CN117440860A - 用于组合文库的测定装置 - Google Patents

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CN117440860A CN202180098630.5A CN202180098630A CN117440860A CN 117440860 A CN117440860 A CN 117440860A CN 202180098630 A CN202180098630 A CN 202180098630A CN 117440860 A CN117440860 A CN 117440860A
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Abstract

公开了一种测定装置，该测定装置包括排列在该测定装置上的高密度孔。

Description

用于组合文库的测定装置
技术领域
本公开提供了用于进行大规模组合文库的测定的装置和方法。特别地，本文所公开的装置和方法允许对多达一千万种化合物的文库进行同时测定。
背景技术
组合文库在文献中是众所周知的，并且经常利用珠粒。这些珠粒中的每种珠粒含有通过接头与珠粒结合的单一化合物的多个拷贝。另外，珠粒通常含有报告元件，诸如DNA，该报告元件允许评定珠粒上的单一化合物的结构。这些文库中的许多文库受到以下事实的限制：所测试的化合物在测定期间保留在珠粒上。因此，由该测定法生成的生物学数据可能被所结合的化合物不能有效地结合到所选靶标上的可能性所损害。这可能是由于来自珠粒的物理干扰以及由于将化合物连接到珠粒的接头的附接所导致的可能的位阻干扰。至于后者，这种连接可抑制否则有效的化合物与靶标适当结合的能力，从而导致证明低于化合物的实际效力的测定结果。
用于解决这种问题的一个选项包括使用可切割的接头，该可切割的接头在适当的刺激(例如，光)下切割，从而从珠粒中释放化合物。一旦化合物在溶液中，诸如在测试孔中，该化合物就以在测定中提供最大效力的方式自由地定向。仍另外地，这些化合物的释放可以以这样的方式进行，使得所释放的化合物的量被控制以便提供有意义的剂量依赖性数据。参见例如美国专利申请公开号2019/0358629。
发明内容
虽然可切割的接头的使用可以帮助避免由珠粒和/或接头引起的位阻问题，但是在测定装置上成规模扩大个别孔的数目以适应更大的文库引起了又一问题。如果相邻的孔彼此过于接近，则一个孔中的测试溶液的一部分可能溢出并污染相邻孔中的测试溶液。任何此类溢出可通过提供假阳性或稀释活性化合物的报道活性来改变结果。前者可在溶液中的测试化合物是活性的并且该溶液的一部分“溢出”到具有无活性化合物的测试孔中时发生。溢出导致具有无活性化合物的孔中现在具有活性化合物，此然后错误地报告在该孔中存在活性。后者可在从具有无活性化合物的孔中溢出污染了具有活性化合物的孔并降低了该活性化合物的浓度，使得当以剂量依赖性方式报告时，所报告的活性低于实际活性时发生。
当测定装置包含大量彼此紧密靠近的孔时，溢出问题是特别相关的。为了维持装置的可工作大小，将孔密度增大到一个孔中的水溶液可溢出并污染相邻孔的程度。在此类密度下，测定结果变得不太可靠，单独孔的可靠性随着孔密度的增大而降低。这为技术人员创造了令人迷惑的难题—使用测定装置，该测定装置将孔分开一段距离，使得该距离不再可容纳所期望的孔密度，或者允许溢出，该溢出降低了在测定期间生成的信息的可靠性。
仍另外地，测定装置中的每个孔包含靶标，该靶标是测试化合物的预期结合位点。靶标位置优选地在孔的中心处或附近。然而，当靶标是活细胞时，在沉积后，细胞可以易位到孔的角落，在该角落处细胞的可视化变得更加困难。由于测定结果往往通过使细胞可视化来测量，因此未能适当地可视化是测定传达关于细胞活性的可靠信息的能力的显著缺点。
考虑到上述情况，将有益的是提供测定装置，该测定装置抑制溢出，并且在适当的时候阻止靶标当放置到孔中时的易位。
在一个实施方案中，本公开提供了包括高密度孔的测定装置，该测定装置被配置为抑制水溶液的一部分从第一孔溢出到第二孔中。在一个实施方案中，本公开提供了一种测定装置，该测定装置阻止定位在孔中的靶标(诸如活细胞)易位。例如，阻止靶标的易位可以降低靶标易位到孔内难以可靠地检测可溶性化合物被吸收到细胞中的所得生物学后果的位点的风险。
因此，在装置实施方案中的一个装置实施方案中，提供了一种测定装置(1)，该测定装置包括排列在该测定装置上的高密度孔(2)，其中这些孔(2)中的每个孔包括：
a)底壁(8)和侧壁(7)，该底壁和该侧壁被配置为将一个或多个珠粒(6)和一个或多个靶标(16)保持在水溶液(17)中；以及
b)隔板(3)，该隔板将相邻孔(2)彼此分开，前提条件是这些隔板中的每个隔板从第一孔(2)的最近边缘到第二孔(2′)的最近边缘的长度为至少约10微米；其中该第二孔(2′)是该第一孔(2)的最近邻居；其中该隔板(3)的至少表面部分包括疏水性斥水层(4)，该疏水性斥水层结合在该隔板中并包围该隔板的该表面或从该隔板的该表面延伸。
在实施方案中，装置(2)的孔包括一个或多个珠粒(6)，该一个或多个珠粒中的每个珠粒含有单一化合物的多个拷贝，该多个拷贝以剂量依赖性方式可释放地结合到这些珠粒(6)。在实施方案中，该底壁(8)包括靶标捕获元件(5)，该靶标捕获元件捕获该靶标(16)并且在将该靶标(16)放置在该孔(2)中之后能够阻止该靶标在该孔内移动。
在一个实施方案中，这些珠粒中的一个或多个珠粒进一步包含mRNA捕获组分。
在装置实施方案中的另一装置实施方案中，提供了一种测定装置(1)，该测定装置包括在该测定装置上排列的高密度孔(2)，其中这些孔(2)中的每个孔包括：
a)底壁(8)和侧壁(7)，该底壁和该侧壁容纳在水溶液(17)中的一个或多个珠粒(6)和一个或多个靶标(16)，其中个别孔(2)中的一个或多个珠粒(6)含有单一化合物的多个拷贝，该多个拷贝以剂量依赖性方式可释放地结合至这些珠粒(6)，并且另外地其中这些珠粒(6)中的每个珠粒包含mRNA捕获组分；
