CN117417892A - 用于产生视网膜祖细胞的系统和方法 - Google Patents

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蔡慧冈
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Abstract

可以通过在其上具有层粘连蛋白基质的表面上分化人胚胎干细胞来产生视网膜祖细胞和成熟感光细胞，所述层粘连蛋白基质由两种层粘连蛋白构成。一种层粘连蛋白是层粘连蛋白‑521，另一种层粘连蛋白是层粘连蛋白‑323或层粘连蛋白‑523。可以使用多种细胞培养基来分化铺在该基底上的干细胞，以获得所述视网膜祖细胞和成熟感光细胞。

Description

用于产生视网膜祖细胞的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请是申请号为201880081377.0的中国专利申请的分案申请。申请号为201880081377.0的中国专利申请是国际申请PCT/SG2018/050517的中国国家阶段申请，其要求于2017年10月17日提交的PCT申请No.PCT/SG2017/050520的优先权，其通过引用完全并入。
背景技术
本公开涉及用于从人多能干细胞(human pluripotent stem cell)产生视网膜祖细胞(retinal progenitor cell)(例如感光细胞祖细胞(photoreceptor progenitorcell)或神经节祖细胞(ganglion progenitor cell))或视网膜感光细胞(retinalphotoreceptor cell)的系统和方法。还公开了用于这样的系统和方法的组合物和基质。本文还公开并包括所得视网膜祖细胞或视网膜感光细胞的移植。这些方法、组合物和包含其的系统可用于治疗眼病，例如黄斑变性(macular degeneration，MD)或色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa，RP)。
在世界范围内，失明的主要原因是年龄相关性黄斑变性(Age-related MacularDegeneration，AMD)和色素性视网膜炎(RP)。这两种病症涉及感光细胞和底部视网膜色素上皮(retina pigmented epithelium，RPE)的损失。感光细胞与RPE之间的功能性相互作用是支持视觉系统所必需的。不幸的是，人视网膜缺乏在细胞因疾病或损伤而损失时再生的能力，并且尚无有效治疗来逆转视网膜变性。
对于人细胞置换而言，认为有丝分裂后的人感光细胞并不是合乎伦理的合适来源，因为它们仅在妊娠19周之后才是可用的。对于来源于干细胞的感光细胞而言，现有方案主要通过使用基于在化学成分未确定的培养条件下的胚状体自发分化来形成3D视杯或视网膜类器官。这些3D类器官不适合移植，并且这种方案产生了具有不同发育阶段的异质视网膜细胞类型。
此外，MatrigelTM是含有数种基底膜蛋白(例如IV型胶原、串珠蛋白聚糖(perlecan)、层粘连蛋白-111)以及生长因子和细胞内蛋白的鼠肿瘤提取物。因此，MatrigelTM是异种的，受到批次间变化的影响，并且含有大量不明确组分。此外，在MatrigelTM上培养的细胞还具有获得非人N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)免疫原的可能性，这使得它们不适合临床应用。
当前的治疗包括口服药物，其包括抗氧化剂(例如维生素A棕榈酸酯)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、钙通道阻断剂和叶黄素/玉米黄质。然而，在视力恢复时都不显示出有效性。
发明内容
本公开涉及用于获得视网膜祖细胞或视网膜感光细胞的系统和方法。简言之，在包含(i)层粘连蛋白-323(laminin-323，LN-323)或LN-523和(ii)层粘连蛋白-521的混合物的基底上培养多能干细胞。LN-323和LN-523先前从未被纯化为纯的形式，而是在人胚肾细胞(HEK-293)中作为重组人蛋白首次生产，并被纯化以作为细胞培养包覆层。使用两种不同的细胞培养基来使干细胞分化，以获得视网膜祖细胞或视网膜感光细胞(取决于对它们进行分化的时间长度)。
还鉴定出五种不同的视网膜祖细胞亚群。这五种亚群可通过第26-34天(Day 26-34)基因谱(gene profile)来鉴定，如本文进一步解释的。
在第一亚群(A)中，在第26-34天基因谱中表达基因CRX、C11orf96、NXPH4、NTS、DCT、PRDM1、NEUROD4、S100A13、RCVRN、FAM57B、SYT4、DLL3、SSTR2、CHRNA5和ROBO2中的至少一种。期望地，表达这些基因中的更多种或大部分。
在第二亚群(B)中，在第26-34天基因谱中表达基因STMN2、ONECUT2、ATOH7、ELAVL4和GAP43中的至少一种。期望地，表达这些基因中的更多种或大部分。
在第三亚群(C)中，在第26-34天基因谱中表达基因CNTN2、NEFM、NEFL、PRPH、POU4F2和CXCR4中的至少一种。期望地，表达这些基因中的更多种或大部分。
在第四亚群(D)中，在第26-34天基因谱中表达基因PAX6、SIX3和SLC2A1中的至少一种。期望地，表达这些基因中的更多种或大部分。
在第五亚群(E)中，在第26-34天基因谱中表达基因VSX2、PTH2、FZD5、RARRES2、DIO3、SOX2和CYP1B1中的至少一种。期望地，表达这些基因中的更多或大部分。
下文更具体地公开了本公开的这些和另一些非限制性特性。
附图说明
该专利或申请文件包含至少一张彩色形式的附图。具有彩图的本专利或专利申请公开的副本将在请求并支付必要费用的情况下由专利局提供。
以下是对附图的简要描述，这些附图是为了说明本文所公开的示例性实施方案的目的而给出的，而不是为了限制本发明的目的。
图1A是描述在本公开的一些方法中产生重组层粘连蛋白-523和层粘连蛋白-323的步骤的流程图。
图1B是显示LN-523的纯化级分或部分中LAMA5、LAMB2和LAMC3链的存在的蛋白质印迹。
图1C是说明了使用AKTA色谱系统的LN-523克隆的蛋白洗脱曲线的色谱图。
图1D是LC-MS/MS(液相色谱-质谱法(Liquid Chromatography-MassSpectrophotometry))结果，显示存在LAMA5、LAMB2和LAMC3链。
图1E是显示LN-323的纯化级分或部分中LAMA3、LAMB2和LAMC3链的存在的蛋白质印迹。
图1F是示出使用AKTA色谱系统的LN-323克隆的蛋白洗脱曲线的色谱图。
图1G是LC-MS/MS(液相色谱-质谱法)结果，显示存在LAMA3、LAMB2和LAMC3链。
图2A是描述hESC分化为感光细胞的方法的图。指示了三种细胞培养物：用于在分化前进行培养的Nutristem(第0天)；神经诱导培养基；和感光细胞分化培养基。还提供了三幅图，示出了D0、D20和D30时的细胞。
图2B和图2C是在LN-523+LN-521基底上生长的细胞的一组五幅不同的图。在图2B中的上图中，y轴是任意单位，以0.05的增量从0延伸到0.15。x轴从左到右为OCT3/4、NANOG、BRA、MIXL1、SOX17、FOXA2和PAX6。
在图2B的标记为PAX6的左下图中，y轴是任意单位，以0.02的增量从0延伸到0.18。x轴从左到右是D0 LN-523+LN-521、D20 LN-523+LN-521、D20仅LN-523、D30LN-523+LN-521以及D30仅LN-523。
在图2B的标记为VSX2的右下图中，y轴是任意单位，以0.01的增量从0延伸到0.06。x轴从左到右是D0 LN-523+LN-521、D20 LN-523+LN-521、D20仅LN523、D30LN523+521以及D30仅LN523。
在图2C的标记为CRX的左图中，y轴是任意单位，以0.0005的增量从0延伸到0.0045。x轴从左到右是D0 LN523+521、D20 LN523+521、D20仅LN523、D30 LN-523+LN-521以及D30仅LN-523。
在图2C的标记为RCVRN的右图中，y轴是任意单位，以0.005的增量从0延伸到0.025。x轴从左到右是D0 LN-523+LN-521、D20 LN-523+LN-521、D20仅LN-523、D30LN-523+LN-521和D30仅LN-523。
图2D和图2E是在LN-323+LN-521基底上生长的细胞的一组五幅不同的图。在图2D的上图中，y轴是任意单位，以0.05的增量从0延伸到0.15。x轴从左到右为OCT3/4、NANOG、BRA、MIXL1、SOX17、FOXA2以及PAX6。
在图2D的标记为PAX6的左下图中，y轴是任意单位，以0.02的增量从0延伸到0.16。x轴从左到右是D0 LN-323+LN-521、D20 LN-323+LN-521、D20仅LN-323、D30LN-323+LN-521以及D30仅LN-323。
在图2D的标记为VSX2的右下图中，y轴是任意单位，以0.005的增量从0延伸到0.05。x轴从左到右是D0 LN-323+LN-521、D20 LN-323+LN-521、D20仅LN-323、D30LN-323+LN-521和D30仅LN-323。
在图2E的标记为CRX的左图中，y轴是任意单位，以0.0002的增量从0延伸到0.0014。x轴从左到右是D0 LN-323+LN-521、D20 LN323+LN-521、D20仅LN-323、D30 LN-323+LN-521和D30仅LN-323。
在图2E的标记为RCVRN的右图中，y轴是任意单位，以0.0001的增量从0延伸到0.0008。x轴从左到右是D0 LN-323+LN-521、D20 LN-323+LN-521、D20仅LN-323、D30LN-323+LN-521和D30仅LN-323。
