KR20230064607A - 양친매성 폴리머 나노디스크를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents
양친매성 폴리머 나노디스크를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 지질 이중층, 양친매성 폴리머를 포함하는 폴리머 나노디스크 및 상기 폴리머 나노디스크를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 지질 이중층, 양친매성 폴리머를 포함하는 폴리머 나노디스크를 이용하는 경우, 항바이러스 효능을 나타내므로 바이러스 감염증을 예방 또는 치료하는 용도로 사용가능하다.
Description
본 발명은 지질 이중층, 양친매성 폴리머를 포함하는 폴리머 나노디스크 및 상기 폴리머 나노디스크를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스(Influenza virus)는 오르소믹소 계통(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A형, B형, C형 등 3가지로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 사람에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 사람, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있다. A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA)과 뉴라미니다제(Neuraminidase;NA)의 종류에 따라 구분되는데, 지금까지 144종류(HA 단백질 16종과 NA 단백질 9종)가 알려져있다. HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA는 바이러스가 세포 내로 침투할 수 있도록 한다.
지금까지 개발된 바이러스 감염증 치료제로는 아만타딘(amantadine) 또는 리만타딘(rimantadine)계열의 M2 이온채널 억제제(M2 ion channel inhibitor)와 오셀타미비르(oseltamivir, 상품명 타미플루) 또는 자나미비르(zanamivir, 상품명 리렌자) 계열의 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 억제제가 알려져 있으나, 이들 치료제는 그의 효과가 제한된다는 문제점이 있었다. 즉, 아만타딘 또는 리만타딘 계열의 유도체 화합물은 이에 대한 저항성 변종바이러스가 빠르게 생성되고, 일부 지역에서 검출된 H5N1 타입의 인플루엔자 바이러스는 아만타딘 또는 리만타딘 계열의 화합물에 대하여 내성을 나타내며, 인플루엔자 B 바이러스는 아만타딘 유도체에 민감하지 않다고 알려져 있다. 또한, 오셀타미비르 또는 자나미비르 계열의 유도체 화합물 역시 이에 대한 저항성 바이러스가 증가하고, 이러한 저항성 바이러스는 어린이에게서 빈번히 발생하고 있다고 알려져 있다.
상기와 같은 기존 바이러스 감염증 치료의 문제점이 없는 새로운 치료제를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 예를 들어, 한국등록특허 제1334143호에는 폴리갈라 카렌시움(Polygala karensium) 추출물 및 이로부터 분리된 잔톤계 화합물을 함유하는 감기, 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 신종플루의 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 이들 제제는 항-바이러스 활성이 낮아서, 신종플루와 같은 인플루엔자 유래 질병에 대한 효과적인 예방 또는 치료효과를 나타내지는 못하고 있다.
또한, 2015년에는 코로나 바이러스에 의한 메르스, 2020년부터 현재 진행형인 코로나 바이러스에 의한 COVID-19 등 바이러스에 의한 질병의 유행이 근래 다수 발생하고 있다.
코로나바이러스는 코로나바이러스과(Coronaviridae)의 코로나바이러스아과(Coronavirinae)에 속하는 RNA 바이러스로, 사람과 동물의 호흡기와 소화기계 감염을 유발한다. 주로 점막전염, 비말전파로 쉽게 감염되며, 사람에게는 일반적으로 경미한 호흡기 감염을 일으키지만 치명적인 감염을 유발하기도 하며, 소와 돼지는 설사, 닭은 호흡기 질환이 발생하기도 한다. 코로나바이러스는 현대 문명에서 치명적인 감염병을 일으키는 대표적인 바이러스다. 2003년 4월에는 중화인민공화국발 중증급성호흡기증후군, 일명 사스가 유행해 사망률 9.6%를 기록하며 많은 사람이 사망했다. 2015년에는 중동호흡기증후군, 일명 메르스가 중동에서 전 세계로 퍼지면서 사망률 약 36%로써 사망자가 다수 발생하였다. 또한 2019년 12월부터 중국 우한발 신종 코로나바이러스 감염증(코로나19,COVID-19)이 전 세계로 확진되면서 감염자가 늘어나고 있으며, 치사율은 2020년 2월까지 집계된 자료에 따르면 2.6%로 그나마 낮은 편이지만 전세계에서 확진자가 폭증하는 중이며 예방 또는 치료 목적으로 승인된 백신이나 항바이러스제는 없었다. 현재, 카모스타트, 렘데시비르, 하이도록시클로로퀸 등의 타 질환치료제로 이용되던 약물들이 코로나바이러스 치료제로의 가능성에 대해서 검토되고, 부작용과 미미한 효능으로 인하여 임상이 실패하거나 정지되어 있다.
수포성내염구바이러스(Vesicular stomatitis Indiana virus, VSV)는 Indiana vesiculovirus, formerly Vesicular stomatitis 라고 불리며, 랍도비리데(Rhabdoviridae) 패밀리에 속한다. 주로 가축 전염병이며, 이에 대한 치료제는 없는 실정이다.
상기한 바이러스들은 모두 지질이중막으로 구성된 외피를 가지고 있다는 공통점이 있다. 상기를 포함한 많은 동물 바이러스들(예, HIV, 간염 바이러스, MERS, 헤르페스 바이러스, 에볼라 바이러스 등)이 막단백질과 지질이중막 외피를 가지고 있다. 막단백질 혹은 표면 항원은 바이러스의 외피에 존재하며, 숙주세포의 수용체에 결합하는 특징을 갖고 있어 바이러스가 세포 내로 침투하는 것을 유도한다. 또한 외피는 바이러스의 감염 경로에서 매우 중요한 역할을 수행할 뿐만 아니라 스스로를 인체의 면역 체계로부터 보호하는 역할을 수행한다. 따라서 위와 같이 바이러스의 막단백질과 수용체 간의 결합을 방해하거나 외피를 손상시킴으로써 바이러스의 감염을 억제할 수 있다. 바이러스의 막단백질을 방해하여 바이러스 증식을 억제(virustatic)하는 약물 중 대표적으로 오셀타미비르(oseltamivir)가 알려져 있으나 이와 같은 항바이러스제의 경우 효과가 일시적이거나, 재발한다거나, 약효가 약하다거나 하는 것은 그 약의 작용양식이 바이러스의 증식을 억제하는 방식이기 때문에 그 약물의 농도가 낮아지면 다시 바이러스가 증식할 수 있다. 또한, 약물의 농도의 변화에 따라서 증식과 중지가 반복되면 당연히 바이러스는 "adaptive evolution"에 의한 결과로서 내성바이러스가 발생할 수 있다. 오셀타미비르(타미플루) 또한 내성바이러스들이 점점 많이 보고되고 있다. 중화 항체의 경우에도 단순히 바이러스 감염 사이클을 저해하는 것만으로는 충분하지 않기 때문에 치료제로 개발하기가 여의치 않은 상황이다. 외피 바이러스의 감염력을 감소시키는 약물은 살바이러스제(virucide)로 표현을 하며, 일상 생활에서는 비누와 소독제 같은 것들이 대표적인 살바이러스제로 사용되고 있다. 하지만, 상기와 같은 살바이러스제는 안전하지 않기 때문에 치료제로 사용하기에 제한적이다.
따라서 강한 약효를 기대하기 위해서는 바이러스 외피를 손상시키는 살바이러스제의 작용 방식이 유리하며, 이에 더하여 안전하고 광범위한 외피바이러스에 대한 적용이 가능한 살바이러스제가 필요하다. 이를 위하여 바이러스가 공통적으로 가지고 있는 막단백질의 상부 영역이 양전하를 띠는 점에 주목하여 구조체의 음전하 특성을 이용해 바이러스와의 결합을 유도한 뒤, 바이러스 외피를 파고들어 손상시키는 특성을 가진 나노디스크 구조체를 만들었다.
