CN117430599A - 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 - Google Patents

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 Download PDF

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CN117430599A
CN117430599A CN202310542567.0A CN202310542567A CN117430599A CN 117430599 A CN117430599 A CN 117430599A CN 202310542567 A CN202310542567 A CN 202310542567A CN 117430599 A CN117430599 A CN 117430599A
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CN202310542567.0A
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张雁
杨圣伟
鲍军
刘鹏宇
唐锋
王峰
彭少平
唐任宏
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Nanjing Zaiming Pharmaceutical Co ltd
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Nanjing Zaiming Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本申请提供了一类作为CDK2/4/6抑制剂的式(I)所示化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐，

Description

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂
本发明要求2022年5月16日向中国国家知识产权局提交的，专利申请号为202210533098.1，发明名称为“细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂”，以及2022年7月13日向中国国家知识产权局提交的，专利申请号为202210820385.0，发明名称为“细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂”的在先申请的优先权。上述在先申请的全文通过引用的方式结合于本发明中。
技术领域
本公开属于医药技术领域，涉及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂化合物或其光学异构体、药学上可接受的盐，含有它们的药物组合物以及作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的用途。
背景技术
肿瘤的发生与多种癌基因和抑癌基因的失衡有关。几乎所有癌基因、抑癌基因的功能效应，最终都会汇聚到细胞周期上来。因此，可以说肿瘤是一类细胞周期性疾病(CellCycle Disease，CCD)，调节或阻断细胞周期是治疗肿瘤的途径之一。目前，已发现的与细胞周期调控有关的分子很多，其中细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-Dependent-Kinases，CDKs)是细胞周期调控网络的核心分子。
细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinases,CDKs)是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，CDK通过对丝氨酸/苏氨酸蛋白的化学作用驱动细胞周期，和周期蛋白协同作用，是细胞周期调控中的重要因子。
在参与细胞周期的CDK亚型中，CDK4/6发挥着不可替代的作用，其中癌症有关的细胞周期突变主要存在于G1期和G1/S期转化过程中，CDK4/6与CyclinD结合形成有激酶活性的复合物，通过抑癌基因Rb产物pRb磷酸化，释放结合的转录因子E2F，启动与S期有关的基因转录，促使细胞通过检验点，并从G1期向S期转移。而CDK2的过表达与细胞周期的异常调节有关，细胞周期蛋白E/CDK2复合物在调节G1/S转换、组蛋白生物合成和中心体复制中也起重要作用。
虽然现有文献中也报道了一些CDK2/4/6小分子抑制剂用于治疗癌症，但仍有大量的患者无法得到满意的临床治疗效果。鉴于此，本公开在现有技术基础上创造性地设计了系列化合物，提供一系列结构新颖、药效优良、生物利用度高、成药性好的CDK2/4/6抑制剂，并用于有效治疗CDK2/4/6介导的疾病，包括但不限于癌症等。
发明内容
本公开提供式(I)所示化合物及其药学上可接受的盐。这些化合物可以抑制CDK(包括CDK2、CDK4和/或CDK6)的活性，从而影响生物学功能。
一种式(I)所示化合物、或其立体异构体或其药学上可接受的盐，
其中，
R1选自C2-C6炔基；
R2、R3独立地选自H、氘、C1-C6烷基或C1-C6氘代烷基；
R4、R5独立地选自卤素、CN、NH2、OH、C1-C6烷基、C1-C6氟烷基、C1-C6烷氧基或C3-C8环烷基；或者由R4、R5及其连接的C共同形成C3-C5环烷基；
R6选自卤素、CN、NH2、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或C3-C8环烷基，所述C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或C3-C8环烷基任选地被F、OH、NH2或C1-C3烷基取代；
R7选自氘、卤素、OH、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、C1-C6氘代烷基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、3-10元杂环基或5-10元杂芳基，所述C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、3-10元杂环基或5-10元杂芳基任选地被Rc取代；
Rc选自F、Cl、Br、OH、CN、-N(CH3)2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C6-C10芳基、3-10元杂环基、C3-C8环烷基或5-10元杂芳基；
R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16独立地选自H、氘、卤素、NH2、OH、C1-C6烷基或C1-C6氘代烷基；
且R2、R3、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16中至少一个选自氘或者C1-C6氘代烷基；
p、n、m独立地选自0、1、2或3。
在一些实施方案中，R1选自乙炔基或者丙炔基。
在一些实施方案中，R1选自乙炔基。
在一些实施方案中，R2独立地选自H、氘、甲基或CD3。
在一些实施方案中，R2独立地选自H、氘或CD3。
在一些实施方案中，R3独立地选自H或氘。
在一些实施方案中，R3独立地选自H。
在一些实施方案中，R4、R5独立地选自卤素、CN、NH2、OH或C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R4、R5独立地选自OH或C1-C6烷基。
在一些实施方案中，R4、R5独立地选自OH或CH3。
在一些实施方案中，R6选自CN、NH2、OH、C1-C6烷基或C3-C8环烷基。
在一些实施方案中，R7独立地选自卤素、OH、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-S(O)2Rc、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C6-C10芳基、4-7元杂环基或5-6元杂芳基，所述C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C6-C10芳基、4-7元杂环基或5-6元杂芳基任选地被Rc取代。
在一些实施方案中，R7独立地选自C1-C6氘代烷基、C1-C6烷基、C3-C8环烷基或3-10元杂环基，所述C1-C6烷基、C3-C8环烷基或3-10元杂环基任选地被Rc取代。
在一些实施方案中，R7独立地选自C1-C6烷基、C3-C8环烷基或3-10元杂环基，所述C1-C6烷基、C3-C8环烷基或3-10元杂环基任选地被Rc取代。
在一些实施方案中，R7独立地选自甲基、环丙基或哌嗪基，所述甲基、环丙基或哌嗪基任选地被Rc取代。
在一些实施方案中，R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16独立地选自H、氘、卤素或C1-C6氘代烷基。
在一些实施方案中，R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16独立地选自H、氘或卤素。
在一些实施方案中，R2、R3、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16中至少一个选自氘或者C1-C6氘代烷基。
在一些实施方案中，R2、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16中至少一个选自氘或者C1-C6氘代烷基。
