四唑盐的(tetrazolium salt)的WST-8溶液时，利用WST-8被活着的细胞内的称为脱氢酶(dehydrogenase)的酶还原并形成橙色的甲臜(formazan)的原理来测定存活细胞的比例(cell viability)。聚合物和聚合物纳米盘形态都不表现出细胞毒性(图3的(A)部分、(B)部分)。
[实施例4：检验聚合物纳米盘的抗病毒功效]
1)确认包含聚合物和聚合物纳米盘的多种药物的抗病毒功效
为了确认聚合物和聚合物纳米盘是否实际上具有抗病毒功效，进行微量中和(MN)实验(Microneutralization assay)。
将实验中使用的物质中(利用肝素、膜支架蛋白(membrane scaffoldprotein)制备的纳米盘(MSP-Nanodisc，MSP-NDG)、仅SMA(Free-SMA)(2∶1)、SMA(2∶1)-ND(POPE))设定为相同浓度(以磷脂浓度为基准为10μM，以聚合物为基准为1μM)，在37℃的温度下向流感病毒(A/波多黎各/8/34(A/Puerto Rico/8/34))处理1小时。向前一天以2×104cells/100μl接种到96孔培养板达100％密集度状态的MDCK细胞处理已反应1小时的“处理物质+病毒混合液”。24小时后，以0.5μM的浓度处理4-MUNANA(4-甲基伞形基-N-乙酰基-α-D-神经氨酸(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-Neuraminic Acid))后在37℃的温度下反应1小时。测量355nm/460nm的荧光值来定量分析病毒的神经氨糖酸苷酶活性。
确认到与相同浓度基准的作为现有药物的肝素和MSP-NDG相比，聚合物Free SMA(2∶1)及聚合物纳米盘SMA(2∶1)-ND(POPE)的抗病毒功效突出(图4的(A)部分)。在此情况下，尽管Free SMA本身因两亲性而具有抗病毒活性，但通过相互结合而具有聚合(aggregation)特性。然而，将其制备为纳米盘形态时，稳定而不聚合，因此具有可以使构成磷脂多样化的优点。实际上在下述实验中以不同的磷脂构成制备纳米盘后比较功效时，确认到包含POPE磷脂的结构物的功效最佳。并且，纳米盘在生物体内(in vivo)比Free SMA的功效更好，其原因判断为也是由于上述稳定性和结构物功效的改善。
2)通过透射电子显微镜确认病毒形态变化
为了确认是否实际上通过聚合物和聚合物纳米盘破坏病毒的形态，以聚合物为基准的1μM、在聚合物纳米盘的情况下以磷脂为基准的10μM与流感病毒(A/Puerto Rico/8/34)反应1小时后，利用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope)拍摄(图4(B)部分)。结果为，可以实际上通过肉眼观察到正常的病毒形态呈现被破坏为能够以肉眼分辨的程度的状态。
[实施例5：确认通过聚合物纳米盘内磷脂构成变化的抗病毒功效增大及稳定性增大]
1)通过聚合物纳米盘内磷脂构成变化确认抗病毒功效增大
为了确认纳米盘随磷脂种类的抗病毒效果，检验使用多种磷脂的纳米盘的抗病毒功效。
利用除POPC以外的其他磷脂，即，利用DMPC、DPPC、POPE、DOTAP等制备聚合物纳米盘后，从以磷脂为基准的最高浓度10μM开始以1/5连续稀释并在37℃的温度下处理流感病毒(A/Puerto Rico/8/34)1小时。此后的过程，除磷脂组成以外，以与实施例相同的方法测量。在此情况下，图5的(A)部分和(B)部分分别为以磷脂的种类为5种和3种来实验的情况，这是为了检验功效的改善并分别再比较磷脂而进行的。结果，在由磷脂种类中的POPE构成的聚合物纳米盘的情况下，与由其他磷脂构成的纳米盘相比较时，确认到抗病毒功效增大，在IC50的情况下，测定为0.21μM。
2)通过聚合物纳米盘内磷脂构成变化确认稳定性(对温度的稳定性)增大
在基于10mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸的水溶液内，通过测定分别以磷脂种类中的POPC、POPE制备的聚合物纳米盘和聚合物自身在37℃温度下随时间的浑浊度变化来确认它们的稳定性(图6)。结果为，确认到把聚合物变换为纳米盘形态时对温度的稳定性高，在纳米盘内构成磷脂中，确认到使用POPE时的稳定性最高。
[实施例6：聚合物与聚合物纳米盘的抗病毒活性差异]
1)聚合物与聚合物纳米盘在不同温度条件下的抗病毒活性差异
通过微量中和实验检验聚合物与聚合物纳米盘在各个温度条件(4℃、37℃)下表现出的抗病毒活性的差异。将实验中使用的聚合物及聚合物纳米盘从聚合物基准最高浓度1μM、纳米盘内磷脂基准最高浓度10μM开始以1/5连续稀释并分别在4℃、37℃的温度下处理流感病毒(A/Puerto Rico/8/34)1小时。在4℃的温度下预先冷却(cooling)前一天以2×104cells/100μl接种到96孔培养板达100％密集度状态的MDCK细胞30分钟后，处理已反应1小时的“处理物质+病毒混合液”。1小时后重新在37℃的条件下培养培养板1小时后，去除药物与病毒混合液并更换干净状态的培养基。24小时后，以0.5μM的浓度处理4-MUNANA后在37℃的温度下反应1小时。测量355nm/460nm的荧光值来定量分析病毒的神经氨糖酸苷酶活性。