바이러스의 외피를 파괴하는 약물은 변종 바이러스에 공통적으로 적용 가능하다는 장점이 있다. 그 이유는 변종이 바이러스 단백질에 발생한 것임에 반하여 바이러스의 외피는 세포막에서 유래하였기 때문에 바이러스의 변이에 영향을 받지 않기 때문이다. 또한, 바이러스의 외피를 파괴하는 약물은 현존하는 항바이러스제에 비해 훨씬 강력한 효능을 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명에서는 정전기적 인력으로 인해 바이러스와의 결합 후, 바이러스의 외피를 비선택적으로 파괴하는 살바이러스제를 개발함으로써, 다범위 종류의 외피바이러스에 적용 가능한 강력하고 안전한 항바이러스제를 개발하고자 하였다.
본 발명은 기존 나노천공자 구조체 내 단백질(Membrane scaffold protein, MSP)이 열에 대한 안정성과 체내 단백질분해효소로부터 저항성이 낮은 점을 고려하여 이를 양친매성 폴리머로 대체함으로써 구조체의 안정성을 개선하고, 항바이러스 활성을 증진하기 위해 착안되었다. 또한, MSP로 나노디스크를 만들기 위해서는 콜린산 나트륨과 같은 계면활성제를 이용하여 단백질과 지질을 섞은 후 바이오비드(BioBead SM2) 등과 같은 흡착제를 이용해서 계면활성제를 제거하는 등 복잡한 공정을 거쳐야 하는 반면 폴리머 나노디스크는 지질과 섞기만 하면 자동적으로 만들어진다는 장점이 있다. 또한 폴리머 나노디스크는 옆면에 강한 음전하를 띄는데 반하여 MSP로 만들어진 나노디스크는 그렇지 않다. 강한 음전하를 띄는 폴리머 나노디스크는 바이러스 표면 단백질의 양전하와 상호작용하기 때문에 바이러스에 쉽게 접근할 수 있게 되며, 나노디스크의 활성으로 인해 바이러스를 쉽게 불활화시킬 수 있는 가능성이 있다. 이는 광범위한 바이러스에 대해 활성을 가지는 항바이러스제 개발의 단초를 제공할 수 있으며, 나노디스크의 항바이러스 활성을 획기적으로 증대시킬 수 있는 가능성이 있다. 즉 나노디스크에서 MSP를 양친매성 폴리머로 대체하는 경우 넓은 바이러스에 대해 살바이러스 활성을 가지게 만들 수 있으며, 기존의 나노디스크보다 높은 항바이러스 성능을 가질 뿐만 아니라 제조 공정이 용이하다는 장점을 가진다. 또한 단백질이 아닌 폴리머를 사용하기 때문에 훨씬 경제적인 생산이 가능하다는 장점이 있을 것으로 판단하였다.
이와 같이 본 발명자들은 기존의 바이러스 억제제들을 대체할 수 있는 새로운 살바이러스제를 개발하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과 지질 이중층, 양친매성 폴리머를 포함하는 폴리머 기반의 나노디스크를 이용하는 경우, 항바이러스 효과가 우수한 점을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 지질 이중층, 양친매성 폴리머를 포함하는 폴리머 기반의 나노디스크를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리머 기반의 나노디스크를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리머 기반의 나노디스크의 효능 향상을 위한 최적화된 구조체를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 양친매성 지질의 소수성 부분이 상호 맞닿아 형성되는 지질 이중층에 양친매성 폴리머가 결합하여 형성된 폴리머 나노디스크를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리머 나노디스크는, 바람직하게 양친매성 지질의 소수성 부분이 상호 맞닿아 상하의 이중층으로 배열하여 원반 형태의 지질 이중층을 형성하고, 그 측면에 노출된 양친매성 지질의 소수성 부분을, 양친매성 폴리머가 소수성 결합으로 둘러 감싸 형성된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 양친매성 지질은, 바람직하게 인지질일 수 있고, 더욱 바람직하게 상기 인지질은, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol),포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) 및 포스파티딜세린(phosphatidylserine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 양친매성 폴리머는 바람직하게 스티렌-말레산(Styrene-Maleic Acid, SMA), 디-이소부틸렌-말레산(Di-IsoButylene-Maleic Acid, DIBMA), 스티렌-말레이미드(Styrene-Maleimide, SMI), 폴리메타크릴레이트(Polymethyl Methacrylate, PMA) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 양친매성 폴리머는 바람직하게 전체 폴리머 나노디스크 대비 0.1 내지 20%로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리머 나노디스크는 바이러스의 지질 이중층 외피를 천공하는 것으로 확인되었다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 바이러스는 바람직하게 버니아비리데(Bunyaviridae) 과, 코로나비리데(Coronaviridae) 과, 필로비리데(Filoviridae) 과, 플라비비리데(Flaviviridae) 과, 헤파드나비리데(Hepadnaviridae) 과, 헤르페스비리데(Herpesviridae) 과, 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae) 과, 폭스비리데(Poxviridae) 과, 랍도비리데(Rhabdoviridae) 과, 레트로비리데(Retroviridae) 과, 토가비리데(Togaviridae) 과 및 헤르페스비리데(Herpesviridae) 과로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 과에 속하는 바이러스인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 바이러스는 바람직하게 인플루엔자 바이러스, 코로나 바이러스 및 수포성 구내염 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리머 나노디스크를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 지질 이중층, 양친매성 폴리머를 포함하는 폴리머 나노디스크를 제공한다.
(b) 본 발명은 상기 폴리머 나노디스크를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(c) 본 발명의 지질 이중층, 양친매성 폴리머를 포함하는 폴리머 나노디스크를 이용하는 경우, 항바이러스 효능을 나타내므로 바이러스 감염증을 예방 또는 치료하는 용도로 적용이 가능하다.
(d) 본 발명에서 양친매성 폴리머를 사용한 결과 기존에 ApoA1 또는 MSP를 사용한 경우에 비해 항바이러스 활성이 매우 높아짐을 확인할 수 있었다.
도 1의 (A)는 SEC을 통해 정제한 폴리머(SMA 2:1) 나노디스크(lipid : SMA = 1 : 2)의 크기별 분포양상이고, (B)는 SEC을 통해 정제한 폴리머(SMA 3:1) 나노디스크(lipid : SMA = 1 : 2)의 크기별 분포양상이다.
도 2의 (A)는 DLS를 통해 측정한 폴리머(SMA 2:1) 나노디스크(lipid : SMA = 1 : 2)의 직경 분포도이고, (B)는 DLS를 통해 측정한 폴리머(SMA 3:1) 나노디스크(lipid : SMA = 1 : 2)의 직경 분포도이다. 도 2의 (C)는 투과전자현미경을 통해 촬영한 폴리머(SMA 2:1) 나노디스크(lipid : SMA = 1 : 2)의 구조 형태이고, (D)는 투과전자현미경을 통해 촬영한 폴리머(SMA 3:1) 나노디스크(lipid : SMA = 1 : 2)의 구조 형태이다.
도 3은 폴리머(SMA 3:1(A), SMA 2:1(B))와 폴리머 나노디스크의 MDCK cell 내에서의 세포 독성을 확인한 실험 결과를 나타낸다.
도 4의 (A)는 폴리머(SMA 2:1), 폴리머 나노디스크, 단백질 기반 나노디스크(MSP-NDG)와 헤파린의 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 효능을 확인한 실험 결과를 나타낸 것이고, (B)는 투과전자현미경을 통해 폴리머(SMA 2:1)와 폴리머 나노디스크에 의한 인플루엔자 바이러스의 형태 변화를 촬영한 결과이다.
도 5는 나노디스크의 인지질 구성을 POPC, DPPC, DMPC, DOTAP, POPE로 제작하여 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 효능을 비교한 실험 결과이다.
