JP2023116819A - 網膜前駆体を生成するためのシステムおよび方法 - Google Patents

網膜前駆体を生成するためのシステムおよび方法 Download PDF

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Abstract

【課題】網膜前駆体を生成するためのシステムおよび方法の提供。【解決手段】網膜前駆体および成熟視細胞は、２種のラミニンから作製されるラミニンマトリクスを有する表面上で、ヒト胚性幹細胞を分化させることによって生成され得る。一方のラミニンはラミニン－５２１であり、他方のラミニンは、ラミニン－３２３またはラミニン－５２３のいずれかである。この基材上にプレートされた幹細胞は、網膜前駆体および成熟視細胞を得るために種々の細胞培養培地を使用して分化され得る。本開示は、網膜前駆細胞または網膜視細胞を得るためのシステムおよび方法に関する。【選択図】なし

Description

関連出願の引用
本出願は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＳＧ２０１７／０５０５２０（２０１７年１０月１７日出願。参考として完全に援用される）に基づく優先権を主張する。
背景
本開示は、網膜前駆細胞（例えば、光受容体前駆細胞または神経節前駆細胞）または網膜視細胞を、ヒト多能性幹細胞から生成するためのシステムおよび方法に関する。このようなシステムおよび方法における使用のための組成物およびマトリクスもまた、開示される。その得られる網膜前駆細胞または網膜視細胞の移植がさらに開示され、本明細書に含まれる。それら細胞を含むこれらの方法、組成物、およびシステムは、眼の状態（例えば、黄斑変性（ＭＤ）または網膜色素変性（ＲＰ））を処置するために有用である。
全世界での失明の主要原因は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）および網膜色素変性（ＲＰ）である。これら２つの状態は、光受容体および下にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）の喪失を含む。視覚系を支援するには、上記光受容体と上記ＲＰＥとの間の機能的相互作用が必要とされる。不運なことには、ヒトの網膜は、細胞が疾患または傷害で失われた場合に再生する能力がなく、網膜変性を回復させる有効な処置は存在しない。
有糸分裂後のヒト光受容体は、それらが妊娠１９週後に入手可能になるに過ぎないことから、ヒト細胞置換にとって倫理的かつ適切な供給源とは考えられない。幹細胞に由来する光受容体についての既存のプロトコールは、主に、３Ｄ眼杯または網膜オルガノイドを形成するためにＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の使用とともに、化学的に規定されていない培養条件の中での自然に起こる胚様体の分化に基づく。これらの３Ｄオルガノイドは、移植にかなう能力はなく、このようなプロトコールは、種々の発生ステージを有する不均質な網膜細胞タイプをもたらす。
さらに、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭは、いくつかの基底膜タンパク質（例えば、ＩＶ型コラーゲン、パールカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）、ラミニン－１１１）、ならびに増殖因子および細胞内タンパク質を含むマウス腫瘍抽出物である。従って、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭは異種のものであり、ロット間変動に影響を及ぼされ、幅広い量の規定されていない構成要素を含む。さらに、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ上で培養した細胞はまた、それらを臨床適用に対して不適切にする非ヒトＮ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）免疫原を獲得する可能性を有する。
現行の処置は、抗酸化剤（例えば、パルミチン酸ビタミンＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、カルシウムチャネル遮断薬、およびルテイン／ゼアキサンチンを含む経口薬物療法を含む。しかし、視力を取り戻すにあたって有効性は何ら示されていない。
簡潔な説明
本開示は、網膜前駆細胞または網膜視細胞を得るためのシステムおよび方法に関する。簡潔には、多能性幹細胞は、（ｉ）ラミニン－３２３（ＬＮ－３２３）またはＬＮ－５２３、および（ｉｉ）ラミニン－５２１の混合物を含む基材上で培養される。ＬＮ－３２３およびＬＮ－５２３は、以前は純粋形態で精製されておらず、ヒト胎児由来腎細胞（ＨＥＫ－２９３）において組換えヒトタンパク質として初めて生成され、精製され、細胞培養コーティングとして使用された。その幹細胞は、網膜前駆細胞または網膜視細胞を得るために（それらが分化される時間の長さに依存して）、２種の異なる細胞培養培地を使用して分化される。
網膜前駆細胞の５種の別個の亜集団も識別されてた。これらの５種の亜集団は、本明細書でさらに説明されるように、２６～３４日目の遺伝子プロフィールによって識別され得る。
第１の亜集団（Ａ）において、遺伝子ＣＲＸ、Ｃ１１ｏｒｆ９６、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＤＣＴ、ＰＲＤＭ１、ＮＥＵＲＯＤ４、Ｓ１００Ａ１３、ＲＣＶＲＮ、ＦＡＭ５７Ｂ、ＳＹＴ４、ＤＬＬ３、ＳＳＴＲ２、ＣＨＲＮＡ５、およびＲＯＢＯ２のうちの少なくとも１つは、２６～３４日目の遺伝子プロフィールにおいて発現される。望ましくは、これら遺伝子のうちの多くまたは大部分が発現される。
第２の亜集団（Ｂ）において、遺伝子ＳＴＭＮ２、ＯＮＥＣＵＴ２、ＡＴＯＨ７、ＥＬＡＶＬ４、およびＧＡＰ４３のうちの少なくとも１つは、２６～３４日目の遺伝子プロフィールにおいて発現される。望ましくは、これら遺伝子のうちの多くまたは大部分が発現される。
第３の亜集団（Ｃ）において、遺伝子ＣＮＴＮ２、ＮＥＦＭ、ＮＥＦＬ、ＰＲＰＨ、ＰＯＵ４Ｆ２、およびＣＸＣＲ４のうちの少なくとも１つは、２６～３４日目の遺伝子プロフィールにおいて発現される。望ましくは、これら遺伝子のうちの多くまたは大部分が発現される。
第４の亜集団（Ｄ）において、遺伝子ＰＡＸ６、ＳＩＸ３、およびＳＬＣ２Ａ１のうちの少なくとも１つは、２６～３４日目の遺伝子プロフィールにおいて発現される。望ましくは、これら遺伝子のうちの多くまたは大部分が発現される。
第５の亜集団（Ｅ）において、遺伝子ＶＳＸ２、ＰＴＨ２、ＦＺＤ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＤＩＯ３、ＳＯＸ２、およびＣＹＰ１Ｂ１のうちの少なくとも１つは、２６～３４日目の遺伝子プロフィールにおいて発現される。望ましくは、これら遺伝子のうちの多くまたは大部分が発現される。
本開示のこれらおよび他の非限定的な特徴は、以下でより詳細に開示される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
網膜前駆細胞であって、ここで２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、
（Ａ）遺伝子ＣＲＸ、Ｃ１１ｏｒｆ９６、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＤＣＴ、ＰＲＤＭ１、ＮＥＵＲＯＤ４、Ｓ１００Ａ１３、ＲＣＶＲＮ、ＦＡＭ５７Ｂ、ＳＹＴ４、ＤＬＬ３、ＳＳＴＲ２、ＣＨＲＮＡ５、およびＲＯＢＯ２のうちの少なくとも１つが発現されること；または
（Ｂ）遺伝子ＳＴＭＮ２、ＯＮＥＣＵＴ２、ＡＴＯＨ７、ＥＬＡＶＬ４、およびＧＡＰ４３のうちの少なくとも１つが発現されること；または
（Ｃ）遺伝子ＣＮＴＮ２、ＮＥＦＭ、ＮＥＦＬ、ＰＲＰＨ、ＰＯＵ４Ｆ２、およびＣＸＣＲ４のうちの少なくとも１つが発現されること；または
（Ｄ）遺伝子ＰＡＸ６、ＳＩＸ３、およびＳＬＣ２Ａ１のうちの少なくとも１つが発現されること；または
（Ｅ）遺伝子ＶＳＸ２、ＰＴＨ２、ＦＺＤ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＤＩＯ３、ＳＯＸ２、およびＣＹＰ１Ｂ１のうちの少なくとも１つが発現されること、
を示す、網膜前駆細胞。
（項目２）
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、
（Ａ）遺伝子ＣＲＸ、Ｃ１１ｏｒｆ９６、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＤＣＴ、ＰＲＤＭ１、ＮＥＵＲＯＤ４、Ｓ１００Ａ１３、ＲＣＶＲＮ、ＦＡＭ５７Ｂ、ＳＹＴ４、ＤＬＬ３、ＳＳＴＲ２、ＣＨＲＮＡ５、およびＲＯＢＯ２のうちの少なくとも２つが発現されること；または
（Ｂ）遺伝子ＳＴＭＮ２、ＯＮＥＣＵＴ２、ＡＴＯＨ７、ＥＬＡＶＬ４、およびＧＡＰ４３のうちの少なくとも２つが発現されること；または
（Ｃ）遺伝子ＣＮＴＮ２、ＮＥＦＭ、ＮＥＦＬ、ＰＲＰＨ、ＰＯＵ４Ｆ２、およびＣＸＣＲ４のうちの少なくとも２つが発現されること；または
（Ｄ）遺伝子ＰＡＸ６、ＳＩＸ３、およびＳＬＣ２Ａ１のうちの少なくとも２つが発現されること；または
