KR20240013103A - 조합 라이브러리용 분석 디바이스 - Google Patents

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KR20240013103A
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제시 루
알렉스 프라이스
펭유 양
칸다스와미 비자얀
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플렉시움 인코포레이티드
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Abstract

정렬된 고밀도의 웰을 포함하는 분석 디바이스가 개시된다.

Description

조합 라이브러리용 분석 디바이스
본 개시는 대규모 조합 라이브러리에 대한 분석을 수행하기 위한 디바이스 및 방법을 제공한다. 특히, 본 명세서에 개시된 디바이스 및 방법은 최대 천만 개의 화합물의 라이브러리에 대한 동시 분석을 수행할 수 있도록 한다.
조합 라이브러리는 문헌에 잘 알려져 있으며, 종종 비드를 사용한다. 이러한 비드 각각은 비드에 대한 링커에 의해 결합된 단일 화합물의 다수의 카피를 포함한다. 또한, 비드에는 전형적으로 비드에 있는 단일 화합물의 구조를 평가할 수 있는 DNA와 같은 보고 요소가 포함되어 있다. 이러한 라이브러리의 대부분은 분석 동안 테스트 중인 화합물이 비드에 남아 있다는 사실에 의해 제한된다. 따라서, 분석에 의해 생성된 생물학적 데이터는 결합된 화합물이 선택한 표적에 효과적으로 결합하지 못할 가능성으로 인해 잠재적으로 손상될 수 있다. 이는 비드로부터의 물리적 간섭뿐만 아니라 화합물을 비드와 연결하는 링커의 부착으로 인한 입체 간섭 가능성 때문일 수 있다. 후자의 경우, 이러한 연결은 다른 강력한 화합물이 표적에 적절하게 결합하는 능력을 억제하여 화합물의 실제 효능보다 낮다는 증거를 제공하는 분석 결과를 초래할 수 있습니다.
이러한 문제를 해결하기 위한 한 가지 옵션은 적절한 자극(예를 들어, 빛)에 의해 절단되어 비드로부터 화합물을 방출하는 절단 가능한 링커를 사용하는 것이다. 화합물이 테스트 웰(well)과 같은 용액에 들어가면, 분석에서 최대 효능을 제공하는 방식으로 자유롭게 배향할 수 있다. 또한, 이러한 화합물의 방출은 의미 있는 용량 의존적 데이터를 제공하기 위해 방출되는 화합물의 양이 제어되는 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2019/0358629호를 참조할 수 있다.
절단 가능한 링커를 사용하면 비드 및/또는 링커로 인한 입체 장애 문제를 피할 수 있지만, 더 큰 라이브러리를 수용하기 위해 분석 디바이스에서 개별 웰의 수를 확장하면 또 다른 문제가 발생한다. 인접한 웰이 서로 너무 가까이 있는 경우 하나의 웰의 테스트 용액 일부가 유출(spill-over)되어 인접한 웰의 테스트 용액을 오염시킬 수 있다. 이러한 유출은 위양성(false positive)을 유발하여 결과를 변경하거나 활성 화합물의 보고된 활성을 희석시킬 수 있다. 전자는 용액의 테스트 화합물이 활성이고 해당 용액의 일부가 비활성 화합물이 있는 테스트 웰로 "유출"될 때 발생할 수 있다. 유출로 인해 비활성 화합물이 있는 웰에 이제는 활성 화합물이 생겨 해당 웰에 활성이 있는 것으로 잘못 보고된다. 후자는 비활성 화합물이 있는 웰로부터의 유출이 활성 화합물이 있는 웰을 오염시키고 활성 화합물의 농도를 감소시켜서, 보고된 활성은 용량 의존적으로 보고될 때 실제 활성보다 적게 된다.
유출 문제는 분석 디바이스에 서로 근접한 다수의 웰이 포함되어 있는 경우 특히 관련이 있다. 디바이스의 작동 가능한 크기를 유지하기 위해, 웰 밀도는 한 웰의 수용액이 유출되어 인접한 웰을 오염시킬 수 있는 지점까지 증가한다. 이러한 밀도에서는 웰 밀도가 증가함에 따라 개별 웰의 신뢰성이 감소하여 분석 결과의 신뢰성이 떨어진다. 따라서, 기술자는 원하는 웰 밀도를 더 이상 수용할 수 없을 정도로 웰을 분리하는 분석 디바이스를 사용하거나, 분석 중에 생성된 데이터의 신뢰성을 감소시키는 유출을 허용해야 하는 난제에 처하게 된다.
더 나아가, 분석 디바이스 내의 각각의 웰은 테스트 화합물의 의도된 결합 부위인 표적을 포함한다. 표적 위치는 바람직하게는 웰의 중심 또는 그 부근이다. 그러나 표적이 생존 가능한 세포인 경우, 증착 후 세포가 웰의 구석으로 이동하여 이러한 세포의 시각화가 더 어려워질 수 있다. 분석 결과는 종종 세포를 시각화하여 측정되기 때문에, 적절하게 시각화하지 못하는 것은 세포의 활성에 관한 신뢰할 수 있는 정보를 전달하는 분석의 능력에 중대한 단점이 된다.
상기와 같은 관점에서, 유출을 억제하고, 적절할 경우, 웰에 배치될 때 표적의 위치 변경을 저해하는 분석 디바이스를 제공하는 것이 유리할 것이다.
일 실시예에서, 본 개시는 제1 웰로부터 제2 웰로 수용액의 일부가 유출되는 것을 억제하도록 구성되는 고밀도의 웰을 포함하는 분석 디바이스를 제공한다. 일 실시예에서, 본 개시는 웰에 배치된 생존 가능한 세포와 같은 표적의 위치 변경을 저해하는 분석 디바이스를 제공한다. 예를 들어, 표적의 위치 변경을 저해하면, 용해성 화합물이 세포로 흡수되어 발생하는 생물학적 결과를 신뢰성 있게 검출하기 어려운 웰 내의 부위로 표적이 위치 변경되는 위험을 감소시킬 수 있다.
따라서, 디바이스 실시예 중 하나에서, 정렬된 고밀도의 웰(2)을 포함하는 분석 디바이스(1)로서, 상기 웰(2)은 각각,
a) 수용액(17)에 하나 이상의 비드(6) 및 하나 이상의 표적(16)을 보유하도록 구성된 바닥 벽(8) 및 측벽(7); 및
b) 인접한 웰(2)을 서로 분리하는 구획부(3)―상기 구획부 각각은 제1 웰(2)의 가장 가까운 에지(edge)로부터 제2 웰(2')의 가장 가까운 에지까지의 길이가 적어도 약 10 마이크로미터이고, 상기 제2 웰(2')은 제1 웰(2)로부터 가장 가까운 이웃임―;
를 포함하고,
상기 구획부(3)의 적어도 표면 일부는 소수성 발수층(4)을 포함하고, 소수성 발수층(4)은 구획부에 통합되고 구획부의 표면을 둘러싸거나 구획부의 표면으로부터 연장되는, 분석 디바이스가 제공된다.
실시예들에서, 디바이스(2)의 웰은 하나 이상의 비드(6)를 포함하며, 각각의 비드는 용량 의존적으로 상기 비드(들)(6)에 방출 가능하게 결합되는 단일 화합물의 다수의 카피를 포함한다. 실시예들에서, 상기 바닥 벽(8)은 상기 표적(16)을 캡처(capture)하고, 상기 표적(16)을 배치한 후 웰(2) 내에서 표적의 이동을 저해할 수 있는 표적 캡처 요소(5)를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 비드 중 하나 이상은 mRNA 캡처 성분을 더 포함한다.
디바이스 실시예의 다른 실시예에서, 정렬된 고밀도의 웰(2)을 포함하는 분석 디바이스(1)로서, 상기 웰(2)은 각각,
a) 수용액(17)에 하나 이상의 비드(6) 및 하나 이상의 표적(16)을 포함하는 바닥 벽(8) 및 측벽(7)―개별 웰(2) 내 비드 또는 비드들(6)은 용량 의존적으로 상기 비드(들)(6)에 방출 가능하게 결합되는 단일 화합물의 다수의 카피를 포함하고, 추가로 상기 비드들(6) 각각은 mRNA 캡처 성분을 포함함―;
b) 인접한 웰(2)을 서로 분리하는 구획부(3)―상기 구획부(3) 각각은 제1 웰(2)의 가장 가까운 에지로부터 제2 웰(2')의 가장 가까운 에지까지의 길이가 적어도 약 10 마이크로미터이고, 상기 제2 웰(2')은 제1 웰(2)로부터 가장 가까운 이웃임―
를 포함하고,
상기 바닥 벽(8)은, 상기 표적(16)을 캡처하고 상기 표적(16)을 배치한 후 웰(2) 내에서의 표적 이동을 저해하는 표적 캡처 요소(5)를 포함하고; 그리고
추가로, 상기 구획부(3)의 적어도 표면 일부는 소수성 발수층(4)을 포함하고, 소수성 발수층(4)은 구획부에 통합되거나 구획부로부터 상방으로 연장되고, 상기 수용액이 실질적으로 존재하지 않는, 분석 디바이스(1)가 제공된다.