도 6은 폴리머 나노디스크의 구성 중 POPE 인지질을 이용한 구조 형태의 열에 대한 안정성 증대를 확인한 실험 결과이다.
도 7은 온도별(4℃(상), 37℃(하)) 환경에서 폴리머와 폴리머 나노디스크의 인플루엔자에 대한 항바이러스 효능을 비교하기 위한 실험 결과이다.
도 8은 폴리머, 폴리머 나노디스크(POPC, POPE 구성)와 헤파린 약물의 살바이러스 효능을 비교하기 위한 실험 결과이다.
도 9는 코로나바이러스 내에 리포터 유전자 mCherry-Luciferase viral RNA 및 스파이크 단백질이 존재하는지 확인하기 위해 실시한 PCR(Polymerase Chain Reaction) 및 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 10은 폴리머와 폴리머 나노디스크의 다양한 변종의 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 효능을 확인한 실험 결과이다.
도 11은 폴리머와 폴리머 나노디스크의 VSV-슈도바이러스에 대한 항바이러스 효능을 확인한 실험 결과이다.
도 12는 폴리머와 폴리머 나노디스크의 코로나-슈도바이러스에 대한 항바이러스 효능을 확인한 실험 결과이다.
도 13의 (A)는 동물 실험(생존율)을 통해 폴리머 나노디스크의 항바이러스 효능을 확인한 실험 결과를 나타낸 것이고, (B)는 동물 실험(체중 변화)을 통해 폴리머 나노디스크의 항바이러스 효능을 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명에 따른 폴리머 나노디스크의 모식도이다.
도 2의 (A)는 DLS를 통해 측정한 폴리머(SMA 2:1) 나노디스크(lipid : SMA = 1 : 2)의 직경 분포도이고, (B)는 DLS를 통해 측정한 폴리머(SMA 3:1) 나노디스크(lipid : SMA = 1 : 2)의 직경 분포도이다. 도 2의 (C)는 투과전자현미경을 통해 촬영한 폴리머(SMA 2:1) 나노디스크(lipid : SMA = 1 : 2)의 구조 형태이고, (D)는 투과전자현미경을 통해 촬영한 폴리머(SMA 3:1) 나노디스크(lipid : SMA = 1 : 2)의 구조 형태이다.
도 3은 폴리머(SMA 3:1(A), SMA 2:1(B))와 폴리머 나노디스크의 MDCK cell 내에서의 세포 독성을 확인한 실험 결과를 나타낸다.
도 4의 (A)는 폴리머(SMA 2:1), 폴리머 나노디스크, 단백질 기반 나노디스크(MSP-NDG)와 헤파린의 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 효능을 확인한 실험 결과를 나타낸 것이고, (B)는 투과전자현미경을 통해 폴리머(SMA 2:1)와 폴리머 나노디스크에 의한 인플루엔자 바이러스의 형태 변화를 촬영한 결과이다.
도 5는 나노디스크의 인지질 구성을 POPC, DPPC, DMPC, DOTAP, POPE로 제작하여 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 효능을 비교한 실험 결과이다.
도 6은 폴리머 나노디스크의 구성 중 POPE 인지질을 이용한 구조 형태의 열에 대한 안정성 증대를 확인한 실험 결과이다.
도 7은 온도별(4℃(상), 37℃(하)) 환경에서 폴리머와 폴리머 나노디스크의 인플루엔자에 대한 항바이러스 효능을 비교하기 위한 실험 결과이다.
도 8은 폴리머, 폴리머 나노디스크(POPC, POPE 구성)와 헤파린 약물의 살바이러스 효능을 비교하기 위한 실험 결과이다.
도 9는 코로나바이러스 내에 리포터 유전자 mCherry-Luciferase viral RNA 및 스파이크 단백질이 존재하는지 확인하기 위해 실시한 PCR(Polymerase Chain Reaction) 및 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 10은 폴리머와 폴리머 나노디스크의 다양한 변종의 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 효능을 확인한 실험 결과이다.
도 11은 폴리머와 폴리머 나노디스크의 VSV-슈도바이러스에 대한 항바이러스 효능을 확인한 실험 결과이다.
도 12는 폴리머와 폴리머 나노디스크의 코로나-슈도바이러스에 대한 항바이러스 효능을 확인한 실험 결과이다.
도 13의 (A)는 동물 실험(생존율)을 통해 폴리머 나노디스크의 항바이러스 효능을 확인한 실험 결과를 나타낸 것이고, (B)는 동물 실험(체중 변화)을 통해 폴리머 나노디스크의 항바이러스 효능을 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명에 따른 폴리머 나노디스크의 모식도이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 지질 이중층, 양친매성 폴리머를 포함하는 폴리머 나노디스크를 제공한다.
본 명세서 상에서 용어 "나노디스크"는 지질 이중층을 포함하는 단층(unilamellar)의 원반(disc) 형태 물질을 의미하며, 상기 지질 이중층의 친수성 양 면이 모두 외부에 노출된 열린 계(open system)를 갖는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 나노디스크 자체는 상기 지질 이중층으로 내부 코어를 갖는 닫힌 공간을 형성하지 않는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서 상에서 용어 "폴리머"는 한 종류 또는 수 종류의 구성 단위(단량체)가 서로에게 많은 수의 화학결합으로 중합되어 연결되어 있는 분자로 되어 있는 화합물을 의미하며 중합체라는 용어로 지칭되기도 한다. 폴리머 구조에 따라 사슬 모양 중합체, 다리걸침 중합체 및 그물 모양 중합체 등이 있으며, 두 개 이상의 다른 단량체로 구성된 폴리머는 공중합체 또는 코폴리머라고 지칭하며, 하나의 단량체로 구성된 폴리머는 단일중합체 또는 호모폴리머라고 지칭한다. 본 발명에서는 이러한 폴리머 중 양친매성 폴리머를 사용한다.
본 명세서 상에서 용어 "폴리머 나노디스크"는 상기 나노디스크에 양친매성 폴리머를 구성으로 추가된 나노디스크이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리머 나노디스크는, 바람직하게 양친매성 지질의 소수성 부분이 상호 맞닿아 상하의 이중층으로 배열하여 원반 형태의 지질 이중을 형성하고, 그 측면에 노출된 양친매성 지질의 소수성 부분을, 양친매성 폴리머층(도 14의 amphipathic polymer 부분)가 소수성 결합으로 둘러 감싸 형성된 것일 수 있다(도 14).
본 발명에서 사용된 양친매성 폴리머는 양친매성을 가지고 있어서 소수성 꼬리 (acyl tail)가 물에 직접 노출되는 것을 방지하는 역할을 한다. 이 양친매성 폴리머가 일정 비율로 존재하게 되면 지질이중막을 형성한 인지질의 중간층(2겹의 소수성 아실 꼬리(acyl tail))을 폴리머가 감싸게 된다. 결과적으로 디스크 형태의 지질이중막 모양이 수용액상에서 안정화된다. 이때, 인지질:폴리머 비율에 따라서 지질이중막 디스크의 크기가 결정된다.
상기 폴리머 나노디스크를 구성하는 지질은 인지질일 수 있으며, 탄소수가 1 내지 50개, 보다 구체적으로 5 내지 30개인 지질 꼬리(tail)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 양친매성 지질은 바람직하게 인지질일 수 있고, 더욱 바람직하게 상기 인지질은, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) 및 포스파티딜세린(phosphatidylserine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으며, 세포막 성분으로 가능한 지질은 모두 선택될 수 있으므로 이에 제한되지는 않는다.
상기 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)은 DOPC(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLPC( 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DMPC(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPC(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), C13PC, DDPC(1,2-Didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DSPC(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DEPC(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DLOPC(1,2-Dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), EPC(Egg phosphatidylcholine), MSPC( 1-Myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), PMPC(1-Palmitoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), PSPC(1-Palmitoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SMPC(1-Stearoyl-2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 SPPC(1-Stearoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)일 수 있다.