（Ｅ）遺伝子ＶＳＸ２、ＰＴＨ２、ＦＺＤ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＤＩＯ３、ＳＯＸ２、およびＣＹＰ１Ｂ１のうちの少なくとも２つが発現されること、
を示す、項目１に記載の網膜前駆細胞。
（項目３）
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、遺伝子ＣＲＸまたはＣ１１ｏｒｆ９６が発現されることを示す；かつ
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＣＲＸが少なくとも５遺伝子カウントパーミリオンで発現されること、または（ｉｉ）Ｃ１１ｏｒｆ９６が少なくとも５遺伝子カウントパーミリオンで発現されることを示す、
項目１に記載の網膜前駆細胞。
（項目４）
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＣＲＸが少なくとも１０遺伝子カウントパーミリオンで発現されること、または（ｉｉ）Ｃ１１ｏｒｆ９６が少なくとも１０遺伝子カウントパーミリオンで発現されることを示す、項目３に記載の網膜前駆体。
（項目５）
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、遺伝子ＳＴＭＮ２またはＯＮＥＣＵＴ２が発現されることを示す；かつ
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＳＴＭＮ２が少なくとも５遺伝子カウントパーミリオンで発現されること、または（ｉｉ）ＯＮＥＣＵＴ２が少なくとも５遺伝子カウントパーミリオンで発現されることを示す、
項目１に記載の網膜前駆細胞。
（項目６）
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＳＴＭＮ２が少なくとも１０遺伝子カウントパーミリオンで発現されること、または（ｉｉ）ＯＮＥＣＵＴ２が少なくとも１０遺伝子カウントパーミリオンで発現されることを示す、項目５に記載の網膜前駆細胞。
（項目７）
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、遺伝子ＣＮＴＮ２またはＰＯＵ４Ｆ２が発現されることを示す；かつ
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＣＮＴＮ２は、少なくとも５遺伝子カウントパーミリオンで発現されること、または（ｉｉ）ＰＯＵ４Ｆ２は、少なくとも５遺伝子カウントパーミリオンで発現されることを示す、
項目１に記載の網膜前駆細胞。
（項目８）
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＣＮＴＮ２が、少なくとも１０遺伝子カウントパーミリオンで発現されること、または（ｉｉ）ＰＯＵ４Ｆ２が少なくとも１０遺伝子カウントパーミリオンで発現されることを示す、項目７に記載の網膜前駆細胞。
（項目９）
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、遺伝子ＰＡＸ６またはＳＩＸ３が発現されることを示す；かつ
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＰＡＸ６が少なくとも５遺伝子カウントパーミリオンで発現されること、または（ｉｉ）ＳＩＸ３が少なくとも５遺伝子カウントパーミリオンで発現されることを示す、
項目１に記載の網膜前駆細胞。
（項目１０）
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＰＡＸ６が少なくとも１０遺伝子カウントパーミリオンで発現されること、または（ｉｉ）ＳＩＸ３が少なくとも１０遺伝子カウントパーミリオンで発現されることを示す、項目９に記載の網膜前駆細胞。
（項目１１）
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、遺伝子ＶＳＸ２またはＣＹＰ１Ｂ１が発現されることを示す；かつ
前記２６～３４日目のプロフィールは、（ｉ）ＶＳＸ２が少なくとも５遺伝子カウントパーミリオンで発現されること、または（ｉｉ）ＣＹＰ１Ｂ１が少なくとも５遺伝子カウントパーミリオンで発現されることを示す、
項目１に記載の網膜前駆細胞。
（項目１２）
前記２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＶＳＸ２が少なくとも１０遺伝子カウントパーミリオンで発現されること、または（ｉｉ）ＣＹＰ１Ｂ１が少なくとも１０遺伝子カウントパーミリオンで発現されることを示す、項目１１に記載の網膜前駆細胞。
（項目１３）
１６～２４日目の遺伝子プロフィールは、遺伝子ＤＡＰＬ１、ＳＩＸ６、ＳＦＲＰ２、ＬＨＸ２、ＰＡＸ６、ＣＤＨ２、ＣＬＤＮ１、ＴＲＰＭ３、ＲＥＬＮ、ＤＣＴ、およびＰＭＥＬのうちの少なくとも１つが発現されることを示す、項目１に記載の網膜前駆細胞。
（項目１４）
前記１６～２４日目の遺伝子プロフィールは、遺伝子ＳＩＸ６、ＳＦＲＰ２、ＬＨＸ２、ＰＡＸ６、ＤＣＴ、またはＰＭＥＬのうちの少なくとも１つが発現されることを示す、項目１３に記載の網膜前駆細胞。
（項目１５）
前記１６～２４日目の遺伝子プロフィールは、ＰＡＸ６が発現されることを示す、項目１３に記載の網膜前駆細胞。
（項目１６）
網膜前駆体の集団を生成するための方法であって、該方法は、
多能性ヒト幹細胞を、ラミニンマトリクスを有する細胞培養表面にプレートする工程であって、ここで該ラミニンマトリクスは、（ｉ）ラミニン－３２３およびラミニン－５２３からなる群より選択される第１のラミニン、ならびに（ｉｉ）ラミニン－５２１である第２のラミニンを含み、該第１のラミニンおよび該ラミニン－５２１は、各々無傷のタンパク質またはタンパク質フラグメントであるかのいずれかである工程；
網膜前駆体を得るために、該多能性ヒト幹細胞を培養する工程；
該網膜前駆体の集団を、（ｉ）１６～２４日目の遺伝子プロフィールを調製し、遺伝子ＤＡＰＬ１、ＳＩＸ６、ＳＦＲＰ２、ＬＨＸ２、ＰＡＸ６、ＣＤＨ２、ＣＬＤＮ１、ＴＲＰＭ３、ＲＥＬＮ、ＤＣＴ、およびＰＭＥＬのうちの少なくとも１つが発現される網膜前駆体を選択する工程；および（ｉｉ）２６～３４日目の遺伝子プロフィールを調製し、
（Ａ）遺伝子ＣＲＸ、Ｃ１１ｏｒｆ９６、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＤＣＴ、ＰＲＤＭ１、ＮＥＵＲＯＤ４、Ｓ１００Ａ１３、ＲＣＶＲＮ、ＦＡＭ５７Ｂ、ＳＹＴ４、ＤＬＬ３、ＳＳＴＲ２、ＣＨＲＮＡ５、およびＲＯＢＯ２のうちの少なくとも１つが発現されるか；または
（Ｂ）遺伝子ＳＴＭＮ２、ＯＮＥＣＵＴ２、ＡＴＯＨ７、ＥＬＡＶＬ４、およびＧＡＰ４３のうちの少なくとも１つが発現されるか；または
（Ｃ）遺伝子ＣＮＴＮ２、ＮＥＦＭ、ＮＥＦＬ、ＰＲＰＨ、ＰＯＵ４Ｆ２、およびＣＸＣＲ４のうちの少なくとも１つが発現されるか；または
（Ｄ）遺伝子ＰＡＸ６、ＳＩＸ３、およびＳＬＣ２Ａ１のうちの少なくとも１つが発現されるか；または
（Ｅ）遺伝子ＶＳＸ２、ＰＴＨ２、ＦＺＤ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＤＩＯ３、ＳＯＸ２、およびＣＹＰ１Ｂ１のうちの少なくとも１つが発現される、
網膜前駆体を選択する工程によって識別する工程、
を包含する方法。
（項目１７）
前記第１のラミニン 対 前記第２のラミニン重量比は、約１：１～約４：１である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記多能性ヒト幹細胞は、
該細胞を、ＴＧＦβインヒビターおよびＷｎｔインヒビターを含む神経誘導培地中で第１の期間にわたって培養する工程；ならびに
該細胞を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、レチノイン酸、およびγセクレターゼインヒビターを含む光受容体分化培地中で第２の期間にわたって培養する工程、
によって培養される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の期間は、約１２０時間～約１６８時間である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記第２の期間は、約２８８時間～約８１６時間である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記神経誘導培地は、ＴＧＦβインヒビターおよびＷｎｔインヒビターを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記神経誘導培地は、
約５μＭ～約１５μＭの前記ＴＧＦβインヒビター；および
約５μＭ～約１５μＭの前記Ｗｎｔインヒビター
を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ＴＧＦβインヒビターはＳＢ４３１５４２である；または
前記ＷｎｔインヒビターはＣＫＩ－７である、
項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記光受容体分化培地は、