디바이스 실시예의 또 다른 실시예에서, 정렬된 복수의 고밀도의 웰(2)을 포함하는 분석 디바이스(1)로서, 상기 웰(2)은 각각,
a) 수용액(17)에 하나 이상의 비드(6) 및 하나 이상의 표적(16)을 포함하는 바닥 벽(8) 및 측벽(7)―개별 웰(2) 내 비드 또는 비드들(6)은 용량 의존적으로 상기 비드(들)(6)에 방출 가능하게 결합되는 단일 화합물의 다수의 카피를 포함하고, 추가로 상기 비드들(6) 각각은 RNA 캡처 성분을 포함함―;
b) 인접한 웰(2)을 서로 분리하는 구획부(3)―상기 구획부(3) 각각은 제1 웰(2)의 가장 가까운 에지로부터 제2 웰(2')의 가장 가까운 에지까지의 길이가 적어도 약 10 마이크로미터이고, 상기 제2 웰(2')은 제1 웰(2)로부터 가장 가까운 이웃임―
를 포함하고,
상기 바닥 벽(8)은, 포유류 세포를 캡처하고 상기 세포를 배치한 후 웰(2) 내에서의 세포 이동을 저해하는 세포 캡처 요소(5)를 포함하고; 그리고
추가로, 상기 구획부(3)의 적어도 표면 일부는 소수성 발수층(4)을 포함하고, 소수성 발수층(4)은 구획부에 통합되거나 구획부로부터 상방으로 연장되고, 상기 수용액이 실질적으로 존재하지 않으며,
또한 추가로, 웰(2) 각각에 있어 수용액의 최상부 표면은 소수성 유체(18)로 덮이는, 분석 디바이스(1)가 제공된다.
바람직한 일 실시예에서, 디바이스는 제곱 밀리미터당 적어도 10 개의 웰의 웰 밀도, 바람직하게는 디바이스당 적어도 약 1,000 개 내지 10,000,000 개의 웰의 웰 밀도를 포함한다. 예를 들어, 디바이스는 적어도 1,000 개의 웰, 적어도 약 10,0000 개의 웰, 적어도 약 100,000 개의 웰, 또는 적어도 약 1,000,000 개의 웰을 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 구획부(3) 각각은 제1 웰(2)의 가장 가까운 에지로부터 제2 웰(2')의 가장 가까운 에지까지의 길이가 약 20 마이크로미터이고, 상기 제2 웰(2')은 제1 웰(2)로부터 가장 가까운 이웃이다. 실시예들에서, 바람직한 구획부(3) 길이의 범위는 적어도 약 10 마이크로미터 내지 약 30 마이크로미터이고, 바람직하게는 약 15 마이크로미터 내지 약 25 마이크로미터이다.
일 실시예에서, 단일 웰(2)은 수용액(17)의 존재하에서 선택적으로 표적 또는 그 표적(16)의 다수의 카피를 포함한다. 일 실시예에서, 표적(16)은 포유류 세포이고, 수용액(17)은 용액에서 세포의 생존력을 유지하기 위한 해당 세포의 성장 배지이다. 일 실시예에서, 포유류 세포는 인간 세포이다.
일 실시예에서, 표적(16)은 포유류 세포이고, 표적 캡처 요소(5)는 웰 내에서 세포의 이동을 저해하기 위해 세포와 결합하거나 세포와 복합화되는 화합물(중합체 포함)을 포함한다.
일 실시예에서, 각각 수용액을 포함하는 고밀도의 웰을 갖는 분석 디바이스에서 유출(spill-over)을 억제하는 방법으로서,
a) 상기 웰 각각의 에지가 가장 가까운 인접 웰의 가장 가까운 에지로부터 적어도 약 10 마이크로미터 떨어져 있도록 상기 웰을 상기 디바이스 상에 정렬하여 상기 웰(2) 사이에 구획부(3)를 제공함으로써 상기 디바이스 상에 ㎟당 적어도 10 개의 웰의 웰 밀도를 제공하는 단계;
b) 상기 구획부(3)의 적어도 일부에 생체적합성, 소수성 발수 필름 또는 층(4)을 도포하는 단계―상기 필름 또는 층은 디바이스(1)를 구성하는 물질을 덮어 하나의 웰(2)에 있는 수용액의 일부가 인접한 웰(2)로 전달되는 것을 저해함―
를 포함하는, 유출 억제 방법이 제공된다.
일 실시예에서, 웰(2)의 저부 표면의 중앙에 근접하여 배치된 표적(16)의 위치 변경을 저해하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 표적(16)의 위치 변경이 저해되도록 충분한 양의 표적 캡처 요소(5)를 도포하는 단계를 포함한다.
조합 라이브러리에 대한 분석을 수행하기에 적합한 장치가 제공된다. 장치는 분석 디바이스를 포함할 수 있다. 분석 디바이스는 분석 디바이스의 최상부 표면 상에 적어도 10,000 개의 웰을 포함할 수 있다. 적어도 10,000 개의 웰 각각은 수용액에 하나 이상의 비드 및 하나 이상의 표적을 보유하도록 구성된 바닥 벽 및 측벽을 포함할 수 있다. 분석 디바이스는 적어도 10,000 개의 웰 중 제1 웰을 적어도 10,000 개의 웰 중 제2 웰로부터 분리하는 표면 구획부를 포함할 수 있다.
제1 웰의 가장 가까운 에지로부터 제2 웰의 가장 가까운 에지까지 분석 디바이스의 최상부 표면에 따른 거리는 약 10 마이크로미터(㎛) 내지 약 50 ㎛일 수 있다.
제2 웰은 제1 웰에 가장 가까운 인접 웰일 수 있다.
표면 구획부 각각의 적어도 일부는 소수성 층을 포함할 수 있다.
소수성 층은 제1 웰로부터 제2 웰로의 수용액의 유출을 제한하도록 구성될 수 있다.
분석 디바이스는 최상부 표면 영역을 가질 수 있다. 최상부 표면 영역 상의 적어도 10,000 개의 웰의 밀도는 제곱 밀리미터(㎟) 당 적어도 10 개의 웰일 수 있다.
웰 각각은 약 30 ㎛ 내지 약 250 ㎛의 웰 직경을 가질 수 있다. 웰 각각은 약 30 ㎛ 내지 약 400 ㎛의 웰 깊이를 가질 수 있다.
밀도는 ㎟당 적어도 10 개의 웰 내지 ㎟ 당 약 400 개의 웰일 수 있다.
밀도는 ㎟당 약 40 개의 웰 내지 약 150 개의 웰일 수 있다.
제1 웰의 가장 가까운 에지로부터 제2 웰의 가장 가까운 에지까지 최상부 표면에 따른 거리는 약 10 ㎛ 내지 약 30 ㎛일 수 있다.
장치는 포유류 세포를 위한 수성 성장 배지 내에서 유지되는 포유류 세포를 더 포함할 수 있다. 수성 성장 배지는 용액에서 포유류 세포의 생존력을 유지하도록 구성될 수 있다.
수성 성장 배지는 적어도 10,000 개의 웰 중 적어도 하나 웰에서 유지될 수 있다.
포유류 세포는 인간 세포일 수 있다.
표적 캡처 요소는 폴리-D-라이신을 포함할 수 있다.
제1 웰의 가장 가까운 에지로부터 제2 웰의 가장 가까운 에지까지 최상부 표면에 따른 거리는 약 15 ㎛ 내지 약 25 ㎛일 수 있다.
분석 디바이스는 최상부 표면에 적어도 약 100,000 개의 웰을 가질 수 있다.
소수성 층은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌과 프로필렌의 블록 공중합체, 폴리테트라플루오로에틸렌, (트리클로로)옥타데실실란(OTS), 비정질 불소중합체 및 폴리디메틸실록산(PDMS)으로부터 선택된 생물학적 호환성, 소수성 물질을 포함할 수 있다.
적어도 10,000 개의 웰 중 적어도 하나의 웰의 바닥은 포유류 세포를 캡처하는 표적 캡처 요소를 더 포함할 수 있다.
적어도 10,000 개의 웰 중 적어도 하나의 웰의 바닥의 적어도 일부는 친수성일 수 있다.