b)隔板(3)，该隔板将相邻孔(2)彼此分开，前提条件是这些隔板(3)中的每个隔板从第一孔(2)的最近边缘到第二孔(2′)的最近边缘的长度为至少约10微米；其中该第二孔(2′)是该第一孔(2)的最近邻居；
其中该底壁(8)包括靶标捕获元件(5)，该靶标捕获元件捕获该靶标(16)并且在将该靶标(16)放置在该孔(2)中之后阻止该靶标在该孔内移动；并且
另外地其中该隔板(3)的至少表面部分包括疏水性斥水层(4)，该疏水性斥水层结合在该隔板中或从该隔板向上延伸并且基本上不含该水溶液。
在装置实施方案中的又一装置实施方案中，提供了一种测定装置(1)，该测定装置包括在该测定装置上排列的多个孔(2)，其中这些孔(2)中的每个孔包括：
a)底壁(8)和侧壁(7)，该底壁和该侧壁容纳在水溶液(17)中的一个或多个珠粒(6)和一个或多个靶标(16)，其中个别孔(2)中的一个或多个珠粒(6)包含单一化合物的多个拷贝，该多个拷贝以剂量依赖性方式可释放地结合至这些珠粒(6)，并且另外地其中这些珠粒(6)中的每个珠粒包含RNA捕获组分；
b)隔板(3)，该隔板将相邻孔(2)彼此分开，前提条件是这些隔板(3)中的每个隔板从第一孔(2)的最近边缘到第二孔(2′)的最近边缘的长度为至少约10微米；其中该第二孔(2′)是该第一孔(2)的最近邻居；
其中该底壁(8)包括细胞捕获元件(5)，该细胞捕获元件捕获哺乳动物细胞并且在将细胞放置在孔(2)中之后阻止细胞在该孔内移动；
另外地其中这些隔板(3)的至少表面部分包括疏水性斥水层(4)，该疏水性斥水层结合在该隔板中或从该隔板向上延伸并且基本上不含该水溶液；并且
仍另外其中这些孔(2)中的每个孔中的水溶液(17)的顶表面被疏水性流体(18)覆盖。
在一个优选实施方案中，该装置包括至少10个孔/平方毫米，以及优选地至少约1,000个孔/装置至10,000,000个孔/装置的孔密度。例如，装置可包括至少1,000个孔、或至少约10,0000个孔、或至少约100,000个孔、或至少约1,000,000个孔。
在另一优选实施方案中，这些隔板(3)中的每个隔板从第一孔(2)的最近边缘到第二孔(2′)的最近边缘的长度为约20微米，其中该第二孔(2′)是该第一孔(2)的最近邻居。在实施方案中，隔板(3)长度的优选范围为至少约10微米至约30微米，并且优选地约15微米至约25微米。
在一个实施方案中，单一孔(2)容纳任选地在水溶液(17)存在下的靶标或靶标(16)的多个拷贝。在一个实施方案中，靶标(16)是哺乳动物细胞，并且水溶液(17)是用于该细胞的生长培养基，以便维持该细胞在溶液中的活力。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。
在一个实施方案中，靶标(16)是哺乳动物细胞，并且靶标捕获元件(5)包含化合物(包括聚合物)，该化合物与细胞结合或与细胞复合，以便阻止细胞在孔内移动。
在一个实施方案中，提供了一种在具有高密度孔的测定装置中抑制溢出的方法，这些孔中的每个孔包含水溶液，该方法包括：
a)在该装置上提供至少10个孔/mm2的孔密度，其中这些孔在该装置上排列，使得这些孔中的每个孔的边缘被放置为距其最近的相邻孔的最近边缘至少约10微米，从而提供这些孔(2)之间的隔板(3)；
b)向这些隔板(3)的至少部分施加生物相容的疏水性斥水膜或层(4)，该疏水性斥水膜或层覆盖在另外构成该装置(1)的材料上，从而创建对将一个孔(2)中的水溶液的一部分转移到相邻孔(2)中的障碍。
在一个实施方案中，提供了一种阻止靠近孔(2)的底表面的中间放置的靶标(16)易位的方法，该方法包括以足够的量施加靶标捕获元件(5)，使得靶标(16)易位被阻止。
提供了一种适于进行组合文库的测定的设备。该设备可包括测定装置。该测定装置可以在测定装置的顶表面上包括至少10,000个孔。该至少10,000个孔中的每个孔可以包括底壁和侧壁，该底壁和该侧壁被配置为将一个或多个珠粒和一个或多个靶标保持在水溶液中。该测定装置可包括表面隔板，这些表面隔板将至少10,000个孔中的第一孔与至少10,000个孔中的第二孔隔开。
沿着测定装置的顶表面从第一孔的最近边缘到第二孔的最近边缘的距离可为约10微米(μm)至约50μm。
第二孔可以是与第一孔最邻近的孔。
表面隔板中的每个表面隔板的至少部分可包括疏水层。
疏水层可被配置为限制水溶液从第一孔溢出到第二孔。
测定装置可具有顶表面区域。顶表面区域上的至少10,000个孔的密度可以是至少10个孔/平方毫米(mm2)。
这些孔中的每个孔可具有约30μm至约250μm的孔直径。这些孔中的每个孔可具有约30μm至约400μm的孔深度。
该密度可以是至少10个孔/mm2至约400个孔/mm2。
该密度可以是约40个孔/mm2至约150个孔/mm2。
沿着该顶表面从该第一孔的最近边缘至该第二孔的最近边缘的距离可为约10μm至约30μm。
该设备可进一步包含哺乳动物细胞，这些哺乳动物细胞维持在用于这些哺乳动物细胞的含水生长培养基中。含水生长培养基可被配置为维持哺乳动物细胞在溶液中的活力。
含水生长培养基可被维持在至少10,000个孔中的至少一个孔中。
该哺乳动物细胞可以是人细胞。
该靶标捕获元件可包括聚-D-赖氨酸。
沿着该顶表面从该第一孔的最近边缘至该第二孔的最近边缘的距离可为约15μm至约25μm。
测定装置可在顶表面上具有至少约100,000个孔。
该疏水层可包含选自以下的生物相容性疏水材料：聚乙烯、聚丙烯、乙烯和丙烯的嵌段共聚物、聚四氟乙烯、(三氯)十八烷基硅烷(OTS)、无定形含氟聚合物、和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