約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬの前記脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；
約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬの前記毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；
約０．１μＭ～約５μＭの前記レチノイン酸；および
約５μＭ～約１５μＭの前記γセクレターゼインヒビター、
を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
前記γセクレターゼインヒビターはＤＡＰＴである、項目１８に記載の方法。
本特許または本出願のファイルは、カラー仕上げの少なくとも１つの図面を含む。カラー図面付きのこの特許または特許出願公報の写しは、請求および必要な料金の支払いをすれば、当局によって提供される。
以下は、図面の簡単な説明である。これは、本明細書で開示される例示的実施形態を例証する目的で示され、限定する目的で示されるのではない。
図１Ａは、本開示のいくつかの方法において組換えラミニン－５２３およびラミニン－３２３を生成するための工程を記載するフローチャートである。
図１Ｂは、ＬＮ－５２３の精製画分または部分におけるＬＡＭＡ５、ＬＡＭＢ２、およびＬＡＭＣ３鎖の存在を示すウェスタンブロットである。
図１Ｃは、ＡＫＴＡ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用するＬＮ－５２３クローンのタンパク質溶離プロフィールを図示するクロマトグラムである。
図１Ｄは、ＬＡＭＡ５、ＬＡＭＢ２、およびＬＡＭＣ３鎖が存在することを示すＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）結果である。
図１Ｅは、ＬＮ－３２３の精製画分または部分におけるＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ２、およびＬＡＭＣ３鎖の存在を示すウェスタンブロットである。
図１Ｆは、ＡＫＴＡ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用するＬＮ－３２３クローンのタンパク質溶離プロフィールを図示するクロマトグラムである。
図１Ｇは、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ２、およびＬＡＭＣ３鎖が存在することを示すＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）結果である。
図２Ａは、ｈＥＳＣを光受容体へと分化させる方法を示すダイアグラムである。３種の細胞培養が示される： 分化前に培養するためのＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（０日目）；神経誘導培地；および光受容体分化培地。Ｄ０、Ｄ２０、およびＤ３０での細胞を示す３枚の写真がまた提供される。
図２Ｂおよび図２Ｃは、ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１基材上で増殖させた細胞の５つの異なるグラフのセットである。図２Ｂの上のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．１５まで０．０５刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＢＲＡ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＰＡＸ６である。
ＰＡＸ６と表示された図２Ｂの左下のグラフでは、ｙ軸は、任意単位であり、０から０．１８まで０．０２刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－５２３のみである。
ＶＳＸ２と表示された図２Ｂの右下のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．０６まで０．０１刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ５２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ５２３＋５２１、およびＤ３０ ＬＮ５２３のみである。
ＣＲＸと表示された図２Ｃの左のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．００４５まで０．０００５刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、Ｄ０ ＬＮ５２３＋５２１、Ｄ２０ ＬＮ５２３＋５２１、Ｄ２０ ＬＮ５２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－５２３のみである。
ＲＣＶＲＮと表示された図２Ｃの右のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．０２５まで０．００５刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－５２３のみである。
図２Ｄおよび図２Ｅは、ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１基材上で増殖させた細胞の５つの異なるグラフのセットである。図２Ｄの上のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．１５まで０．０５刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＢＲＡ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＰＡＸ６である。
ＰＡＸ６と表示された図２Ｄの左下のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．１６まで０．０２刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－３２３のみである。
ＶＳＸ２と表示された図２Ｄの右下のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．０５まで０．００５刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－３２３のみである。
ＣＲＸと表示された図２Ｅの左のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．００１４まで０．０００２刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－３２３のみである。
ＲＣＶＲＮと表示された図２Ｅの右のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．０００８まで０．０００１刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－３２３のみである。
図２Ｆおよび図２Ｇは、ＬＮ－５２１のみの基材上で増殖させた細胞の５つの異なるグラフのセットである。図２Ｆの上のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．２まで０．０５刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＢＲＡ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＰＡＸ６である。
ＰＡＸ６と表示された図２Ｆの左下のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．１２まで０．０２刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－５２１である。
ＶＳＸ２と表示された図２Ｆの右下のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．０２５まで０．００５刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－５２１である。
ＣＲＸと表示された図２Ｇの左下のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．００２５まで０．０００５刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、Ｄ０ ＬＮ５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－５２１である。
ＲＣＶＲＮと表示された図２Ｇの左下のグラフでは、ｙ軸は任意単位にあり、０から０．００３まで０．００５刻みで推移する。ｘ軸は、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－５２１である。