명세서에는 본 발명의 분석 디바이스의 특정 양태를 예시하는 도면이 제공된다. 이러한 디바이스는 필수 구성요소와 선택적 구성요소를 포함한다. 본 도면들에서 이러한 구성요소들 각각은 참조의 용이성을 위해 번호가 매겨져 있으며, 여러 도면들에서 발견되는 공통 구성요소들은 동일한 번호를 갖는다. 본 명세서에 설명된 구성요소는 제한되지 않으며 예시적인 목적으로만 제공되는 것으로 이해된다. 개별 구성요소의 등가물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 디바이스(1)의 일 실시예의 일부에 대한 단면 개요를 도시한다. 도 1a는 평면도이다. 도 1b는 측면도이다.
도 2a 및 도 2b는 도 1a 및 도 1b에 설명된 디바이스(1)의 일부의 단면을 도시하며, 디바이스(1)는 웰(2), 상기 웰(2) 내의 비드(6), 웰(2) 내의 표적 캡처 요소(5) 및 하나의 웰을 다른 웰과 구분하는 표면의 일부를 형성하는 소수성 발수층(4)을 포함한다. 도 2a는 가장 왼쪽 웰(2)에 비드(6)가 배치되어 있고, 가운데와 가장 오른쪽의 다른 두 웰(2)은 비어 있다(명확성을 위해). 도 2b는 도 2a의 디바이스로서, 가장 오른쪽 웰에 비드(6), 표적(16) 및 용액(17)이 채워져 있는 디바이스를 도시한다. 도 2a에서와 같이, 다른 웰(2)의 내용물은 명확성을 위해 생략한다.
도 2c는 본 명세서에 기술된 디바이스(1)의 일부의 다른 실시예의 단면을 도시한 것으로, 여기서 디바이스(1)는 웰(2), 웰(2) 내의 비드(6), 웰(2) 내의 표적 캡처 요소(5) 및 구획부(3)의 적어도 일부로부터 상방으로 연장되는 소수성 발수층(4)을 포함한다.
도 3은 실리콘 오일과 같은 소수성 액체(18)가 디바이스(1)의 최상부에 도포되어 디바이스 위에 오일 층을 제공함으로써, 하나의 웰로부터 인접한 웰로 유출되는 것을 더욱 억제하는 본 발명의 선택적 양태를 도시한다. 도 3은 또한 소수성 액체(18)를 포함하기 위해 상방으로 연장되는 선택적 벽(28)을 도시한다.
도 4는 본 명세서에 설명된 분석 디바이스의 구획부(3) 상에 소수성 발수 층(4)을 형성하기 위한 하나의 공정을 도시한다.
대규모 조합 라이브러리에 대한 분석을 수행하기 위한 디바이스 및 방법이 개시된다. 그러나, 본 발명을 보다 상세히 설명하기에 앞서, 먼저 다음의 용어들을 정의한다. 정의되지 않은 경우, 본 명세서에서 사용되는 용어는 일반적으로 통용되는 과학적 의미를 갖는다.
본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위한 목적일 뿐이며, 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 달리 명시되지 않는 한, 복수 형태도 포함하는 것으로 의도된다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 이후에 기술되는 이벤트 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생할 수 없으며, 그 설명이 이벤트 또는 상황이 발생하는 경우와 그렇지 않은 경우를 포함한다는 것을 의미한다.
예를 들어, 온도, 시간, 양, 농도 및 범위를 포함하는 기타 수치 지정 앞에 사용될 때, "약"이라는 용어는 (+) 또는 (-) 10 ％, 5 ％, 1 ％ 또는 그 사이의 하위 범위 또는 하위 값에 의해 달라질 수 있는 근사치를 나타낸다. 바람직하게는, "약"이라는 용어는 양이 +/- 10 ％만큼 달라질 수 있음을 의미한다.
"포함하는" 또는 "포함하다"는 조성물 및 방법이 상기 열거된 요소들을 포함하지만, 다른 요소들을 배제하지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다.
조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때, "본질적으로 구성하는"은 명시된 목적을 위해 조합에 본질적으로 중요한 다른 요소들을 제외하는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서에 정의된 요소들로 본질적으로 구성된 조성물은 청구된 발명의 기본적이고 새로운 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.
"구성하는"은 다른 성분의 미량 원소 이상 및 실질적인 방법 단계를 제외하는 것을 의미한다. 이러한 전환 용어 각각에 의해 정의된 실시예는 본 발명의 범위 내에 있다.
"분석 디바이스"라는 용어는 표적에 대해 다수의 테스트 화합물을 동시에 분석할 수 있는 디바이스를 지칭한다. 이러한 디바이스는 복수의 웰을 포함하며, 각각의 개별 웰은 실질적으로 동일한 화합물의 다수의 카피를 포함하는 것이 바람직하다. 디바이스는 빛을 투과하는 물질로 구성된다. 예를 들어, 빛은 디바이스에 노출되거나 디바이스 내부에서 생성될 수 있다. 일 실시예에서, 투과되는 빛은 실질적으로 동일한 화합물의 다수의 카피 각각을 비드에 부착하는 절단 가능한 결합의 적어도 일부가 비드에서 절단되어 웰에 해당 화합물의 농도를 갖는 용액을 생성할 수 있는 파장 및 강도로 이루어진다. 일 실시예에서, 투과되는 빛은 주어진 웰의 분자로부터 생성되는 형광이며, 이러한 분자는 비드에 결합되지 않는 것이 바람직하다. 형광이 디바이스를 통해 투과됨에 따라, 그렇게 생성된 형광은 디바이스 외부에서 검출될 수 있다.
일 실시예에서, 분석 디바이스는 최대 1,000,000 개의 웰, 바람직하게는 최대 약 10,000,000 개의 웰을 포함한다. 일 실시예에서, 분석 디바이스는 약 10,000 개 내지 약 10,000,000 개의 웰을 포함하며, 바람직하게는 약 50,000 개 내지 약 2,000,000 개의 웰을 포함한다. 바람직한 일 실시예에서, 디바이스의 크기는 최대 약 10,000 제곱 밀리미터이다.
"표적"이라는 용어는, 테스트 화합물의 해당 표적에 대한 결합 친화성 및/또는 그러한 결합의 생물학적 결과를 평가하고자 하는 생물학적 물질과 같은 물질을 의미한다. 예시적인 표적은 단일 클론 또는 다클론 항체, 단일 클론 또는 다클론 항체의 단편, 포유류 세포, DNA, RNA, siRNA, 단백질(예를 들어, 융합 단백질, 효소, 사이토카인, 케모카인 등), 바이러스 등을 포함한다. 바람직한 일 실시예에서, 표적은 인간 세포와 같은 포유류 세포이다.
"표적 캡처 요소"라는 용어는 화합물 또는 화합물의 혼합물의 생체적합성 층 또는 필름을 의미한다. 일 실시예에서, 층 또는 필름은 웰 내의 표적 이동을 저해하기에 충분한 강도로 웰의 저부 표면 상의 표적에 결합하거나 복합화한다. 다른 실시예에서, 표적 캡처 요소는 현탁액 또는 용액 내 표적의 무결성을 저해하지 않는 생체적합성 층 또는 필름이다. 다른 실시예에서, 표적과 표적 캡처 요소 사이의 복합체는 1 x 10-3 ㎛ol/μL 미만의 해리 상수(Kd)에 의해 정의된다. 일 실시예에서, 다수의 세포가 단일 웰에 사용되는 경우, 표적 캡처 요소는 세포 응집을 더욱 억제한다.
"방출 가능하게 결합된"이라는 용어는 비드에 결합된 화합물이 결합을 끊는 자극의 적용에 의해 방출될 수 있음을 의미한다. 이러한 결합은 때때로 "절단 가능한" 결합이라고도 한다. 화합물을 방출하는 데 적합한 자극은 사용되는 결합에 따라 다르다. 당 기술에는 이러한 결합의 예와 결합을 끊는 적절한 자극이 풍부하게 기재되어 있다. 절단 가능한 결합의 비제한적인 예로는 pH 변화, 효소 활성, 산화 변화, 산화 환원, 자외선, 적외선, 초음파, 자기장 변화 등에 의해 방출되는 결합이 있다. 이러한 절단 가능한 결합과 이러한 결합을 절단하는 데 필요한 해당 자극에 대한 포괄적인 요약은 문헌 [Taresco, et al., Self-Responsive Prodrug Chemistries for Drug Delivery, Wiley Online Library, 2018] 및 웹 주소 [onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adtp.201800030]에서 확인할 수 있다.