상기 포스파티딜글리세롤은 DMPG(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)], DPPG(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DSPG(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)), POPG(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DEPG(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3[Phosphorac-(1-glycerol)]), DLPG(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]), DOPG(1,2-Dioleoyl-snglycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)]) 또는 DSPG(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3[Phospho-rac-(1-glycerol)])일 수 있다.
상기 포스파티딜에탄올아민은 DMPE(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DPPE(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPE(1,2-Distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine), DOPE(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DEPE(1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DLPE(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 또는 POPE(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)일 수 있다.
상기 포스파티딜세린은 DOPS(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DLPS(1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DMPS(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DPPS(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), DSPS(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine) 또는 POPS 일 수 있다.
상기 폴리머 나노디스크를 구성하는 양친매성 지질은, 상기 인지질에 추가하여 중성지방, 예를 들면 트리글리세라이드, 콜레스테롤(cholesterol) 또는 이의 유도체, 및 당지질(saccharolipid), 예를 들어 강글리오사이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 폴리머 나노디스크는 지질 이중층의 친수성 양 면이 모두 외부에 노출된 열린 계를 갖는 원반 형태라는 점에서, 내부에 친수성 코어(core)를 포함하고 지질 이중층의 양면 중 한 면만 외부에 노출된 닫힌 계(closed system)를 갖는 구(sphere) 형태의 리포좀(liposome)과 구별된다. 상기 리포좀은 지질 이중층으로 내부 코어를 갖는 닫힌 공간을 형성할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 양친매성 폴리머는 스티렌-말레산(Styrene-Maleic Acid, SMA), 디-이소부틸렌-말레산(Di-IsoButylene-Maleic Acid, DIBMA), 스티렌-말레이미드(Styrene-Maleimide, SMI), 폴리메타크릴레이트(Polymethyl Methacrylate, PMA) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 SMA는 스티렌(Styrene)과 말레산(maleic acid)가 2:1 혹은 3:1의 비율로 중합되는 코폴리머인 것으로, 당업계에 널리 알려진 중합방법에 의해 중합될 수 있으며, SMA는 추가적으로 에탄올아민, 에틸렌디아민, 4차 암모니움, 설프하이드릴 등으로 수식될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 양친매성 폴리머는 바람직하게 전체 폴리머 나노디스크 대비 0.1 내지 20%로 포함되는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로는 상기 양친매성 폴리머는 전체 폴리머 나노디스크 대비 0.2 내지 5 %, 0.3 내지 5 %, 0.4 내지 5 %, 0.1 내지 4 %, 0.2 내지 4 %, 0.3 내지 4 %, 0.4 내지 4 %, 0.1 내지 3 %, 0.2 내지 3 %, 0.3 내지 3 %, 0.4 내지 3 %, 0.1 내지 2 %, 0.2 내지 2 %, 0.3 내지 2 %, 0.4 내지 2 %로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 양친매성 폴리머는 SMA인 것이고, 상기 SMA는 바람직하게 전체 폴리머 나노디스크 대비 0.3 내지 0.7%로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리머 나노디스크는 직경이 2 내지 50 nm에 해당하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로 상기 폴리머 나노디스크는 직경이 2 내지 40 nm, 2 내지 30nm, 3 내지 50 nm, 3 내지 40 nm, 3 내지 30 nm, 4 내지 50 nm, 4 내지 40 nm, 4 내지 30 nm, 5 내지 50 nm, 5 내지 40 nm, 5 내지 30 nm에 해당하는 것이나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 폴리머 나노디스크는 폴리머의 종류는 SMA인 것이고, 그 직경이 10 내지 20 nm에 해당하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리머 나노디스크는 바이러스의 지질 이중층 외피를 천공하는 것으로 확인되었다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 바이러스는 버니아비리데(Bunyaviridae) 과, 코로나비리데(Coronaviridae) 과, 필로비리데(Filoviridae) 과, 플라비비리데(Flaviviridae) 과, 헤파드나비리데(Hepadnaviridae) 과, 헤르페스비리데(Herpesviridae) 과, 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae) 과, 폭스비리데(Poxviridae) 과, 랍도비리데(Rhabdoviridae) 과, 레트로비리데(Retroviridae) 과, 토가비리데(Togaviridae) 과 및 헤르페스비리데(Herpesviridae) 과로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 과에 속하는 바이러스인 것일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 바이러스는 버니아비리데(Bunyaviridae) 과에 속하는 시놈브레한타바이러스(Sin Nombre Hantavirus) 등; 코로나비리데(Coronaviridae)과에 속하는 다양한 급성 호흡기 증후군에 관여하는 코로나바이러스(Coronavirus) 등; 필로비리데(Filoviridae)과에 속하는 에볼라 바이러스(Ebola virus), 마르버그 바이러스(Marburg virus) 등; 플라비비리데(Flaviviridae) 과에 속하는 웨스트 닐 바이러스(West Nile virus), 엘로우 피버 바이러스(Yellow Fever virus), 뎅기 피버 바이러스(Dengue Fever virus), C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus) 등; 헤파드나비리데(Hepadnaviridae) 과에 속하는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B) 등; 헤르페스비리데(Herpesviridae) 과에 속하는 헤르페스 심플렉스 1 바이러스(Herpes Simplex 1 virus), 헤르페스 심플렉스 2 바이러스(Herpes Simplex 2 virus) 등; 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae) 과에 속하는 인플루엔자 바이러스(Influenza virus) 등; 폭스비리데(Poxviridae) 과에 속하는 스몰폭스 바이러스(Smallpox virus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus), 몰루스컴 콘타지오섬 바이러스(Molluscum contagiosum virus), 멍키폭스 바이러스(Monkeypox virus) 등; 랍도비리데(Rhabdoviridae) 과에 속하는 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus) 등; 레트로비리데(Retroviridae) 과에 속하는 HIV(Human Immunodeficiency virus) 등; 토가비리데(Togaviridae) 과에 속하는 치컹구니아 바이러스(Chikungunya virus) 등; 헤르페스비리데(Herpesviriae) 과에 속하는 수도라비에스 바이러스(Pseudorabies virus), HHV 바이러스 등이 될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 코로나 바이러스 및 수포성 구내염 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리머 나노디스크를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 약제학적 조성물은 본 발명의 일 양태인 폴리머 나노디스크를 포함하는 것이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 명세서 상에서 용어 "바이러스 감염증"이란, 상기 지질 이중층의 외피를 가지는 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 질환을 의미하는데, 일 예로서, 버니아비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 신증후근성출혈열(유행성출혈열); 코로나비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 코감기 등 호흡기 질환 또는 코로나바이러스 감염증; 플라비비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 C형 간염; 헤파드나비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 B형 간염; 헤르페스비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 대상포진; 오르소믹소비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 독감 또는 인플루엔자 바이러스 감염증; 폭스비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 천연두; 랍도비리데 과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 광견병 또는 수포성 구내염; 레트로비리데과의 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 후천성 면역결핍증 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 오르소믹소비리데과에 속하는 인플루엔자 바이러스의 감염에 의하여 발병되는 독감 또는 인플루엔자 바이러스 감염증이 될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 상기 조성물 외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 척추강 내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 흉골 내 투여, 종양 내 투여, 비내 투여, 뇌내 투여, 두개골 내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량(약제학적 유효량)을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 질환 상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 내복약, 주사제 등 다양하게 제조될 수 있고, 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
한편, 본 출원인은 실험을 통해 본 발명의 폴리머 나노디스크가 i) 세포 독성을 나타내지 않고, ii) 안정성이 우수하고, iii) 인플루엔자 바이러스, 코로나 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 등 다양한 바이러스에 항바이러스 효능을 나타낸 점을 확인하였다. 또한, 구조체의 조성 중 인지질과 폴리머의 종류를 다양화하여 항바이러스 효능의 증대를 확인하였다.