图2F和图2G是在仅LN-521的基底上生长的细胞的一组五幅不同的图。在图2F的上图中，y轴是任意单位，以0.05的增量从0延伸到0.2。x轴从左到右为OCT3/4、NANOG、BRA、MIXL1、SOX17、FOXA2和PAX6。
在图2F的标记为PAX6的左下图中，y轴是任意单位，以0.02的增量从0延伸到0.12。x轴从左到右是D0 LN-521、D20 LN-521和D30 LN-521。
在图2F的标记为VSX2的右下图中，y轴是任意单位，以0.005的增量从0延伸到0.025。x轴从左到右是D0 LN-521、D20 LN-521和D30 LN-521。
在图2G的标记为CRX的左下图中，y轴是任意单位，以0.0005的增量从0延伸到0.0025。x轴从左到右是D0 LN521、D20 LN-521和D30 LN-521。
在图2G的标记为RCVRN的右下图中，y轴是任意单位，以0.005的增量从0延伸到0.003。x轴从左到右是D0 LN-521、D20 LN-521和D30 LN-521。
图3A-3C是显示D0的未分化hESC和D38的hESC来源的视网膜细胞的免疫细胞化学分析的图片组。图3A是在LN-523+LN-521基底上生长的细胞。图3B是在LN-523+LN-521基底上生长的细胞。图3C是在仅LN-521基底上生长的细胞。每组包含10张显微照片，其中比例尺＝20μM。在每组中，顶行显示了针对OCT4的D0细胞、针对PAX6的D0细胞和针对PAX6的D38细胞的分析。第二行示出了与DAPI合并的这些细胞。第三行显示针对VSX2的D38细胞和针对RCVRN的D38细胞的分析。第四行示出了与DAPI合并的这些细胞。在D0未分化干细胞中，表达OCT4，但不表达PAX6(配对框基因(paired box)6)。在D38分化细胞中，表达标志物PAX6、VSX2和RCVRN。
图3D是比较了标志物PAX6、VSX2、CRX和RCVRN在三种层粘连蛋白基质上的表达的柱状图。y轴是任意单位，以20的增量从0延伸到100。在x轴上，从左到右的标志物是PAX6、VSX2、CRX和RCVRN。对于每种标志物，左边的条是在LN-523:LN-521基底上的表达，中间的条针对LN-323:LN-521基底，而右边的条针对仅LN-521基底。
图4A是通过单细胞RNA测序绘制的所有第20天视网膜祖细胞的NANOG表达水平的t分布随机近邻嵌入算法(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding algorithm，t-SNE)可视化图(x和y轴分别为t-SNE的维度1和维度2)。每个点代表一个细胞。“Log2 Adj.计数”是指经Log2 scrano-归一化并经细胞周期调整后的NANOG基因计数。NANOG基因的计数范围为从0至2.21。
图4B是通过单细胞RNA测序绘制的所有第20天视网膜祖细胞的POU5F1表达水平的t-SNE可视化图。每个点代表一个细胞。POU5F1基因的计数范围为从0至1.33。
图4C是通过单细胞RNA测序绘制的所有第20天视网膜祖细胞的PAX6表达水平的t-SNE可视化图。每个点代表一个细胞。PAX6基因的计数范围为从-0.36至5.87。
图4D是通过单细胞RNA测序绘制的所有第20天视网膜祖细胞的LHX2表达水平的t-SNE可视化图。每个点代表一个细胞。LHX2基因计数范围为从-0.54至5.00。
图5是显示针对表达PAX6的第20天视网膜祖细胞亚群所鉴定的标志物基因的基因-基因表达(通过单细胞RNA测序绘制)成对相关水平的热图。对经单细胞测序绘制并且通过了质量控制步骤的所有第20天视网膜祖细胞计算该基因-基因表达成对相关性。水平条显示成对基因-基因表达的成对皮尔逊相关性，范围为从-1至1。
图6是显示针对所有第30天视网膜祖细胞内鉴定的五种细胞亚群中的每一种，所鉴定的标志物基因的基因-基因表达(通过单细胞RNA测序绘制)成对相关水平的热图。对经单细胞测序绘制的并且通过了质量控制步骤的所有第30天视网膜祖细胞计算该基因-基因表达成对相关性。从上至下，将细胞的五个亚群表示为：CRX+、STMN2+、CNTN2+、PAX6+和VSX2+。用线分隔属于不同细胞亚群的标志物基因。用箭头指示用来对五种细胞亚群的每一种进行命名的基因。水平条显示基因-基因表达成对皮尔逊相关性，范围为从-1至1。
作为参考，图6中右侧的基因的垂直列表如下所示(从上到下)：C11orf96；NXPH4；NTS；DCT；PRDM1；NEUROD4；CRX；S100A13；RCVRN；FAM57B；SYT4；DLL3；SSTR2；CHRNA5；ROBO2；ONECUT2；ATOH7；STMN2；ELAVL4；GAP43；NEFM；NEFL；PRPH；CNTN2；POU4F2；CXCR4；SIX3；PAX6；SLC2A1；PTH2；FZD5；VSX2；RARRES2；DIO3；SOX2以及CYP1B1。当从右向左阅读时，图6的底部的基因的水平列表是相同的。
图7A是通过单细胞RNA测序绘制的所有第30天视网膜祖细胞的CRX表达水平的t分布随机近邻嵌入算法(t-SNE)可视化图(x和y轴分别为t-SNE的维度1和维度2)。每个点代表一个细胞。“Log2 Adj.计数”是指经Log2 scrano-归一化并经细胞周期调整后的基因计数。CRX基因的计数范围为-0.05至3.33。
图7B是通过单细胞RNA测序绘制的所有第30天视网膜祖细胞的C11orf96表达水平的t-SNE可视化图。每个点代表一个细胞。C11orf96基因的计数范围为从-0.25至5.15。
图7C是通过单细胞RNA测序绘制的所有第30天视网膜祖细胞的STMN2表达水平的t-SNE可视化图。每个点代表一个细胞。STMN2基因计数范围为从-0.92至6.52。
图7D是通过单细胞RNA测序绘制的所有第30天视网膜祖细胞的ONECUT2表达水平的t-SNE可视化图。每个点代表一个细胞。ONECUT2基因计数范围为从-0.80至4.81。
图7E是通过单细胞RNA测序绘制的所有第30天视网膜祖细胞的CNTN2表达水平的t-SNE可视化图。每个点代表一个细胞。CNTN2基因计数范围为从-0.24至5.35。
图7F是通过单细胞RNA测序绘制的所有第30天视网膜祖细胞的POU4F2表达水平的t-SNE可视化图。每个点代表一个细胞。POU4F2基因的计数范围为-0.14至4.47。
图7G是通过单细胞RNA测序绘制的所有第30天视网膜祖细胞的PAX6表达水平的t-SNE可视化图。每个点代表一个细胞。PAX6基因的计数范围为从0至5.68。
图7H是通过单细胞RNA测序绘制的所有第30天视网膜祖细胞的SIX3表达水平的t-SNE可视化图。每个点代表一个细胞。SIX3基因计数范围为从0至4.63。
图7I是通过单细胞RNA测序绘制的所有第30天视网膜祖细胞的VSX2表达水平的t-SNE可视化图。每个点代表一个细胞。VSX2基因计数范围为从-0.17至3.28。
图7J是通过单细胞RNA测序绘制的所有第30天视网膜祖细胞的CYP1B1表达水平的t-SNE可视化图。每个点代表一个细胞。CYP1B1基因的计数范围为从-0.23至6.01。
具体实施方式
通过参考附图可以获得对本文公开的组合物和方法的更完整的理解。这些附图仅仅是基于方便和易于证明本公开的示意性表示，并且因此不旨在限定或限制示例性实施方案的范围。
尽管为了清楚起见，在以下描述中使用了特定术语，但是这些术语旨在仅指代为了在附图中说明而选择的实施方案的特定结构，并且不旨在限定或限制本公开的范围。在附图和下面的描述中，应当理解，相似的数字标记指代相同功能的部件。
本文所讨论的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用并入其全部内容。
无数量词修饰的名词包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。
如在说明书和权利要求书中使用的，术语“包括/包含”可以包括“由……组成”和“基本上由……组成”的实施方案。如本文中所使用的，术语“包括/包含(comprise(s)、include(s))”、“具有(having、has)”、“能/可以/可(can)”、“含有(contain(s))”及其变型旨在是开放式的过渡短语、术语或词语，其要求存在所命名的成分/步骤存在，并且允许其它成分/步骤的存在。然而，这样的描述应当被解释为描述由所列举的成分/步骤组成，或基本上由所列举的成分/步骤组成，其允许仅存在所命名的成分/步骤，以及可能由其产生的任何杂质，并且排除其它成分/步骤。
本申请的说明书和权利要求书中的数值应被理解为包括当减少到相同数目的有效数字时相同的数值，和与所述值相差小于本申请中所描述类型的用来确定该值的常规测量技术的实验误差的数值。
本文公开的所有范围包括所提及端点并且可独立地组合(例如，“从2至10”的范围包括端点2和10，以及所有中间值)。
术语“约”可以用于包括可以在不改变该值的基本功能的情况下变化的任何数值。当与范围一起使用时，“约”还公开了由两个端点的绝对值限定的范围，例如“约2至约4”还公开了“从2到4”的范围。术语“约”可以指的是所指示数目的正负10％。