在一些实施方案中，R2、R3、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16中至少一个选自氘或者氘代甲基。
在一些实施方案中，Rc选自C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Rc选自甲基。
在一些实施方案中，p选自0、1或2。
在一些实施方案中，p选自0。
在一些实施方案中，n、m独立地选自0或1。
在一些实施方案中，n选自1，m选自0。
在一些实施方案中，式(I)所示化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐选自式(II)所示化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐，
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16如上文定义。
在一些实施方案中，所述式(I)所示化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐选自以下化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐：
另一方面，本申请还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含式(I)所示化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。
还一方面，本申请涉及式(I)所示化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐，或其药物组合物在制备用于预防或治疗由CDK2/4/6介导的疾病药物中的用途。
还一方面，本申请涉及式(I)所示化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐，或其药物组合物在预防或治疗由CDK2/4/6介导的疾病中的用途。
还一方面，本申请涉及用于预防或治疗由CDK2/4/6介导的疾病的式(I)所示化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐，或其药物组合物。
还一方面，本申请还涉及治疗由CDK2/4/6介导的疾病的方法，该方法包括给以个体治疗上有效剂量的包含本申请的式(I)所示化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐的药物组合物。
另一方面，本申请提供式(I)所示化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐、或其药物组合物在制备用于预防或者治疗癌症的药物中的用途。
另一方面，本申请提供式(I)所示化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐、或其药物组合物在预防或者治疗癌症中的用途。
另一方面，本申请提供用于预防或者治疗癌症的式(I)所示化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。
另一方面，本公开提供治疗癌症的方法，该方法包括给以个体治疗上有效剂量的包含式(I)化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。
在本申请的一些实施方案中，所述癌症例如为实体瘤、腺癌或血液学癌症，如乳腺癌或卵巢癌。
术语定义和说明
除非另有说明，本公开中所用的术语具有下列含义，本公开中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、示例性的定义、优选的定义、表格中记载的定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
本文中消旋体或者对映体纯的化合物的图示法来自Maehr，J.Chem.Ed.1985，62:114-120。除非另有说明，用楔形键和虚楔键(和/>)表示一个立体中心的绝对构型，用黑实键和虚键(/>和/>)表示一个立体中心的相对构型(如脂环化合物的顺反构型)。
术语“互变异构体”是指因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团异构体。本公开化合物可表现出互变异构现象。互变异构的化合物可以存在两种或多种可相互转化的种类。互变异构体一般以平衡形式存在，尝试分离单一互变异构体时通常产生一种混合物，其理化性质与化合物的混合物是一致的。平衡的位置取决于分子内的化学特性。例如，在很多脂族醛和酮如乙醛中，酮型占优势；而在酚中，烯醇型占优势。本公开包含化合物的所有互变异构形式。
术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，包括顺反异构体、对映异构体和非对映异构体。
本公开的化合物可以具有不对称原子如碳原子、硫原子、氮原子、磷原子或不对称双键，因此本公开的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。特定的几何或立体异构体形式可以是顺式和反式异构体、E型和Z型几何异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，以及其外消旋混合物或其它混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，以上所有这些异构体以及它们的混合物都属于本公开化合物的定义范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子、不对称硫原子、不对称氮原子或不对称磷原子，所有取代基中涉及到的这些异构体以及它们的混合物，也均包括在本公开化合物的定义范围之内。本公开的含有不对称原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来，光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。
术语“被取代”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为氧代(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代，氧代不会发生在芳香基上。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，乙基“任选”被卤素取代，是指乙基可以是未被取代的(CH2CH3)、单取代的(CH2CH2F、CH2CH2Cl等)、多取代的(CHFCH2F、CH2CHF2、CHFCH2Cl、CH2CHCl2等)或完全被取代的(CF2CF3、CF2CCl3、CCl2CCl3等)。本领域技术人员可理解，对于包含一个或多个取代基的任何基团，不会引入任何在空间上不可能存在和/或不能合成的取代或取代模式。
当任何变量(例如Ra、Rb)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。例如，如果一个基团被2个Rb所取代，则每个Rb都有独立的选项。
当一个连接基团的数量为0时，比如-(CH2)0-，表示该连接基团为键。
当一个取代基的键交叉连接到一个环上的两个原子时，这种取代基可以与这个环上的任意原子相键合。例如，结构单元表示R5可在苯环上的任意一个位置发生取代。
本文中的Cm-Cn是指具有m-n范围中的整数个碳原子。例如“C1-C10”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子、6个碳原子、7个碳原子、8个碳原子、9个碳原子或10个碳原子。
术语“烷基”是指通式为CnH2n+1的烃基，该烷基可以是直链或支链的。术语“C1-C10烷基”可理解为表示具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直链或支链饱和烃基。所述烷基的具体实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1，1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，1-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基或1，2-二甲基丁基等；术语“C1-C6烷基”可理解为表示具有1至6个碳原子的烷基，具体实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、新戊基、己基、2-甲基戊基等。术语“C1-C3烷基”可理解为表示具有1至3个碳原子的直链或支链饱和烷基。所述“C1-C10烷基”可以包含“C1-C6烷基”或“C1-C3烷基”等范围，所述“C1-C6烷基”可以进一步包含“C1-C3烷基”。
术语“烷氧基”是指直链或支链醇类失去羟基上的氢原子产生的基团，可理解为“烷基氧基”或“烷基-O-”。术语“C1-C10烷氧基”可理解为“C1-C10烷基氧基”或“C1-C10烷基-O-”；术语“C1-C6烷氧基”可理解为“C1-C6烷基氧基”或“C1-C6烷基-O-”。所述“C1-C10烷氧基”可以包含“C1-C6烷氧基”和“C1-C3烷氧基”等范围，所述“C1-C6烷氧基”可以进一步包含“C1-C3烷氧基”。
术语“氘代烷基”意在包括单氘代烷基和多氘代烷基。例如，术语“C1-6氘代烷基”意指被一个或多个氘取代的如上所定义的C1-6烷基，包括但不仅限于CD3、CH2CD3等等。