따라서, 본 발명의 폴리머 나노디스크는 우수한 안정성, 제작 용이성, 우수한 항바이러스 효능, 낮은 세포 독성을 나타내어 체내에서 우수한 항바이러스 기능을 수행할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
[실시예 1: 폴리머 나노디스크의 제조]
폴리머 나노디스크를 제작하기 위해 폴리머로써 SMA(Styrene-Maleic Acid) 중 Styrene : Maleic acid가 각각 2:1과 3:1의 비율로 중합된 두 종류의 폴리머를 사용하였고, 구성 지질은 16:0-18:1 POPC(Phosphatidylcholine, 이하 약어로 기재), 16:0 DPPC(Dipalmitoylphosphatidylcholine, 이하 약어로 기재), 14:0 DMPC(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 이하 약어로 기재), 18:1 DOTAP(Dioleoyl-3-trimethylammonium propane, 이하 약어로 기재), 16:0-18:1 POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 이하 약어로 기재)가 사용되었다. 본 실험에 사용된 각각의 조성은 다음과 같다.
| 명칭 | Lipid : SMA ratio (w/w) |
| SMA (2:1)-ND (POPC) | 1:2 |
| SMA (2:1)-ND (DPPC) | 1:1 |
| SMA (2:1)-ND (DMPC) | 1:1 |
| SMA (2:1)-ND (POPE) | 1:4 |
| SMA (2:1)-ND (DOTAP) | 1:3 |
| SMA (3:1)-ND (POPC) | 1:2 |
| SMA (3:1)-ND (POPE) | 1:4 |
* ND=나노디스크(NanoDisc)
폴리머 나노 천공자의 제조방법은 구체적으로 다음과 같다.
먼저 고체 가루 형태의 지질을 유기용매에 녹인 후, 상기 표 1 조성의 지질을 유리관에서 혼합한 뒤 질소 가스와 진공관을 이용해 유기용매를 완전히 기화시켜 필름 형태의 지질만 남겼다. 수화 버퍼(10 mM HEPES, 150 mM NaCl; pH 7.4)를 이용해 필름 형태의 지질을 5분 이상 충분히 녹인 후, 액체 질소와 50℃의 물을 이용해 동결과 융해과정을 5회 이상 수행하여 리포좀을 생성하였다. 이후 폴리머를 0.5-2%(w/v)의 양으로 첨가한 뒤 액체 질소와 50℃의 소니케이터를 이용해 동결 및 음파처리 과정을 5회 이상 수행하였다. 이를 통해 폴리머가 리포좀을 파고들면서 물 분자가 끼어들어 지질층 사이에 구멍(pore)을 형성하게 되고 최종적으로 나노디스크 구조가 형성되었다. 나노디스크를 형성하지 못한 폴리머와 직경이 큰 리포좀을 제거하기 위해 초고속 원심분리 여과(Ultracentrifugal filtration)를 수행하였다. 완성된 나노디스크의 농축액을 Size Exclusion Chromatography를 통해 크기에 따라 정제하고 얻어진 샘플을 농축하여 얻어내었다(도 1의 (A), (B)). 나노디스크 내의 지질 농도는 lipid quantification assay kit를 이용하여 측정하였고, 샘플의 농도는 지질의 농도를 기준하여 표기하였다.
[실시예 2: 폴리머 나노디스크의 구조 및 형태 확인]
1) 폴리머 나노디스크의 구조 확인
상기 실시예 1에서 제조된 폴리머 나노디스크의 직경을 DLS(Dynamic Light Scattering)를 통해 측정하였다. DLS를 통해 나노디스크의 직경을 측정한 결과, 10 mM의 지질(POPC 100%)에 1.2%의 SMA(2:1)를 첨가하였을 때 평균 직경은 13.4 nm이며 전체 질량의 80.9%를 차지하였다(도 2의 (A)). 또한 10 mM의 지질(POPC 100%)에 1.2%의 SMA(3:1)를 첨가하였을 때 평균 직경은 15.6 nm이며 전체 질량의 87.4%를 차지하였다(도 2의 (B)).
2) 폴리머 나노디스크의 형태 확인
상기에서 직경을 확인한 폴리머 나노디스크의 구조 형태를 관찰하고자 지질과 폴리머의 농도 총합이 20 nmol/100 ㎕가 되도록 희석하여 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscope)을 이용해 촬영하였다(도 2의 (C)는 SMA 2:1, (D)는 SMA 3:1임). 본 발명에서 SMA를 사용하여 원반 형태로 만들어진다는 것은 'Tanaka M et al., Effects of charged lipids on the physicochemical and biological properties of lipid-styrene maleic acid copolymer discoidal particles. Biochim Biophys Acta Biomembr. (2020) 3-4.'의 논문에서 인지질과 SMA를 조합하여 본 발명과 유사한 방법으로 구조체를 제작한 후, 투과전자현미경으로 촬영한 구조체 형태를 discoidal shape(원반형)로 언급하고 있는 것에서와 같이 확인할 수 있다.
[실시예 3: 폴리머 나노디스크의 세포독성 검증]
체내에서 합성되지 않는 폴리머가 약물로써 체내에 주입되었을 경우, 폴리머를 외부 항원으로 인식해 면역반응이나 독성을 유발할 수 있다. 이를 우려하여 두 종류의 폴리머와 그로 제작된 폴리머 나노디스크에 대한 세포 독성 여부를 각각 확인하였다.
96 웰 플레이트에 2*104 cells/100 μl의 MDCK 세포를 시딩하고, 24시간 후 세포의 밀집도(confluency)가 90% 이상일 때 폴리머의 경우 최고 농도 5 μM, 나노디스크의 경우 인지질 기준 최고 농도 50 μM부터 1/5 연속 희석하여 최저 농도 각각 0.00032, 0.0032 mM까지 세포에 처리하였다. 이는 직경 10 nm 경의 나노디스크 내 폴리머의 구성비율이 1/10인 것을 고려한 결과이다. 24시간 후, 수용성의 테트라졸륨 염(tetrazolium salt)인 WST-8 용액을 웰당 100 μl씩 처리하면 살아있는 세포 내의 탈수소효소(dehydrogenase)라는 효소에 의해 WST-8이 환원되면서 주황색의 포마잔(formazan)을 형성하는 원리를 이용해 살아있는 세포의 비율(cell viability)을 측정하였다. 폴리머와 폴리머 나노디스크 형태 모두 세포 독성을 나타내지 않았다(도 3의 (A), (B)).
[실시예 4: 폴리머 나노디스크의 항바이러스 효능 검증]
1) 폴리머와 폴리머 나노디스크를 포함한 다양한 약물의 항바이러스 효능 확인
폴리머와 폴리머 나노디스크가 실제로 항바이러스 효능을 갖는지 확인하고자 MN실험법(Microneutralization assay)을 수행하였다.
실험에 사용될 물질(헤파린, 막단백질(membrane scaffoldprotein)을 이용하여 제조된 나노디스크(MSP-Nanodisc, MSP-NDG), Free-SMA (2:1), SMA (2:1)-ND (POPE))을 동일 농도 (인지질 농도 기준 10 μM, 폴리머 기준 1 μM)로 설정하여 인플루엔자 바이러스(A/Puerto Rico/8/34)에 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 전날 2*104 cells/100 μl로 96-웰 플레이트에 시딩하여 100% 밀집도(confluency) 상태인 MDCK 세포에, 1시간 동안 반응시킨 '처리 물질 + 바이러스 혼합액'을 처리하였다. 24시간 후 0.5 μM의 농도로 4-MUNANA(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-Neuraminic Acid)를 처리하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 355/460 nm의 형광 값을 측정하여 바이러스의 NA(neuraminidase) 활성을 정량 분석하였다.