"화합물"이라는 용어는 "시험 화합물"과 상호 교환될 수 있으며, 표적에 대한 결합 친화성 및/또는 그러한 결합의 생물학적 결과에 대해 평가되는 화합물을 의미한다. 이러한 화합물은 일반적으로 특정 표적과 관련된 구조-활성 관계(SAR) 분석의 일부이다. 어떤 화합물이 표적에 결합하거나 결합하지 않는지에 대한 분석은 숙련된 전문가에게 화합물 구조 변화의 결과에 대한 의미 있는 데이터를 제공한다. 마찬가지로, 그러한 결합의 생물학적 결과(또는 활성)를 평가하는 것은, 어떤 구조적 차이가 이러한 생물학적 결과를 변화시키는지에 대한 추가적인 정보를 숙련된 기술자에게 제공한다.
화합물과 관련하여 사용되는 "실질적으로 동일하다"는 용어는 비드 상의 화합물의 대다수가 동일하다는 것을 의미한다. 일 실시예에서, 화합물의 적어도 80 ％가 동일하고, 바람직하게는 적어도 90 ％, 더 바람직하게는 적어도 95 ％가 동일하다. 동일하지 않은 화합물은 일반적으로 비드에서 불완전한 반응의 결과이며, 이러한 화합물은 출발 물질이거나 최종 생성물의 중간체이다. 이러한 화합물은 표적과 의미 있게 상호작용하기에 충분한 구조가 결여된 것으로 예상된다.
"유체"라는 용어는 액체 또는 유동성 분말을 의미한다.
"용량 의존적으로 상기 비드(들)(6)에 방출 가능하게 결합된다"는 용어는 화합물이 절단 가능한 링커를 통해 비드에 결합되며, 여기서 절단은 적정 가능하여 방출되는 화합물의 양을 제어할 수 있다는 것을 의미한다. 일 실시예에서, 절단 가능한 링커에 의해 방출되는 화합물의 양은 동일한 절단 가능한 링커에 의해 동일하거나 다른 비드에 결합된 형광 화합물과 같은 동반 마커의 다수의 카피를 연결하여 평가된다. 비드에 결합되면 절단 불가능한 퀀처 분자가 비드 근처에 부착되어 해당 형광 화합물의 형광을 줄이거나 제거한다. 형광 강도 대 절단제에 의해 비드에서 절단된 형광 화합물의 양(예를 들어, 규정된 파장 및 규정된 강도의 UV 광선)의 표준화된 플롯이 설정된 기간 동안 생성된다. 그런 다음 자외선을 절단 가능한 테스트 화합물을 갖는 테스트 비드와 절단 가능한 형광 화합물을 갖는 비드에 동일하게 적용한다. 그런 다음 형광 강도의 표준화된 플롯에 의해 입증된 형광 화합물의 절단 정도는 방출된 테스트 화합물의 양과 상관관계가 있다. 이러한 방식으로, 일단 테스트 웰당 용액의 양이 알려져 있기 때문에, 방출되는 테스트 화합물의 양을 제어하고 이를 용액 내 테스트 화합물의 농도와 상관시킬 수 있다.
"생체적합성"이라는 용어는 비드, 표적, 표적 캡처 요소, 화합물, mRNA, 사용된 수용액 등을 포함하는(그러나, 이에 제한되지 않음) 디바이스에 사용되는 구성요소 각각과 호환되는 물질을 지칭한다. 표적이 생존 가능한 세포인 경우, 생체적합성 물질은 사용 중에 세포의 생존력을 유지해야 한다. 마찬가지로 단백질, 폴리펩타이드, 항체, DNA, mRNA의 경우 생체적합성 물질은 이러한 구성요소의 기능적 특성을 유지해야 한다.
디바이스
화합물의 매우 큰 조합 라이브러리를 분석하는 능력은 전체 디바이스의 크기 제약과 디바이스의 웰 밀도에 의해 제한된다. 웰의 크기가 감소함에 따라, 제곱 밀리미터당 더 많은 웰을 배치할 수 있는 능력은 증가한다. 그러나 웰 무결성을 위해서는 인접한 웰 사이에 최소한의 거리가 있어야 하므로 이러한 증가에는 한계가 있다. 예를 들어, 웰이 너무 가까우면 하나의 웰의 수용액 일부가 다른 웰로 유출되어 두 웰 모두의 평가가 의심스러워질 수 있다. 일반적으로 웰 사이의 최소 거리는 적어도 약 50 마이크로미터로, 하나의 웰로부터 다른 웰로의 유출을 상당히 줄이거나 방지할 수 있다. 그러나, 이러한 이격 거리는 웰의 고밀도와는 상반된다.
본 명세서에 설명된 장치에서, 웰의 설계는 웰 사이의 소수성 발수 표면 또는 돌출부가 유출을 억제하기 때문에, 웰 사이의 최소 거리를 약 10 마이크로미터 및 약 5 마이크로미터로 감소시키면서 웰의 무결성을 유지할 수 있게 한다. 따라서 제곱 밀리미터당 훨씬 더 많은 웰을 사용할 수 있다. 따라서, 실시예들에서, 웰 분리는 50 마이크로미터 미만, 40 마이크로미터 미만, 30 마이크로미터 미만, 또는 20 마이크로미터 미만일 수 있으며, 각각은 약 5 마이크로미터, 약 10 마이크로미터 또는 약 15 마이크로미터의 최소 분리 거리를 가지며, 상기 인용된 값들 사이의 임의의 값 또는 범위, 그 분수를 포함한다.
웰 각각의 직경은 또한 디바이스 상의 웰의 밀도를 제어한다. 예를 들어, 직경이 약 40 마이크로미터인 웰을 갖는 디바이스는 웰의 직경이 약 150 마이크로미터인 디바이스보다 훨씬 더 큰 웰의 밀도를 허용할 수 있다. 실질적으로, 본 명세서에 설명된 디바이스는 웰을 포함하는 디바이스 표면의 제곱 밀리미터당 적어도 10 개의 웰을 갖는 것과 같이, 웰의 밀도가 높다.
마지막으로, 본 발명의 디바이스는 숙련된 기술자가 쉽게 사용할 수 있는 크기여야 한다. 예를 들어, 종래의 96 개의 웰 플레이트는 약 128 ㎜×85 ㎜(또는 약 7.4 인치×3.3 인치)이다. 이러한 플레이트는 ㎟당 약 0.00885 개의 웰 밀도를 제공한다. 반면, 본 명세서에 설명된 디바이스는 ㎟당 최대 약 400 개의 웰 밀도, 바람직하게는 ㎟당 적어도 10 개의 웰 밀도, 더 바람직하게는 ㎟당 약 40 개 내지 약 150 개의 웰 밀도를 갖는 것으로 고려된다. 실시예에서, 웰은 약 60 내지 150 마이크로미터의 웰 직경을 갖는다. 전체적으로, ㎟당 약 200 개의 웰 밀도는 종래의 96 개 웰 플레이트와 호환되도록 크기를 조정할 때, 2,100,000 개 이상의 웰을 제공한다. 그러나, 약 12 인치(300 ㎜ - X축) 이하 내지 약 12 인치(300 ㎜ - Y축) 이하로 선호되는 최대 크기로 다양한 디바이스 크기가 실현 가능하다. 여기에 설명된 고 웰 밀도 디바이스는 조합 라이브러리의 처리량이 매우 높다.
이제 도 1a 및 도 1b를 참조하면, 두께(100)가 약 1 ㎜이고, 예시된 웰(2) 각각이 약 150 마이크로미터의 최대 직경(105)(최장 축을 따라 측정됨), 약 150 마이크로미터의 웰(2) 깊이(110) 및 하나의 웰의 가장 가까운 에지로부터 가장 가까운 이웃인 제2 웰의 가장 가까운 에지까지 적어도 20 마이크로미터의 거리를 갖는 디바이스(1) 표면의 예시적인 부분을 예시하는 개략도가 제공된다.
보다 일반적으로, 도 1a 및 도 1b의 디바이스(1)는 적어도 약 0.1 ㎜의 상하 두께(100)를 가지며, 그 표면 상에 다수의 웰(2)을 포함한다. 각각의 웰(2)은 직경(105)이 약 30 내지 약 250 마이크로미터, 바람직하게는 약 50 내지 약 150 마이크로미터이다. 각각의 웰(2)은 약 30 내지 약 400 마이크로미터, 바람직하게는 약 150 마이크로미터의 깊이(110)를 갖는다. 이는 웰 직경이 약 150 마이크로미터이고, 깊이가 약 150 마이크로미터인 경우 웰 내의 부피가 2.65 x 106 세제곱 마이크로미터 또는 0.00265 마이크로리터를 제공한다.