术语“环烷基”是指完全饱和的且以单环、并环、桥环或螺环等形式存在的碳环。除非另有指示，该碳环通常为3至10元环。术语“C3-C10环烷基”可理解为表示饱和的单环、并环、螺环或桥环，其具有3～10个碳原子。所述环烷基的具体实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基，降冰片基(双环[2.2.1]庚基)、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基、螺[4.5]癸烷基等。术语“C3-C10环烷基”可以包含“C3-C6环烷基”，术语“C3-C6环烷基”可理解为表示饱和的单环或双环烃环，其具有3～6个碳原子，具体实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基或环己基等。
术语“杂环基”是指完全饱和的或部分饱和的(整体上不是具有芳香性的杂芳族)单环、并环、螺环或桥环基团，其环原子中含有1-5个杂原子或杂原子团(即含有杂原子的原子团)，所述“杂原子或杂原子团”包括但不限于氮原子(N)、氧原子(O)、硫原子(S)、磷原子(P)、硼原子(B)、-S(＝O)2-、-S(＝O)-、-P(＝O)2-、-P(＝O)-、-NH-、-S(＝O)(＝NH)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)NH-等。术语“3-10元杂环基”是指环原子数目为3、4、5、6、7、8、9或10的杂环基，且其环原子中含有1-5个独立选自上文所述的杂原子或杂原子团。“3-10元杂环基”包括“4-7元杂环基”，其中，4元杂环基的具体实例包括但不限于氮杂环丁烷基或氧杂环丁烷基；5元杂环基的具体实例包括但不限于四氢呋喃基、二氧杂环戊烯基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基、4,5-二氢噁唑基或2,5-二氢-1H-吡咯基；6元杂环基的具体实例包括但不限于四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、二噻烷基、硫代吗啉基、哌嗪基、三噻烷基、四氢吡啶基或4H-[1,3,4]噻二嗪基；7元杂环基的具体实例包括但不限于二氮杂环庚烷基。所述杂环基还可以是双环基，其中，5,5元双环基的具体实例包括但不限于六氢环戊并[c]吡咯-2(1H)-基；5,6元双环基的具体实例包括但不限于六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(1H)-基、5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪基或5,6,7,8-四氢咪唑并[1,5-a]吡嗪基。任选地，所述杂环基可以是上述4-7元杂环基的苯并稠合环基，具体实例包括但不限于二氢异喹啉基等。“4-10元杂环基”可以包含“5-10元杂环基”、“4-7元杂环基”、“5-6元杂环基”、“6-8元杂环基”、“4-10元杂环烷基”、“5-10元杂环烷基”、“4-7元杂环烷基”、“5-6元杂环烷基”、“6-8元杂环烷基”等范围，“4-7元杂环基”进一步可以包含“4-6元杂环基”、“5-6元杂环基”、“4-7元杂环烷基”、“4-6元杂环烷基”、“5-6元杂环烷基”等范围。本公开中尽管有些双环类杂环基部分地含有一个苯环或一个杂芳环，但所述杂环基整体上仍是无芳香性的。
术语“芳基”是指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环的芳香环基团。芳基可以具有6-20个碳原子，6-14个碳原子或6-12个碳原子。术语“C6-C20芳基”可理解为具有6～20个碳原子的芳基。特别是具有6个碳原子的环(“C6芳基”)，例如苯基；或者具有9个碳原子的环(“C9芳基”)，例如茚满基或茚基；或者具有10个碳原子的环(“C10芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基；或者具有13个碳原子的环(“C13芳基”)，例如芴基；或者是具有14个碳原子的环(“C14芳基”)，例如蒽基。术语“C6-C10芳基”可理解为具有6～10个碳原子的芳基。特别是具有6个碳原子的环(“C6芳基”)，例如苯基；或者具有9个碳原子的环(“C9芳基”)，例如茚满基或茚基；或者具有10个碳原子的环(“C10芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基。术语“C6-C20芳基”可以包含“C6-C10芳基”
术语“杂芳基”是指具有芳香性的单环或稠合多环体系，其中含有至少一个选自N、O、S的环原子，其余环原子为C的芳香环基。术语“5-10元杂芳基”可理解为包括这样的单环或双环芳族环系：其具有5、6、7、8、9或10个环原子，特别是5或6或9或10个环原子，且其包含1-5个，优选1-3个独立选自N、O和S的杂原子。特别地，杂芳基选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基或噻二唑基等以及它们的苯并衍生物，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基或异吲哚基等；或吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基等以及它们的苯并衍生物，例如喹啉基、喹唑啉基或异喹啉基等；或吖辛因基、吲嗪基、嘌呤基等以及它们的苯并衍生物；或噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基或吩噁嗪基等。术语“5-6元杂芳基”指具有5或6个环原子的芳族环系，且其包含1-3个，优选1-2个独立选自N、O和S的杂原子。
术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
术语“羟基”是指-OH基团。
术语“氨基”是指-NH2基团。
术语“治疗有效量”意指
(i)治疗特定疾病、病况或障碍，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状，或(iii)延迟本文中所述的特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状发作的本公开化合物的用量。
构成“治疗有效量”的本公开化合物的量取决于该化合物、疾病状态及其严重性、给药方式以及待被治疗的哺乳动物的年龄而改变，但可例行性地由本领域技术人员根据其自身的知识及本公开内容而确定。
术语“个体”包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人，非人的灵长类动物(例如黑猩猩和其它猿类和猴)；家畜，例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，例如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。非人哺乳动物的实例包括但不限于鸟类和鱼类等。在本文提供的一个有关方法和组合物的实施方案中，所述哺乳动物可以为人。
术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的酸或碱的盐，包括化合物与无机酸或有机酸形成的盐，以及化合物与无机碱或有机碱形成的盐。
术语“药物组合物”是指一种或多种本公开的化合物或其盐与药学上可接受的辅料组成的混合物。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本公开的化合物。
术语“药学上可接受的辅料”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些辅料。合适的辅料是本领域技术人员熟知的，例如碳水化合物、蜡、水溶性和/或水可膨胀的聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等。
词语“包括(comprise)”或“包含(comprise)”及其英文变体例如comprises或comprising可理解为开放的、非排他性的意义，即“包括但不限于”。
本公开还包括与本文中记载的那些相同的，但一个或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数的原子置换的同位素标记的本公开化合物。可结合到本公开化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、123I、125I和36Cl等。
某些同位素标记的本公开化合物(例如用3H及14C标记)可用于化合物和/或底物组织分布分析中。氚化(即3H)和碳-14(即14C)同位素对于由于它们易于制备和可检测性是尤其优选的。正电子发射同位素，诸如15O、13N、11C和18F可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以测定底物占有率。通常可以通过与公开于下文的方案和/或实施例中的那些类似的下列程序，通过同位素标记试剂取代未经同位素标记的试剂来制备同位素标记的本公开化合物。
本公开的药物组合物可通过将本公开的化合物与适宜的药学上可接受的辅料组合而制备，例如可配制成固态、半固态、液态或气态制剂，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶等。
给予本公开化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物的典型途径包括但不限于口服、直肠、局部、吸入、肠胃外、舌下、阴道内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药。
本公开的药物组合物可以采用本领域众所周知的方法制造，如常规的混合法、溶解法、制粒法、乳化法、冷冻干燥法等。
本文所述的通式Ⅰ化合物的所有施用方法中，每天给药的剂量为0.01mg/kg到200mg/kg体重，以单独或分开剂量的形式。
具体实施方式