図３Ａ～３Ｃは、Ｄ０ 未分化ｈＥＳＣおよびＤ３８ ｈＥＳＣ由来網膜細胞の免疫細胞化学分析を示す写真のセットである。図３Ａは、ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１基材上で増殖させた細胞に関するものである。図３Ｂは、ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１基材上で増殖させた細胞に関するものである。図３Ｃは、ＬＮ－５２１のみの基材上で増殖させた細胞に関するものである。各セットは、１０枚の顕微鏡写真を含む（スケールバー＝２０μｍ）。各セットでは、上の列は、ＯＣＴ４に関するＤ０細胞の、ＰＡＸ６に関するＤ０細胞の、およびＰＡＸ６に関するＤ３８細胞の分析を示す。第２の列は、これらをＤＡＰＩと複合したものを示す。第３の列は、ＶＳＸ２に関するＤ３８細胞のおよびＲＣＶＲＮに関するＤ３８細胞の分析を示す。第４の列は、これらをＤＡＰＩと複合したものを示す。Ｄ０ 未分化幹細胞では、ＯＣＴ４は発現されるが、ＰＡＸ６（Ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ ６）は発現されない。Ｄ３８ 分化細胞では、マーカーＰＡＸ６、ＶＳＸ２、およびＲＣＶＲＮが発現される。 同上。 同上。
図３Ｄは、３種のラミニンマトリクスに対してマーカーＰＡＸ６、ＶＳＸ２、ＣＲＸ、およびＲＣＶＲＮの発現を比較する棒グラフである。ｙ軸は任意単位にあり、０から１００まで２０刻みで推移する。ｘ軸については、左から右に、マーカーは、ＰＡＸ６、ＶＳＸ２、ＣＲＸ、およびＲＣＶＲＮである。各マーカーに関して、左側の棒は、ＬＮ－５２３：ＬＮ－５２１基材上での発現である。中央の棒は、ＬＮ－３２３：ＬＮ－５２１基材に関するものであり、右側の棒は、ＬＮ－５２１のみの基材に関するものである。
図４Ａは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての２０日目の網膜前駆細胞に関するＮＡＮＯＧ発現レベルのｔ分布型確率的近傍埋め込みアルゴリズム（ｔ－ＳＮＥ）可視化（ｔ－ＳＮＥ次元１および２、それぞれ、ｘ軸およびｙ軸）である。各ドットは細胞を表す。「Ｌｏｇ２調整カウント（Ｌｏｇ２ Ａｄｊ． ｃｏｕｎｔ）」とは、Ｌｏｇ２ ｓｃｒａｎ正規化しかつＮＡＮＯＧの細胞周期調整した遺伝子カウントをいう。ＮＡＮＯＧ遺伝子カウントは、０から２．２１までの範囲に及ぶ。
図４Ｂは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての２０日目の網膜前駆細胞に関するＰＯＵ５Ｆ１発現レベルのｔ－ＳＮＥ可視化である。各ドットは細胞を表す。ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子カウントは、０から１．３３までの範囲に及ぶ。
図４Ｃは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての２０日目の網膜前駆細胞に関するＰＡＸ６発現レベルのｔ－ＳＮＥ可視化である。各ドットは細胞を表す。ＰＡＸ６遺伝子カウントは、－０．３６から５．８７までの範囲に及ぶ。
図４Ｄは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての２０日目の網膜前駆細胞に関するＬＨＸ２発現レベルのｔ－ＳＮＥ可視化である。各ドットは細胞を表す。ＬＨＸ２遺伝子カウントは、－０．５４から５．００までの範囲に及ぶ。
図５は、ＰＡＸ６を発現する２０日目の網膜前駆細胞の亜集団に関して識別されたマーカー遺伝子の遺伝子－遺伝子発現（ｇｅｎｅ－ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される）ペアワイズ相関レベルを示すヒートマップである。この遺伝子－遺伝子発現ペアワイズ相関は、単一細胞配列決定法によってプロフィールが示され、品質管理工程に合格した全ての２０日目の網膜前駆細胞にわたって計算される。水準バー（ｌｅｖｅｌ ｂａｒ）は、遺伝子－遺伝子発現ペアワイズピアソン相関を示し、－１から１までの範囲に及ぶ。
図６は、全ての３０日目の網膜前駆細胞内で識別された細胞の５種の亜集団の各々に関して識別されたマーカー遺伝子の、遺伝子－遺伝子発現（単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される）ペアワイズ相関レベルを示すヒートマップである。この遺伝子－遺伝子発現ペアワイズ相関は、単一細胞配列決定法によってプロフィールが示され、品質管理工程に合格した全ての３０日目の網膜前駆細胞にわたって計算される。上から下まで、その５種の細胞亜集団は、以下のとおりに示される： ＣＲＸ＋、ＳＴＭＮ２＋、ＣＮＴＮ２＋、ＰＡＸ６＋およびＶＳＸ２＋。別個の細胞亜集団に属するマーカー遺伝子は、線で分離されている。その５種の細胞亜集団の各々を命名する遺伝子は、矢印で示される。その水準バーは、遺伝子－遺伝子発現ペアワイズピアソン相関を示し、－１から１までの範囲に及ぶ。
参照のために、図６において右側にある遺伝子の縦に示されるリストは、以下のとおりに示されている（上から下に）： Ｃ１１ｏｒｆ９６； ＮＸＰＨ４； ＮＴＳ； ＤＣＴ； ＰＲＤＭ１； ＮＥＵＲＯＤ４； ＣＲＸ； Ｓ１００Ａ１３； ＲＣＶＲＮ； ＦＡＭ５７Ｂ； ＳＹＴ４； ＤＬＬ３； ＳＳＴＲ２； ＣＨＲＮＡ５； ＲＯＢＯ２； ＯＮＥＣＵＴ２； ＡＴＯＨ７； ＳＴＭＮ２； ＥＬＡＶＬ４； ＧＡＰ４３； ＮＥＦＭ； ＮＥＦＬ； ＰＲＰＨ； ＣＮＴＮ２； ＰＯＵ４Ｆ２； ＣＸＣＲ４； ＳＩＸ３； ＰＡＸ６； ＳＬＣ２Ａ１； ＰＴＨ２； ＦＺＤ５； ＶＳＸ２； ＲＡＲＲＥＳ２； ＤＩＯ３； ＳＯＸ２； およびＣＹＰ１Ｂ１。図６の下にある遺伝子の横に示されるリストは、右から左に読む場合に同じである。
図７Ａは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての３０日目の網膜前駆細胞に関するＣＲＸ発現レベルのｔ分布型確率的近傍埋め込みアルゴリズム（ｔ－ＳＮＥ）可視化（ｔ－ＳＮＥ次元１および２、それぞれ、ｘ軸およびｙ軸）である。各ドットは細胞を表す。Ｌｏｇ２調整カウントとは、Ｌｏｇ２ ｓｃｒａｎ正規化しかつ細胞周期調整した遺伝子カウントをいう。ＣＲＸ 遺伝子カウントは、－０．０５から３．３３までの範囲に及ぶ。
図７Ｂは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての３０日目の網膜前駆細胞に関するＣ１１ｏｒｆ９６発現レベルのｔ－ＳＮＥ可視化である。各ドットは細胞を表す。Ｃ１１ｏｒｆ９６遺伝子カウントは、－０．２５から５．１５までの範囲に及ぶ。
図７Ｃは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての３０日目の網膜前駆細胞に関するＳＴＭＮ２発現レベルのｔ－ＳＮＥ可視化である。各ドットは細胞を表す。ＳＴＭＮ２遺伝子カウントは、－０．９２から６．５２までの範囲に及ぶ。
図７Ｄは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての３０日目の網膜前駆細胞に関するＯＮＥＣＵＴ２発現レベルのｔ－ＳＮＥ可視化である。各ドットは細胞を表す。ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子カウントは、－０．８０から４．８１までの範囲に及ぶ。
図７Ｅは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての３０日目の網膜前駆細胞に関するＣＮＴＮ２発現レベルのｔ－ＳＮＥ可視化である。各ドットは細胞を表す。ＣＮＴＮ２遺伝子カウントは、－０．２４から５．３５までの範囲に及ぶ。
図７Ｆは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての３０日目の網膜前駆細胞に関するＰＯＵ４Ｆ２発現レベルのｔ－ＳＮＥ可視化である。各ドットは細胞を表す。ＰＯＵ４Ｆ２遺伝子カウントは、－０．１４から４．４７までの範囲に及ぶ。
図７Ｇは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての３０日目の網膜前駆細胞に関するＰＡＸ６発現レベルのｔ－ＳＮＥ可視化である。各ドットは細胞を表す。ＰＡＸ６遺伝子カウントは、０から５．６８までの範囲に及ぶ。
図７Ｈは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての３０日目の網膜前駆細胞に関するＳＩＸ３発現レベルのｔ－ＳＮＥ可視化である。各ドットは細胞を表す。ＳＩＸ３遺伝子カウントは、０から４．６３までの範囲に及ぶ。
図７Ｉは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての３０日目の網膜前駆細胞に関するＶＳＸ２発現レベルのｔ－ＳＮＥ可視化である。各ドットは細胞を表す。ＶＳＸ２遺伝子カウントは、－０．１７から３．２８までの範囲に及ぶ。
図７Ｊは、単一細胞ＲＮＡ配列決定法によってプロフィールが示される全ての３０日目の網膜前駆細胞に関するＣＹＰ１Ｂ１発現レベルのｔ－ＳＮＥ可視化である。各ドットは細胞を表す。ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子カウントは、－０．２３から６．０１までの範囲に及ぶ。
詳細な説明