可以与本公开相关的若干公知参考文献包括：Molecular Cloning:ALaboratoryManual(Sambrook等，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，GeneExpression Technology(Methods in Enzymology，Vol.185，由D.Goeddel编辑，1991，Academic Press，San Dieg，Calif.)，“Guide to Protein Purification”in Methods inEnzymology(M.P.Deutsher编辑(1990)Academic Press，Inc.)；PCR Protocol:A Guide toMethods and Applications(Innis等，1990，Academic Press，San Diego，Calif.)，Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique，第二版，(R.I.Freshney.1987.Liss，Inc.New York，N.Y.)，Gene Transfer andExpressionProtocol，第109-128页，E.J.Murray编辑，The Humana Press Inc.，Clifton，N.J.)，或Ambion1998Catalog(Ambion，Austin，Tex.)，Functional Diversity ofLaminins，Domogatskaya，A，Rodin，S和Tryggvason,K.,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.2012，28，523-553。
层粘连蛋白包括一个α链亚单位、一个β链亚单位和一个γ链亚单位，其全部通过卷曲螺旋结构域连接成三聚体。十二种已知的层粘连蛋白亚单位链理论上可形成至少60种不同的同种型。目前，在天然哺乳动物组织中，已鉴定16种三聚体层粘连蛋白类型。在三聚体层粘连蛋白结构内存在可鉴定结构域，该结构域对其它层粘连蛋白和基底层分子以及细胞质膜结合受体具有结合活性。例如，结构域VI、IVb和IVa形成球状结构，结构域V、IIIb和IIIa(其包含富含半胱氨酸的EGF样元件)用于形成杆状结构。在这三种链的C末端处的结构域I和II参与三链卷曲螺旋结构(长臂)的形成。在人组织中已经发现了以至少十六种不同组合存在的遗传学上有区别的五种α链、三种β链和三种γ链。这些层粘连蛋白的一种命名法基于它们的链组成来描述同种型，例如，层粘连蛋白111含有α-1、β-1和γ-1链。
如本文所用，术语“层粘连蛋白-323”(LN-323)是指通过将α3、β2和γ3链连接在一起而形成的蛋白质。如本文所使用的，术语“层粘连蛋白-521”(LN-521)是指通过将α5、β2和γ1链连接在一起而形成的蛋白质。如本文所用，术语“层粘连蛋白523”(LN-523)是指通过将α5、β2和γ3链连接在一起而形成的蛋白质。这些术语应被解释为涵盖重组层粘连蛋白和来自天然来源的异三聚体层粘连蛋白二者。术语“重组”是指使用表达质粒来在正常情况下不表达该蛋白的细胞中人工产生蛋白。
层粘连蛋白可以是完整的蛋白三聚体或蛋白链或蛋白片段。术语“完整的”是指由全部α链、一个β链和γ链的结构域构成的蛋白，其中三个链连接在一起以形成异三聚体结构。蛋白不分解为单独的链、片段或功能结构域。术语“链”指的是层粘连蛋白的单独的α链、β链或γ链的全部。术语“片段”是指含有一个、两个或三个对另一分子或受体具有结合活性的功能结构域的任何蛋白片段。然而，链不应当被认为是片段，因为每个链具有超过三个这样的结构域。类似地，完整的层粘连蛋白三聚体不应当被认为是片段。功能结构域的实例包括结构域I、II、III、IV、V、VI和G结构域。关于这些结构域的进一步信息可见于Domogatskaya，A.，Rodin，S.和Tryggvason，K.2012.Functional diversity oflaminins.Annu RevCell Dev Biol 28:523-553，通过引用将其并入。
本公开涉及用于培养和分化多能干细胞以获得视网膜祖细胞(例如感光细胞祖细胞或神经节祖细胞)或视网膜感光细胞的方法。特别地，在仅含有两种层粘连蛋白同种型的层粘连蛋白基质上培养干细胞。层粘连蛋白基质中的第一层粘连蛋白是LN-323或LN-523，它们在体内位于围绕视网膜感光细胞的基质中。层粘连蛋白基质中的第二层粘连蛋白是LN-521。可替代地，层粘连蛋白基质可以仅包含单种层粘连蛋白，即层粘连蛋白-521。然后将干细胞暴露于两种特定的细胞培养基中。这产生了多能干细胞来源的感光细胞，其比在含有不明确、异种且可替代的细胞外基质共混物的底物上生长的细胞更适合于临床应用。
分化细胞通常需要两件事来存活和繁殖：(1)为细胞提供结构和表型稳定化支持的基底；和(2)向细胞提供营养的细胞培养基。非常普遍地，多能干细胞在层粘连蛋白基质上培养，所述层粘连蛋白基质可以固定到固体表面上，所述固体表面充当结构支持并且还维持多能表型。术语“固体”是指物质的状态，即基底不是液体或气体或等离子体。表面可以是刚性的/硬的或非常柔性的(诸如膜)，并且术语“固体”不应当被解释为需要特定程度的刚性。表面(1)通常是容器，例如培替氏培养皿或多孔板的孔中。层粘连蛋白基质为在该表面上的基底(即，层或包覆层)的形式。与含有两种层粘连蛋白的基底相结合，以适当的时间间隔施用不同的细胞培养基，导致分化的感光细胞(作为祖细胞或作为成熟细胞)。
可与本文公开的方法和材料一起使用的干细胞是多能人干细胞。此类干细胞可包括诱导的多能干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、胎儿干细胞、羊膜干细胞和一般性的任何多能干细胞。干细胞是一种未分化的细胞，特化细胞随后从其衍生出来。多能性是指具有分化成所有三个胚层的细胞的潜能的细胞。
在一些实施方案中，层粘连蛋白基质包含两种层粘连蛋白的混合物。层粘连蛋白基质仅包含两种层粘连蛋白三聚体/链/片段，但允许其它成分也存在于层粘连蛋白基质中。第一层粘连蛋白是层粘连蛋白-323(LN-323)或层粘连蛋白-523(LN-523)。第二层粘连蛋白是层粘连蛋白-521(LN-521)。每种层粘连蛋白可以是完整蛋白或蛋白片段，尽管在优选的实施方案中，层粘连蛋白是完整蛋白。
在特定的实施方案中，可以预期的是，层粘连蛋白基质中的层粘连蛋白-323/523与层粘连蛋白-521的重量比为约1:1至约4:1，包括约1:1至约2:1(即，层粘连蛋白-521总是少于层粘连蛋白-323/523)。特别地，层粘连蛋白-323和层粘连蛋白-523存在于跨视网膜中的视杆和视锥的外界膜中，且层粘连蛋白-523存在于位于RPE下方的Bruch膜中。认为它们的存在驱动了干细胞向视网膜谱系特异性细胞的分化。
在其它实施方案中，层粘连蛋白基质仅包含单种层粘连蛋白，即层粘连蛋白-521。除了层粘连蛋白之外，层粘连蛋白基质中仍然可以存在其它成分。
细胞培养基底与多种细胞培养基组合使用以获得所需的视网膜祖细胞或感光细胞细胞。使用两种不同的细胞培养基，在下文中对其进行描述并在本文中将其称为神经诱导培养基和感光细胞分化培养基。
神经诱导培养基和感光细胞分化培养基二者都起始于基础培养基。基础培养基由Glasgow最小必需培养基(Glasgow minimum essential medium，GMEM)组成，该培养基可从ThermoFisher Scientific(目录号11710035)获得。GMEM补充有0.1mM的β-巯基乙醇、1×非必需氨基酸溶液(Gibco目录号11140050，提供为100×)，和1mM丙酮酸盐，以制备基础培养基。
作为参考，GMEM含有表1中列出的以下成分：
表1
1×非必需氨基酸溶液含有表2中所列浓度的以下成分：
表2
1×成分 浓度(mg/L)
甘氨酸 7.5
L-丙氨酸 8.9
L-天冬酰胺 13.20
L-天冬氨酸 13.30
L-谷氨酸 14.70
L-脯氨酸 11.50
L-丝氨酸 10.50
通过将基础培养基与其它添加剂按体积份进行混合来制备神经诱导培养基和感光细胞分化培养基。一种此类添加剂是无维生素A的B27补充剂，其可以从Thermo Fisher(目录号12587010，以50×提供)获得。另一种添加剂是N2补充剂，其可以从Thermo Fisher(目录号A1370701，以100×提供)获得。另一些添加剂包括人脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、人睫状神经营养因子(ciliary neurotrophicfactor，CNTF)、视黄酸、TGFβ抑制剂如SB431542(CAS#301836-41-9)、γ-分泌酶抑制剂例如DAPT。BDNF可从Peprotech(目录号450-02)获得，以及Wnt抑制剂如CKI-7。CNTF可以从Prospec-Tany Technogene(目录号CYT-272)获得。DAPT可以从Selleckchem(目录号S2215)获得。CKI-7可以从Sigma(CAS#1177141-67-1，目录号C0742)获得。
通过将97体积份(parts by volume，pbv)的基础培养基与2pbv的无维生素A的B27添加物和1pbv的N2补充物混合，然后加入TGFβ抑制剂(如SB431542)和Wnt抑制剂，来制备神经诱导培养基。TGF-β抑制剂以约1μM至约10μM，特别是约5μM的浓度存在。在具体的实施方案中，TGF-β抑制剂是SB431542。Wnt抑制剂以约1μM至约10μM，特别是约5μM的浓度存在。在具体的实施方案中，Wnt抑制剂是CKI-7。神经诱导培养基不包含生长因子，例如BDNF、CNTF或γ分泌酶抑制剂。
通过将97体积份(pbv)的基础培养基与2pbv的无维生素A的B27添加物和1pbv的N2补充剂混合，然后加入BDNF、CNTF、视黄酸和γ分泌酶抑制剂(例如DAPT)，来制备感光细胞分化培养基。BDNF以约1ng/mL至约20ng/mL，特别是约10ng/mL的浓度存在。CNTF以约1ng/mL至约30ng/mL的浓度存在，包括约5ng/mL至约25ng/mL，或约10ng/mL至约20ng/mL，特别是约20ng/mL。视黄酸以约0.1μM至约5μM，特别是约0.5μM的浓度存在。γ分泌酶抑制剂以约5μM至约15μM，特别是约10μM的浓度存在。感光细胞分化培养基不包含TGFβ抑制剂或Wnt抑制剂。
首先将干细胞平铺到由如上所述的一种或两种层粘连蛋白构成的层粘连蛋白基质/细胞培养基底上。干细胞通常以单层施用，并且可以约10,000个细胞/cm2的密度平铺。