以下实施例详细说明发明的技术方案，但本公开的保护范围包括但不限于此。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)和/或质谱(MS)来确定的。NMR位移的单位为10-6(ppm)。NMR测定的溶剂为氘代二甲基亚砜、氘代氯仿、氘代甲醇等，内标为四甲基硅烷(TMS)；“IC50”指半数抑制浓度，指达到最大抑制效果一半时的浓度。
DMF：N,N-二甲基甲酰胺；DCM：二氯甲烷；THF：四氢呋喃；EDCl:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；HOBT:1-羟基苯并三唑；BTA:苯并三氮唑；LDA:二异丙基氨基锂；DBU：1,8-二偶氮杂双螺环[5.4.0]十一-7-烯；Et3N和TEA：三乙胺；Tf2O:三氟甲磺酸酐；Fe(acac)3:三乙酰丙酮铁；NMP：N-甲基吡咯烷酮；CD3MgI:甲基-D3-碘化镁；2-Me-THF：2-甲基四氢呋喃；OXONE：过氧单磺酸钾；DMSO：二甲基亚砜；DIPEA和DIEA：N,N-二异丙基乙胺；NIS：N-碘代丁二酰亚胺；AgOTf：三氟甲磺酸银；Pd(dppf)Cl2：[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)；TBAF：四丁基氟化铵；POCl3：三氯氧磷；Pd(allyl)Cl2：氯化烯丙基钯(II)二聚体；Toluene：甲苯；Dioxane：二氧六环。
实施例1：2-((1-(环丙基磺酰基)哌啶-4-基)氨基)-6-乙炔基-8-((1R,2R)-2-羟基-2-甲基环戊基)-5-(甲基-d3)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮
步骤1：中间体1-2的合成
将1-1(50.0g)溶于400mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入碳酸钾(59.3g)，(1R,2R)-2-氨基-1-甲基环戊烷-1-醇(27.2g)后加热至50℃反应3小时后反应完毕，反应液冷却后倒入700mL的冰水中，有大量白色固体析出，过滤，滤饼水洗后干燥制得标题化合物。
步骤2：中间体1-3的合成
将1-2(63.0g)溶解于450mL乙醇中，加入氢氧化钠水溶液(4M/L,202mL)。室温搅拌3小时后反应完毕，浓缩后再加入600mL水，用4N的稀盐酸调pH至4，有大量白色固体析出，过滤，滤饼干燥后制得标题化合物。
步骤3：中间体1-4的合成
将1-3(30.8g)溶于350mL二氯甲烷中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(41.7g)，1-羟基苯并三唑(14.7g)和苯并三氮唑(25.9g)，室温搅拌15小时后反应完毕，反应液浓缩后经柱层析(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)制得标题化合物。
步骤4：中间体1-5的合成
向三口瓶中加入100mL的四氢呋喃，氮气保护下降温至-75℃，加入二异丙基氨基锂(2M,379mL)，缓慢滴加乙酸乙酯(50.2g)的四氢呋喃溶液。-75℃搅拌1小时，缓慢滴加1-4(36.5g)的四氢呋喃溶液，-65℃搅拌2小时后反应完毕。用饱和氯化铵水溶液缓慢淬灭，向体系加入100mL的水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，制得标题化合物。
步骤5：中间体1-6的合成
将1-5(20.0g)溶于600mL四氢呋喃中，加入1,8-二偶氮杂双螺环[5.4.0]十一-7-烯(40.0g)。加热至60℃搅拌15小时后反应完毕。反应液加入到400mL水中，乙酸乙酯萃取。水相用稀盐酸调pH至3左右，乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤，浓缩，经柱层析(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)分离纯化制得标题化合物。
步骤6：中间体1-7的合成
将1-6(10.5g)溶解于150mL二氯甲烷中，降温至-65℃，氮气保护下缓慢加入三乙胺(13.8g)和三氟甲磺酸酐(19.3g)。-65℃搅拌15小时后反应完毕。加入50mL的水淬灭，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后，过滤，浓缩，经柱层析(石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱)分离纯化制得标题化合物。
步骤7：中间体1-8的合成
将1-7(10.3g)溶于80mL四氢呋喃中，加入三乙酰丙酮铁(3.30g)，N-甲基吡咯烷酮(462mg)，氮气保护下降温至-55℃。缓慢滴加甲基-D3-碘化镁(1M,93.4mL)，-55℃搅拌2小时后反应完毕。加入70mL的水，乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后经柱层析(石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱)制得标题化合物。
步骤8：中间体1-9的合成
将1-8(61.0mg)溶解于2-甲基四氢呋喃(4mL)和水(1mL)的混合溶剂中，0℃下分批加入过氧单磺酸钾(361mg)，室温搅拌5小时后反应完毕。加入5mL水，乙酸乙酯(3×10mL)萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥后，过滤，浓缩，经柱层析(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)制得标题化合物。
步骤9：中间体1-10的合成
将1-9(62.0mg)溶解于5mL二甲基亚砜中，加入N,N-二异丙基乙胺(167mg)和1-(环丙基磺酰基)哌啶-4-胺(74.0mg)，室温搅拌12小时后反应完毕。加入5mL水淬灭，乙酸乙酯(3×10mL)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经柱层析(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)制得标题化合物。
步骤10：中间体1-11的合成
将1-10(80.0mg)溶解于二氯甲烷(3mL)和二甲基亚砜(3mL)的混合液中，加入N-碘代丁二酰亚胺(31.0mg)，三氟甲磺酸银(3.00mg)，室温搅拌12小时后反应结束。加入10mL水淬灭，乙酸乙酯(3×15mL)萃取，有机相用饱和亚硫酸钠溶液(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后制得标题化合物。
步骤11：中间体1-12的合成
将1-11(70.0mg)，1,1'-二(二苯膦基)二茂铁二氯化钯(II)(17.0mg)和碘化亚铜(9.00mg)溶解于4mL N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护下加入三乙胺(36.0mg)和三异丙基硅基乙炔(44.0mg)，45℃搅拌4小时后反应结束。降至室温，加入15mL水，乙酸乙酯(3×10mL)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经柱层析(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)制得标题化合物。
步骤12：化合物1的合成
将1-12(52.0mg)溶解于3mL四氢呋喃，加入四丁基氟化铵(80.6μL,1M)，搅拌15分钟后反应结束。加入5mL水，乙酸乙酯(3×10mL)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，有机相浓缩后经制备HPLC(色谱柱:spherical-C18；流动相:A为水；B为乙腈，B％:0％-40％,40mL/min)制得标题化合物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(s,1H),5.88-5.33(m,2H),4.10-3.93(m,1H),3.88-3.73(m,2H),3.54(s,1H),3.12-3.00(m,1H),2.81-2.67(m,1H),2.39-2.25(m,2H),2.24-2.13(m,2H),2.08-1.97(m,2H),1.94-1.84(m,1H),1.83-1.58(m,4H),1.23-1.12(m,5H),1.05-0.97(m,2H).
LC-MS(ESI):m/z＝489.2[M+H]；
实施例2:2-(((3R,4R)-1-(环丙基磺酰基)-3-氟哌啶-4-基)氨基)-6-乙炔基-8-((1R,2R)-2-羟基-2-甲基环戊基)-5-(甲基-d3)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮
参考实施例1的合成方法，不同的是将步骤9中的1-(环丙基磺酰基)哌啶-4-胺替换为(3R,4R)-1-(环丙基磺酰基)-3-氟哌啶-4-胺，同法制得标题化合物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H),5.90-5.74(m,1H),4.80-4.54(m,1H),4.40-4.16(m,1H),4.16-4.00(m,1H),3.82-3.70(m,1H),3.56(s,1H),3.22-3.01(m,2H),2.79-2.61(m,1H),2.47-2.27(m,2H),2.11-1.64(m,5H),1.37-1.10(m,5H),1.10-0.98(m,2H).