本明細書で開示される組成物および方法のより完全な理解は、添付の図面を参照することによって得られ得る。これらの図面は、本開示を示す便宜上および容易さに基づく模式的表示に過ぎず、従って、例示的実施形態の範囲を規定または限定することは意図されない。
具体的な用語が、明瞭さを目的として以下の説明において使用されるが、これらの用語は、図面における例証のために選択された実施形態の特定の構造に言及することのみが意図され、本開示の範囲を規定または限定することは意図されない。図面および以下に続く説明において、類似の番号表示が類似の機能の構成要素に言及することは、理解されるべきである。
本明細書で考察される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それらの全体において参考として援用される。
単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「この、その、上記（ｔｈｅ）」は、状況が別段明確に規定しなければ、複数形を含む。
本明細書および請求項において使用される場合、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」実施形態および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」実施形態を含み得る。用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「し得る（ｃａｎ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、およびこれらのバリエーションは、本明細書で使用される場合、挙げられた成分／工程の存在を要求し、かつ他の成分／工程の存在を許容する、制限のない移行性の句、用語、または文言であることが意図される。しかし、このような記載は、組成物またはプロセスを、その挙げられた成分／工程のみの存在を、そこから生じ得る任意の不純物とともに許容し、他の成分／工程を排除する、その列挙された成分／工程「からなる」および「から本質的になる」としても記載すると解釈されるべきである。
本出願の明細書および請求項における数値は、その数値を決定するために、有効数字の同じ桁数に縮小される場合に同じである数値および本発明出願において記載されるタイプの従来の測定技術の実験誤差未満で述べられた値とは異なる数値を含むことが理解されるべきである。
本明細書で開示される全ての範囲は、その記載される端点を含み、独立して組み合わせ可能である（例えば、「２～１０（ｆｒｏｍ ２ ｔｏ １０）」という範囲は、その端点である２および１０、ならびにその中間にある全ての値を含む）。
用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、任意の数値であって、その値の基本的な機能を変化させることなく変動し得るものを含むために使用され得る。範囲とともに使用される場合、「約」はまた、その２つの端点の絶対値によって規定される範囲を開示し、例えば、「約２～約４」はまた、「２～４」という範囲を開示する。用語「約」は、その示される数字の±１０％に言及し得る。
本開示に関連し得るいくつかの周知の参考文献としては、以下が挙げられる： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８５， Ｄ． Ｇｏｅｄｄｅｌ編， １９９１． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」 ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ｍ． Ｐ． Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ編， （１９９０） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）； ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓ， ｅｔ ａｌ． １９９０． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， 第２版． （Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ． １９８７． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ｐｐ． １０９－１２８， Ｅ． Ｊ． Ｍｕｒｒａｙ編， Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｃｌｉｆｔｏｎ， Ｎ．Ｊ．）、またはＡｍｂｉｏｎ １９９８カタログ（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ， Ｔｅｘ．）、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌａｍｉｎｉｎｓ， Ｄｏｍｏｇａｔｓｋａｙａ， Ａ， Ｒｏｄｉｎ， Ｓ ａｎｄ Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ， Ｋ，． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２０１２， ２８， ５２３－５５３。
ラミニンタンパク質は、１個のα鎖サブユニット、１個のβ鎖サブユニット、および１個のγ鎖サブユニットを含み、全て、コイルドコイルドメインを通じてトリマーの状態で一緒に連結されている。１２種の公知のラミニンサブユニット鎖が、理論的には、少なくとも６０種の異なるアイソフォームを形成し得る。現在、１６種のトリマーラミニンタイプが、天然の哺乳動物組織において識別されている。そのトリマーのラミニン構造内では、他のラミニン分子および基底ラミニン分子に対する結合活性を有するドメイン、ならびに細胞質膜結合レセプターが識別可能である。例えば、ドメインＶＩ、ＩＶｂ、およびＩＶａは、球場の構造を形成し、ドメインＶ、ＩＩＩｂ、およびＩＩＩａ（これらは、システインリッチＥＧＦ様エレメントを含む）はロッド様構造を形成する。その３種の鎖のＣ末端にあるドメインＩおよびＩＩは、三重鎖コイルドコイル構造（長腕）の形成に関与する。遺伝的に異なる５種のα鎖、３種のβ鎖、および３種のγ鎖が存在し、これらは、少なくとも１６種の異なる組み合わせにおいてヒト組織に見出されている。これらのラミニンタンパク質の１つの命名法は、それらの鎖組成に基づいてアイソフォームを記載する（例えば、ラミニン－１１１は、α１鎖、β１鎖、およびγ１鎖を含む）。
本明細書で使用される場合、用語「ラミニン－３２３（ｌａｍｉｎｉｎ－３２３）」（ＬＮ－３２３）とは、α３鎖、β２鎖およびγ３鎖が一緒に結合することによって形成されるタンパク質をいう。本明細書で使用される場合、用語「ラミニン－５２１（ｌａｍｉｎｉｎ－５２１）」（ＬＮ－５２１）とは、α５鎖、β２鎖およびγ１鎖が一緒に結合することによって形成されるタンパク質をいう。本明細書で使用される場合、用語「ラミニン－５２３（ｌａｍｉｎｉｎ－５２３）」（ＬＮ－５２３）とは、α５鎖、β２鎖およびγ３鎖が一緒に結合することによって形成されるタンパク質をいう。これらの用語は、組換えラミニンおよび天然に存在する供給源からのヘテロトリマーラミニンの両方を包含すると解釈されるべきである。用語「組換え」は、そのタンパク質が、このようなタンパク質を通常は発言しない細胞において発現プラスミドを使用して人工的に生成されることを示す。
ラミニンは、完全なタンパク質トリマー、またはタンパク質鎖、またはタンパク質フラグメントであり得る。用語「完全な（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」とは、α鎖、１個のβ鎖、およびγ鎖のドメイン全てから構成され、その３種の鎖がそのヘテロトリマー構造を形成するために一緒に結合されているタンパク質をいう。そのタンパク質は、別個の鎖、フラグメント、または機能的ドメインへと分解されない。用語「鎖（ｃｈａｉｎ）」とは、そのラミニンタンパク質の個々のα鎖、β鎖、またはγ鎖の実体に言及する。用語「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、別の分子またはレセプターへの結合活性を有する１個、２個、または３個の機能的ドメインを含む任意のタンパク質フラグメントに言及する。しかし、鎖は、各鎖が３種より多くのこのようなドメインを有することから、フラグメントと見做されるべきでない。同様に、完全なラミニンタンパク質トリマーは、フラグメントと見做されるべきではない。機能的ドメインの例としては、ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、およびＧドメインが挙げられる。これらのドメインに関するさらなる情報は、Ｄｏｍｏｇａｔｓｋａｙａ， Ａ．， Ｒｏｄｉｎ， Ｓ．， ａｎｄ Ｔｒｙｇｇｖａｓｏｎ， Ｋ． ２０１２． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２８：５２３－５５３（これは参考として援用される）に見出される。