동일 농도 기준, 기존 약물인 헤파린과 MSP-NDG에 비해 폴리머 Free SMA (2:1) 및 폴리머 나노디스크 SMA (2:1)-ND (POPE)의 항바이러스 효능이 뛰어난 것을 확인했다(도 4의 (A)). 이때, Free SMA 자체도 양친매성으로 인해 항바이러스 활성을 가지기는 하나, 서로 결합하여 aggregation되는 특성이 있다. 하지만, 이를 나노디스크 형태로 제작할 시 aggregation되는 것으로부터 안정하고, 구성 인지질을 다양화할 수 있다는 점에 장점이 있다. 실제로 하기 실험에서 인지질 구성을 달리하여 나노디스크를 제작한 후, 효능을 비교할 때, POPE 인지질을 포함한 구조체가 가장 효능이 좋은 것을 확인하였다. 또한, in vivo에서 나노디스크가 Free SMA보다 효능이 좋은 점도 이러한 안정성과 구조체 효능 개선에 기인한 것으로 판단된다.
2) 투과전자현미경을 통한 바이러스 형태 변화 확인
실제로 폴리머와 폴리머 나노디스크에 의해 바이러스의 형태가 파괴되는지 확인하기 위해 폴리머 기준 1 μM, 폴리머 나노디스크의 경우 인지질 기준 10 μM로 인플루엔자 바이러스(A/Puerto Rico/8/34)와 1시간 반응시킨 후 투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscope)을 이용해 촬영하였다(도 4의 (B)). 그 결과, 실제로 정상 바이러스와 육안으로 구별이 가능할 정도로 바이러스 형태가 파괴된 모습을 육안으로 관찰할 수 있었다.
[실시예 5: 폴리머 나노디스크 내 인지질 구성 변화를 통한 항바이러스 효능 증대 및 안정성 증대 확인]
1) 폴리머 나노디스크 내 인지질 구성 변화를 통한 항바이러스 효능 증대 확인
인지질 종류에 따른 나노디스크의 항바이러스 효과를 확인하기 위해 다양한 인지질을 사용한 나노디스크의 항바이러스 효능을 검증하였다.
POPC 외의 다른 인지질 즉 DMPC, DPPC, POPE, DOTAP 등을 이용하여 폴리머 나노디스크를 제조한 후 인지질 기준 최고 농도 10 μM부터 1/5 연속 희석하여 인플루엔자 바이러스(A/Puerto Rico/8/34)에 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 이후 과정은 인지질 조성이 다른 것 외에 실시예와 동일하게 측정하였다. 이때, 도 5의 (A)와 (B)는 인지질의 종류를 5종류와, 3종류로 달리하여 실험한 것으로, 효능의 개선을 재검증하고 인지질 각각을 재비교하기 위해 수행한 것이다. 그 결과, 인지질 종류 중 POPE로 구성된 폴리머 나노디스크의 경우, 다른 인지질 구성의 나노디스크와 비교 시 항바이러스 효능이 증대되는 것을 확인하였고, IC50의 경우 0.21 μM로 측정되었다.
2) 폴리머 나노디스크 내 인지질 구성 변화를 통한 안정성(온도에 대한 안정성) 증대 확인
10 mM HEPES 기반의 수용액 내에서 인지질 종류 중 POPC, POPE 각각으로 제작된 폴리머 나노디스크와 폴리머 자체에 한해 37℃ 내에서 시간에 따른 혼탁도의 변화를 측정하여 그 안정성을 확인하였다(도 6). 그 결과, 폴리머를 나노디스크 형태로 변환했을 때 온도에 대한 안정성이 높은 것을 확인하였고, 나노디스크 내 구성 인지질 중에서도 POPE의 경우 가장 안정성이 높은 것을 확인하였다.
[실시예 6: 폴리머와 폴리머 나노디스크의 항바이러스 활성 차이]
1) 온도별 조건 내에서의 폴리머와 폴리머 나노디스크의 항바이러스 활성 차이
폴리머와 폴리머 나노디스크가 각각의 온도 조건(4℃, 37℃)에서 나타내는 항바이러스 활성의 차이를 MN 실험법을 통해 검증하였다. 실험에 사용될 폴리머 및 폴리머 나노디스크를 폴리머 기준 최고 농도 1 μM, 나노디스크 내 인지질 기준 최고 농도 10 μM부터 1/5 연속 희석하여 인플루엔자 바이러스(A/Puerto Rico/8/34)와 각각 4℃, 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 전날 2*104 cells/100 μl 로 96-웰 플레이트에 시딩하여 100% 밀집도(confluency) 상태인 MDCK 세포를 30분 동안 미리 4℃에서 cooling 후, 1시간 동안 반응시킨 '처리 물질 + 바이러스 혼합액'을 처리하였다. 1시간 후 플레이트를 다시 37℃ 조건에서 1시간 배양한 후, 약물과 바이러스 혼합액을 제거하고 깨끗한 상태의 배지로 교체하였다. 24시간 후 0.5 μM의 농도로 4-MUNANA(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-Neuraminic Acid)를 처리하고 37℃ 조건에서 1시간 동안 반응시켰다. 355/460 nm의 형광 값을 측정하여 바이러스의 NA(neuraminidase) 활성을 정량 분석하였다.
그 결과, 37℃ 조건에 비하여 4℃ 조건 내에서는 폴리머 자체의 항바이러스 활성이 약해지는 것을 확인했고, 인지질 중 POPE 구성의 폴리머 나노디스크는 4℃ 조건과 37℃ 조건 모두에서 폴리머 자체보다 항바이러스 활성이 뛰어난 것을 확인했다(도 7).
2) 폴리머와 폴리머 나노디스크의 살바이러스(virucidal) 활성 차이
막단백질 기반의 나노디스크, 헤파린과 비교하여, 폴리머와 폴리머 나노디스크 각각의 항바이러스 작용 기작을 확인하기 위해 37℃에서 1시간 동안 바이러스와 EC90 농도의 약물을 반응시킨 후에 1/100 의 농도로 희석하여 미리 시딩해둔 MDCK cell에 처리하였다. 24시간 후 0.5 μM의 농도로 4-MUNANA(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-Neuraminic Acid)를 처리하고 37℃ 조건에서 1시간 동안 반응시켰다. 355/460 nm의 형광 값을 측정하여 바이러스의 NA(neuraminidase) 활성을 정량 분석하였다.
바이러스 증식 저해성(virustatic) 특성을 갖는 것으로 알려진 기존 약물 헤파린은 1/100 희석만으로도 바이러스의 활성이 회복되는 양상을 보인 반면, 폴리머와 폴리머 나노디스크는 1/100로 희석을 하여도 바이러스의 활성이 낮은 것을 확인하였다(도 8). 이를 통해 약물의 작용 기작이 살바이러스제(virucidal)와 가까운 것을 확인하였다. 특히 인지질 POPE 구성의 나노디스크의 살바이러스능이 제일 좋은 것으로 나타났다.