然后，通过将神经诱导培养基施加于平铺的干细胞来起始分化。将细胞在神经诱导培养基中培养约120小时至约168小时的第一时间段，包括约144小时(即，6天)。可以周期性地更换培养基，例如每48小时。
接着，除去神经诱导培养基，并将感光细胞分化培养基施加于平铺的干细胞。将细胞在感光细胞分化培养基中培养约288小时(12天)至约816小时(34天)的第二时间段。可以周期性地更换培养基，例如每48小时。暴露于感光细胞分化培养基的时间长度将影响所得细胞的成熟度，使得可以获得视网膜祖细胞或成熟感光细胞。这导致约20天至约40天的分化和成熟的总时间段，以获得所需的视网膜感光细胞(祖细胞或成熟的细胞)。然后可将感光细胞移植到患者的一只或两只眼睛中，或用于其它应用。
可通过在分化开始后第20天时多能标志物Oct3/4和Nanog的显著下调以及标志物PAX6的上调来鉴定从干细胞向所需感光细胞的分化。标志物VSX2、CRX和RCVRN在分化开始后第30天上调。这些可以通过qPCR或免疫染色来量化。
本文公开的方法能够在化学成分确定且无异源成分(xeno-free)的培养物环境下，稳健地将人胚胎干细胞分化为感光细胞，具有将临床上安全的感光细胞移植到患者中的前景。因此，提供了化学成分确定且无动物血清的方法，该方法符合GMP并且提供了临床级的感光细胞。
某些视网膜祖细胞亚群也可以通过使用在分化开始后的某些天制得的基因谱或蛋白谱来鉴定。“第X天基因谱(Day X gene profile)”包含在第X天的祖细胞的基因表达水平，该基因表达水平的测量单位为每百万基因计数(counts per million，cpm)，如根据calculateCPM函数由scater 1.8.4R安装包所计算的。在这点上，预期给定基因的表达水平将在分化过程期间变化，并且表达水平的测量可用于鉴定可能对于特定目的特别有用的亚群。
构想了四种特定的基因谱。第一基因谱在第16-24天(本文也称为“第16-24天基因谱”)中的任一天制得。第二基因谱在第20天制得，在本文中也称为“第20天基因谱”。对于第16-24天基因谱的任何提及也应被认为具体提及了第20天的基因谱。第三基因谱在第26-34天中的任一天制得，本文也称为“第26-34天基因谱”。第四基因谱在第30天制得，在本文中也称为“第30天基因谱”。对于第26-34天基因谱的任何提及也应被认为具体提及了第30天的基因谱。
基于第16-24天基因谱和第26-34天基因谱，已鉴定出五个特定亚群。
在第一亚群(A)中，在第26-34天基因谱中表达基因CRX、C11orf96、NXPH4、NTS、DCT、PRDM1、NEUROD4、S100A13、RCVRN、FAM57B、SYT4、DLL3、SSTR2、CHRNA5和ROBO2中的至少一种。具体构想了这些基因中任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种的组合。在一些实施方案中，所表达基因的组合包括CRX和C11orf96。
在第二亚群(B)中，在第26-34天基因谱中表达基因STMN2、ONECUT2、ATOH7、ELAVL4和GAP43中的至少一种。具体构想了这些基因中的任何2、3、4或5种的组合。在一些实施方案中，所表达基因的组合包括STMN2和ONECUT2。
在第三亚群(C)中，在第26-34天基因谱中表达基因CNTN2、NEFM、NEFL、PRPH、POU4F2和CXCR4中的至少一种。具体构想了这些基因中的任何2、3、4、5或6种的组合。在一些实施方案中，所表达基因的组合包括CNTN2和POU4F2。
在第四亚群(D)中，基因PAX6、SIX3和SLC2A1中的至少一种在第26-34天基因谱中表达。具体构想了这些基因中的任何2或3种的组合。在一些实施方案中，所表达基因的组合包括PAX6和SIX3。
在第五亚群(E)中，在第26-34天基因谱中表达基因VSX2、PTH2、FZD5、RARRES2、DIO3、SOX2和CYP1B1中的至少一种。具体构想了这些基因中的任何2、3、4、5、6或7种的组合。在一些实施方案中，所表达基因的组合包括VSX2和CYP1B1。
在本公开中，对“所表达”基因的提及意指该基因的基因表达水平具有1次每百万基因计数(cpm)的最小值。还应注意，在这些亚群中表达的某些基因的讨论不应解释为意指另外的基因未表达。例如，基因STMN2仍然在亚群(A)中表达是可能的。
此外，在这五个亚群中，第16-24天基因谱通常指示表达基因DAPL1、SIX6、SFRP2、LHX2、PAX6、CDH2、CLDN1、TRPM3、RELN、DCT或PMEL中的至少一种。具体构想了这些基因中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种的组合。在更具体的实施方案中，表达基因SIX6、SFRP2、LHX2、PAX6、DCT或PMEL中的至少一种，包括这些基因中的任何2、3、4、6或6种的组合。在特定的实施方案中，PAX6在第16-24天基因谱中表达。如果需要，可使用第16-24天基因谱来丢弃终点不是所需细胞谱系的分化细胞。
在亚群(A)的特定实施方案中，第26-34天基因谱指示：(i)CRX以至少5次每百万基因计数而表达，和/或(ii)C11orf96以至少5次每百万基因计数而表达。在更具体的实施方案中，第26-34天基因谱指示：(i)CRX以至少10次每百万基因计数而表达，和/或(ii)C11orf96以至少10次每百万基因计数而表达。
在亚群(B)的特定实施方案中，第26-34天基因谱指示：(i)STMN2以至少5次每百万基因计数而表达，和/或(ii)ONECUT2以至少5次每百万基因计数而表达。在更具体的实施方案中，第26-34天基因谱指示：(i)STMN2以至少10次每百万基因计数而表达，和/或(ii)ONECUT2以至少10次每百万基因计数而表达。
在亚群(C)的特定实施方案中，第26-34天基因谱指示(i)CNTN2以至少5次每百万基因计数而表达，和/或(ii)POU4F2以至少5次每百万基因计数而表达。在更具体的实施方案中，第26-34天基因谱指示：(i)CNTN2以至少10次每百万基因计数而表达，和/或(ii)POU4F2以至少10次每百万基因计数而表达。
在亚群(D)的特定实施方案中，第26-34天基因谱指示：(i)PAX6以至少5次每百万基因计数而表达，和/或(ii)SIX3以至少5次每百万基因计数而表达。在更具体的实施方案中，第26-34天基因谱指示：(i)PAX6以至少10次每百万基因计数而表达，和/或(ii)SIX3以至少10次每百万基因计数而表达。
在亚群(E)的特定实施方案中，第26-34天基因谱指示：(i)VSX2以至少5次每百万基因计数而表达，和/或(ii)CYP1B1以至少5次每百万基因计数而表达。在更具体的实施方案中，第26-34天基因谱指示：(i)VSX2以至少10次每百万基因计数而表达，和/或(ii)CYP1B1以至少10次每百万基因计数而表达。
在以下非限制性工作实例中进一步说明本公开，但应理解，这些实例仅意图为说明性的，且本公开不意图限制于本文中所陈述的材料、条件、工艺参数等。
实施例
实施例1
过表达LN-523和LN-323的HEK的细胞系开发
在图1A中提供了描述生产重组层粘连蛋白-523和层粘连蛋白-323的步骤的流程图。简言之，产生编码层粘连蛋白α-3、β-2和γ-3链并且含有三种不同抗生素抗性基因的人重组层粘连蛋白表达质粒，并将其顺序转染到HEK细胞中。为了产生LN-523，将编码层粘连蛋白α-5、β-2和γ-3链的表达质粒顺序转染到HEK细胞中。建立了过表达所需层粘连蛋白链的稳定克隆细胞系。第三，使用qPCR和蛋白质印迹鉴定潜在的阳性克隆。第四，将细胞培养基切换为用于阳性层粘连蛋白克隆的无血清培养基。第五，通过凝胶过滤含有所分泌层粘连蛋白的细胞培养基。最后，进行蛋白质印迹和质谱法以确认层粘连蛋白链的身份。
在Penp-Strep(Life Technologies)的存在下将人胚肾(HEK)293细胞培养并维持基础培养基中，所述基础培养基由补充有10％胎牛血清的DMEM-GlutaMAX、高浓度葡萄糖、丙酮酸盐(Life Technologies)组成。对于用于治疗目的的人LN-323和LN-523的GMP生产，在人血清(而非胎牛血清)存在下培养细胞。
在质粒转染前，在无Penp-Strep的情况下接种HEK293细胞，使得它们在转染时达到约70％汇合。使用2000试剂(Life Technologies)和Opti-MeM(LifeTechnologies)将含有人层粘连蛋白-γ-3链的人重组层粘连蛋白质粒(pcDNA3.1)首先转染到HEK293细胞中。首先使用潮霉素B选择，利用克隆环(Bel-Art)来建立克隆稳定细胞系HEK003。随后将表达层粘连蛋白β-2链的质粒转染到HEK003中。然后，利用遗传霉素(G418)和潮霉素B选择来建立HEK023。将表达层粘连蛋白α-5和层粘连蛋白α-3链的质粒分别转染到HEK023克隆细胞系中，以分别生成HEK523和HEK323克隆细胞系。用博莱霉素、遗传霉素(G418)和潮霉素B选择最终的HEK523/323细胞系。
通过使用LAMA5、LAMA3、LAMB2和LAMC3基因引物对的定量聚合酶链式反应(qPCR)分析来确定克隆细胞系的身份。进一步扩增HEK523和HEK323的潜在阳性克隆细胞系，并将基础培养基切换为无血清培养基一周。收集培养基并进行蛋白质印迹分析以进一步证实由阳性克隆细胞系产生的层粘连蛋白的身份。所选择的阳性HEK523和HEK323克隆细胞系应分别将LN-523和LN-323分泌到培养基中。在4℃下将培养基在聚乙二醇中渗析4-5天。将含有LN-523和LN-323的培养基在Amico离心管中浓缩，并通过XK26/100柱使用色谱系统(GE Healthcare Life Sciences)进行蛋白纯化。进行蛋白质印迹和质谱法，以对视网膜特异性层粘连蛋白同种型的洗脱的纯化级分进行分析。