本開示は、多能性幹細胞を培養および分化させて、網膜前駆細胞（例えば、光受容体前駆細胞または前駆神経節細胞）または網膜視細胞を得るための方法に関する。特に、幹細胞は、２種のラミニンアイソフォームのみを含むラミニンマトリクス上で培養される。そのラミニンマトリクス中の第１のラミニンは、ＬＮ－３２３またはＬＮ－５２３であり、これらは、インビボで網膜光受容体の周囲のマトリクスに位置する。そのラミニンマトリクス中の第２のラミニンは、ＬＮ－５２１である。あるいは、そのラミニンマトリクスは、単一のラミニン（これは、ラミニン－５２１である）のみを含み得る。次いで、その幹細胞は、２種の特定の細胞培養培地に曝される。これは、細胞外マトリクスの規定されていない、異種のおよび代替のブレンドを含む基材上で増殖させた細胞より臨床適用に適した多能性幹細胞に由来する光受容体を生じる。
分化した細胞は代表的には、生存および再生するために２つのものを要求する：（１）その細胞のための構造的および表現型安定化支持体を提供する基材；ならびに（２）その細胞に栄養を提供する細胞培養培地。非常に一般的には、その多能性幹細胞は、固体表面（これは、構造的支持体として作用しかつ多能性表現型をも維持する）に付着され得るラミニンマトリクス上で培養される。用語「固体（ｓｏｌｉｄ）」とは、物質の状態に言及する。すなわち、その基材は、液体またはガスまたはプラズマではない。その表面は、剛性／固いまたは非常に可撓性（例えば、フィルム）であり得、用語「固体」は、特定の剛性の程度を要求すると解釈されるべきではない。表面（１）は、代表的には容器、例えば、ペトリ皿であるか、またはマルチウェルプレートのウェルにある。そのラミニンマトリクスは、表面上の基材（すなわち、層またはコーティング）の形態にある。２種のラミニンを含む基材と組み合わせて、適切な時間間隔で異なる細胞培養培地を適用すると、分化した光受容体を（前駆細胞として、または成熟細胞としてのいずれかで）生じる。
本明細書で開示される方法および材料とともに使用され得る幹細胞は、多能性ヒト幹細胞である。このような幹細胞は、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、胎児幹細胞、羊膜性幹細胞（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、および概して任意の多能性幹細胞を含み得る。幹細胞は、未分化細胞であり、この細胞から専門化した細胞がその後得られる。多能性とは、全ての３種の胚葉の細胞へと分化する可能性を有する細胞をいう。
いくつかの実施形態において、そのラミニンマトリクスは、２種のラミニンの混合物を含む。そのラミニンマトリクスは、２種のラミニントリマー／鎖／フラグメントのみを含むが、他の成分がそのラミニンマトリクスの中になお存在することを許容する。その第１のラミニンは、ラミニン－３２３（ＬＮ－３２３）またはラミニン－５２３（ＬＮ－５２３）のいずれかである。その第２のラミニンは、ラミニン－５２１（ＬＮ－５２１）である。各ラミニンは、無傷のタンパク質またはタンパク質フラグメントであり得るが、好ましい実施形態ではそのラミニンは、無傷のタンパク質である。
特定の実施形態において、そのラミニンマトリクス中のラミニン－３２３／５２３ 対
ラミニン－５２１の重量比は、約１：１～約４：１（約１：１～約２：１を含む）であることが企図される（すなわち、常にラミニン－５２１の方が、ラミニン－３２３／５２３より少ない）。特に、ラミニン－３２３およびラミニン－５２３は、網膜の杆体および錐体にわたる外境界膜に存在し、ラミニン－５２３は、ＲＰＥの下に位置するブルッフ膜に存在する。それらの存在は、網膜系統特異的細胞への幹細胞の分化を駆動すると考えられる。
他の実施形態において、そのラミニンマトリクスは、単一のラミニン（これは、ラミニン－５２１である）のみを含む。他の成分（ラミニン以外）は、そのラミニンマトリクスになお存在してもよい。
細胞培養基材は、所望の網膜前駆細胞または視細胞を得るために多数の細胞培養培地と組み合わせて使用される。２種の異なる細胞培養培地が使用され、これら培地は、以下で記載され、本明細書で神経誘導培地および光受容体分化培地といわれる。
その神経誘導培地および光受容体分化培地はともに、基礎培地で始まる。その基礎培地は、グラスゴー最少必須培地（ＧＭＥＭ）（これは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている（カタログ番号１１７１００３５））からなる。このＧＭＥＭに、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１×の非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１１４００５０（１００×として提供））、および１ｍＭのピルベートを補充して、その基礎培地を作製する。
参照のために、ＧＭＥＭは、表１に列挙される以下の成分を含む：
１×非必須アミノ酸溶液は、表２に列挙される濃度で以下の成分を含む：
その神経誘導培地および光受容体分化培地は、その基礎培地の容量部と他の添加剤とを混合することによって作製される。１つのこのような添加剤は、Ｂ２７ビタミンＡ非含有補充物であり、これは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから得られ得る（カタログ番号１２５８７０１０、５０×で提供）。別の添加剤は、Ｎ２補充物であり、これは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから得られ得る（カタログ番号Ａ１３７０７０１、１００×で提供）。他の添加剤としては、ヒト脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ヒト毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、レチノイン酸、ＴＧＦβインヒビター（例えば、ＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ＃ ３０１８３６－４１－９））、γセクレターゼインヒビター（例えば、ＤＡＰＴ）が挙げられる。ＢＤＮＦは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから得られ得る（カタログ番号４５０－０２）。Ｗｎｔインヒビター（例えば、ＣＫＩ－７）。ＣＮＴＦは、Ｐｒｏｓｐｅｃ－Ｔａｎｙ Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅから得られ得る（カタログ番号ＣＹＴ－２７２）。ＤＡＰＴは、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから得られ得る（カタログ番号Ｓ２２１５）。ＣＫＩ－７は、Ｓｉｇｍａから得られ得る（ＣＡＳ＃ １１７７１４１－６７－１、カタログ番号Ｃ０７４２）。
その神経誘導培地は、９７容量部（ｐｂｖ）の基礎培地と、２ｐｂｖのＢ２７ビタミンＡ非含有補充物および１ｐｂｖのＮ２補充物とを混合し、次いで、ＴＧＦβインヒビター（例えば、ＳＢ４３１５４２）およびＷｎｔインヒビターを添加することによって作製される。そのＴＧＦ－βインヒビターは、約１μＭ～約１０μＭ、特に、約５μＭの濃度で存在する。具体的な実施形態において、そのＴＧＦ－βインヒビターはＳＢ４３１５４２である。そのＷｎｔインヒビターは、約１μＭ～約１０μＭ、特に、約５μＭの濃度で存在する。具体的な実施形態において、そのＷｎｔインヒビターはＣＫＩ－７である。その神経誘導培地は、増殖因子、例えば、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、またはγセクレターゼインヒビターを含まない。
その光受容体分化培地は、９７容量部（ｐｂｖ）の基礎培地と、２ｐｂｖのＢ２７ビタミンＡ非含有補充物および１ｐｂｖのＮ２補充物とを混合し、次いで、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、レチノイン酸、およびγセクレターゼインヒビター（例えば、ＤＡＰＴ）を添加することによって作製される。そのＢＤＮＦは、約１ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬ、特に、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。そのＣＮＴＦは、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬ（約５ｎｇ／ｍＬ～約２５ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ～約２０ｎｇ／ｍＬを含む）、特に、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。そのレチノイン酸は、約０．１μＭ～約５μＭ、特に、約０．５μＭの濃度で存在する。そのγセクレターゼインヒビターは、約５μＭ～約１５μＭ、特に、約１０μＭの濃度で存在する。その光受容体分化培地は、ＴＧＦβインヒビターまたはＷｎｔインヒビターを含まない。
幹細胞は、上記で記載されるとおりの１種または２種のラミニンから作製されるそのラミニンマトリクス／細胞培養基材上に先ずプレートされる。その幹細胞は代表的には、単層として適用され、約１０，０００ 細胞／ｃｍ２の密度でプレートされ得る。