该至少10,000个孔中的至少一个孔的底面可进一步包括捕获哺乳动物细胞的靶标捕获元件。
该至少10,000个孔中的至少一个孔的底面的至少一部分可以是亲水性的。
附图说明
本文提供了说明本发明的测定装置的某些方面的图。这些装置包括所需部件以及任选的部件。为了便于参考，对这些附图中的这些部件中的每个部件进行编号，并且在多个附图中存在的共同部件具有相同的编号。应当理解，本文所述的部件是非限制性的，并且仅出于说明目的而提供。个别部件的等同物被包括在本发明的范围内。
图1A和图1B示出了本发明的装置(1)的一个实施方案的一部分的剖视概述。图1A是俯视图。图1B是侧视图。
图2A和图2B示出了图1A和图1B中所述的装置(1)的一部分的横截面，其中该装置(1)包括孔(2)、在这些孔(2)中的珠粒(6)、孔(2)中的靶标捕获元件(5)、疏水性斥水层(4)，该疏水性斥水层形成该表面的将一个孔与另一个孔分隔的部分。图2A示出了最左边的孔(2)，该最左边的孔中设置有珠粒(6)，而中间和最右边的其他两个孔(2)是空的(为了清楚起见)。图2B示出了图2A的装置，在该装置中最右侧的孔填充有珠粒(6)、靶标(16)和溶液(17)。如在图2A中，仅为了清楚起见省略了其他孔(2)的内容物。
图2C示出了本文所述的装置(1)的一部分的另一实施方案的横截面，其中该装置(1)包括孔(2)、孔(2)中的珠粒(6)、孔(2)中的靶标捕获元件(5)、和疏水性斥水层(4)，该疏水性斥水层从隔板(3)的至少部分向上延伸。
图3示出了本发明的任选方面，其中将诸如硅油的疏水性液体(18)施加到装置(1)的顶部，以便在该装置上提供油层，从而进一步抑制从一个孔溢出到相邻孔。图3还示出了任选的壁(28)，这些壁向上延伸以容纳疏水性液体(18)。
图4示出了一种用于在本文所述的测定装置的隔板(3)上形成疏水性斥水层(4)的方法。
具体实施方式
公开了用于进行大规模组合文库的测定的装置和方法。然而，在更详细地描述本发明之前，将首先定义以下术语。如果没有定义，则本文所用的术语具有它们通常接受的科学含义。
本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且并不旨在限制本发明。如本文所用，除非上下文清楚地另外指示，否则单数形式“一”、“一个(种)”和“该”旨在也包括复数形式。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且该描述包括该事件或情况发生的情形以及该事件或情况不发生的情形。
术语“约”当在数字名称(例如，温度、时间、量、浓度和此类其他名称，包括范围)之前使用时，表示近似值，该近似值可变化(+)或(-)10％、5％、1％或其间的任何子范围或子值。优选地，术语“约”是指剂量可以变化+/-10％。
“包含”或“包括”旨在意指组合物和方法包括所述要素，但不排除其他要素。
当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应意指排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由如本文所定义的元素组成的组合物将不排除不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特性的其他材料或步骤。
“由……组成”应意指排除大于痕量元素的其他成分和实质方法步骤。由这些过渡术语中的每个过渡术语限定的实施方案在本发明的范围内。
术语“测定装置”是指能够同时测定针对靶标的多种测试化合物的装置。此类装置含有多个孔，其中每个个别孔优选地容纳有基本上相同化合物的多个拷贝。该装置包括使光透射过的材料。例如，光可以暴露在装置上或者光可以从装置内生成。在一个实施方案中，透射穿过其的光的波长和强度使得将基本上相同的化合物的多个拷贝中的每个拷贝附接到珠粒的可切割键的至少部分从珠粒上切割下来，从而在孔中生成具有一定浓度的该化合物的溶液。在一个实施方案中，透射穿过其的光是由给定孔中的分子生成的荧光，其中这些分子优选不结合到珠粒上。当荧光透射过装置时，如此生成的荧光能够在装置外被检测到。
在一个实施方案中，测定装置包括高达1,000,000个孔，优选地高达约10,000,000个孔。在一个实施方案中，测定装置包括约10,000个至约10,000,000个孔，优选地约50,000个至约2,000,000个孔。在一个优选实施方案中，装置的大小为高达约10,000平方毫米。
术语“靶标”意指材料，诸如生物材料，人们希望评定测试化合物对该靶标的结合亲和力和/或这种结合的生物学结果。示例性靶标包括单克隆或多克隆抗体、单克隆或多克隆抗体的片段、哺乳动物细胞、DNA、RNA、siRNA、蛋白质(例如，融合蛋白、酶、细胞因子、趋化因子等)、病毒等。在一个优选实施方案中，靶标是哺乳动物细胞，诸如人细胞。
术语“靶标捕获元件”意指化合物或化合物混合物的生物相容性层或膜。在一个实施方案中，该层或膜以足够的强度与孔的底表面上的靶标结合或复合，以便阻止靶标在孔内移动。在另一实施方案中，靶标捕获元件是不干扰悬浮液或溶液中靶标的完整性的生物相容性层或膜。在另一实施方案中，靶标与靶标捕获元件之间的复合体由小于1×10-3μmol/μL的离解常数(Kd)限定。在一个实施方案中，当在单个孔中采用多个细胞时，则靶标捕获元件进一步抑制细胞聚集。
术语“可释放地结合”意指结合到珠粒的化合物可以通过施加破坏键的刺激而被释放。这种键有时被称为“可切割”键。释放化合物的适当刺激取决于所使用的键。本领域有许多此类键和破坏该键的适当刺激的示例。可切割键的非限制性示例包括通过仅举几例来说pH变化、酶活性、氧化变化、氧化还原、UV光、红外光、超声波、磁场变化释放的那些键。此类可切割的键和切割这些键所需的对应刺激的全面概述由Taresco等人，Self-ResponsiveProdrug Chemistries for Drug Delivery,Wiley Online Library,2018,onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adtp.201800030提供。