LC-MS(ESI):m/z＝507.2[M+H]；
实施例3：6-乙炔基-8-((1R,2R)-2-羟基-2-甲基环戊基)-2-((1-(甲基磺酰基)哌啶-4-基-4-d)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮
步骤1：中间体3-3的合成：
将3-1(244mg)和3-2(406mg)加入到3mL二甲基亚砜中，加入N,N-二异丙基乙胺(319mg)。室温搅拌16小时后反应完毕。加入10mL水，用1N盐酸调pH至6～7。乙酸乙酯萃取(20mL*2)，有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤，浓缩，经柱层析(石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱)制得中间体3-3。
步骤2：中间体3-4的合成：
将中间体3-3(526mg)加入到5mL二氯甲烷/二甲亚砜混合溶剂中(v:v＝1:1)，加入N-碘代丁二酰亚胺(436mg)和三氟甲磺酸银(33mg)。室温搅拌15个小时后反应完毕。加入10mL饱和亚硫酸钠水溶液淬灭，再加20mL水，二氯甲烷萃取(20mL*2)。有机相无水硫酸钠干燥后，过滤，浓缩，制得中间体3-4。
步骤3：中间体3-5的合成：
将3-4(510mg)，三甲基硅基乙炔(183mg)，三乙胺(188mg)，1,1'-二(二苯膦基)二茂铁二氯化钯(II)(68mg)和碘化亚铜(18mg)加入到N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，氩气保护下加热至45℃，4个小时后反应完毕。加入20mL水，乙酸乙酯萃取(25mL*2)。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤，浓缩，经柱层析(石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱)纯化制得中间体3-5。
步骤4：化合物3的合成：
将3-5(460mg)加入到10mL甲醇中，加入碳酸钾(141mg)，室温搅拌20分钟后反应完毕。加10mL水，二氯甲烷萃取(10mL*3)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经制备HPLC(色谱柱:spherical-C18；流动相:A为水；B为乙腈，B％:0％-40％,40mL/min)制得化合物3。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.43(s,1H),7.75(s,1H),5.91-5.57(m,2H),3.89-3.71(m,2H),3.32(s,1H),3.00-2.86(m,2H),2.85-2.63(m,4H),2.38-2.28(m,1H),2.27-2.13(m,2H),2.09-1.97(m,2H),1.94-1.61(m,4H),1.16(s,3H).
LC-MS(ESI):m/z＝447.2[M+H]；
实施例4：6-乙炔基-8-((1R,2R)-2-羟基-2-甲基环戊基)-5-(甲基-d3)-2-((1-((4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基)哌啶-4-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮
步骤1：4-2的合成：
将1-9(400mg)和1-(4-氨基-1-哌啶基)-2,2,2-三氟乙酮(345mg)溶于5mL二甲亚砜中，0℃条件下加入N,N-二异丙基乙胺(759mg)，室温搅拌6小时后反应完毕。向反应液中加入50mL水，乙酸乙酯萃取。有机相浓缩后制得标题化合物。
步骤2：4-3的合成：
将4-2(540mg),N-碘代丁二酰亚胺(406mg),三氟甲磺酸银(31.0mg)加入到二氯甲烷/二甲亚砜＝1/1(v/v)混合溶剂(5mL)中，室温搅拌10小时后反应完毕。加入20mL水，乙酸乙酯萃取，有机相浓缩后经柱层析(石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱)制得标题化合物。
步骤3：4-4的合成：
将4-3(480mg)和三甲基硅基乙炔(161mg)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)，加入Pd(dppf)Cl2(58.5mg)，碘化亚铜(15.7mg)和三乙胺(213mg)。氩气保护下加热至45℃，12小时后反应完毕。加入20mL水，乙酸乙酯萃取，有机相用硫酸钠干燥后浓缩，经柱层析(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)纯化制得标题化合物。
步骤4：4-5的合成：
将4-4(210mg)溶于10mL甲醇中，加入碳酸钾(105mg)室温搅拌20分钟后反应完毕。加水20mL，二氯甲烷萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，有机相浓缩后制得标题化合物。
步骤5：化合物4的合成：
将4-5(173mg)和4-甲基哌嗪-1-磺酰氯(134mg)加入到10mL二氯甲烷中，0℃缓慢加入N,N-二异丙基乙胺(116mg)，室温搅拌4小时后反应完毕。加入50mL水，乙酸乙酯萃取。有机相用硫酸钠干燥后，过滤，浓缩，经柱层析(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)纯化制得标题化合物。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.54(s,1H),5.76-5.33(m,2H),4.07-3.89(m,1H),3.71-3.67(m,2H),3.47(s,1H),3.23-3.19(m,4H),2.99-2.93(m,2H),2.75-2.62(m,1H),2.51-2.42(m,4H),2.36-2.28(m,4H),2.21-1.74(m,6H),1.62-1.51(m,2H),1.16(s,3H)。
LC-MS(ESI):m/z＝547.3[M+H]；
实施例5：6-乙炔基-8-((1R,2R)-2-羟基-2-甲基环戊基)-2-((1-(甲基磺酰基)哌啶-4-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮-5-d
步骤1:5-2的合成
将1-6(500mg)加入到5mL 1,4-二氧六环中，室温下加入三氯氧磷(748mg)，微波加热至80℃反应10分钟后反应结束。将反应液倒入饱和碳酸钠溶液中调节pH至7～8，乙酸乙酯萃取10mL*3，有机相用硫酸钠干燥，过滤，经柱层析(石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱)制得标题化合物。
步骤2:5-3的合成：
氮气保护下，将氯化烯丙基钯(II)二聚体(22.4mg),1,3-双(2,6-二异丙基苯基)氯化咪唑翁(52.2mg)和碳酸铯(149mg)加入到无水甲苯中，加热至80℃搅拌15分钟。随后加入中间体5-2(100mg)和氘代甲醇(6.60mg)，90℃反应12小时后反应结束。加入5mL的水淬灭，乙酸乙酯萃取10mL*2，有机相用5mL的饱和食盐水洗涤，减压蒸出溶剂，经柱层析(石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱)制得标题化合物。
步骤3:5-4的合成：
氮气保护下，将5-3(58.1mg)溶解于水(1mL)/2-甲基四氢呋喃(4mL)混合溶剂中，0℃条件下分批加入过氧单磺酸钾(381mg)，25℃搅拌12小时后反应结束，加入5mL的水淬灭，乙酸乙酯萃取10mL*2，有机相用5mL饱和亚硫酸氢钠洗涤，有机相浓缩后，经柱层析(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)制得标题化合物。
步骤4:5-5的合成：
将5-4(34.2mg)，1-甲磺酰基-4-氨基哌啶(28.6mg)溶解于二甲基亚砜(3mL)，加入N,N-二异丙基乙胺(135mg)，氮气保护下室温搅拌12小时后反应结束。向反应液中加入15mL水，乙酸乙酯萃取，有机相浓缩后，经柱层析(石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱)制得标题化合物。
步骤5:5-6的合成：
氮气保护下，将5-5(15.6mg)溶解于二甲基亚砜(2mL)/二氯甲烷(2mL)混合溶剂中。0℃下加入三氟甲磺酸银(1.10mg)，N-碘代丁二酰亚胺(11.2mg)，25℃搅拌12小时后反应结束。加15mL水，乙酸乙酯萃取，有机相浓缩后制得标题化合物。
步骤6:5-7的合成：
将5-6(16.2mg),Pd(dppf)Cl2(5.30mg)和碘化亚铜(2.80mg)溶解于干燥的N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，氮气保护下加入三乙胺(11.1mg)和三异丙基硅基乙炔(19.9mg)，加热至55℃搅拌2小时后反应结束。反应液经硅藻土抽滤，滤液加10mL的水，乙酸乙酯萃取10mL*2，有机相用5mL的饱和食盐水洗涤，减压蒸出溶剂，浓缩后，经柱层析(二氯甲烷：甲醇梯度洗脱)制得标题化合物。
步骤7:化合物5的合成：
将5-7(15.0mg)溶解于干燥的四氢呋喃(5mL)中，加入四丁基氟化铵(1M,24.8μL)后搅拌5分钟。加入5mL水，乙酸乙酯萃取10mL*2，有机相用5mL的饱和食盐水洗涤，减压蒸出溶剂，有机相浓缩后经反相高效液相色谱(色谱柱：spherical-C18；流动相：A为0.5％碳酸氢铵体系；B为乙腈，B％：0％-95％，40mL/min)纯化制得标题化合物。
LCMS(ESI):m/z＝447.2[M+H]
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.47(s,1H),5.74(t,J＝9.2Hz,1H),5.35(s,1H),4.05(d,J＝10.0Hz,1H),3.89-3.67(m,2H),3.35(s,1H),3.10-2.93(m,2H),2.85(s,3H),2.76-2.63(m,1H),2.26 -2.07(m,3H),1.93-1.80(m,3H),1.78-1.64(m,3H),1.37(s,3H).