图1B是显示LN-523的纯化级分或部分中的层粘连蛋白α-5、β-2和γ-3链的存在的蛋白质印迹。图1C是示出了使用色谱系统说明LN-523克隆的蛋白洗脱曲线的色谱图。图1D是LC-MS/MS(液相色谱-质谱法)结果，显示了存在层粘连蛋白α-5、β-2和γ-3链。
图1E是显示LN-323的纯化级分或部分中的层粘连蛋白α-3、β-2和γ-3链的存在的蛋白质印迹。图1F是示出了使用色谱系统说明LN-323克隆的蛋白洗脱曲线的色谱图。图1G是LC-MS/MS(液相色谱-质谱法)结果，显示了存在层粘连蛋白α-5、β-2和γ-3链。
hESC的维持
根据制造商说明(BioLamina)，在4℃下，用10μg/mL的纯化人LN同种型包覆的培养板(Costar)过夜。在LN-521上体外接种并繁殖多能人胚胎干细胞(hESC)，使其维持多潜能性。在预包覆LN的平板上以单层培养hESC细胞系H1(WiCell Research Institute)，并将其维持在NutriStem hESC XF(Biological Industries，Israel)培养基中。在汇合后，通过使用TrypLESelect(GIBCO Invitrogen)在37℃、5％CO2下胰蛋白酶消化8分钟，对细胞进行传代培养。常规地，在10,000-20,000个细胞/cm2下传代H1细胞系。
感光细胞分化方案
用(A)仅LN-521；(B)LN-523和LN-521的混合物(2:1比率)；或者(C)LN-323+LN-521的混合物(2:1比率)包覆24孔组织培养板。对该板进行包覆以获得10μg/mL的终浓度。以约70,000个细胞/孔的接种密度平铺hESC(H1)，并将其维持在NutriStem中2天，每天更换新鲜培养基。
在整个分化过程中使用的基础培养基由补充有0.1mMβ-巯基乙醇(LifeTechnologies)、1×非必需氨基酸溶液(Gibco)和1mM丙酮酸(Gibco)的GMEM(Glasgow最小必需培养基，Life Technologies)组成。
在达到约70％汇合2天之后，用神经诱导培养基(neural induction media，NIM)替代NutriStem。NIM由97％的基础培养基、2％的无维生素A的B27(Life Technologies)补充剂、1％的N2补充物(CTS，Life Technologies)、5μM的SB431542(Sigma)和5μM的CKI-7(Sigma)组成。从第0天(D0)到D6，每2天更换一次NIM。
在分化的第7天(D7)，用感光细胞分化培养基(photoreceptor differentiationmedia，PRDM)替代NIM。PRDM由97％的基础培养基、2％的无维生素A的B27补充剂、1％的N2补充物(CTS)、10ng/ml人BDNF(脑源性神经营养因子，PEPROTECH)、10ng/ml人CNTF(睫状神经营养因子，PROSPEC-TANY TECHNOGENE)、0.5μM视黄酸(Tocris Bioscience)以及10μM DAPT(N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰基)]-S-苯基甘氨酸叔丁酯，Selleckchem)组成。每隔一天更换该培养基，直到D30。
图2A是描述了将hESC分化为感光细胞的方法的图。指示了三种细胞培养物：用于分化前培养的Nutristem(第0天)；神经诱导培养基；和感光细胞分化培养基。还提供了三幅图，示出了D0、D20和D30时的细胞。
图2B和图2C是在LN-523+LN-521基底上生长的细胞的一组五幅不同的图。图2B的上图比较了D0细胞和D20细胞中标志物OCT3/4、NANOG、BRA、MIXL1、SOX17、FOXA2和PAX6的表达。OCT3/4和NANOG在D0上调，而PAX6在D20上调。
图2B的左下图比较了PAX6的表达，从左到右针对：D0 LN-523+LN-521、D20LN-523+LN-521、D20仅LN-523、D30 LN-523+LN-521和D30仅LN-523。与D0相比，PAX6在D20和D30时上调。
图2B的右下图比较了VSX2(视觉系统同源盒2(Visual System Homeobox 2))的表达，从左到右针对：D0 LN-523+LN-521、D20 LN-523+LN-521、D20仅LN-523、D30LN-523+LN-521和D30仅LN-523。与D0相比，VSX2在D20和D30时上调。
图2C的左图比较了CRX(锥杆同源盒蛋白(Cone Rod Homeobox protein))的表达，从左到右针对：D0 LN-523+LN-521、D20 LN-523+LN-521、D20仅LN-523、D30 LN-523+LN-521和D30仅LN-523。与D0相比，CRX在D20和D30时上调。
图2C的右图比较了RCVRN(恢复蛋白，recoverin)的表达，从左到右针对：D0LN-523+LN-521、D20 LN-523+LN-521、D20仅LN-523、D30 LN-523+LN-521和D30仅LN-523。与D0相比，RCVRN在D30时上调。
图2D和图2E是在LN-323+LN-521基底上生长的细胞的一组五幅不同的图。图2D的上图比较了标志物OCT3/4、NANOG、BRA、MIXL1、SOX17、FOXA2和PAX6在D0细胞和D20细胞的表达。OCT3/4和NANOG在D0时上调，而PAX6在D20时上调。
图2D的左下图比较了PAX6的表达，从左到右针对：D0 LN-323+LN-521、D20LN-323+LN-521、D20仅LN-323、D30 LN323+LN-521和D30仅LN-323。与D0相比，PAX6在D20和D30时上调。
图2D的右下图比较了VSX2的表达，从左到右针对：D0 LN-323+LN-521、D20LN-323+LN-521、D20仅LN-323、D30 LN-323+LN-521和D30仅LN323。与D0相比，VSX2在D20和D30时上调。
图2E的左图比较了CRX的表达，从左到右针对：D0 LN-323+LN-521、D20 LN-323+LN-521、D20仅LN-323、D30 LN-323+LN-521和D30仅LN-323。与D0相比，CRX在D20和D30时上调。
图2E的右图比较了RCVRN的表达，从左到右针对：D0 LN-323+LN-521、D20LN-323+LN-521、D20仅LN-323、D30 LN-323+LN-521和D30仅LN-323。与D0相比，RCVRN在D20和D30时上调。
图2F和图2G是在仅LN-521的基底上生长的细胞的一组五幅不同的图。图2F的上图比较了标志物OCT3/4、NANOG、BRA、MIXL1、SOX17、FOXA2和PAX6在D0细胞和D20细胞的表达。OCT3/4和NANOG在D0时上调，而PAX6在D20时上调。
图2F的左下图比较了PAX6的表达，从左到右针对：D0、D20和D30。与D0相比，PAX6在D20和D30时上调。
图2F的右下图比较了VSX2的表达，从左到右针对：D0、D20和D30。与D0相比，VSX2在D20和D30时上调。
图2G的左图比较了CRX的表达，从左到右针对：D0、D20和D30。与D0相比，CRX在D20和D30时上调。
图2G的右下图比较了RCVRN的表达，从左到右针对：D0、D20和D30。与D0相比，RCVRN在D20和D30时上调。
图3A-3C是显示对D0的未分化hESC和D38的hESC来源的视网膜细胞的免疫细胞化学分析的图片组。图3A是在LN-523+LN-521基底上生长的细胞。图3B是在LN-523+LN-521基底上生长的细胞。图3C是在仅LN-521基底上生长的细胞。每组包含10张显微照片，其中比例尺＝20μm。在每组中，顶行显示了针对D0细胞的OCT4分析，D0细胞的PAX6分析以及D38细胞的PAX6分析。第二行显示了与DAPI合并的这些细胞。第三行显示了针对D38细胞的VSX2分析和针对D38细胞的RCVRN分析。第四行显示了与DAPI合并的这些细胞。在D0未分化干细胞中，表达OCT4，但不表达PAX6(配对框基因6)。在D38分化细胞中，表达标志物PAX6、VSX2和RCVRN。
图3D比较了对于三种层粘连蛋白基质的标志物PAX6、VSX2、CRX和RCVRN表达。从左到右，基质为LN-523:LN-521、LN-323:LN-521和仅LN-521。
实施例2
用来源于H1胚胎干细胞的第20天和第30天的视网膜祖细胞生成两个独立的单细胞RNA测序数据集。用实施例1的层粘连蛋白方案培养H1细胞20天和30天。在每种情况下，使用10×基因组学试剂盒分离RNA，并使用Illumina Hi-Seq3000测序平台对其进行测序。将读数映射到人基因组(Ensembl版本90)，并使用Cell Ranger 2.1.1 10x基因组学软件进行定量。向Cell Ranger软件提供通过对Ensembl转录组进行基因生物型(蛋白质编码、lincRNA和反义)过滤而生成的定制参考转录组。以设定为3000的预期细胞数目参数(预期细胞)运行Cell Ranger。
第20天和第30天的Cell Ranger的估计细胞数目分别为1,790和3,881。第20天和第30天的总读数分别为631,803,330和687,721,993。第20天和第30天的映射到人基因组的读数百分比分别为97.1％和96.8％。Cell Ranger返回与每个基因(即基因计数)和细胞相关的唯一分子标识符(unique molecular identifier，UMI)的数目。然后将Cell Ranger输出矩阵(即，genes.tsv和barcodes.tsv)输入到R中，并丢弃所有细胞中具有零计数的基因。