본 명세서에 기술된 디바이스는 다수의 생체적합성 물질 중 임의의 생체적합성 물질을 포함할 수 있으며, 여기에는 제온 스페셜티 머티리얼스사(Zeon Specialty Materials, Inc.)(미국 캘리포니아주 산호세)에서 구매 가능한 시클로 올레핀 중합체(COP), 폴리플라스틱스 USA사(Polyplastics USA, Inc.)(미국 미시간주 파밍턴힐스) 등 여러 출처에서 구매 가능한 고리형 올레핀 공중합체(COC), 퍼트남 플라스틱스사(Putnam Plastics)(미국 코네티컷주 데이빌) 등 여러 출처에서 구매 가능한 폴리이미드, 포스터 코포레이션사(Foster Corporation)(미국 코네티컷주 퍼트남) 등 여러 출처에서 구매 가능한 폴리카보네이트, 엣지 엠보싱사(Edge Embossing)(미국 메사추세츠주 메드포드)에서 구매 가능한 폴리디메틸실록산 및 파켐 파인 앤 스페셜티 케미컬스(Parchem Fine & Specialty Chemicals)(미국 뉴욕주 뉴로셸)에서 구매 가능한 폴리메틸메타크릴레이트와 같은 중합체를 포함한다(그러나, 이에 제한되지 않음).
본 발명의 디바이스는 당업자에게 잘 알려진 핫 엠보싱 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있으며, 중합체를 유리 전이 온도 바로 위의 온도로 가열하여 연화시킨 중합체에 패턴을 스탬핑하는 것을 포함한다. 중합체의 후속 냉각은 본 명세서에 설명된 디바이스에 고밀도의 웰을 제공한다. 대안으로, 금형 사출 기술이 사용될 수 있으며 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 생체적합성 중합체의 고체 블록을 레이저 에칭하여 원하는 웰 밀도뿐만 아니라 적절한 크기, 부피 및 형상을 갖는 원하는 수의 웰을 도입할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 다수의 웰(2) 및 웰(2)을 서로 분리하는 구획부(3)를 포함하는 부분적으로 형성된 디바이스(1)의 일부를 예시한다(구획부(3)의 확대도에 대해서는 도 2a 내지 도 2c 참조). 일 실시예에서, 각각의 구획부(3)는 제1 웰(2)에서 가장 가까운 인접 웰(2')까지의 거리가 적어도 약 10 마이크로미터 떨어져 있다. 웰(2) 사이의 이러한 최소 거리는 균일한 수용액(유출 없음)이 각각의 웰(2)에 포함되고 각각의 웰(2)이 비드에 결합된 동일한 테스트 화합물의 다수의 카피를 포함하는 하나 이상의 비드를 포함하도록 웰의 무결성을 보장한다. 바람직한 실시예에서, 구획부(3)는 가장 가까운 이웃 웰로부터 측정된 길이가 약 5, 10 또는 20 마이크로미터이고, 더 바람직하게는 길이가 약 20 마이크로미터에서 약 50 마이크로미터 미만인 길이를 갖는다.
상기와 같이 약 10 마이크로미터 길이의 구획부(3)를 갖는 핫 엠보싱 방법에 의해 웰(2)을 생성할 때, 열가소성 중합체 시트는 상술한 바와 같이 유리 전이 온도보다 약간 높은 온도로 가열된다. 바람직하게는 원하는 밀도로 표면에 균일하게 배치되는 다수의 원형 프롱을 포함하는 스탬프가 선택된다. 각각의 프롱은 위에서 설명한 웰(2)의 크기와 상관관계가 있는 직경과 깊이를 갖도록 크기가 조정된다. 인접한 두 개의 프롱 사이의 거리는 적어도 약 10 마이크로미터이다(즉, 구획부(3)의 두께는 적어도 약 10 마이크로미터이다). 스탬프의 크기는 프롱을 구성하는 부분이 시트의 최상부 표면 내에 맞도록 조정된다. 프롱의 전체 길이가 시트에 가라앉을 수 있도록 스탬프에 충분한 힘이 가해진다. 필요한 힘은 시트의 부드러움 정도에 따라 달라지며 숙련된 장인이 쉽게 확인할 수 있다. 시트가 냉각됨에 따라, 프롱들은 제거되어 도 1a 및 도 1b에 따라 웰(2) 및 구획부(3)를 포함하는 시트를 제공하게 된다.
대안적으로, 도 1a 및 도 1b의 부분적으로 형성된 디바이스(1)는 스탬프의 돌출부에 대응하는 돌출부가 있는 몰드 반쪽(수형 몰드 반쪽)과 디바이스의 베이스를 형성하는 몰드 반쪽(암형 몰드 반쪽)를 형성하는 2 개의 몰드 반쪽을 사용하여 통상적인 사출 성형에 의해 제조될 수 있다. 몰드 반쪽은 도 1a 및 도 1b에 표시된 디바이스(1) 형상의 캐비티를 형성하기 위해 서로 나란히 배치된다. 이 캐비티에 단량체 또는 반응성 올리고머 조성물을 주입한 후 중합하면, 이제 도 1a 및 도 1b에 따른 웰(2) 및 구획부(3)를 포함하는 디바이스(1)가 제공된다.
일 실시예에서, 열 엠보싱 또는 몰드 형성 후에, 통상적인 스퍼터링 기술에 의해 웰(2)의 저부 표면(즉, 웰(2)의 바닥 벽; 도 2a 참조)(8)을 포함하는 디바이스(1)의 최상부 표면에 이산화규소 코팅이 도포될 수 있다. 바람직하게는, 이산화규소 층의 두께는 약 0.5 내지 약 100 나노미터이고, 더 바람직하게는 약 10 내지 50 나노미터이다. 이산화규소 코팅은 발수성, 생체적합성 층(4)과 형성될 표적 캡처 요소(5)를 모두 결합하는 반응성 층을 제공한다.
도 2a, 도 2b 및 도 2c는 구성의 서로 다른 단계 동안의 디바이스(1)의 서로 다른 양태를 예시한다. 예를 들어, 도 2a는 측면 표면(7) 및 저부 표면(8)을 갖는 웰(2)과, 구획부(3)의 최상부 표면을 획정하는 생물학적 호환성, 소수성, 발수 층(4)을 갖는 디바이스(1)를 예시한다. 제1 웰(2)에는 표적 캡처 층(5)과 비드(6)가 도시되어 있다.
도 2b는 웰(2) 내 수용액(17) 내의 표적(16)을 더 포함한다. 그리고, 도 2c는 도 2a에 개시된 것과 다른 생물학적 호환성, 소수성, 발수 층(4)의 대체 형태를 도시한다. 도 2c에서, 발수층(4)은 구획부(3)의 일부에만 형성되며, 상기 구획부(4)의 길이를 줄이기 위해 형성 후 발수층(4)을 레이저 에칭함으로써 형성될 수 있다.
디바이스(1)의 구체적인 구성에 관해서는, 웰(2)의 저부 표면을 포함하여 디바이스(1)의 최상부 표면에 이산화규소 코팅을 도포한 후, 각각의 구획부(3)는 도 4에 예시된 바와 같이, 한 웰에서 다른 웰로 수용액이 유출되는 것을 억제하는 생물학적 호환성, 소수성, 발수층(4)을 포함하도록 수정된다. 발수층(4)은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌과 프로필렌의 블록 공중합체, 폴리테트라플루오로에틸렌, (트리클로로)옥타데실실란(OTS), 비정질 불소중합체(예를 들어, 싸이탑(등록상표(CYTOP®)) 및 폴리디메틸실록산(PDMS) 등과 같은 생물학적 호환성, 소수성, 발수 물질을 포함한다.
생체적합성 발수층(4)은 종래의 코팅 기술에 의해 생성된다. 예를 들어, 도 4의 공정의 단계 1에 도시된 바와 같이, 그러한 기술 중 하나는 디바이스와 호환되는 적절한 용매(예를 들어, 에탄올)에 용해된 생체적합성 발수 물질의 용액을 디스크(24) 상에 도포하는 것을 포함한다. 그런 다음 디스크(24)를 회전시켜(표시되지 않음) 약 1 내지 5 마이크로미터의 얇은 용액막(23)을 생성한다. 회전을 멈춘 다음 도 4의 단계 2에 도시된 대로 디바이스(1)의 최상부 표면을 박막(23) 위에 놓거나 그 안에 넣는다. 디바이스(1)는 단계 3에 도시된 바와 같이 약 1 분 내지 5 분 내에 디스크(24)로부터 분리되고, 그 후 건조되어 약 1 내지 5 마이크로미터 두께의 발수층(4)을 형성한다.