生物学活性及相关性质测试例
实验例1：本公开化合物对CDK1，CDK2，CDK4，CDK6，CDK9激酶抑制效果检测CDK1激酶实验方法概述如下：
使用Perkin Elmer的Lance Ultra TR-FRET激酶检测试剂，通过检测激酶反应中底物的磷酸化水平来测定CDK1的体外活性。反应缓冲液包含以下组分：50mM HEPES(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM EGTA、2mM DTT、0.01％Tween 20；人源重组CDK1/CycA2蛋白(ProQinase，0134-0054-1)用反应缓冲液稀释成1nM的激酶溶液；底物反应溶液包括用反应缓冲液稀释成100nM的ULight-4E-BP1激酶底物(PerkinElmer，TRF0128)和2000μM ATP；检测缓冲液包括用1X检测缓冲液(PerkinElmer，CR97-100)稀释成2nM Europium-anti-phospho-4E-BP1抗体(PerkinElmer，TRF0216)和20mM的EDTA。
使用Echo650自动化工作站向384孔检测板(Perkin Elmer，6007299)中添加100nL化合物溶液，再加入5μL的CDK1激酶溶液，混合均匀后室温孵育5分钟。随后加入5μL底物反应溶液，将反应混合物在室温孵育60分钟。随后加入与反应等体积的10μL检测缓冲液，混合均匀并在室温条件下静置60分钟后，用Envision读板机(Perkin Elmer)在615nm和665nm波长下检测反应进程。信号值(吸光度665nm/吸光度615nm)与底物的磷酸化程度呈正相关性，从而检测出CDK1激酶的活性。该实验中，未加CDK1激酶蛋白组作为100％抑制组，加CDK1激酶蛋白但是未加化合物组作为0％抑制组。
化合物对CDK1活性抑制百分比可以用以下公式计算：
抑制百分比＝100-100*(待测化合物特定浓度下信号值-100％抑制组信号值)/(0％抑制组信号值-100％抑制组信号值)。
化合物IC50值由8个浓度点用XLfit(ID Business Solutions Ltd.，UK)软件通过以下公式计算：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)×slope factor))
其中Y为抑制百分比，X为待测化合物浓度的对数值，Bottom为最小抑制百分比，Top为最大抑制百分比，slope factor为曲线斜率系数。
CDK2激酶实验方法概述如下：
试验方法：使用Perkin Elmer的Lance Ultra TR-FRET激酶检测试剂，通过检测激酶反应中底物的磷酸化水平来测定CDK2的体外活性。反应缓冲液包含以下组分：50mMHEPES(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM EGTA、2mM DTT、0.01％Tween 20；人源重组CDK2/CycE1蛋白(SignalChem，C29-18G-10)用反应缓冲液稀释成20nM的激酶溶液；底物反应溶液包括用反应缓冲液稀释成100nM的ULight-4E-BP1激酶底物(PerkinElmer，TRF0128)和400μM ATP；检测缓冲液包括用1X检测缓冲液(PerkinElmer，CR97-100)稀释成2nM Europium-anti-phospho-4E-BP1抗体(PerkinElmer，TRF0216)和20mM的EDTA。
使用Echo650自动化工作站向384孔检测板(Perkin Elmer，6007299)中添加100nL化合物溶液，再加入5μL的CDK2激酶溶液，混合均匀后室温孵育5分钟。随后加入5μL底物反应溶液，将反应混合物在室温孵育60分钟。随后加入与反应等体积的10μL检测缓冲液，混合均匀并在室温条件下静置60分钟后，用Envision读板机(Perkin Elmer)在615nm和665nm波长下检测反应进程。信号值(吸光度665nm/吸光度615nm)与底物的磷酸化程度呈正相关性，从而检测出CDK2激酶的活性。该实验中，未加CDK2激酶蛋白组作为100％抑制组，加CDK2激酶蛋白但是未加化合物组作为0％抑制组。
化合物对CDK2活性抑制百分比可以用以下公式计算：
抑制百分比＝100-100*(待测化合物特定浓度下信号值-100％抑制组信号值)/(0％抑制组信号值-100％抑制组信号值)。
化合物IC50值由8个浓度点用XLfit(ID Business Solutions Ltd.，UK)软件通过以下公式计算：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)×slope factor))
其中Y为抑制百分比，X为待测化合物浓度的对数值，Bottom为最小抑制百分比，Top为最大抑制百分比，slope factor为曲线斜率系数。
CDK4激酶实验方法概述如下：
使用Perkin Elmer的Lance Ultra TR-FRET激酶检测试剂，通过检测激酶反应中底物的磷酸化水平来测定CDK4的体外活性。反应缓冲液包含以下组分：50mM HEPES(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM EGTA、2mM DTT、0.01％Tween20；人源重组CDK4/CycD3蛋白(Carna Biosciences，04-105)用反应缓冲液稀释成4nM的激酶溶液；底物反应溶液包括用反应缓冲液稀释成100nM的ULight-4E-BP1激酶底物(PerkinElmer，TRF0128)和400μM ATP；检测缓冲液包括用1X检测缓冲液(PerkinElmer，CR97-100)稀释成2nM Europium-anti-phospho-4E-BP1抗体(PerkinElmer，TRF0216)和20mM的EDTA。
使用Echo650自动化工作站向384孔检测板(Perkin Elmer，6007299)中添加100nL化合物溶液，再加入5μL的CDK4激酶溶液，混合均匀后室温孵育5分钟。随后加入5μL底物反应溶液，将反应混合物在室温孵育60分钟。随后加入与反应等体积的10μL检测缓冲液，混合均匀并在室温条件下静置60分钟后，用Envision读板机(Perkin Elmer)在615nm和665nm波长下检测反应进程。信号值(吸光度665nm/吸光度615nm)与底物的磷酸化程度呈正相关性，从而检测出CDK4激酶的活性。该实验中，未加CDK4激酶蛋白组作为100％抑制组，加CDK4激酶蛋白但是未加化合物组作为0％抑制组。
化合物对CDK4活性抑制百分比可以用以下公式计算：
抑制百分比＝100-100*(待测化合物特定浓度下信号值-100％抑制组信号值)/(0％抑制组信号值-100％抑制组信号值)。
化合物IC50值由8个浓度点用XLfit(ID Business Solutions Ltd.，UK)软件通过以下公式计算：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)×slope factor))
其中Y为抑制百分比，X为待测化合物浓度的对数值，Bottom为最小抑制百分比，Top为最大抑制百分比，slope factor为曲线斜率系数。
CDK6激酶实验方法概述如下：
使用Perkin Elmer的Lance Ultra TR-FRET激酶检测试剂，通过检测激酶反应中底物的磷酸化水平来测定CDK6的体外活性。反应缓冲液包含以下组分：50mM HEPES(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM EGTA、2mM DTT、0.01％Tween20；人源重组CDK6/CycD3蛋白用反应缓冲液稀释成4nM的激酶溶液；底物反应溶液包括用反应缓冲液稀释成100nM的ULight-4E-BP1激酶底物(PerkinElmer，TRF0128)和400μM ATP；检测缓冲液包括用1X检测缓冲液(PerkinElmer，CR97-100)稀释成2nM Europium-anti-phospho-4E-BP1抗体(PerkinElmer，TRF0216)和20mM的EDTA。