对于每个样品(即，第20天和第30天的视网膜祖细胞)，进行独立分析。在每次分析中，通过去除以下细胞来进行细胞质量控制：(a)具有非常低和非常高的文库大小的细胞(即，分别低于和高于总细胞文库大小的第5百分位和第99百分位的细胞)；(b)具有低的检测基因数目的细胞(即，低于由在每种细胞中检测到的基因总数形成的分布的第5百分位的细胞)；和(c)线粒体基因超过总基因计数的10％的细胞。在去除了未通过细胞质量控制步骤的细胞后，计算所有基因的每百万基因计数(gene count-per-million(CPM))。通过将原始基因计数矩阵提供给来自scater 1.8.4R安装包的calculateCPM函数来计算每百万基因计数(McCarthy等,2017,Scater:pre-processing,quality control,normalization andvisualization of single-cell RNA-seq data in R.Bioinformatics btw777)。运行calculateCPM函数，其中use_size_factors参数设置为FALSE。
此外，在每个单独的分析中，采取以下五个基因质量控制步骤：(a)仅保留“可检测的”基因，其定义为在总细胞的至少1％中检测到多于一个转录物的基因；(b)去除在数据中具有低的平均表达的基因(即，具有低于0.01的平均原始基因计数表达的基因，该截断是基于所有细胞和所有基因的平均基因表达的总分布而设定的)；(c)使用M3Drop 3.09R安装包来去除具有高丢失(dropout)率的基因(Andrews,2017,M3Drop:Michaelis-MentenModelling of Dropouts in single-cell RNASeq)。在该步骤中，使用M3Drop假发现率(falsediscovery rate，FDR)将所有基因从低FDR至高FDR排序，然后除去底部25％的基因(即具有最高丢失的基因)；(d)去除基因表达分布中的异常值基因(即，“MALAT1”基因)；和(e)去除在线粒体基因组上编码的基因。
在基因质量控制步骤之后，用scran 1.8.4R安装包将基因计数归一化(Lun等,2016,A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seqdata with Bioconductor.F1000Research 5,2122)。通过用quickCluster函数对数据进行预聚类，由细胞池计算scran尺寸因子。将该函数的输出对象提供至computeSumFactors函数，然后使用来自scater 1.8.4R安装包(具有默认参数化)的标准化函数计算经log2-变换的归一化计数(McCarthy等,2017,Scater:pre-processing,quality control,normalization and visualization of single-cell RNA-seq datainR.Bioinformatics btw777)。然后，为了考虑细胞周期效应，通过使用来自scater 1.8.4R安装包的cyclone函数为每个细胞计算G2M和G1细胞周期阶段评分(McCarthy等，2017)。该函数与一组人细胞周期基因一起提供，这些基因提供于(Scialdone等,2015,Computationalassignment of cell-cycle stage from single-cell transcriptomedata.Methods 85,54–61)中。然后，通过提供计数并将“细胞周期G2M评分和“细胞周期G1评分”作为来自limma 3.36.3R安装包的removeBatchEffect函数的协变量来针对细胞周期效应校正经Log2-scran归一化的基因计数(Ritchie等,2015,limma powers differentialexpression analyses for RNA-sequencing andmicroarray studies.Nucleic AcidsRes.43,e47–e47)。
为了在视网膜祖细胞的异质集合内鉴定标志细胞亚群的基因，使用SC3 1.8R安装包进行细胞聚类(Kiselev等,2017SC3:consensus clustering of single-cell RNA-seqdata.Nat.Methods 14,483–486)。通过使用来自scater 1.8.4R安装包的trendVar和decomposeVar函数来识别高度可变的基因(Lun等，2016)。通过所得假发现率(FDR)值对所有基因进行排序(从低至高)，并且将前50％的基因(表示具有最高变异性的基因)用于以SC3的细胞聚类。使用针对细胞周期效应进行校正后的经Log2-scran归一化的基因计数和所计算的仅高可变基因的集合来运行SC3。是通过自动检测聚类数(即，通过运行SC3 R安装包的sc3_estimate_k函数而获得的K参数)来运行SC3。这导致分别在第20天和第30天的视网膜祖细胞中鉴定到19和21个细胞聚类。
在第20天的视网膜祖细胞中，鉴定了表达PAX6基因的细胞的标志基因。在第30天的视网膜祖细胞中，针对不同的细胞亚群鉴定了标志基因：(a)表达PAX6的细胞；(b)表达CRX的细胞；和(c)表达VSX2的细胞。
为了鉴定针对这些细胞集合的标志基因，在先前计算的两个聚类集合(分别为第20天和第30天的19和21个细胞聚类)的每一个中，通过使用针对细胞周期效应进行校正后的经Log2-scran归一化的基因计数来计算目的基因(例如PAX6)的中值表达水平。然后，为了获得单一的目的基因阳性细胞聚类，目的基因中值Log2表达水平高于0.58(在未进行log转换的基因计数中，该值对应于0.5)的聚类细胞被合并在一起。然后，在所有剩余的聚类和目的基因阳性细胞聚类之间，进行成对差异表达分析。用edgeR 3.22.3R安装包进行该差异表达分析(Robinson等,2010,edgeR:a Bioconductor package for differentialexpression analysis ofdigital gene expression data.Bioinformatics 26,139–140)。使用未归一化的(原始)基因计数来运行EdgeR，并使用scran 1.8.4R安装包的sizeFactors函数和edgeR R安装包的estimateDisp、glmQLFit和glmQLFTest函数来计算尺寸因子。仅使用通过上述所有质量控制步骤的基因和细胞。为考虑到细胞周期效应，将“细胞周期G2M得分”和“细胞周期G1得分”包括在如以上所计算的edgeR模型中。在进行差异表达后，细胞聚类标志基因被定义为满足以下两个条件的那些基因：(a)当与所有其他聚类比较时，成对Log2倍数变化值高于2，和(b)在其中该基因被声明为标志物的聚类中，Log2中值表达水平高于1。该表达值对应于未进行log转换的基因计数中的1。
在第30天视网膜祖细胞中，还计算了另外两个细胞聚类的基因标志物：(a)当以K参数为2、指定为STMN2+聚类来运行SC3算法时所获得的细胞聚类编号1；(b)当以K参数为3、指定为CNTN2+聚类来运行SC3算法时所获得的细胞聚类编号3。通过运行差异表达分析和上述步骤来计算这些细胞聚类的基因标志物。
选择标志这些细胞亚群中的每一个的最顶端的基因(即，第20天PAX6+细胞和第30天PAX6+细胞、VSX2+细胞、CRX+细胞、STMN2+细胞以及CNTN2+细胞)，并且通过使用来自R安装包gplots 3.0.1的heatmap.2函数，在无缩放和默认参数化的情况下，将它们的基因-基因成对皮尔逊相关水平绘制为直方图(Warnes等,2016,gplots:Various RProgrammingTools for Plotting Data)，以获得图5和图6。
通过使用t-分布的随机近邻嵌入算法(t-SNE)(McCarthy等，2017)，分别使第20天和第30天的祖细胞可视化。通过将经Log2 scran归一化并经细胞周期调整后基因计数提供给来自scater 1.8.4R安装包的plotTSNE函数(McCarthy等，2017)，用两个维度计算t-SNE。将t-SNE的perplexity参数设定为通过了质量控制除以5的细胞数。在t-SNE图中，每个点对应于单个细胞，并且通过将每个细胞与标志着第20天和第30天的视网膜祖细胞的每一亚群的基因的表达水平进行映射，来在这些图中可视化细胞亚群(图4C-4D、7A-7J)。将最浅和最深颜色设定为每个所绘制基因的最小和最大表达水平。还针对由基因NANOG和POU5F1(图4A-4B)的表达水平染色的第20天视网膜祖细胞生成t-SNE图。
发现第20天的视网膜祖细胞缺少基因NANOG和POU5F1的表达(图4A-4B)。还发现第20天的视网膜祖细胞在特定细胞亚群中表达PAX6(图4C)。
还鉴定出属于该表达PAX6的第20天细胞亚群的第20天视网膜祖细胞的以下基因标志物(图5)：DAPL1、SIX6、SFRP2、LHX2、PAX6、CDH2、CLDN1、TRPM3、RELN、DCT和PMEL。
在第30天视网膜祖细胞中，鉴定出5种不同的细胞亚群(图6)。这些细胞亚群通过以下基因的表达来标志：
(a)CRX、C11orf96、NXPH4、NTS、DCT、PRDM1、NEUROD4、S100A13、RCVRN、FAM57B、SYT4、DLL3、SSTR2、CHRNA5和ROBO2(CRX+亚群，包括在图7A和图7B中突出显示的细胞)；
(b)STMN2、ONECUT2、ATOH7、ELAVL4和GAP43(STMN2+亚群，包括图7C和图7D中突出显示的细胞)；
(c)CNTN2、NEFM、NEFL、PRPH、POU4F2和CXCR4(CNTN2+亚群，包括图7E和图7F突出显示的细胞)；
(d)PAX6、SIX3和SLC2A1(PAX6+亚群，包括图7G和图7H中突出显示的细胞)；以及