结果为，确认到与37℃的条件相比，在4℃条件下，聚合物本身的抗病毒活性变弱，确认到在4℃和37℃的条件下，由磷脂中的POPE构成的聚合物纳米盘的抗病毒活性均比聚合物本身突出(图7)。
2)聚合物与聚合物纳米盘的杀病毒(virucidal)活性差异
为了通过与基于膜支架蛋白的纳米盘、肝素比较来确认聚合物和聚合物纳米盘的抗病毒作用机制，在37℃的温度下时病毒与EC90浓度的药物反应1小时后，稀释为1/100的浓度并处理预先接种的MDCK细胞(cell)。24小时后，以0.5μM的浓度处理4-MUNANA后在37℃的温度下反应1小时。测量355nm/460nm的荧光值来定量分析病毒的神经氨糖酸苷酶活性。
确认到已知具有病毒增殖抑制特性的现有的药物肝素在稀释为1/100的情况下，表现出病毒的活性恢复的状态，与之相反，即使将聚合物和聚合物纳米盘稀释为1/100，病毒的活性仍较低(图8)。通过此确认到药物的作用机制与杀病毒剂(virucidal)相近。尤其，由磷脂POPE构成的纳米盘的杀病毒能力最佳。
[实施例7：制备水泡性口炎病毒(VSV，Vesicular Stomatitis Virus)-假病毒、冠状病毒-假病毒]
1)制备双报告基因水泡性口炎病毒-假病毒、冠状病毒-假病毒生产用质粒
制备两种假病毒所需的HIV gag-pol质粒(pNL4.3-mCherry-Luc)从Addgene公司(马萨诸塞州，美国)购买，有关质粒的信息在Kara G.Lassen,et al..2012,AFlexibleModel of HIV-1Latency Permitting Evaluation of Many Primary CD4 T-CellReservoirs,PLOS one中发表。通过其他研究所(KIST，韩国)获得VSV-G、mVSV-G(H162R)质粒，相关信息通过细胞生物实验室公司(Cell Biolabs)(加利福尼亚州，美国)获得。冠状病毒刺突蛋白通过义翘神州公司(Sinobiological)(北京，中国)购买，通过定点诱变(SiteDirected Mutagenesis)进行C-term 19氨基酸缺失，实验中使用的引物的序列如下述表2所示，详细的组成和反应条件如表3所示。
[表2]
[表3]
2)用于转化的质粒Maxiprep
为了用于转化的Maxiprep，通过热冲击方法将上述购买和制备的质粒转化到Top10水溶性细胞。将在包含150μg/ml的氨苄西林(ampicillin)的固体培养基中生长的细胞集落接种到10ml的包含氨苄西林的液体培养基(LB肉汤基础培养基(LB broth miller))中，在37℃、250rpm的振荡培养器中培养16小时。然后，向600ml的相同的培养基中二次接种后在37℃、200rpm的振荡培养器中追加培养16小时。然后，以6000rpm的转速离心分离10分钟来去除培养基后只获取细胞。在获得的细胞中利用Maxiprep试剂盒(kit)(Qiagen公司，美国)来大量纯化质粒。
3)制备水泡性口炎病毒-假病毒、冠状病毒-假病毒
通过293T细胞株(ATCC公司，美国)生产、纯化假病毒。向445ml的杜氏改良伊戈尔培养基(DMEM)(Hyclone公司，美国)加入50ml的胎牛血清(FBS)(阿特拉斯公司(ATLAS)，美国)、5ml的PSN(Hyclone公司，美国)来制备培养用培养基后利用其传代培养293T细胞株。向在10cm的培养皿中以90％左右的密度培养的293T细胞株分别放入15μg的HIV gag-pol质粒、5μg的VSV-G质粒、60μg的聚醚酰亚胺(PEI)以及15μg的HIV gag-pol质粒、5μg的刺突蛋白质粒、60μg的聚醚酰亚胺并在37℃、5％的CO2的恒温箱中培养8小时后，更换培养基并追加培养48小时。然后，收集培养基并以800g的条件离心分离5分钟来与细胞分离后，根据需要实施20％的蔗糖密度梯度离心法(Sucrose cushion centrifugation)。
4)确认制备的水泡性口炎病毒-假病毒、冠状病毒-假病毒的特性
确认两种假病毒内是否存在mCherry-荧光素酶病毒核糖核酸(mCherry-Luciferase viral RNA)以及外膜蛋白(冠状病毒刺突蛋白)。实验中使用的引物的序列如下述表4所示，向假病毒产物处理1％的Triton X-100后，利用M-MLV逆转录酶(考世茂基因技术公司(Cosmogenetech)，韩国)和KOD-Neo-Plus(东洋纺公司(Toyobo)，日本)实施聚合酶链式反应(PCR，Polymerase Chain Reaction)后，在1％的琼脂凝胶中以135V的电压进行电泳30分钟来确认扩增与否。相关聚合酶链式反应的详细组成和反应条件如表5、表6所示。