使用Echo650自动化工作站向384孔检测板(Perkin Elmer，6007299)中添加100nL化合物溶液，再加入5μL的CDK6激酶溶液，混合均匀后室温孵育5分钟。随后加入5μL底物反应溶液，将反应混合物在室温孵育60分钟。随后加入与反应等体积的10μL检测缓冲液，混合均匀并在室温条件下静置60分钟后，用Envision读板机(Perkin Elmer)在615nm和665nm波长下检测反应进程。信号值(吸光度665nm/吸光度615nm)与底物的磷酸化程度呈正相关性，从而检测出CDK6激酶的活性。该实验中，未加CDK6激酶蛋白组作为100％抑制组，加CDK6激酶蛋白但是未加化合物组作为0％抑制组。
化合物对CDK6活性抑制百分比可以用以下公式计算：
抑制百分比＝100-100*(待测化合物特定浓度下信号值-100％抑制组信号值)/(0％抑制组信号值-100％抑制组信号值)。
化合物IC50值由8个浓度点用XLfit(ID Business Solutions Ltd.,UK)软件通过以下公式计算：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)×slope factor))
其中Y为抑制百分比，X为待测化合物浓度的对数值，Bottom为最小抑制百分比，Top为最大抑制百分比，slope factor为曲线斜率系数。
CDK9激酶实验方法概述如下：
使用Perkin Elmer的Lance Ultra TR-FRET激酶检测试剂，通过检测激酶反应中底物的磷酸化水平来测定CDK9的体外活性。反应缓冲液包含以下组分：50mM HEPES(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM EGTA、2mM DTT和0.01％Tween20；人源重组CDK9/CycT1蛋白用反应缓冲液稀释成0.6nM的激酶溶液；底物反应溶液包括用反应缓冲液稀释成100nM的ULight-4E-BP1激酶底物(PerkinElmeR,TRF0128)和300μM ATP；检测缓冲液包括用1X检测缓冲液(PerkinElmeR,CR97-100)稀释成2nM Europium-anti-phospho-4E-BP1抗体(PerkinElmeR,TRF0216)和20mM的EDTA。
使用Echo650自动化工作站向384孔检测板(Perkin ElmeR,6007299)中添加100nL化合物溶液，再加入5μL的CDK9激酶溶液，混合均匀后室温孵育5分钟。随后加入5μL底物反应溶液，将反应混合物在室温孵育15分钟。随后加入与反应等体积的10μL检测缓冲液，混合均匀并在室温条件下静置60分钟后，用Envision读板机(Perkin Elmer)在615nm和665nm波长下检测反应进程。信号值(吸光度665nm/吸光度615nm)与底物的磷酸化程度呈正相关性，从而检测出CDK9激酶的活性。该实验中，未加CDK9激酶蛋白组作为100％抑制组，加CDK9激酶蛋白，但是未加化合物组作为0％抑制组。
化合物对CDK9活性抑制百分比可以用以下公式计算：
抑制百分比＝100-100*(待测化合物特定浓度下信号值-100％抑制组信号值)/(0％抑制组信号值-100％抑制组信号值)。
化合物IC50值由8个浓度点用XLfit(ID Business Solutions Ltd.，UK)软件通过以下公式计算：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)×slope factor))
其中Y为抑制百分比，X为待测化合物浓度的对数值，Bottom为最小抑制百分比，Top为最大抑制百分比，slope factor为曲线斜率系数。
试验结果：在本实验条件下，测试化合物对CDK2，CDK4，CDK6均具有良好的抑制活性，测试化合物相应活性测试结果具体见表1。
表1测试化合物对CDK1，CDK2，CDK4，CDK6，CDK9激酶抑制活性测试结果
实验例2：本公开化合物对OVCAR3，MCF7细胞增殖的抑制效果检测
试验方法：通过Brdu酶联免疫吸附(ELISA)方法评估本公开的化合物对OVCAR3细胞增殖的影响。
OVCAR3细胞(ATCC，HTB-161)在含有2μg/mL牛胰岛素Insulin(翊圣，40107ES60)，20％FBS(Gibco，10099)和100U/mL青链霉素混合液(Thermofisher，15140122)的RPMI1640(Gibco，A10491-01)完全培养基中培养，当细胞在培养容器中覆盖率达80-90％时，将细胞吹散后种植于384孔板(Corning，3570)，每孔4000细胞(40μLRPMI1640完全培养基)，然后将384孔板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜。
过夜后使用Echo650自动化工作站每孔加入80nL稀释后的化合物，轻轻混匀，然后将384孔板置于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养。24小时后按照Cell ProliferationELISA,BrdU检测试剂盒(Roch，11669915001)的方法检测OVCAR3细胞DNA合成过程中的Brdu掺入量。该实验中，未加细胞组(用1640培养基替代)作为100％抑制组，加细胞但是未加化合物组作为0％抑制组。
化合物对OVCAR3细胞增值抑制的百分比可以用以下公式计算：
抑制百分比＝100-100*(待测化合物特定浓度下信号值-100％抑制组信号值)/(0％抑制组信号值-100％抑制组信号值)。
化合物IC50值由8个浓度点用XLfit(ID Business Solutions Ltd.，UK)软件通过以下公式计算：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)×slope factor))
其中Y为抑制百分比，X为待测化合物浓度的对数值，Bottom为最小抑制百分比，Top为最大抑制百分比，slope factor为曲线斜率系数。
通过Brdu酶联免疫吸附(ELISA)方法评估本公开的化合物对MCF7细胞增殖的影响。
MCF7细胞(ATCC，HTB-22)在含有10μg/mL牛胰岛素Insulin(翊圣，40107ES60)，1％NEAA(Thermofisher，11140050),10％FBS(Gibco，10099)和100U/mL青链霉素混合液(Thermofisher，15140122)的DMEM(Gibco，11995073)完全培养基中培养，当细胞在培养容器中覆盖率达80-90％时，将细胞吹散后种植于384孔板(Corning，3570)，每孔2000个细胞(40μLDMEM1640完全培养基)，然后将384孔板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜。
过夜后使用Echo650自动化工作站每孔加入80nL稀释后的化合物，轻轻混匀，然后将384孔板置于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养。24小时后按照Cell ProliferationELISA,BrdU检测试剂盒(Roch，11669915001)的方法检测MCF7细胞DNA合成过程中的BrdU掺入量。该实验中，未加细胞组(用DMEM培养基替代)作为100％抑制组，加细胞但是未加化合物组作为0％抑制组。
化合物对MCF7细胞增值抑制的百分比可以用以下公式计算：
抑制百分比＝100-100*(待测化合物特定浓度下信号值-100％抑制组信号值)/(0％抑制组信号值-100％抑制组信号值)
化合物IC50值由8个浓度点用XLfit(ID Business Solutions Ltd.，UK)软件通过以下公式计算：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logIC50-X)×slope factor))
其中Y为抑制百分比，X为待测化合物浓度的对数值，Bottom为最小抑制百分比，Top为最大抑制百分比，slope factor为曲线斜率系数。测试化合物相应活性测试结果具体见表2。
表2测试化合物对OVCAR3，MCF7细胞增殖抑制活性测试结果