(e)VSX2、PTH2、FZD5、RARRES2、DIO3、SOX2和CYP1B1(VSX2+亚群，包括图7I和图7J中突出显示的细胞)。
已经参考示例性实施方案描述了本公开。在阅读和理解前面的详细描述时，其他人将想到修改和改变。本公开旨在被解释为包括所有这样的修改和改变，只要它们落在所附权利要求或其等同物的范围内。
以下各项目对应本申请母案的原始递交项目：
项目1.视网膜祖细胞，其中第26-34天基因谱指示：
(A)表达基因CRX、C11orf96、NXPH4、NTS、DCT、PRDM1、NEUROD4、S100A13、RCVRN、FAM57B、SYT4、DLL3、SSTR2、CHRNA5和ROBO2中的至少一种；或
(B)表达基因STMN2、ONECUT2、ATOH7、ELAVL4和GAP43中的至少一种；或
(C)表达基因CNTN2、NEFM、NEFL、PRPH、POU4F2和CXCR4中的至少一种；或
(D)表达基因PAX6、SIX3和SLC2A1中的至少一种；或
(E)表达基因VSX2、PTH2、FZD5、RARRES2、DIO3、SOX2和CYP1B1中的至少一种。
项目2.根据项目1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：
(A)表达基因CRX、C11orf96、NXPH4、NTS、DCT、PRDM1、NEUROD4、S100A13、RCVRN、FAM57B、SYT4、DLL3、SSTR2、CHRNA5和ROBO2中的至少两种；或
(B)表达基因STMN2、ONECUT2、ATOH7、ELAVL4和GAP43中的至少两种；或
(C)表达基因CNTN2、NEFM、NEFL、PRPH、POU4F2和CXCR4中的至少两种；或
(D)表达基因PAX6、SIX3和SLC2A1中的至少两种；或
(E)表达基因VSX2、PTH2、FZD5、RARRES2、DIO3、SOX2和CYP1B1中的至少两种。
项目3.根据项目1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：表达基因CRX或C11orf96；并且
其中，所述第26-34天基因谱指示：(i)CRX以至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)C11orf96以至少5次每百万基因计数而表达。
项目4.根据项目3所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：(i)CRX以至少10次每百万基因计数而表达，或者(ii)C11orf96以至少10次每百万基因计数而表达。
项目5.根据项目1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：表达基因STMN2或ONECUT2；并且
其中，所述第26-34天基因谱指示：(i)STMN2以至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)ONECUT2以至少5次每百万基因计数而表达。
项目6.根据项目5所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：(i)STMN2以至少10次每百万基因计数而表达，或者(ii)ONECUT2以至少10次每百万基因计数而表达。
项目7.根据项目1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：表达基因CNTN2或POU4F2；并且
其中，所述第26-34天基因谱指示：(i)CNTN2以至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)POU4F2以至少5次每百万基因计数而表达。
项目8.根据项目7所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：(i)CNTN2以至少10次每百万基因计数而表达，或者(ii)POU4F2以至少10次每百万基因计数而表达。
项目9.根据项目1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：表达基因PAX6或SIX3；并且
其中，所述第26-34天基因谱指示：(i)PAX6以至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)SIX3以至少5次每百万基因计数而表达。
项目10.根据项目9所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：(i)PAX6以至少10次每百万基因计数而表达，或者(ii)SIX3以至少10次每百万基因计数而表达。
项目11.根据项目1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：表达基因VSX2或CYP1B1；并且
其中，所述第26-34天谱指示：(i)VSX2以至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)CYP1B1以至少5次每百万基因计数而表达。
项目12.根据项目11所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：(i)VSX2以至少10次每百万基因计数而表达，或者(ii)CYP1B1以至少10次每百万基因计数而表达。
项目13.根据项目1所述的视网膜祖细胞，其中，第16-24天基因谱指示：表达基因DAPL1、SIX6、SFRP2、LHX2、PAX6、CDH2、CLDN1、TRPM3、RELN、DCT和PMEL中的至少一种。
项目14.根据项目13所述的视网膜祖细胞，其中所述第16-24天基因谱指示：表达基因SIX6、SFRP2、LHX2、PAX6、DCT或PMEL中的至少一种。
项目15.根据项目13所述的视网膜祖细胞，其中所述第16-24天基因谱指示：表达PAX6。
项目16.产生视网膜祖细胞群的方法，其包括：
在细胞培养表面上平铺多能人干细胞，所述细胞培养表面上具有层粘连蛋白基质，其中所述层粘连蛋白基质包含(i)选自由层粘连蛋白-323和层粘连蛋白-523组成的组的第一层粘连蛋白，和(ii)为层粘连蛋白-521的第二层粘连蛋白，其中所述第一层粘连蛋白和所述层粘连蛋白-521分别为完整蛋白或蛋白片段；
培养所述多能人干细胞以获得视网膜祖细胞；
通过以下步骤鉴定视网膜祖细胞群：(i)制备第16-24天基因谱并选择其中表达基因DAPL1、SIX6、SFRP2、LHX2、PAX6、CDH2、CLDN1、TRPM3、RELN、DCT和PMEL中的至少一种的视网膜祖细胞；和(ii)制备第26-34天基因谱并选择下述视网膜祖细胞，其中：
(A)表达基因CRX、C11orf96、NXPH4、NTS、DCT、PRDM1、NEUROD4、S100A13、RCVRN、FAM57B、SYT4、DLL3、SSTR2、CHRNA5和ROBO2中的至少一种；或
(B)表达基因STMN2、ONECUT2、ATOH7、ELAVL4和GAP43中的至少一种；或
(C)表达基因CNTN2、NEFM、NEFL、PRPH、POU4F2和CXCR4中的至少一种；或
(D)表达基因PAX6、SIX3和SLC2A1中的至少一种；或
(E)表达基因VSX2、PTH2、FZD5、RARRES2、DIO3、SOX2和CYP1B1中的至少一种。
项目17.根据项目16所述的方法，其中所述第一层粘连蛋白与所述第二层粘连蛋白的重量比为约1:1至约4:1。
项目18.根据项目16所述的方法，其中通过以下步骤培养所述多能人干细胞：
在包含TGFβ抑制剂和Wnt抑制剂的神经诱导培养基中培养所述细胞持续第一时间段；和
在包含脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、视黄酸和γ分泌酶抑制剂的感光细胞分化培养基中培养所述细胞持续第二时间段。
项目19.根据项目18所述的方法，其中所述第一时间段为约120小时至约168小时。
项目20.根据项目18所述的方法，其中所述第二时间段为约288小时至约816小时。
项目21.根据项目18所述的方法，其中所述神经诱导培养基包含TGFβ抑制剂和Wnt抑制剂。
项目22.根据项目21所述的方法，其中所述神经诱导培养基包含：
约5μM至约15μM的所述TGFβ抑制剂；和
约5μM至约15μM的所述Wnt抑制剂。
项目23.根据项目21所述的方法，其中：
所述TGFβ抑制剂是SB431542；或
所述Wnt抑制剂是CKI-7。
项目24.根据项目18所述的方法，其中所述感光细胞分化培养基包含：
约1ng/mL至约20ng/mL的所述脑源性神经营养因子(BDNF)；
约1ng/mL至约30ng/mL的所述睫状神经营养因子(CNTF)；
约0.1μM至约5μM的所述视黄酸；和
约5μM至约15μM的所述γ分泌酶抑制剂。
项目25.根据项目18所述的方法，其中所述γ分泌酶抑制剂是DAPT。

Claims (28)

1.视网膜祖细胞，其中第26-34天基因谱指示：
(A)(i)CRX以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)C11orf96以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达；或
(B)(i)STMN2以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)ONECUT2以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达；或
(C)(i)CNTN2以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)POU4F2以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达；或