[실시예 7: VSV(수포성 구내염 바이러스, Vesicular Stomatitis Virus)- 슈도바이러스, 코로나-슈도바이러스 제조]
1) 이중 리포터 VSV-슈도바이러스, 코로나-슈도바이러스 생산용 플라스미드 제조
두 슈도바이러스 제조에 필요한 HIV gag-pol 플라스미드(pNL4.3-mCherry-Luc)는 Addgene(매사추세츠, 미국)을 통해 구매하였으며 플라스미드에 대한 정보는 Kara G. Lassen, et al.. 2012, A Flexible Model of HIV-1 Latency Permitting Evaluation of Many Primary CD4 T-Cell Reservoirs, PLOS one에서 발췌하였다. VSV-G, mVSV-G(H162R) 플라스미드는 타 연구실(KIST, 한국)을 통해 분양받았으며 관련 정보는 Cell Biolabs(캘리포니아, 미국)을 통해 전달받았다. 코로나바이러스 스파이크 단백질은 업체Sinobiological(베이징, 중국)을 통해 구매하였으며 위치 유도 돌연변이법(Site Directed Mutagenesis)을 통해 C-term 19 아미노산 결실을 진행하였으며, 실험에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 2에 기재하였고, 자세한 조성과 반응 조건은 표 3에 기재하였다.
| forward primer | TGTGGCTCCTGTTGTTAAAAGTTTGATGAGGAT(서열번호 1) |
| reverse primer | ATCCTCATCAAACTTTTAACAACAGGAGCCACA(서열번호 2) |
| PCR 조성 | 각 프라이머 1 μL씩, 벡터 3 μL, dNTP 1 μL, 5X phusion GC buffer 10 μL, Phusion polymerase 0.5 μL 및 증류수 33.5 μL |
| PCR 조건 | Initial denaturation: 98℃, 3분 30회 반복: denaturation(98℃, 20초) →annealing(61℃, 30초) →extension(72℃, 6분) Final extension: 72℃, 10분 |
2) 형질전환을 위한 플라스미드 Maxiprep
상기 구매 및 제작된 플라스미드를 형질전환을 위한 maxiprep을 위해 Top10 수용성 세포에 열충격 방법을 통해 형질전환하였다. 150 μg/ml의 암피실린(ampicillin)이 포함된 고체 배지에서 자란 콜로니를 10 ml의 암피실린이 포함된 액체 배지(LB broth miller)에 접종하였으며, 37℃, 250rpm 쉐이킹 인큐베이터에서 16시간 배양하였다. 이후 600 ml의 동일 액체 배지에 2차 접종한 후 37 ℃, 200rpm 쉐이킹 인큐베이터에서 16시간 추가 배양하였다. 이후 6000 rpm에서 10분간 원심분리하여 배지를 제거하고 세포만 얻어내었다. 얻어낸 세포에서 Maxiprep kit(Qiagen, 미국)를 이용하여 플라스미드를 대량 정제하였다.
3) VSV-슈도바이러스, 코로나-슈도바이러스 제조
슈도바이러스는 293T 세포주(ATCC, 미국)를 통해 생산, 정제하였다. 293T 세포주는 DMEM(Hyclone, 미국) 445 ml에 FBS(ATLAS, 미국) 50 ml, PSN(Hyclone, 미국) 5 ml을 첨가하여 배양용 배지를 만들고 이를 이용하여 계대배양 하였다. 10 cm 디쉬에 90% 정도의 밀도로 배양된 293T 세포주에 각각 HIV gag-pol 플라스미드 15 μg, VSV-G 플라스미드 5 μg, PEI 60 μg과 HIV gag-pol 플라스미드 15 μg, 스파이크 단백질 플라스미드 5 μg, PEI 60 μg을 넣고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 8시간 배양한 후 배지를 교체하고 48시간 추가 배양하였다. 이후 배양 배지를 수거하여 800 g에서 5분간 원심분리하여 세포와 분리한 후 필요에 따라 20% 수크로스 쿠션 원심분리법(Sucrose cushion centrifugation)을 실시하였다.
4) 제조된 VSV-슈도바이러스, 코로나-슈도바이러스의 특성 확인
두 슈도바이러스 내 mCherry-Luciferase viral RNA가 존재하고 외막단백질(코로나 스파이크 단백질)이 존재하는지 확인하였다. 실험에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 4에 기재하였고 슈도바이러스 산물에 Triton X-100을 1% 처리한 후 M-MLV 역전사 효소(코스모진텍, 한국)와 KOD-Neo-Plus(Toyobo, 일본)를 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 실시한 후 1% 아가로즈 겔에 135V, 30분 동안 전기영동하여 증폭 여부를 확인하였다. 해당 PCR 반응에 대한 자세한 조성과 반응 조건은 표 5, 6에 기재하였다. 외막단백질 존재 여부는 웨스턴 블롯을 통해 확인하였으며 우선 슈도바이러스 산물을 23,000 rpm, 2시간 30분 동안 원심분리하여 농축한 후 8% PAGE-gel에 로딩한 후 80V 20분, 140V 1시간 10분동안 전기영동하였다. 이후 니트로셀룰로오스 막(NC 막) 위에 PAGE-gel을 올리고 270mA 전류를 40분동안 흘려보내 NC 막 위로 단백질을 옮겼다. 이후 TBST 버퍼에 탈지분유를 5%로 녹여 (w/v) 1시간 동안 NC 막 블로킹을 진행한 후 Anti-SARS-CoV-2 spike antibody(abcam, 미국)를 1μg/ml의 농도로 TBST에 녹인 후 NC 막에 1시간 동안 처리하였다. 이후 TBST로 10분간 세척을 진행하며 이를 3회 반복한 후 Anti-rabbit IgG 항체(sigma, 미국)를 1:2000의 비율로 TBST 버퍼에 녹인 후 1시간 동안 처리한 후 다시 TBST로 10분간 세척을 진행하는 과정을 3회 반복하였다. 그 후 ECL을 통하여 화학 발광반응을 일으켜 필름을 감광하여 고정하였다. 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 3kb의 mCherry-Luciferase viral RNA의 증폭을 슈도바이러스 산물의 양에 비례하여 확인할 수 있었으며 180kDa의 스파이크 단백질의 발현을 확인할 수 있었다.
| forward primer | GGGGGTGGGAAGCCCTCAAATATTGG(서열목록 3) |
| Reverse primer | GGGTTGTGCCGCCTTTGCAGGTG(서열목록 4) |
| RT-PCR 조성 | forward 프라이머 1 μL씩, 벡터 2.5 μL, dNTP 1 μL, 5X M-MLV buffer 4 μL, M-MLV Reverse Transcriptase 1 μL 및 증류수 10.5 μL |
| RT-PCR 조건 | Annealing: 65℃, 5분 Extension: 42℃, 1시간 Enzyme inactivation: 72℃, 15분 |
| PCR 조성 | 각 프라이머 1 μL씩, 벡터 1 μL, dNTP 5 μL, 10X KOD buffer 5 μL, MgSO4 3 μL, Phusion polymerase 1 μL 및 증류수 31 μL |
| PCR 조건 | 최초 denaturation: 94℃, 2분35회 반복: denaturation(98℃, 10초) →Extension(68℃, 3분) |
[실시예 8: 다양한 군의 바이러스에 대한 폴리머와 폴리머 나노디스크의 항바이러스 활성]
1) 다양한 변종의 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 효능 검증
인플루엔자 바이러스(A/Puerto Rico/8/34) 외의 다른 변종의 인플루엔자 바이러스에도 폴리머와 폴리머 나노디스크가 항바이러스 효능을 나타내는지 확인하기 위해 실시예 4와 동일하게 MN 실험법을 통해 비교하였다. 최고 농도는 나노디스크 인지질 농도 기준으로 30 μM부터 1/3 연속 희석하여 최저 농도 0.014 μM까지 처리하였다.
바이러스의 NA(neuraminidase) 활성을 정량 분석한 결과, 인플루엔자 바이러스(A/Philippine/2/82), (B/Yamagata/16/88), (A/Aquatic bird/Korea/w81)에 대해서는 폴리머 형태에 비해 나노디스크 형태일 때 대략적인 IC50 값이 10배 정도 낮아지는 것을 확인하였고, 이를 통해 항바이러스 효능이 증대되었다고 할 수 있다(도 10).