/>
实验例3本公开化合物的药代动力学性质检测
试验动物：
健康成年BALB/c小鼠，雌性，平均分组，每组3只，3只灌胃，3只静脉，小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(浙)2019-0001。
药物配制：
称取一定量药物，溶于DMSO 5％+PG 20％+无水乙醇5％+solutol 10％+水60％，配制成10mg/mL，用于灌胃。称取一定量药物，溶于DMSO 1％+PG 4％+无水乙醇1％+solutol2％+水92％，配制成1mg/mL，用于静脉注射。
给药方式：
灌胃组：BALB/c小鼠禁食过夜后灌胃给药，给药剂量均为25mg/kg，给药体积均为2.5mL/kg。
静脉组：BALB/c小鼠禁食过夜后静脉给药，给药剂量均为3mg/kg，给药体积均为3mL/kg。
操作方法：
小鼠灌胃或静脉给药后，于给药后5min，15min，30min，1h，2h，4h，6h，由眼眶采血40μL，5μL EDTA-K2抗凝，12000rpm，4℃，5分钟离心分离血浆，于-20℃保存。
测定不同浓度的药物灌胃或静脉给药后小鼠血浆中待测化合物含量：取样品室温融解，涡旋1min；定量转移15μL至2mL96孔板中，加入150μL内标沉淀剂，振荡(1200rpm*3min)；离心(4000rpm*15min)，转移上清100μL至1mL 96孔板中；氮气吹干，加入100μL复溶液(乙腈水1：9)，振荡摇匀(900rpm*3min),20μL进样分析。LC/MS/MS条件：流动相A:0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈，色谱柱：ACE C18 5μm(3.0mm*50mm)，柱温：35℃，流速0.5mL/min。
试验结果：
在本实验条件下，测试化合物表现出较好的药代动力学性质，具体结果的详见表3和表4。
表3小鼠单次灌胃给予化合物后药代动力学参数
表4小鼠单次静脉给予化合物后药代动力学参数
以上所述并非对本公开作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本公开技术方案范围内，依据本公开的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本公开技术方案的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种式(I)所示化合物、或其立体异构体或其药学上可接受的盐，
其中，
R1选自C2-C6炔基；
R2、R3独立地选自H、氘、C1-C6烷基或C1-C6氘代烷基；
R4、R5独立地选自卤素、CN、NH2、OH、C1-C6烷基、C1-C6氟烷基、C1-C6烷氧基或C3-C8环烷基；或者由R4、R5及其连接的C共同形成C3-C5环烷基；
R6选自卤素、CN、NH2、OH、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或C3-C8环烷基，所述C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或C3-C8环烷基任选地被F、OH、NH2或C1-C3烷基取代；
R7选自氘、卤素、OH、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、C1-C6氘代烷基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、3-10元杂环基或5-10元杂芳基，所述C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、3-10元杂环基或5-10元杂芳基任选地被Rc取代；
Rc选自F、Cl、Br、OH、CN、-N(CH3)2、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C6-C10芳基、3-10元杂环基、C3-C8环烷基或5-10元杂芳基；
R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16独立地选自H、氘、卤素、NH2、OH、C1-C6烷基或C1-C6氘代烷基；
且R2、R3、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16中至少一个选自氘或者C1-C6氘代烷基；
p、n、m独立地选自0、1、2或3。
2.根据权利要求1所述式(I)所示化合物、或其立体异构体或药学上可接受的盐，其特征在于：R1选自乙炔基或者丙炔基。
3.根据权利要求2所述式(I)所示化合物、或其立体异构体或药学上可接受的盐，其特征在于：R1选自乙炔基。
4.根据权利要求1-3任一项所述式(I)所示化合物、或其立体异构体或药学上可接受的盐，其特征在于：R2独立地选自H、氘、甲基或CD3。
5.根据权利要求1-4任一项所述式(I)所示化合物、或其立体异构体或药学上可接受的盐，其特征在于：R4、R5独立地选自卤素、CN、NH2、OH或C1-C6烷基。
6.根据权利要求5所述式(I)所示化合物、或其立体异构体或药学上可接受的盐，其特征在于：R4、R5独立地选自OH或C1-C6烷基。
7.根据权利要求1-6任一项所述式(I)所示化合物或其立体异构体或药学上可接受的盐，其特征在于：R7独立地选自C1-C6氘代烷基、C1-C6烷基、C3-C8环烷基或3-10元杂环基，所述C1-C6烷基、C3-C8环烷基或3-10元杂环基任选地被Rc取代。
8.根据权利要求7所述式(I)所示化合物、或其立体异构体或药学上可接受的盐，其特征在于：R7独立地选自C1-C6烷基、C3-C8环烷基或3-10元杂环基，所述C1-C6烷基、C3-C8环烷基或3-10元杂环基任选地被Rc取代。
9.根据权利要求1-8任一项所述式(I)所示化合物、或其立体异构体或药学上可接受的盐，其特征在于：Rc选自C1-C6烷基。
10.根据权利要求1-9任一项所述式(I)所示化合物、或其立体异构体或药学上可接受的盐，其特征在于：R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16独立地选自H、氘、卤素或C1-C6氘代烷基。
11.根据权利要求1-10任一项所述式(I)所示化合物、或其立体异构体或药学上可接受的盐，其特征在于：n选自1，m选自0。
12.根据权利要求1所述式(I)所示化合物、或其立体异构体或药学上可接受的盐，其特征在于：式(I)所示化合物、或其立体异构体或其药学上可接受的盐选自式(II)所示化合物、或其立体异构体或其药学上可接受的盐，
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16如权利要求1定义。
13.根据权利要求1所述式(I)所示化合物、或其立体异构体或药学上可接受的盐，其特征在于：所述式(I)所示化合物、或其立体异构体或其药学上可接受的盐选自以下化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐：
14.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-13中任一项所述的化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。
15.权利要求1-13中任一项所述的化合物、或其立体异构体或药学上可接受的盐，或权利要求14所述药物组合物在制备预防或者治疗由CDK2/4/6介导的疾病药物中的用途。
16.用于预防或治疗由CDK2/4/6介导的疾病的权利要求1-13中任一项所述的化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐，或权利要求14所述的药物组合物。
17.一种预防或者治疗由CDK2/4/6介导的疾病的方法，所述的方法包括给以个体治疗上有效剂量的权利要求1-13中任一项所述的化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐、或权利要求14所述的药物组合物。
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