通过蛋白印迹法确认是否存在外膜蛋白，首先以23000rpm离心分离假病毒产物2小时30分钟来浓缩后，上样到8％的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE-gel)后以80V、20分钟以及140V、1小时10分钟的条件进行电泳。然后，将聚丙烯酰胺凝胶放到硝化纤维膜(NC膜)上，使270mA的电流流过40分钟来使蛋白质移到硝化纤维膜上。然后，以5％(w/v)的浓度在TBST缓冲液中溶解脱脂奶粉来封闭硝化纤维膜1小时后，以1μg/ml的浓度将抗SARS-CoV-2刺突抗体(Anti-SARS-CoV-2spike antibody)(abcam公司，美国)溶于TBST缓冲液中后，向硝化纤维膜处理1小时。然后，使用TBST缓冲液洗涤10分钟，重复3次后，以1∶2000的比例将抗兔(Anti-rabbit)IgG抗体(西格玛公司(sigma)，美国)溶于TBST缓冲液后处理1小时后，重新使用TBST缓冲液洗涤10分钟的过程3次。然后，通过增强型化学发光试剂(ECL)引起化学发光反应来使底片感光来固定。结果为，如图9所示，能够以假病毒产物的量成比例地确认3kb的mCherry-荧光素酶病毒核糖核酸的扩增并确认180kDa的刺突蛋白表达。
<110> MVRIX 株式会社
<120> 包含聚合物纳米盘的用于预防或治疗病毒感染症的药物组合物
<130> YP-21-259
<150> KR 10-2021-0051407
<151> 2021-04-20
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒正向引物
<400> 1
tgtggctcct gttgttaaaa gtttgatgag gat
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒反向引物
<400> 2
atcctcatca aacttttaac aacaggagcc aca
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry-荧光素酶病毒核糖核酸正向引物
<400> 3
gggggtggga agccctcaaa tattgg
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry-荧光素酶病毒核糖核酸反向引物
<400> 4
gggttgtgcc gcctttgcag gtg

Claims (11)

1.一种聚合物纳米盘，其特征在于，由两亲性聚合物与通过两亲性脂质的疏水部分相互连接形成的脂质双分子层结合来形成。
2.根据权利要求1所述的聚合物纳米盘，其特征在于，上述聚合物纳米盘以如下方式形成：两亲性脂质的疏水部分相互连接形成排列为上下两层的圆盘形态的脂质双分子层，两亲性聚合物通过疏水键包裹暴露于上述脂质双分子层的侧面的两亲性脂质的疏水部分。
3.根据权利要求1所述的聚合物纳米盘，其特征在于，上述两亲性脂质为选自由磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺及磷酯酰丝氨酸组成的组中的一种以上磷脂。
4.根据权利要求1所述的聚合物纳米盘，其特征在于，上述两亲性聚合物为选自由苯乙烯-马来酸、二异丁烯-马来酸、苯乙烯-马来酰亚胺、聚甲基丙烯酸甲酯及它们的组合组成的组中的一种以上。
5.根据权利要求1所述的聚合物纳米盘，其特征在于，相对于上述聚合物纳米盘总量，包含0.1％至20％的上述两亲性聚合物。
6.根据权利要求1所述的聚合物纳米盘，其特征在于，上述聚合物纳米盘穿孔病毒的脂质双分子层外壳。
7.根据权利要求6所述的聚合物纳米盘，其特征在于，上述病毒为属于选自由布尼亚病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、嗜肝脱氧核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、正粘病毒科、痘病毒科、弹状病毒科、逆转录病毒科、披膜病毒科及疱疹病毒科组成的组中的一种以上科的病毒。
8.根据权利要求6所述的聚合物纳米盘，其特征在于，上述病毒为选自由流感病毒、冠状病毒及水泡性口炎病毒组成的组中的一种以上病毒。
9.一种用于预防或治疗病毒感染症的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1至8中任一项所述的聚合物纳米盘。
10.一种预防或治疗病毒感染症的方法，其特征在于，包括向个体给药包含权利要求1至8中任一项所述的聚合物纳米盘的用于预防或治疗病毒感染症的药物组合物的步骤。
11.一种筛选最优化的纳米盘结构物的组合物的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，使目标病毒与权利要求1至8中任一项所述的聚合物纳米盘反应；以及
步骤(b)，确认上述聚合物纳米盘是否对目标病毒表现出抗病毒活性。
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