다른 실시예에서, 생체적합성 발수층(4)의 형성은 원하는 두께로 사출 성형에 의해 수행된다. 생체적합성 발수층(4)의 첨가는 각각의 웰의 깊이에 추가되므로, 전술한 웰의 총 깊이는 생체적합성 발수층(4)이 형성된 후의 그 깊이를 지칭하는 것으로 이해된다.
웰(2)의 저부 상에의 표적 캡처(층) 요소(5)의 도포는 도 4, 단계 4 내지 단계 5에 따라 달성된다. 단계 4에서, 표적 캡처 요소(5)는 예시적인 목적으로만 사용되는 폴리-D-라이신(PDL)이다. 예를 들어, 약 0.1 mg/mL의 농도에 도달할 수 있도록 충분한 PDL을 수용액에 용해시킨다. PDL은 다양한 출처에서 구매 가능하다. PDL의 하나의 바람직한 공급원으로서 써모피셔 사이언티픽사(ThermoFisher Scientific)(미국 캘리포니아주 샌디에이고 메사 림 로드 10010)로부터 카탈로그 번호 A389040로 공급된다. 표적 캡처 요소(5)의 다른 예로는 피브로넥틴(fibronectin)(써모피셔 사이언티픽사, 카탈로그 번호: 33016015), 비트로넥틴(vitronectin)(시그마 알드리치사(Sigma Aldrich), 카탈로그 번호: 5051) 등이 있다.
PDL 표적 캡처 요소(5)가 없는 부분적으로 형성된 디바이스(1)는 도 4의 단계 4에 도시된 바와 같이 PDL 용액을 포함하는 용기에 침지된다. 침지는 약 1 시간 동안 계속된다. 그런 다음 도 4의 단계 E에 도시된 바와 같이 디바이스(1)를 제거한 후 건조시킨다. 디바이스(1)의 최상부 표면의 소수성 코팅은 그 표면에 PDL의 증착을 억제하여 웰(2)의 저부 표면(8) 및 웰(2)의 측벽(7)에 표적 캡처 요소를 제공한다.
표적 캡처 요소(5)는 웰(2)의 저부 표면(8)과 생물학적으로 호환되며, 일단 증착되면 표적 위치 변경을 저해하도록 증착 부위에서 표적(17)에 부착되거나, 표적(1)이 용액에 있거나 현탁액일 때 표적(1)과 생물학적으로 호환된다. 소수성의 영역이 허용되기는 하지만, 표적 캡처 요소(5)의 전반적인 특성은 친수성인 것이 바람직하다. 일 실시예에서, 표적 캡처 요소(5)는 웰(2)의 저부 표면(8) 및 그 위에 증착된 표적(17)에 부착되도록 선택된다. 표적 캡처 요소(5)는 폴리(아미노산), DNA, RNA, siRNA, 항체, 항체 단편, 단백질, 폴리펩티드 등과 같은 물질을 포함한다. 특정 표적 캡처 요소(5)는 사용되는 표적(16)에 대해 선택되며, 이러한 선택은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일 실시예에서, 표적(16)은 인간 헬라 세포와 같은 포유류 세포이고, 표적 캡처 요소(5)는 D-라이신(PDL)의 중합체이다. 약 1 x 109 내지 약 1 x 1014의 라이신 잔기를 갖는 D-라이신 중합체가 바람직하다.
생체적합성 발수층(4)이 표적 캡처 요소(5)와 함께 사용될 때, 본 명세서에 설명된 디바이스(1)는 전자기 에너지 검출 수단(예를 들어, 빛)을 사용하여 웰(2)에 침착된 세포의 재현 가능한 검출을 유지할 뿐만 아니라 제곱 밀리미터당 웰의 매우 높은 밀도를 허용한다. 본 명세서에 기술된 생체적합성 발수층(4)의 존재는 인접한 웰에서 수용액이 유출되는 것을 억제하거나 제거한다.
표적 캡처 요소(5)의 존재는, 웰(2)의 저부에 근접하거나 중앙에 증착된 표적의 모서리로의 위치 변경과 관련된 문제를 제거하는 데 도움이 된다. 그렇게 위치 변경되면, 표적(5)에 적용되고 표적(5)에서 회수되는 전자기 에너지의 적용 및 판독의 신뢰성이 떨어진다.
바람직하게는, 표적 캡처 요소(5)는 정전기, 친수성(예를 들어, 수소 결합), 소수성 및 반 데르 발 힘을 포함하는 비공유 상호 작용에 의해 표면(8)에 침착하는 표적(1)에 결합한다. 이러한 결합은 평형 해리 상수(Kd - 때때로 KD라고도 함)로 측정할 수 있으며, 값이 낮을수록 더 강한 결합 상호작용과 상관관계가 있다. 일 실시예에서, 표적 캡처 요소(5)는 웰(2) 내에서 표적(1)의 위치 변경을 저해하기에 충분한 해리 상수를 갖는 표적(1)에 결합한다. 바람직하게는, 표적 캡처 요소에 대한 표적의 결합은 약 1 x 10-3 이하, 더 바람직하게는 약 1 x 10-5 ㎛ol/μL 이하의 Kd를 제공한다.
상기 공정은 분석 디바이스(1)를 형성하는 방법을 제공하며, 상기 디바이스는 다수의 웰(2)을 포함한다. 이 방법은,
a) 생체적합성 열가소성 물질을 유리 전이 온도 바로 위까지 가열하여 상기 물질을 연화시키는 단계;
b) 상기 가열된 물질의 표면에 스탬프를 적용하는 단계―상기 스탬프는 다수의 프롱(prong)을 포함하며, 각각의 프롱은 형성될 웰(2)의 크기와 연관된 직경 및 깊이를 가지도록 크기 조정되고, 인접한 임의의 두 프롱 사이의 거리는 적어도 약 10 마이크로미터임―;
c) 스탬프에 충분한 압력을 가하여 프롱의 전체 길이가 시트에 가라앉도록 한 다음 후속하여 제거되어, 각각의 웰을 인접한 웰(2)로부터 분리하는 구획부(3)를 갖고 저부 표면(8) 및 측면 표면(7)을 갖는 웰(2)을 제공하는 단계;
d) 선택적으로, 웰(2) 및 구획부(3)의 노출된 표면에 이산화규소의 층을 도포하는 단계;
e) 생체적합성, 발수성, 소수성 물질(4)의 층을 구획부(3)에 도포하는 단계; 및
f) 웰(2)의 저부 표면에 표적 캡처 요소(5)의 층을 도포하는 단계
를 포함하고,
이로써, 하나의 웰(2)로부터 인접한 웰(2)로 수용액(17)이 유출되는 것을 억제할 수 있는 동시에 웰(2)에 침착된 표적이 상기 웰(2) 내에서 이동하는 것을 저해할 수 있는 디바이스(1)를 제공한다.
도 3에 예시된 다른 실시예에서, 디바이스(1)의 외부 에지(28)는 물보다 밀도가 낮은 소수성 유체층(18)의 추가를 허용하기 위해 약간 상방으로 연장된다. 이 층(18)은 테스트 결과에 영향을 줄 수 있는 먼지, 꽃가루 등과 같은 오염 물질에 의한 웰(2)의 오염을 방지할 뿐만 아니라 유출을 방지하는 추가적인 보호 기능을 제공한다. 소수성 유체(18)는 생체적합성이며 25℃에서 밀도가 세제곱 센티미터당 0.99그램 미만이므로 유체가 수용액 위에 층을 형성한다. 한 가지 바람직한 소수성 유체(18)는 실리콘 오일로, 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마알드리치사(SigmaAldrich, Inc.)와 같은 많은 상업적 공급업체로부터 입수 가능하다. 소수성 유체(18)는 디바이스(1) 위에 위치하여 하나의 웰(2)에서 다른 웰(2)로 수용액(17)을 유출시키지 않는 방식으로 유체의 미스트를 도포하는 디스펜서를 포함하여 임의의 방식으로 도포할 수 있다. 소수성 유체층(18)을 제공하는 한 가지 수단은 발명의 명칭이 "분석 디바이스용 캡"인 미국 출원 제16/774,875호(대리인 안건 번호 057698-503F01US)에 나와 있다. 도 3에 따르면, 디바이스에 선택적 벽(28)을 제공하고, 채워진 웰(2) 위에 소수성 액체(18)를 배치하는 것을 포함하는 유출 및 증발을 방지하는 방법이 제공된다.