可与“测试化合物”互换的术语“化合物”意指这样的化合物，评估该化合物对靶标的结合亲和力和/或此类结合的生物学结果。此类化合物通常是结构-活性关系(SAR)分析的一部分，因为它涉及特定的靶标。什么化合物结合或不结合靶标的分析为技术人员提供了关于化合物结构变化的结果的有意义的数据。同样，评定此类结合的生物学结果(或活性)为技术人员提供了关于什么结构差异改变这些生物学结果的仍另外信息。
参考化合物使用的术语“基本上相同”意指珠粒上的大多数化合物是相同的。在一个实施方案中，至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％的化合物是相同的。不相同的化合物通常是珠粒上不完全反应的结果，使得这些化合物是起始材料或最终产物的中间体。预期此类化合物缺乏足够的结构以有意义地与靶标相互作用。
术语“流体”意指液体或可流动粉末。
术语“以剂量依赖性方式与这些珠粒(6)可释放地结合”意指化合物经由可切割的接头结合至珠粒，其中切割是可滴定的，使得可控制所释放的化合物的量。在一个实施方案中，由可切割的接头释放的化合物的量通过由相同的可切割的接头连接结合至相同或不同珠粒的伴随标记物(诸如荧光化合物)的多个拷贝来评定。当结合到珠粒上时，不可切割的猝灭剂分子附接到其附近以减少或消除该荧光化合物的荧光。在设定的时间段内生成了荧光强度对比通过切割剂(例如，限定波长和限定强度的UV光)从珠粒切割的荧光化合物的量的标准化曲线。然后将UV光同等地施加到具有可切割的测试化合物的测试珠粒和具有可切割的荧光化合物的珠粒。然后将荧光强度标准化曲线所证实的荧光化合物的切割程度与所释放的测试化合物的量相关联。以这种方式，由于每个测试孔的溶液量是已知的，因此可以控制所释放的测试化合物的量并将其与溶液中测试化合物的浓度的量相关联。
术语“生物相容性”是指与装置中使用的组分中的每种组分相容的材料，包括但不限于珠粒、靶标、靶标捕获元件、化合物、mRNA、所采用的水溶液等。在靶标是活细胞的情况下，生物相容性材料必须在使用期间维持细胞的活力。同样，对于蛋白质、多肽、抗体、DNA、mRNA，生物相容性材料必须保留这些组分的功能性质。
装置
测定非常大的化合物组合文库的能力受到整个装置的大小约束和装置上的孔密度的限制。随着孔大小的减小，在每平方毫米基础上放置更多孔的能力增大。然而，这种增加存在限制，因为孔完整性要求在相邻孔之间存在最小距离。例如，如果孔太靠近在一起，则一个孔中的水溶液的一部分可能溢出到另一个孔中，使得两个孔的评估都是可疑的。通常，孔之间的最小距离为至少约50微米，这确保了基本上减少/防止从一个孔溢出到另一个孔。然而，这种分离距离与高密度的孔相反。
在本文所述的装置中，孔的设计允许孔之间的最小距离减小至约10微米并且低至约5微米，与此同时维持孔完整性，因为孔之间的疏水性斥水表面或突起抑制溢出。这允许每平方毫米明显更多的孔。因此，在实施方案中，孔间隔可以小于50微米、或小于40微米、或小于30微米、或小于20微米，这些孔各自具有约5微米、或约10微米、或约15微米的最小间隔距离，包括所述值之间的任何值或范围，包括它们的分数。
这些孔中的每个孔的直径还控制装置上的孔的密度。例如，具有直径为约40微米的孔的装置可以允许比孔直径为约150微米的装置显著更大的孔密度。实际上，本文所述的装置具有高密度的孔，诸如包括孔的装置表面具有至少10个孔/平方毫米的那些。
最后，本发明的装置应定大小为易于由熟练技术人员使用。例如，常规96孔板为约128mm乘85mm(或约7.4英寸乘3.3英寸)。这些板提供约0.00885个孔/mm2的孔密度。然而，本文所述的装置预期具有高达约400个孔/mm2，优选地至少10个孔/mm2，更优选地约40个孔/mm2至约150个孔/mm2的孔密度。在实施方案中，孔具有约60微米至150微米的孔直径。在透视图中，约200个孔/mm2的孔密度在定大小为与常规96孔板相容时提供了超过2,100,000个孔。然而，许多不同的装置大小是可行的，优选的最大大小为不大于约12英寸(300mm-X轴)至不大于约12英寸(300mm-Y轴)。本文所述的高孔密度装置允许组合文库的特别高的生产量。
现在转到图1A和图1B，提供了说明具有约1mm厚度(100)的装置1的表面的示例性部分的概述，并且其中所说明的孔(2)中的每一个孔具有约150微米的最大直径(105)(沿其最长轴测量)、约150微米的孔(2)深度(110)、以及从一个孔的最近边缘到作为其最近邻居的第二孔的最近边缘的至少20微米的距离。
更一般地说，图1A和图1B的装置1具有至少约0.1mm的顶部至底部厚度(100)并且在其表面上包括多个孔(2)。每个孔(2)具有约30微米至约250微米，优选地约50微米至约150微米的直径(105)。每个孔(2)的深度(110)为约30微米至约400微米，优选地约150微米。当孔直径为约150微米且深度为约150微米时，这提供了孔内2.65×106立方微米或0.00265微升的体积。
本文所述的装置可包括多种生物相容性材料中的任一种生物相容性材料，包括但不限于聚合物，诸如可从Zeon Specialty Materials，Inc.(San Jose，California，USA)商购获得的环烯烃聚合物(COP)、可从多种来源(诸如Polyplastics USA，Inc.(FarmingtonHills，michigan，USA))商购获得的环烯烃共聚物(COC)、可从多种来源(诸如PutnamPlastics(Dayville，Connecticut，USA))商购获得的聚酰亚胺、可从多种来源(诸如FosterCorporation(Putnam，Connecticut，USA))商购获得的聚碳酸酯、可从Edge Embossing(Medford，Massachusetts，USA)商购获得的聚二甲基硅氧烷和可从Parchem Fine&Specialty Chemicals(New Rochelle，New York，USA)商购获得的聚甲基丙烯酸甲酯。