2) VSV(수포성 구내염 바이러스, Vesicular Stomatitis Virus)-슈도바이러스에 대한 항바이러스 효능 검증
293T 세포주에 VSV-슈도바이러스를 감염시킨 후 항바이러스제로서 나노디스크를 함께 처리하였을 때 바이러스 감염 저해에 따른 형광, 발광 값 저하를 측정함으로써 항바이러스 효능을 측정하였다. 구체적으로, 293T 세포주를 3 X 105 cell/ml 500 μL씩 24 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 16시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포에서 배지를 걷어내고, PBS를 각 웰당 250 μL씩 분주하고 제거하여 세척하는 것을 2회 반복하였다. VSV-슈도바이러스를 각 웰당 50 μL (~1×105 RLU, Relative Light Unit) 준비하여 다양한 약물(SMA-ND, 헤파린, lipo-G)을 20 μM부터 2-배 희석에 맞추어 혼합해 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 각 293T 세포 웰에 처리한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 8시간 동안 감염시키고 배지를 교체하고 48시간 추가 배양하였다. 배양 후 세포에서 배지를 걷어내고, PBS를 각 웰당 250 μL씩 분주하고 제거하여 세척하고 1X CCLR(Cell Culture Lysis Reagent, Promega, 미국)를 각 웰당 50 μL씩 처리하였다. 이후 96 웰 화이트 플레이트의 각 웰에 세포 용해물 20 μL와 Luciferase assay buffer(Promega, 미국) 80 μL씩 처리한 후 spectrometer로 발광 값을 측정하였다. 형광값은 96 웰 블랙 플레이트의 각 웰에 세포 용해물 30 μL씩 처리하여 여기 파장 487 nm, 방출 파장 520 nm의 파장으로 측정하였다. 이때, 항바이러스제 없이 VSV-슈도바이러스와 293T 세포주만 배양한 것을 음성 대조군으로 정하고, 바이러스 감염 없이 293T 세포주만을 배양한 것을 양성 대조군으로 정하고 기존 VSV에 항바이러스 효능을 갖는다고 알려진 헤파린 설페이트(Galen, 미국)를 대조군으로 정해서 나노디스크에 의한 형광, 발광 값 감소를 측정하였다.
슈도바이러스 억제 실험 결과, SMA-ND가 농도에 비례하여 VSV-슈도바이러스 감염을 저해시키는 양상을 보였으며 헤파린 및 lipo-G와 비교하였을 우수한 바이러스 감염 억제능을 보이는 것을 확인하였다(도 11).
3) 코로나-슈도바이러스에 대한 항바이러스 효능 검증
상기 VSV-슈도바이러스의 항바이러스 효능을 검증한 것과 같은 방법으로 상기 실시예에서 제조한 나노디스크와 코로나-슈도바이러스를 이용하여 코로나-슈도바이러스 억제 실험을 실시하였으며 해당 결과를 그래프로 나타냈다. 여기에서는 카모스타트메실산염(Camostat mesylate, Sigma, 미국)를 대조군으로 사용하였으며 약물 농도와 슈도바이러스 용량은 상기 VSV-슈도바이러스의 항바이러스 효능 검증실험과 동일하게 진행하였다.
그 결과, SMA-ND가 농도에 비례하여 코로나-슈도바이러스 감염을 저해시키는 효능을 보였으며 기존 헤파린, 카모스타트와 비교하였을 때 최저 농도 0.5 μM에서 22%, 최고 농도 2 μM에서 81% 내외의 가장 높은 바이러스 감염 억제능을 보이는 것을 확인하였다(도 12).
[실시예 9: 동물 실험을 통한 폴리머 나노디스크의 항바이러스 효과 검증]
세포 단계에서 굉장히 높은 항바이러스 효능을 보였던 폴리머 나노디스크에 대하여 실험동물 모델에서의 효능 검증 실험을 진행하였다(도 13의 (A), (B)). 7주령의 암컷 BALB/c 마우스를 실험에 사용하였으며, 4 MLD50의 PR8 바이러스로 intranasal (IN) 경로를 통해 공격접종을 진행하였다. 공격접종 1시간 후 치료 약물을 동일하게 IN 경로를 통해 비강으로 1회/1일로 이틀간 투여하였고, 이때 투여 농도는 SMA (2:1)-ND (DMPC) 0.35 mg/kg이다. 공격접종 후 12일간 체중 변화와 생존율을 관찰, 기록하였다. 그 결과, 폴리머(SMA)가 투여된 실험군은 0% 생존율을 보인 반면 폴리머 나노디스크가 투여된 실험군은 60%의 생존율을 보였다(도 13의 (A)).
한편, 체중 변화 분석 결과는 그 차이가 더욱 두드러지는데, 바이러스 접종 후 약 2일 후부터 급격한 체중 감소를 나타내는 나머지 실험군과는 달리 폴리머 나노디스크가 투여된 실험군은 비교적 빠르게 회복하는 양상을 나타냈다(도 13의 (B)).
이상 종합하면 본 발명의 실시예에 따르면, 폴리머 나노디스크 특히 SMA-ND는 i) 세포 독성을 나타내지 않고, ii) 안정성이 우수하고, iii) 인플루엔자 바이러스, 코로나 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV, 바이러스 등 다양한 바이러스에 항바이러스 효능을 나타냈다. 또한, 본 발명의 폴리머 나노디스크는 막단백질(MSP, membrane scaffold protein)을 이용하여 제조된 나노디스크보다 우수한 항바이러스 효능을 나타내는 것으로 사료된다.
Claims (9)
- 양친매성 지질의 소수성 부분이 상호 맞닿아 형성되는 지질 이중층에 양친매성 폴리머가 결합하여 형성된 폴리머 나노디스크.
- 제1항에 있어서,
상기 폴리머 나노디스크는,
양친매성 지질의 소수성 부분이 상호 맞닿아 상하의 이중층으로 배열하여 원반 형태의 지질 이중층을 형성하고, 그 측면에 노출된 양친매성 지질의 소수성 부분을, 양친매성 폴리머가 소수성 결합으로 둘러 감싸 형성된 것을 특징으로 하는 폴리머 나노디스크.
- 제1항에 있어서,
상기 양친매성 지질은,
포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) 및 포스파티딜세린(phosphatidylserine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 인지질인 것을 특징으로 하는 폴리머 나노 디스크.
- 제1항에 있어서,
상기 양친매성 폴리머는,
스티렌-말레산(Styrene-Maleic Acid, SMA), 디-이소부틸렌-말레산(Di-IsoButylene-Maleic Acid, DIBMA), 스티렌-말레이미드(Styrene-Maleimide, SMI), 폴리메타크릴레이트(Polymethyl Methacrylate, PMA) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 폴리머 나노디스크.
- 제1항에 있어서,
상기 양친매성 폴리머는
전체 폴리머 나노디스크 대비 0.1 내지 20%로 포함되는 것을 특징으로 하는 폴리머 나노디스크.
- 제1항에 있어서,
상기 폴리머 나노디스크는,
바이러스의 지질 이중층 외피를 천공하는 것을 특징으로 하는 폴리머 나노디스크.
- 제6항에 있어서,
상기 바이러스는,
버니아비리데(Bunyaviridae) 과, 코로나비리데(Coronaviridae) 과, 필로비리데(Filoviridae) 과, 플라비비리데(Flaviviridae) 과, 헤파드나비리데(Hepadnaviridae) 과, 헤르페스비리데(Herpesviridae) 과, 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae) 과, 폭스비리데(Poxviridae) 과, 랍도비리데(Rhabdoviridae) 과, 레트로비리데(Retroviridae) 과, 토가비리데(Togaviridae) 과 및 헤르페스비리데(Herpesviridae) 과로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 과에 속하는 바이러스인 것을 특징으로 하는 폴리머 나노디스크.
- 제6항에 있어서,
상기 바이러스는,
인플루엔자 바이러스, 코로나 바이러스 및 수포성 구내염 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 바이러스인 것을 특징으로 하는 폴리머 나노디스크.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리머 나노디스크를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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