다음 실시예는 예시적인 목적으로만 제공되며, 청구된 발명에 대한 어떠한 제한도 구성하지 않는다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 온도는 섭씨 온도이고, 달리 명시되지 않는 한 모든 조건은 대기압이다. 이 예에서 다음 약어는 다음과 같은 의미를 갖는다:
mL = 밀리리터
㎜ = 밀리미터
㎟ = 제곱 밀리미터
OTS = 트리클로로(옥타데실)실란
PMMA = 폴리메틸 메타크릴산
rpm = 분당 회전 수
μL = 마이크로리터
㎛ = 마이크로미터
예 1 - 디바이스(1)의 형성
76 ㎜(X축) x 50 ㎜(Y축) x 1 ㎜(Z축) 크기의 열가소성 PMMA 시트(영국 빌링햄 소재의 루사이트 인터내셔널 카셀 웍스사(Lucite International Cassel Works)로부터 입수 가능함)를 약 125 ℃의 유리 전이 온도(Tg)보다 약간 높은 온도로 가열하여 플라스틱을 연화시킨다. 표면에 4 열로 균일하게 배치된 여러 개의 원형 프롱을 포함하는 스탬프가 선택되며, 각각의 열의 밀도는 ㎟당 약 40 개의 프롱이다. 프롱의 각각의 열은 길이가 대략 50 ㎜이고, 폭이 7 ㎜이다.
각각의 프롱의 직경은 약 150 ㎛이고, 베이스로부터 프롱의 끝까지의 깊이는 약 150 ㎛이다. 인접한 두 개의 프롱 사이의 거리는 약 20 ㎛이다. 스탬프의 크기는 프롱의 열 각각이 시트의 최상부 표면에 맞도록 조정된다. 스탬프에 충분한 힘을 가하여 프롱의 전체 길이가 시트의 최상부 표면에 가라앉도록 한다. 필요한 힘은 시트의 부드러움 정도에 따라 다르며 숙련된 장인이 쉽게 확인할 수 있다. 시트가 냉각됨에 따라 프롱이 제거되어 도 1에 표시된 것처럼 웰(2)과 구획부(3)를 갖는 부분적으로 형성된 디바이스(1)를 제공한다.
웰(2) 및 구획부(3)를 갖는 디바이스(1)는 당업자에게 잘 알려진 종래의 스퍼터링 기술에 의해 이산화규소(SiO2)의 박막층으로 코팅된다. 스퍼터링 공정은 약 30 나노미터 두께의 이산화규소 막이 형성될 때까지 계속된다. 이 필름의 목적은 소수성 발수층(4)과 표적 캡처 요소(5)의 디바이스(1)에 대한 접착력을 향상시키는 데 사용된다.
디바이스(1)를 준비하는 다음 단계는 도 4에 예시된다.
도 4는 부분적으로 형성된 디바이스(1)의 최상부 표면에 이산화규소 층이 제 위치에 있는 발수 요소(3)가 형성되는 것을 예시한다. 구체적으로, 회전 가능한 디스크(24)를 스피너에 배치하고 약 25 마이크로몰 농도의 에탄올에 OTS 용액을 도포한다. 스피너가 시동되고 약 1000 rpm의 속도로 회전한다. 용액(23)이 디스크에 균일하게 증착될 때까지 회전을 계속한다. 전형적으로, 회전은 약 1 분 미만 동안 계속된 후 정지되고, 용액(23)의 두께는 약 0.1 마이크로미터 내지 약 2 마이크로미터이다.
도 4의 단계 2에서, 부분적으로 형성된 디바이스(1)의 최상부 표면은 현재 정지된 디스크(24) 상의 용액(23) 내에 배치되고, 최대 약 5 분 동안 유지된다. 도 4의 단계 3에서, 부분적으로 형성된 디바이스(1)는 디스크에서 제거된 후 건조되어 약 1 내지 2 마이크로미터 두께의 발수층(4)을 형성한다.
도 4의 단계 4는 웰(2)의 저부 표면에의 표적 캡처 요소(6)의 형성을 예시한다. 도 4의 단계 4에서, 용기(25)는 카탈로그 번호 A389040로서 미국 캘리포니아주 샌디에이고 메사 림 로드 10010 소재의 써모피셔 사이언티픽사로부터 얻은 폴리-D-라이신 용액(26)으로 채워져 있다. 예를 들어, 약 0.1 mg/mL의 농도에 도달하도록 충분한 PDL이 수용액에 용해된다. PDL 표적 캡처 요소(5)가 없는 부분적으로 형성된 디바이스(1)를 PDL 용액(26)을 포함하는 용기에 침지시킨다. 침지는 약 1 시간 동안 계속된다. 그런 다음 디바이스(1)를 제거한 다음 도 4의 단계 5에 따라 건조시킨다. 디바이스(1)의 최상부 표면의 소수성 코팅은 그 표면에 PDL의 침착을 억제하여 웰(2)의 저부 표면(8) 및 웰(2)의 측벽(7)에 표적 캡처 요소(4)를 제공한다.
상기 예는 예시적인 목적으로만 제공되며, 제한되지 않는다. 다른 기술들이 디바이스(1)를 형성하는 데 사용될 수 있다.

Claims (39)

  1. 정렬된 고밀도의 웰(2)을 포함하는 분석 디바이스(1)로서,
    상기 웰(2)은 각각,
    a) 수용액(17)에 하나 이상의 비드(6) 및 하나 이상의 표적(16)을 보유하도록 구성된 바닥 벽(8) 및 측벽(7);
    b) 인접한 웰(2)을 서로 분리하는 구획부(3)―상기 구획부 각각은 제1 웰(2)의 가장 가까운 에지로부터 제2 웰(2')의 가장 가까운 에지까지의 길이가 적어도 약 10 마이크로미터이고, 상기 제2 웰(2')은 제1 웰(2)로부터 가장 가까운 이웃임―;
    를 포함하고,
    각각의 웰(2)은 하나 이상의 비드(6)를 보유하고, 하나 이상의 비드(6) 각각은 용량 의존적으로 상기 하나 이상의 비드(6)에 방출 가능하게 결합되는 단일 화합물의 다수의 카피를 포함하고, 추가로 상기 하나 이상의 비드(6) 각각은 mRNA 캡처 성분을 더 포함하고;
    상기 바닥 벽(8)은, 상기 표적(16)을 캡처하고 상기 표적(16)을 배치한 후 웰(2) 내에서의 표적 이동을 저해할 수 있는 결합된 표적 캡처 요소(5)를 더 포함하며; 그리고
    상기 구획부(3)의 적어도 표면 부분은 소수성 발수층(4)을 포함하고, 소수성 발수층(4)은 구획부에 통합되고 구획부의 표면을 둘러싸거나 구획부의 표면으로부터 연장되는, 분석 디바이스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 디바이스는 제곱 밀리미터당 적어도 10 개 웰의 웰 밀도를 갖는, 분석 디바이스.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 디바이스는 제곱 밀리미터당 약 10 내지 400의 웰 밀도를 갖는, 분석 디바이스.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 표적은 수용액에 유지되는, 분석 디바이스.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 표적은 포유류 세포이고, 상기 수용액은 용액에서 세포의 생존력을 유지하기 위한 해당 세포의 성장 배지인, 분석 디바이스.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 포유류 세포는 인간 세포인, 분석 디바이스.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 표적 캡처 요소는 폴리-D-라이신을 포함하는, 분석 디바이스.
  8. 정렬된 고밀도의 웰(2)을 포함하는 분석 디바이스(1)로서,
    상기 웰(2)은 각각,
    a) 수용액(17)에 하나 이상의 비드(6) 및 하나 이상의 표적(16)을 보유하도록 구성되는 바닥 벽(8) 및 측벽(7)―개별 웰(2) 내 하나 이상의 비드(6)는 상기 하나 이상의 비드(6)에 방출 가능하게 결합되는 단일 화합물의 다수의 카피를 포함하고, 상기 단일 화합물은 용량 의존적으로 방출 가능하며, 추가로 상기 하나 이상의 비드(6) 각각은 mRNA 캡처 성분을 포함함―;
    b) 인접한 웰(2)을 서로 분리하는 구획부(3)―상기 구획부(3) 각각은 제1 웰(2)의 가장 가까운 에지로부터 제2 웰(2')의 가장 가까운 에지까지의 길이가 적어도 약 10 마이크로미터이고, 상기 제2 웰(2')은 제1 웰(2)로부터 가장 가까운 이웃임―
    를 포함하고,
    상기 바닥 벽(8)은, 상기 표적(16)을 캡처하고 상기 표적(16)을 배치한 후 웰(2) 내에서의 표적 이동을 저해하는 표적 캡처 요소(5) 포함하고; 그리고
    추가로, 상기 구획부(3)의 적어도 표면 부분은 소수성 발수층(4)을 포함하고, 소수성 발수층(4)은 구획부에 통합되거나 구획부로부터 상방으로 연장되고, 상기 수용액이 실질적으로 존재하지 않는, 분석 디바이스.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 디바이스는 제곱 밀리미터당 적어도 10 개 웰의 웰 밀도를 갖는, 분석 디바이스.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 디바이스는 제곱 밀리미터당 약 10 내지 400의 웰 밀도를 갖는, 분석 디바이스.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 표적은 수용액에 유지되는, 분석 디바이스.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 표적은 포유류 세포이고, 상기 수용액은 용액에서 세포의 생존력을 유지하기 위한 해당 세포의 성장 배지인, 분석 디바이스.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 포유류 세포는 인간 세포인, 분석 디바이스.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 표적 캡처 요소는 폴리-D-라이신을 포함하는, 분석 디바이스.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 비드는 mRNA 캡처 성분을 더 포함하는, 분석 디바이스.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 다바이스는 제곱 밀리미터당 적어도 10 개 웰의 웰 밀도를 갖는, 분석 디바이스.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 디바이스는 제곱 밀리미터당 약 10 내지 400의 웰 밀도를 갖는, 분석 디바이스.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 표적은 수용액에 유지되는, 분석 디바이스.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 표적은 포유류 세포이고, 상기 수용액은 용액에서 세포의 생존력을 유지하기 위한 해당 세포의 성장 배지인, 분석 디바이스.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 포유류 세포는 인간 세포인, 분석 디바이스.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 표적 캡처 요소는 폴리-D-라이신을 포함하는, 분석 디바이스.