(D)(i)PAX6以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)SIX3以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达；或
(E)(i)VSX2以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)CYP1B1以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达。
2.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中，所述第26-34天基因谱指示：(i)CRX以至少5次每百万基因计数而表达，并且(ii)C11orf96以至少5次每百万基因计数而表达。
3.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：(i)CRX以至少10次每百万基因计数而表达，或者(ii)C11orf96以至少10次每百万基因计数而表达。
4.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱还指示：NXPH4、NTS、DCT、PRDM1、NEUROD4、S100A13、RCVRN、FAM57B、SYT4、DLL3、SSTR2、CHRNA5或ROBO2以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少1次每百万基因计数而表达。
5.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中，所述第26-34天基因谱指示：(i)STMN2以至少5次每百万基因计数而表达，并且(ii)ONECUT2以至少5次每百万基因计数而表达。
6.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：(i)STMN2以至少10次每百万基因计数而表达，或者(ii)ONECUT2以至少10次每百万基因计数而表达。
7.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱还指示：ATOH7、ELAVL4或GAP43以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少1次每百万基因计数而表达。
8.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中，所述第26-34天基因谱指示：(i)CNTN2以至少5次每百万基因计数而表达，并且(ii)POU4F2以至少5次每百万基因计数而表达。
9.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：(i)CNTN2以至少10次每百万基因计数而表达，或者(ii)POU4F2以至少10次每百万基因计数而表达。
10.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱还指示：NEFM、NEFL、PRPH或CXCR4以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少1次每百万基因计数而表达。
11.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中，所述第26-34天基因谱指示：(i)PAX6以至少5次每百万基因计数而表达，并且(ii)SIX3以至少5次每百万基因计数而表达。
12.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：(i)PAX6以至少10次每百万基因计数而表达，或者(ii)SIX3以至少10次每百万基因计数而表达。
13.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱还指示：SLC2A1以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少1次每百万基因计数而表达。
14.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中，所述第26-34天基因谱指示：(i)VSX2以至少5次每百万基因计数而表达，并且(ii)CYP1B1以至少5次每百万基因计数而表达。
15.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱指示：(i)VSX2以至少10次每百万基因计数而表达，或者(ii)CYP1B1以至少10次每百万基因计数而表达。
16.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中所述第26-34天基因谱还指示：PTH2、FZD5、RARRES2、DIO3或SOX2以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少1次每百万基因计数而表达。
17.根据权利要求1所述的视网膜祖细胞，其中，第16-24天基因谱指示：表达基因DAPL1、SIX6、SFRP2、LHX2、PAX6、CDH2、CLDN1、TRPM3、RELN、DCT和PMEL中的至少一种。
18.根据权利要求12所述的视网膜祖细胞，其中所述第16-24天基因谱指示：表达PAX6。
19.产生视网膜祖细胞群的方法，其包括：
在细胞培养表面上平铺多能人干细胞，所述细胞培养表面上具有层粘连蛋白基质，其中所述层粘连蛋白基质包含(i)为层粘连蛋白-521的第一层粘连蛋白，其中所述层粘连蛋白-521分别为完整蛋白或蛋白片段，以及(ii)选自由层粘连蛋白-323和层粘连蛋白-523组成的组的第二层粘连蛋白，其中所述第二层粘连蛋白为完整蛋白或蛋白片段；
培养所述多能人干细胞以获得视网膜祖细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法还包括；
通过以下步骤鉴定视网膜祖细胞群：(i)制备第16-24天基因谱并选择其中表达基因DAPL1、SIX6、SFRP2、LHX2、PAX6、CDH2、CLDN1、TRPM3、RELN、DCT和PMEL中的至少一种的视网膜祖细胞；和(ii)制备第26-34天基因谱并选择下述视网膜祖细胞，其中：
(A)(i)CRX以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)C11orf96以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达；或
(B)(i)STMN2以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)ONECUT2以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达；或
(C)(i)CNTN2以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)POU4F2以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达；或
(D)(i)PAX6以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)SIX3以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达；或
(E)(i)VSX2以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达，或者(ii)CYP1B1以经Log2归一化并经细胞周期调整后的基因计数的至少5次每百万基因计数而表达。
21.根据权利要求19所述的方法，其中通过以下步骤培养所述多能人干细胞：
在包含TGFβ抑制剂和Wnt抑制剂的神经诱导培养基中培养所述细胞持续第一时间段；和
在包含脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、视黄酸和γ分泌酶抑制剂的感光细胞分化培养基中培养所述细胞持续第二时间段。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一时间段为120小时至168小时。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二时间段为288小时至816小时。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述神经诱导培养基包含：
5μM至15μM的所述TGFβ抑制剂；和
5μM至15μM的所述Wnt抑制剂。
25.根据权利要求21所述的方法，其中：
所述TGFβ抑制剂是SB431542；或
所述Wnt抑制剂是CKI-7。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述感光细胞分化培养基包含：
1ng/mL至20ng/mL的所述脑源性神经营养因子(BDNF)；
1ng/mL至30ng/mL的所述睫状神经营养因子(CNTF)；
0.1μM至5μM的所述视黄酸；和
5μM至15μM的所述γ分泌酶抑制剂。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述γ分泌酶抑制剂是DAPT。
28.根据权利要求19所述的方法，其中所述第二层粘连蛋白与所述第一层粘连蛋白的重量比为1:1至4:1。
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