本发明的装置可通过本领域熟知的热压印方法容易地制备，并且包括将图案压印到通过将聚合物加热到刚好高于其玻璃化转变温度的温度而软化的聚合物中。聚合物的后续冷却在本文所述的装置中提供高密度的孔。或者，模具注射技术是可使用的并且是本领域中熟知的。仍另外，生物相容性聚合物的固体块可以被激光蚀刻以引入具有适当大小、体积和形状以及具有期望的孔密度的期望数量的孔。
图1A和图1B示出了部分形成的装置(1)的一部分，该部分包括多个孔(2)和将孔(2)彼此分开的隔板(3)(对于隔板(3)的放大图，参见图2A至图2C)。在一个实施方案中，每个隔板(3)从远离第一孔(2)到其最近的相邻孔(2′)的长度为至少约10微米。孔(2)之间的这种最小距离确保了孔的完整性，使得均匀的水溶液(无溢出)被包括在每个孔(2)中，并且每个孔(2)容纳有一个或多个珠粒，其中珠粒含有与其结合的相同测试化合物的多个拷贝。在优选实施方案中，隔板(3)具有从最近的相邻孔测量的约5微米、10微米或20微米的长度，更优选地约20微米至小于约50微米的长度。
当如上所述通过具有约10微米长度的隔板(3)的热压印方法生成孔(2)时，如上所述将热塑性聚合物片材加热到略高于其玻璃化转变温度的温度。印模经选择为包括多个圆形尖头，这些圆形尖头优选地以期望的密度均匀地放置在印模的表面上。每个尖头定大小为具有与上述孔(2)的大小相关的直径和深度。任何两个相邻尖头之间的距离为至少约10微米(即，隔板(3)为至少约10微米厚)。印模定大小为使得包括尖头的部分配合在片材的顶表面内。将足够的力施加到印模上，以确保尖头的全部长度沉入片材中。所需的力取决于片材的柔软度并且可由技术人员容易地确定。当片材冷却时，去除尖头，以便提供现在包含根据图1A和图1B的孔(2)和隔板(3)的片材。
另选地，图1A和图1B的部分形成的装置(1)可以通过使用两个半模的常规注射成型来制备—其中一个半模具有与印模的凸起相对应的凸起(阳半模)，并且另一个半模形成装置的基底(阴半模)。半模彼此并置以形成图1A和图1B中所示的装置(1)形状的空腔。如图1A和图1B所示，将单体或反应性低聚物组合物注入此空腔中之后进行聚合，提供了现在含有孔(2)和隔板(3)的装置(1)。
在一个实施方案中，在热压印或模具形成之后，可以通过常规溅射技术将二氧化硅涂层施加到装置(1)的顶表面，包括孔(2)的底表面(即，孔(2)的底壁；参见图2A)(8)。优选地，二氧化硅层的厚度为约0.5至约100纳米，更优选地约10纳米至50纳米。二氧化硅涂层提供了反应层，该反应层结合斥水生物相容性层(4)以及待形成的靶标捕获元件(5)两者。
图2A、图2B和图2C示出了在构造的不同阶段期间装置(1)的不同方面。例如，图2A示出了具有孔(2)的装置(1)，该孔具有侧表面(7)和底表面(8)以及限定隔板(3)的顶表面的生物相容的疏水性斥水层(4)。在第一孔(2)中，示出了靶捕获层(5)和珠粒(6)。
图2B进一步包括在孔(2)中的在水溶液(17)中的靶标(16)。并且图2C示出了图2A中所公开的生物相容的疏水性斥水层(4)的替代形式。在图2C中，仅在隔板(3)的一部分上方形成斥水层(4)，并且这可以通过激光蚀刻形成之后的疏水层(4)以减小该隔板(4)的长度来形成。
关于装置(1)的构造的细节，在将二氧化硅涂层施加到装置(1)的顶表面(包括孔(2)的底表面(8))上之后，然后将每个隔板(3)修改为包含生物相容的疏水性斥水层(4)，该生物相容的疏水性斥水层抑制水溶液(17)从一个孔溢出到另一个孔，如图4中所示。该斥水层(4)包含生物相容的疏水性斥水材料，诸如聚乙烯、聚丙烯、乙烯和丙烯的嵌段共聚物、聚四氟乙烯、(三氯)十八烷基硅烷(OTS)、无定形含氟聚合物(诸如)、和聚二甲基硅氧烷(PDMS)等。
生物相容性斥水层(4)通过常规涂覆技术生成。例如，如图4的方法的步骤1中所示，一种此类技术涉及将溶解在与装置相容的合适溶剂(例如，乙醇)中的生物相容性斥水材料的溶液施加到盘(24)上。然后使盘(24)自旋(未示出)以产生约1-5微米的薄溶液膜(23)。停止自旋，然后将装置(1)的顶表面置于薄膜(23)上/内，如图4的步骤2中所示。使装置(1)如步骤3所示在约1分钟至5分钟内从盘(24)脱离，然后干燥以形成厚度为约1微米至5微米的斥水层(4)。
在替代实施方案中，然后通过注塑成形到所需厚度来进行斥水生物相容性层(4)的形成。由于斥水生物相容性层(4)的添加增加了这些孔中的每个孔的深度，因此应当理解的，上述孔的总深度是指在形成斥水层(4)之后的深度。
根据图4，步骤4至步骤5实现了将靶捕获(层)元件(5)施加到孔(2)的底部上。在步骤4中，靶标捕获元件(5)是聚-D-赖氨酸(PDL)，其仅用于说明目的。将足够的PDL溶解到水溶液中，以达到例如约0.1mg/mL的浓度。PDL可从许多来源商购获得。PDL的一种优选来源来自ThermoFisher Scientific,10010Mesa Rim Road,San Diego,California USA，产品目录号A389040。靶标捕获元件(5)的其他示例包括：纤连蛋白(ThermoFisher Scientific，目录号33016015)、玻连蛋白(Sigma Aldrich，目录号5051)等。
将没有PDL靶标捕获元件(5)的部分形成的装置(1)浸入容纳有PDL溶液的容器中，如图4，步骤4所示。浸渍持续约1小时。然后将装置(1)取出并然后干燥，如图4，步骤E所示。装置(1)的顶表面上的疏水性涂层抑制PDL在该表面上的沉积，从而在孔(2)的底表面(8)上以及可能在孔(2)的侧壁(7)上提供靶标捕获元件。