  22. 각각 수용액을 포함하는 고밀도의 웰을 갖는 분석 디바이스에서 유출(spill-over)을 억제하는 방법으로서,
    a) 상기 웰 각각의 에지가 가장 가까운 인접 웰의 가장 가까운 에지로부터 적어도 20 마이크로미터 떨어져 있도록 상기 웰을 상기 디바이스 상에 정렬하여 상기 웰 사이에 구획부를 제공함으로써 상기 디바이스 상에 ㎟당 적어도 10 개의 웰의 웰 밀도를 제공하는 단계;
    b) 상기 구획부의 적어도 일부에 생체적합성, 소수성 발수 필름 또는 층을 도포하는 단계―상기 필름 또는 층은 달리 상기 디바이스를 구성하는 물질을 덮어 하나의 웰에 있는 수용액의 일부가 인접한 웰로 전달되는 것을 저해함―
    를 포함하는, 유출 억제 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 웰의 저부는 표적 위치 변경이 저해되도록 충분한 양의 표적 캡처 요소를 더 포함하는, 유출 억제 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    하나 이상의 비드(6)에 방출 가능하게 결합된 단일 화합물의 다수의 카피를 포함하는 하나 이상의 비드를 도입하는 단계를 더 포함하고, 상기 화합물은 용량 의존적으로 방출 가능하며, 추가로 상기 하나 이상의 비드(6) 각각은 RNA 캡처 성분을 포함하는, 유출 억제 방법.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 웰 각각 내에 표적을 도입하는 단계를 더 포함하는, 유출 억제 방법.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 웰 각각 내에 하나 이상의 비드 및 표적을 도입한 후, 웰 위에 소수성 액체를 도포하는 단계를 더 포함하며, 상기 소수성 액체는 물보다 밀도가 낮은, 유출 억제 방법.
  27. 다수의 웰(2)을 포함하는 분석 디바이스(1)를 형성하는 방법으로서,
    a) 생체적합성 열가소성 물질을 유리 전이 온도 바로 위까지 가열하여 상기 물질을 연화시키는 단계;
    b) 상기 가열된 물질의 표면에 스탬프를 적용하는 단계―상기 스탬프는 다수의 프롱(prong)을 포함하며, 각각의 프롱은 형성될 웰(2)의 크기와 연관된 직경 및 깊이를 가지도록 크기 조정되고, 인접한 임의의 두 프롱 사이의 거리는 적어도 약 10 마이크로미터임―;
    c) 스탬프에 충분한 압력을 가하여 프롱의 전체 길이가 시트에 가라앉도록 한 다음 후속하여 제거되어, 각각의 웰을 인접한 웰(2)로부터 분리하는 구획부(3)를 갖고 저부 표면(8) 및 측면 표면(7)을 갖는 웰(2)을 제공하는 단계;
    d) 선택적으로, 웰(2) 및 구획부(3)의 노출된 표면에 이산화규소의 층을 도포하는 단계;
    e) 생체적합성, 발수성, 소수성 물질(4)의 층을 구획부(3)에 도포하는 단계; 및
    f) 웰(2)의 저부 표면에 표적 캡처 요소(5)의 층을 도포하는 단계
    를 포함하고,
    이로써, 하나의 웰(2)로부터 인접한 웰(2)로 수용액(17)이 유출되는 것을 억제할 수 있는 동시에 웰(2)에 침착된 표적이 상기 웰(2) 내에서 이동하는 것을 저해할 수 있는 디바이스(1)를 제공하는, 분석 디바이스 형성 방법.
  28. 조합 라이브러리에 대한 분석을 수행하기에 적합한 장치로서,
    최상부 표면에 적어도 10,000 개의 웰을 포함하는 분석 디바이스―적어도 10,000 개의 웰 각각은 수용액에 하나 이상의 비드 및 하나 이상의 표적을 보유하도록 구성된 바닥 벽 및 측벽을 포함함―; 및
    적어도 10,000 개의 웰 중 제1 웰을 적어도 10,000 개의 웰 중 제2 웰로부터 분리하는 표면 구획부
    를 포함하고,
    상기 제1 웰의 가장 가까운 에지로부터 상기 제2 웰의 가장 가까운 에지까지 분석 디바이스의 최상부 표면을 따른 거리가 약 10 마이크로미터(㎛) 내지 약 50 ㎛이고,
    상기 제2 웰은 제1 웰에 가장 인접한 웰이고,
    상기 표면 구획부 각각의 적어도 일부가 소수성 층을 포함하고,
    상기 소수성 층은 상기 제1 웰로부터 상기 제2 웰로의 수용액의 유출을 제한하도록 구성되고,
    상기 분석 디바이스는 최상부 표면적을 가지며, 상기 상부 표면적에 있는 적어도 10,000 개의 웰의 밀도는 제곱 밀리미터(㎟)당 적어도 10 개의 웰이고, 및
    상기 웰 각각의 웰 직경은 약 30 ㎛ 내지 약 250 ㎛이고, 웰 깊이는 약 30 ㎛ 내지 약 400 ㎛인, 장치.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 밀도는 ㎟당 적어도 10 개의 웰 내지 ㎟당 약 400 개의 웰인, 장치.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 밀도는 ㎟당 약 40 개의 웰 내지 ㎟당 약 150 개의 웰인, 장치.
  31. 제28항에 있어서,
    상기 제1 웰의 가장 가까운 에지로부터 상기 제2 웰의 가장 가까운 에지까지 상기 최상부 표면을 따른 거리는 약 10 ㎛ 내지 약 30 ㎛인, 장치.
  32. 제28항에 있어서,
    상기 장치는, 포유류 세포를 위한 수성 성장 배지에서 유지되는 포유류 세포를 더 포함하고,
    상기 수성 성장 배지는 용액에서 포유류 세포의 생존력을 유지하도록 구성되고, 그리고
    상기 수성 성장 배지는 적어도 10,000 개의 웰 중 적어도 하나의 웰에서 유지되는, 장치.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 포유류 세포는 인간 세포인, 장치.
  34. 제32항에 있어서,
    상기 표적 캡처 요소는 폴리-D-라이신을 포함하는, 장치.
  35. 제31항에 있어서,
    상기 제1 웰의 가장 가까운 에지로부터 상기 제2 웰의 가장 가까운 에지까지 최상부 표면을 따른 거리는 약 15 ㎛ 내지 약 25 ㎛인, 장치.
  36. 제28항에 있어서,
    상기 분석 디바이스는 상기 최상부 표면에 적어도 약 100,000 개의 웰을 갖는, 장치.
  37. 제28항에 있어서,
    상기 소수성 층은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌과 프로필렌의 블록 공중합체, 폴리테트라플루오로에틸렌, (트리클로로)옥타데실실란(OTS), 비정질 불소중합체 및 폴리디메틸실록산(PDMS)으로부터 선택된 생물학적 호환성, 소수성 물질을 포함하는, 장치.
  38. 제32항에 있어서,
    적어도 10,000 개의 웰 중 적어도 하나의 웰의 바닥은 포유류 세포를 캡처하는 표적 캡처 요소를 더 포함하는, 장치.
  39. 제28항에 있어서,
    적어도 10,000 개의 웰 중 적어도 하나의 웰의 바닥의 적어도 일부가 친수성인, 장치.
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