次いで、分化は、その神経誘導培地を、そのプレートされた幹細胞に適用することによって開始される。その細胞は、その神経誘導培地中で、約１２０時間～約１６８時間（約１４４時間（すなわち、６日間）を含む）の第１の期間にわたって培養される。その培地は、定期的に、例えば、４８時間ごとに交換され得る。
次に、その神経誘導培地は除去され、光受容体分化培地が、そのプレートされた幹細胞に適用される。その細胞は、その光受容体分化培地中で、約２８８時間（１２日間）～約８１６時間（３４日間）の第２の期間にわたって培養される。その培地は、定期的に、例えば、４８時間ごとに交換され得る。その光受容体分化培地への曝露の時間の長さは、得られる細胞の成熟度に影響を及ぼし得る。その結果、網膜前駆細胞または成熟視細胞が得られ得る。これは、所望の網膜視細胞（前駆体または成熟）を得るために分化および成熟化の約２０日間～約４０日間の合計期間で生じる。その視細胞は、次いで、患者の片眼または両眼へと移植され得るか、または他の適用のために使用され得る。
幹細胞から所望の視細胞への分化は、分化開始後２０日目で、多能性マーカーであるＯｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの顕著なダウンレギュレーション、ならびにそのマーカーＰＡＸ６のアップレギュレーションによって識別され得る。そのマーカーＶＳＸ２、ＣＲＸ、およびＲＣＶＲＮは、分化開始後３０日目にアップレギュレートされる。これらは、ｑＰＣＲまたは免疫染色によって定量され得る。
本明細書で開示される方法は、臨床上安全な光受容体を患者に移植するという期待をもって、化学的に規定されかつ異種由来成分非含有の培養環境においてヒト胚性幹細胞を視細胞へと分化させることに強い。従って、これは、ＧＭＰ適合性でありかつ臨床グレードの視細胞を提供する、化学的に規定されかつ動物血清非含有の方法を提供する。
ある種の網膜前駆細胞亜集団はまた、分化開始後のある特定の日数で作製される遺伝子またはタンパク質プロフィールの使用によって識別され得る。「Ｘ日目の遺伝子プロフィール（Ｄａｙ Ｘ ｇｅｎｅ ｐｒｏｆｉｌｅ）」とは、Ｘ日目の前駆細胞の遺伝子発現レベルを含み、その遺伝子発現レベルは、ｓｃａｔｅｒ １．８．４ Ｒパッケージの関数ｃａｌｃｕｌａｔｅＣＰＭによって計算される場合の遺伝子カウントパーミリオン（ＣＰＭ）という単位で測定される。この点において、所定の遺伝子の発現レベルが分化プロセスの間に変動し、発現レベルの測定値が特定の目的のために特に有用であり得る亜集団を識別するために使用され得ることは、予測される。
４種の特定の遺伝子プロフィールが企図される。第１の遺伝子プロフィールは、１６～２４日目のうちのいずれか１つに対して作製される（本明細書で「１６～２４日目の遺伝子プロフィール」ともいわれる）。第２の遺伝子プロフィールは、２０日目に作製される（本明細書で「２０日目の遺伝子プロフィール」ともいわれる）。１６～２４日目の遺伝子プロフィールへの任意の言及はまた、２０日目の遺伝子プロフィールに具体的に言及していると見做されるべきである。第３の遺伝子プロフィールは、２６～３４日目のうちのいずれか１つに対して作製される（本明細書で「２６～３４日目の遺伝子プロフィール」ともいわれる）。第４の遺伝子プロフィールは、３０日目に作製される（本明細書で「３０日目の遺伝子プロフィール）ともいわれる）。２６～３４日目の遺伝子プロフィールへの任意の言及はまた、３０日目の遺伝子プロフィールに具体的に言及していると見做されるべきである。
５種の特定の亜集団が、１６～２４日目の遺伝子プロフィールおよび２６～３４日目の遺伝子プロフィールに基づいて識別されている。
第１の亜集団（Ａ）では、遺伝子ＣＲＸ、Ｃ１１ｏｒｆ９６、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＤＣＴ、ＰＲＤＭ１、ＮＥＵＲＯＤ４、Ｓ１００Ａ１３、ＲＣＶＲＮ、ＦＡＭ５７Ｂ、ＳＹＴ４、ＤＬＬ３、ＳＳＴＲ２、ＣＨＲＮＡ５、およびＲＯＢＯ２のうちの少なくとも１つが、２６～３４日目の遺伝子プロフィールで発現される。これらの遺伝子のうちのいずれか２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、または１５種の組み合わせが、具体的に企図される。いくつかの実施形態において、発現される遺伝子の組み合わせとしては、ＣＲＸおよびＣ１１ｏｒｆ９６が挙げられる。
第２の亜集団（Ｂ）では、遺伝子ＳＴＭＮ２、ＯＮＥＣＵＴ２、ＡＴＯＨ７、ＥＬＡＶＬ４、およびＧＡＰ４３のうちの少なくとも１つが、２６～３４日目の遺伝子プロフィールで発現される。これらの遺伝子のうちのいずれか２種、３種、４種、または５種の組み合わせが、具体的に企図される。いくつかの実施形態において、発現される遺伝子の組み合わせとしては、ＳＴＭＮ２およびＯＮＥＣＵＴ２が挙げられる。
第３の亜集団（Ｃ）では、遺伝子ＣＮＴＮ２、ＮＥＦＭ、ＮＥＦＬ、ＰＲＰＨ、ＰＯＵ４Ｆ２、およびＣＸＣＲ４のうちの少なくとも１つが、２６～３４日目の遺伝子プロフィールで発現される。これらの遺伝子のうちのいずれか２種、３種、４種、５種、または６種の組み合わせが、具体的に企図される。いくつかの実施形態において、発現される遺伝子の組み合わせとしては、ＣＮＴＮ２およびＰＯＵ４Ｆ２が挙げられる。
第４の亜集団（Ｄ）では、遺伝子ＰＡＸ６、ＳＩＸ３、およびＳＬＣ２Ａ１のうちの少なくとも１つが、２６～３４日目の遺伝子プロフィールで発現される。これらの遺伝子のうちのいずれか２種または３種が、具体的に企図される。いくつかの実施形態において、発現される遺伝子の組み合わせとしては、ＰＡＸ６およびＳＩＸ３が挙げられる。
第５の亜集団（Ｅ）では、遺伝子ＶＳＸ２、ＰＴＨ２、ＦＺＤ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＤＩＯ３、ＳＯＸ２、およびＣＹＰ１Ｂ１のうちの少なくとも１つが、２６～３４日目の遺伝子プロフィールで発現される。これらの遺伝子のうちのいずれか２種、３種、４種、５種、６種、または７種の組み合わせが、具体的に企図される。いくつかの実施形態において、発現される遺伝子の組み合わせとしては、ＶＳＸ２およびＣＹＰ１Ｂ１が挙げられる。
本開示では、「発現される（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）」遺伝子への言及は、遺伝子が１遺伝子カウントパーミリオン（ＣＰＭ）の最小値を有するという遺伝子発現レベルを意味する。これら亜集団において発現されるある種の遺伝子の考察は、他の遺伝子が発現されないことを意味すると解釈されるべきではないこともまた注記される。例えば、遺伝子ＳＴＭＮ２が、亜集団（Ａ）においてなお発現されることは可能である。
さらに、これら５種の亜集団において、その１６～２４日目の遺伝子プロフィールは通常、遺伝子ＤＡＰＬ１、ＳＩＸ６、ＳＦＲＰ２、ＬＨＸ２、ＰＡＸ６、ＣＤＨ２、ＣＬＤＮ１、ＴＲＰＭ３、ＲＥＬＮ、ＤＣＴ、またはＰＭＥＬのうちの少なくとも１種が発現されることを示す。これらの遺伝子のうちのいずれか２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、または１１種の組み合わせが、具体的に企図される。より具体的な実施形態において、遺伝子ＳＩＸ６、ＳＦＲＰ２、ＬＨＸ２、ＰＡＸ６、ＤＣＴ、またはＰＭＥＬのうちの少なくとも１つが、これらの遺伝子のうちのいずれか２種、３種、４種、６種、または６種の組み合わせを含め、発現される。特定の実施形態において、ＰＡＸ６は、その１６～２４日目の遺伝子プロフィールで発現される。その１６～２４日目の遺伝子プロフィールは、所望であれば、所望の細胞系統において終了しない分化している最中の細胞を廃棄するために使用される。
亜集団（Ａ）の特定の実施形態において、その２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＣＲＸが少なくとも５遺伝子ＣＰＭで発現されること、および／または（ｉｉ）Ｃ１１ｏｒｆ９６が少なくとも５遺伝子ＣＰＭで発現されること、を示す。より具体的な実施形態において、その２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＣＲＸが少なくとも１０遺伝子ＣＰＭで発現されること、および／または（ｉｉ）Ｃ１１ｏｒｆ９６が少なくとも１０遺伝子ＣＰＭで発現されること、を示す。
亜集団（Ｂ）の特定の実施形態において、その２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＳＴＭＮ２が少なくとも５遺伝子ＣＰＭで発現されること、および／または（ｉｉ）ＯＮＥＣＵＴ２が少なくとも５遺伝子ＣＰＭで発現されること、を示す。より具体的な実施形態において、その２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＳＴＭＮ２が少なくとも１０遺伝子ＣＰＭで発現されること、および／または（ｉｉ）ＯＮＥＣＵＴ２が少なくとも１０遺伝子ＣＰＭで発現されること、を示す。
亜集団（Ｃ）の特定の実施形態において、その２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＣＮＴＮ２が少なくとも５遺伝子ＣＰＭで発現されること、および／または（ｉｉ）ＰＯＵ４Ｆ２が少なくとも５遺伝子ＣＰＭで発現されること、を示す。より具体的な実施形態において、その２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＣＮＴＮ２が少なくとも１０遺伝子ＣＰＭで発現されること、および／または（ｉｉ）ＰＯＵ４Ｆ２ が少なくとも１０遺伝子ＣＰＭで発現されること、を示す。