靶标捕获元件(5)与孔(2)的底表面(8)是生物相容的，并且在沉积位点处粘附到靶标(17)以便一旦沉积就阻止靶标易位，或者当靶标(1)在溶液中或者是悬浮液时与靶标(1)是生物相容的。优选地，靶标捕获元件(5)的总体特性是亲水性的，但是疏水性区域是允许的。在一个实施方案中，靶标捕获元件(5)经选择以粘附至孔(2)的底表面(8)和沉积在其上的靶标(17)。靶标捕获元件(5)包含诸如聚(氨基酸)、DNA、RNA、siRNA、抗体、抗体片段、蛋白质、多肽等材料。相对于所采用的靶标(16)选择特定的靶标捕获元件(5)，并且这种选择是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，靶标(16)是哺乳动物细胞，诸如人Hela细胞，并且靶标捕获元件(5)是D-赖氨酸的聚合物(PDL)。具有约1×109个赖氨酸残基至约1×1014个赖氨酸残基的D-赖氨酸聚合物是优选的。
当生物相容性斥水层(4)与靶标捕获元件(5)组合使用时，本文所述的装置(1)允许每平方毫米非常高的孔密度以及使用电磁能检测手段(例如，光)维持沉积在孔(2)中的细胞的可再现检测。本文所述的斥水生物相容性层(4)的存在抑制或消除了水溶液从相邻孔的溢出。
靶标捕获元件(5)的存在有助于避免与沉积在孔2的底部的中部处或其附近处的靶标易位到其拐角相关的问题。当这样易位时，施加到靶标5和从该靶标取回的电磁能的施加和读取变得不太可靠。
优选地，靶标捕获元件(5)通过非共价相互作用(包括静电、亲水性(例如，氢键)、疏水性和范德华力)与沉积在表面(8)上的靶标(1)结合。这种结合可以通过平衡解离常数(Kd-有时称为KD)来测量，其中较低的值与较强的结合相互作用相关。在一个实施方案中，靶标捕获元件(5)以足够的解离常数与靶标(1)结合，从而阻止靶标(1)在孔(2)内的易位。优选地，靶标与靶标捕获元件的结合提供了不大于约1×10-3μmol/μL且更优选地不大于约1×10-5μmol/μL的Kd。
上述方法提供了一种用于形成测定装置(1)的方法，其中该装置包括多个孔(2)。这种方法包括：
a)将生物相容性热塑性材料加热至刚好高于玻璃化转变温度，以软化该材料；
b)将印模施加到该经加热的材料的表面，其中该印模包含多个尖头，其中每个尖头被定大小为具有与待形成的孔(2)的大小相关的直径和深度，其中任何两个相邻尖头之间的距离为至少约10微米；
c)向该印模施加足够的压力，以确保该尖头的全长沉入片材中并且然后随后被去除以提供具有隔板(3)的孔(2)，该隔板将每个孔与相邻的孔(2)分开，该孔具有底表面(8)和侧表面(7)；
d)任选地将二氧化硅层施加到该隔板(3)和该孔(2)的暴露表面；
e)将生物相容的疏水性斥水材料(4)的层施加至隔板(3)；以及
f)将靶标捕获元件(5)的层施加至这些孔(2)的底表面，
从而提供装置(1)，该装置能够抑制水溶液(17)从一个孔(2)溢出到相邻的孔(2)，与此同时阻止沉积在该孔(2)中的靶标在该孔(2)内易位。
在图3所示的另一实施方案中，装置(1)的外边缘(28)略微向上延伸以允许添加密度小于水的疏水性流体层(18)。这个层(18)提供了防止溢出以及防止孔(2)被诸如灰尘、花粉等可能影响测试结果的污染物污染的附加保护。疏水性流体18是生物相容的并且在25℃下具有小于0.99克/立方厘米的密度，使得该流体在水溶液上方形成层。一种优选的疏水性流体18是硅油，其可从许多商业供应商(诸如SigmaAldrich,Inc.，St.Louis，Missouri，USA)获得。疏水性流体18可以以任何方式施加，包括通过位于装置(1)上方的分配器，并且以不引起水溶液(17)从一个孔(2)到另一个孔(2)的任何溢出的方式施加流体的雾。在名称为“Caps for Assay Devices”的美国申请号16/774,875(代理人档案号057698-503F01US)中提供了一种用于提供疏水性流体层(18)的手段。根据图3，提供了一种防止溢出和蒸发的方法，该方法包括提供具有任选的壁(28)的装置，以及将疏水性液体(18)放置在经填充的孔(2)上方。
提供以下实施例仅用于说明目的，并不构成对所要求保护的本发明的任何限制。除非另外指明，否则所有温度均为摄氏温度，并且除非另有说明，否则所有条件均处于大气压下。在此实施例中，以下缩写具有以下含义：
mL＝毫升
mm＝毫米
mm2＝平方毫米
OTS＝三氯(十八烷基)硅烷
PMMA＝聚甲基甲基丙烯酸
rpm＝每分钟转速
μL＝微升
μm＝微米
实施例1-装置(1)的形成
将测量为76mm(X轴)×50mm(Y轴)×1mm(Z轴)的热塑性PMMA片材(购自LuciteInternational Cassel Works，Billingham UK)加热至略高于为约125℃的其玻璃化转变温度(Tg)的温度以软化该塑料。印模经选择为包括在其表面上以每排约40个尖头/mm2的密度均匀地放置成4排的多个圆形尖头。每排尖头是约50mm长和7mm宽。
每个尖头具有约150μm的直径和从尖头的基底到端部约150μm的深度。任何两个相邻叉之间的距离为约20μm。印模定大小为使得每排尖头配合在片材的顶表面内。对印模施加足够的力，以确保尖头的全部长度沉入片材的顶面中。所需的力取决于片材的柔软度并且可由技术人员容易地确定。当板冷却时，去除尖头以便提供具有孔(2)和隔板(3)的部分形成的装置(1)，如图1所描绘。
然后，通过本领域熟知的常规溅射技术，用二氧化硅(SiO2)薄层涂覆具有孔(2)和隔板(3)的装置(1)。继续溅射工艺直到形成厚为约30纳米的二氧化硅膜。这种膜的目的用于增强疏水性斥水层(4)和靶标捕获元件(5)两者对装置(1)的粘附。
制备装置(1)的下一步骤如图4所示。
图4示出了在部分形成的装置(1)的顶表面上形成斥水元件(3)，其中二氧化硅层处于适当位置。具体而言，将可旋转盘(24)置于自旋器上，并向其施加浓度为约25微摩尔的OTS的乙醇溶液。启动自旋器并以约1000rpm的速率旋转。继续自旋直到溶液(23)均匀地沉积在盘上。通常，自旋持续约小于1分钟，然后停止，并且溶液(23)的厚度为约0.1微米至约2微米。
在图4，步骤2中，将部分形成的装置(1)的顶表面置于现在固定的盘(24)上的溶液(23)中并在那里维持长达约5分钟。在图4，步骤3中，将部分形成的装置(1)从盘上取下，然后干燥以形成厚度为约1微米至2微米的斥水层(4)。
图4，步骤4说明了在孔(2)的底面上靶标捕获元件(6)的形成。在图4，步骤4中，向容器(25)填充从ThermoFisher Scientific，10010Mesa Rim Road，San Diego，CaliforniaUSA以目录号A389040获得的聚-D-赖氨酸的溶液(26)。将足够的PDL溶解到水溶液中，以达到例如约0.1mg/mL的浓度。将没有PDL靶标捕获元件(5)的部分形成的装置(1)浸入容纳有PDL溶液(26)的容器中。浸渍持续约1小时。然后取出装置(1)并然后干燥，如图4，步骤5所示。装置(1)的顶表面上的疏水性涂层抑制PDL在该表面上的沉积，从而在孔(2)的底表面(8)上以及可能在孔(2)的侧壁(7)上提供靶标捕获元件(4)。
提供以上实施例仅用于说明性目的且为非限制性的。可以使用其他技术来形成装置(1)。

Claims (39)

1.一种测定装置(1)，所述测定装置包括排列在所述测定装置上的高密度孔(2)，其中所述孔(2)中的每个孔包括：
a)底壁(8)和侧壁(7)，所述底壁和所述侧壁被配置为将一个或多个珠粒(6)和一个或多个靶标(16)保持在水溶液(17)中；
b)隔板(3)，所述隔板将相邻孔(2)彼此分开，前提条件是所述隔板中的每个隔板从第一孔(2)的最近边缘到第二孔(2′)的最近边缘的长度为至少约10微米；其中所述第二孔(2′)是所述第一孔(2)的最近邻居；
其中每个孔(2)保留所述一个或多个珠粒(6)，所述一个或多个珠粒(6)中的每个珠粒包含单一化合物的多个拷贝，所述多个拷贝以剂量依赖性方式可释放地结合到所述一个或多个珠粒(6)，并且另外其中所述一个或多个珠粒(6)中的每个珠粒包含mRNA捕获组分；
所述底壁(8)进一步包括结合的靶标捕获元件(5)，所述结合的靶标捕获元件捕获所述靶标(16)并且在将所述靶标(16)放置在所述孔(2)中之后能够阻止所述靶标在所述孔内移动；并且
其中所述隔板(3)的至少表面部分包括疏水性斥水层(4)，所述疏水性斥水层结合在所述隔板中并包围所述隔板的所述表面或从所述隔板的所述表面延伸。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述装置包括至少10个孔/平方毫米的孔密度。
3.根据权利要求2所述的装置，其中所述装置包括约10个/平方毫米至400个/平方毫米的孔密度。
4.根据权利要求1所述的装置，其中所述靶标被保持在水溶液中。
5.根据权利要求4所述的装置，其中所述靶标是哺乳动物细胞，并且所述水溶液是用于所述细胞的生长培养基，以便维持所述细胞在溶液中的活力。
6.根据权利要求5所述的装置，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
7.根据权利要求6所述的装置，其中所述靶标捕获元件包括聚-D-赖氨酸。
8.一种测定装置(1)，所述测定装置包括排列在所述测定装置上的高密度孔(2)，其中所述孔(2)中的每个孔包括：
a)底壁(8)和侧壁(7)，所述底壁和所述侧壁被配置为将一个或多个珠粒(6)和一个或多个靶标(16)保持在水溶液(17)中，其中个别孔(2)中的所述一个或多个珠粒(6)包含单一化合物的多个拷贝，所述多个拷贝可释放地结合至所述一个或多个珠粒(6)，所述单一化合物为以剂量依赖性方式可释放的，并且另外地其中所述一个或多个珠粒(6)中的每个珠粒包含mRNA捕获组分；
b)隔板(3)，所述隔板将相邻孔(2)彼此分开，前提条件是所述隔板(3)中的每个隔板从第一孔(2)的最近边缘到第二孔(2′)的最近边缘的长度为至少约10微米；其中所述第二孔(2′)是所述第一孔(2)的最近邻居；
其中所述底壁(8)包括靶标捕获元件(5)，所述靶标捕获元件捕获所述靶标(16)并且在将所述靶标(16)放置在所述孔(2)中之后阻止所述靶标在所述孔内移动；并且
另外地其中所述隔板(3)的至少表面部分包括疏水性斥水层(4)，所述疏水性斥水层结合在所述隔板中或从所述隔板向上延伸并且基本上不含所述水溶液。
9.根据权利要求8所述的装置，其中所述装置包括至少10个孔/平方毫米的孔密度。
10.根据权利要求9所述的装置，其中所述装置包括约10个/平方毫米至400个/平方毫米的孔密度。
11.根据权利要求8所述的装置，其中所述靶标被保持在水溶液中。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述靶标是哺乳动物细胞，并且所述水溶液是用于所述细胞的生长培养基，以便维持所述细胞在溶液中的活力。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
14.根据权利要求13所述的装置，其中所述靶标捕获元件包括聚-D-赖氨酸。
15.根据权利要求1所述的装置，其中所述珠粒进一步包含mRNA捕获组分。
16.根据权利要求1所述的装置，其中所述装置包括至少10个孔/平方毫米的孔密度。
17.根据权利要求16所述的装置，其中所述装置包括约10个/平方毫米至400个/平方毫米的孔密度。
18.根据权利要求15所述的装置，其中所述靶标被保持在水溶液中。
19.根据权利要求18所述的装置，其中所述靶标是哺乳动物细胞，并且所述水溶液是用于所述细胞的生长培养基，以便维持所述细胞在溶液中的活力。
20.根据权利要求19所述的装置，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
21.根据权利要求20所述的装置，其中所述靶标捕获元件包括聚-D-赖氨酸。
22.一种在具有高密度孔的测定装置中抑制溢出的方法，所述孔中的每个孔包含水溶液，所述方法包括：
a)在所述装置上提供至少10个孔/mm2的孔密度，使所述孔在所述装置上排列，使得所述孔中的每个孔的边缘被放置为距其最近的相邻孔的最近边缘至少20微米，从而提供所述孔之间的隔板；
b)向所述隔板的至少部分施加生物相容的疏水性斥水膜或层，所述疏水性斥水膜或层覆盖在另外构成所述装置的材料上，从而创建对将一个孔中的水溶液的一部分转移到相邻孔中的障碍。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述孔的所述底部进一步包括足量的靶标捕获元件以便阻止靶标易位。
24.根据权利要求21所述的方法，所述方法进一步包括引入一个或多个珠粒，所述一个或多个珠粒包含单一化合物的多个拷贝，所述多个拷贝可释放地结合至所述一个或多个珠粒(6)，所述化合物是以剂量依赖性方式可释放的，并且另外其中所述一个或多个珠粒(6)中的每个珠粒包含RNA捕获组分。
25.根据权利要求21所述的方法，所述方法进一步包括在所述孔中的每个孔内引入靶标。
26.根据权利要求23所述的方法，所述方法进一步包括在将所述一个或多个珠粒和靶标引入所述孔中的每个孔内之后将疏水液体施加在所述孔上，所述疏水液体具有小于水的密度。
27.一种用于形成测定装置(1)的方法，其中所述装置包含多个孔(2)，所述方法包括：
a)将生物相容性热塑性材料加热至刚好高于玻璃化转变温度，以软化所述材料；
b)将印模施加到所述经加热的材料的表面，其中所述印模包含多个尖头，其中每个尖头被定大小为具有与待形成的所述孔(2)的所述大小相关的直径和深度，其中任何两个相邻尖头之间的距离为至少约10微米；
c)向所述印模施加足够的压力，以确保所述尖头的全长沉入片材中并且然后随后被去除以提供具有隔板(3)的孔(2)，所述隔板将每个孔与相邻的孔(2)分开，所述孔具有底表面(8)和侧表面(7)；
d)任选地将二氧化硅层施加到所述隔板(3)和所述孔(2)的暴露表面；
e)将生物相容的、斥水的、疏水材料(4)层施加到所述隔板(3)；以及
f)将靶标捕获元件(5)的层施加至所述孔(2)的所述底表面，
从而提供装置(1)，所述装置能够抑制水溶液(17)从一个孔(2)溢出到相邻的孔(2)，与此同时阻止沉积在所述孔(2)中的靶标在所述孔(2)内易位。
28.一种适于进行组合文库的测定的设备，其中所述设备包括：
测定装置，所述测定装置在所述测定装置的顶表面上包括至少10,000个孔，其中所述至少10,000个孔中的每个孔包括底壁和侧壁，所述底壁和所述侧壁被配置为将一个或多个珠粒和一个或多个靶标保持在水溶液中；以及
表面隔板，所述表面隔板将所述至少10,000个孔中的第一孔与所述至少10,000个孔中的第二孔隔开，
其中沿着所述测定装置的所述顶表面从所述第一孔的最近边缘到所述第二孔的最近边缘的距离为约10微米(μm)至约50μm，
其中所述第二孔是与所述第一孔最邻近的孔，
其中所述表面隔板中的每个表面隔板的至少部分包括疏水层，
其中所述疏水层被配置为限制所述水溶液从所述第一孔溢出到所述第二孔，
其中所述测定装置具有顶表面区域，并且所述顶表面区域上的所述至少10,000个孔的密度为至少10个孔/平方毫米(mm2)，并且其中所述孔中的每个孔具有约30μm至约250μm的孔直径和约30μm至约400μm的孔深度。
29.根据权利要求27所述的设备，其中所述密度为至少10个孔/mm2至约400个孔/mm2。
30.根据权利要求28所述的设备，其中所述密度为约40个孔/mm2至约150个孔/mm2。
31.根据权利要求27所述的设备，其中沿着所述顶表面从所述第一孔的所述最近边缘至所述第二孔的所述最近边缘的所述距离为约10μm至约30μm。
32.根据权利要求27所述的设备，
其中所述设备进一步包含哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞维持在用于所述哺乳动物细胞的含水生长培养基中，
其中所述含水生长培养基被配置为维持所述哺乳动物细胞在溶液中的所述活力，并且
其中所述含水生长培养基被维持在所述至少10,000个孔中的至少一个孔中。
33.根据权利要求31所述的设备，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
34.根据权利要求31所述的设备，其中所述靶标捕获元件包括聚-D-赖氨酸。
35.根据权利要求30所述的设备，其中沿着所述顶表面从所述第一孔的所述最近边缘到所述第二孔的所述最近边缘的所述距离为约15μm至约25μm。
36.根据权利要求27所述的设备，其中所述测定装置在所述顶表面上具有至少约100,000个孔。
37.根据权利要求27所述的设备，其中所述疏水层包含选自以下的生物相容性疏水材料：聚乙烯、聚丙烯、乙烯和丙烯的嵌段共聚物、聚四氟乙烯、(三氯)十八烷基硅烷(OTS)、无定形含氟聚合物、和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
38.根据权利要求31所述的设备，其中所述至少10,000个孔中的至少一个孔的底面进一步包括捕获所述哺乳动物细胞的靶标捕获元件。
39.根据权利要求27所述的设备，其中所述至少10,000个孔中的至少一个孔的所述底面的至少部分是亲水性的。
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