亜集団（Ｄ）の特定の実施形態において、その２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＰＡＸ６が少なくとも５遺伝子ＣＰＭで発現されること、および／または（ｉｉ）ＳＩＸ３が少なくとも５遺伝子ＣＰＭで発現されること、を示す。より具体的な実施形態において、その２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＰＡＸ６が少なくとも１０遺伝子ＣＰＭで発現されること、および／または（ｉｉ）ＳＩＸ３が少なくとも１０遺伝子ＣＰＭで発現されること、を示す。
亜集団（Ｅ）の特定の実施形態において、その２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＶＳＸ２が少なくとも５遺伝子ＣＰＭで発現されること、および／または（ｉｉ）ＣＹＰ１Ｂ１が少なくとも５遺伝子ＣＰＭで発現されること、を示す。より具体的な実施形態において、その２６～３４日目の遺伝子プロフィールは、（ｉ）ＶＳＸ２が少なくとも１０遺伝子ＣＰＭで発現されること、および／または（ｉｉ）ＣＹＰ１Ｂ１が少なくとも１０遺伝子ＣＰＭで発現されること、を示す。
本開示は、以下の非限定的な作業実施例においてさらに例証され、これらの実施例が例証であることが意図されるに過ぎないこと、および本開示が、本明細書で記載される材料、条件、プロセスパラメーターなどに限定されるとは意図されないことは理解される。
実施例１
ＬＮ－５２３およびＬＮ－３２３を過剰発現するＨＥＫの細胞株開発
組換えラミニン－５２３およびラミニン－３２３を生成するための工程を記載するフローチャートが、図１Ａに提供される。簡潔には、ラミニンα３鎖、β２鎖、およびγ３鎖をコードしかつ３種の異なる抗生物質耐性遺伝子を含むヒト組換えラミニン発現プラスミドを生成し、ＨＥＫ細胞へと逐次的にトランスフェクトした。ＬＮ－５２３を生成するために、ラミニンα５鎖、β２鎖、およびγ３鎖をコードする発現プラスミドを、ＨＥＫ細胞へと逐次的にトランスフェクトした。所望のラミニン鎖を過剰発現する安定なクローン細胞株を、樹立した。第３に、潜在的陽性クローンを、ｑＰＣＲおよびウェスタンブロットを使用して識別した。第４に、その陽性ラミニンクローンのために、その細胞培養培地を無血清培地へと切り替えた。第５に、分泌されたラミニンを含む細胞培養培地を、ゲルを通して濾過した。最後に、ウェスタンブロット法および質量分析法を行って、そのラミニン鎖が何であるかを確認した。
ヒト胎児由来腎（ＨＥＫ）２９３細胞を培養し、ＤＭＥＭ－ＧｌｕｔａＭＡＸ、高グルコース、ピルベート（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなり、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で１０％ ウシ胎仔血清を補充した基礎培地中で維持した。Ｆｏｒ 治療目的のヒトＬＮ－３２３およびＬＮ－５２３のＧＭＰ生成のために、その細胞を、ヒト血清（ウシ胎仔血清の代わりに）の存在下で培養した。
プラスミドでのトランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３細胞を、これらがトランスフェクションの時に約７０％コンフルエントに達するように、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐの非存在下で播種した。ヒトラミニンγ３鎖を含むヒト組換えラミニンプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＯｐｔｉ－ＭｅＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞へと先ずトランスフェクトした。クローン性の安定な細胞株ＨＥＫ００３を、クローニングリング（Ｂｅｌ－Ａｒｔ）を使用するとともにハイグロマイシンＢ選択を使用して先ず樹立した。これの次に、ラミニンβ２鎖を発現するプラスミドを使用して、ＨＥＫ００３へとトランスフェクトした。ＨＥＫ０２３をその後、ジェネティシン（Ｇ４１８）およびハイグロマイシンＢ選択を使用して樹立した。ラミニンα５鎖およびラミニンα３鎖を発現するプラスミドを、ＨＥＫ０２３クローン細胞株へと別個にトランスフェクトして、それぞれ、ＨＥＫ５２３クローン細胞株およびＨＥＫ３２３クローン細胞株を生成した。その最終的なＨＥＫ５２３／３２３細胞株を、ゼオシン、ジェネティシン（Ｇ４１８）およびハイグロマイシンＢによって選択した。
そのクローン細胞株が何であるかを、ＬＡＭＡ５、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ２およびＬＡＭＣ３遺伝子プライマー対を使用する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析によって決定した。ＨＥＫ５２３およびＨＥＫ３２３という潜在的陽性クローン細胞株をさらに拡大し、その基礎培養培地を無血清培地へと１週間にわたって切り替えた。その培地を集め、ウェスタンブロット分析を行って、その陽性クローン細胞株によって生成されたラミニンタンパク質が何であるかをさらに確認した。その選択された陽性ＨＥＫ５２３およびＨＥＫ３２３クローン細胞株は、それぞれ、ＬＮ－５２３およびＬＮ－３２３をその培地へと分泌するはずである。その培地の透析を、ポリエチレングリコール中、４～５日間、４℃において行った。そのＬＮ－５２３およびＬＮ－３２３含有培地を、Ａｍｉｃｏ遠心分離チューブの中で濃縮し、タンパク質精製を、ＸＫ２６／１００カラムを通じてAＫ
ＴＡ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。ウェスタンブロットおよび質量分析を行って、その網膜特異的ラミニンアイソフォームの溶離した精製画分を分析した。
図１Ｂは、ＬＮ－５２３の精製画分または部分の中のラミニンα５鎖、β２鎖、およびγ３鎖の存在を示すウェスタンブロットである。図１Ｃは、AＫＴＡ Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用するＬＮ－５２３クローンのタンパク質溶離プロフィールを図示するクロマトグラムである。図１Ｄは、ラミニンα５鎖、β２鎖、およびγ３鎖が存在することを示すＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）結果である。
図１Ｅは、ＬＮ－３２３の精製画分または部分の中のラミニンα３鎖、β２鎖、およびγ３鎖の存在を示すウェスタンブロットである。図１Ｆは、AＫＴＡ Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用するＬＮ－３２３クローンのタンパク質溶離プロフィールを図示するクロマトグラムである。図１Ｇは、ラミニンα３鎖、β２鎖、およびγ３鎖が存在することを示すＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）結果である。
ｈＥＳＣの維持
培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、製造業者の説明書（ＢｉｏＬａｍｉｎａ）に従って、精製ヒトＬＮアイソフォームで一晩、４℃において、１０μｇ／ｍＬでコーティングした。多能性ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を播種し、これらが多能性を維持するＬＮ－５２１上で、インビトロで増殖させた。そのｈＥＳＣ株Ｈ１（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、ＬＮを予めコーティングしたプレート上に単層で培養し、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ｈＥＳＣ ＸＦ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，
Ｉｓｒａｅｌ）培地中で維持した。コンフルエントになったら、その細胞を、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔ（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して８分間、３７℃、５％ ＣＯ２においてトリプシン処理することによって継代培養した。そのＨ１細胞株を、１０，０００～２０，０００ 細胞／ｃｍ２で慣用的に継代した。
光受容体分化プロトコール
２４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に、（Ａ）ＬＮ－５２１のみ； （Ｂ）ＬＮ－５２３およびＬＮ－５２１（２：１比）の混合物；または（Ｃ）ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１（２：１比）の混合物のいずれかをコーティングした。そのプレートを、１０μｇ／ｍＬの最終濃度を得るためにコーティングした。そのｈＥＳＣ（Ｈ１）を、約７０，０００ 細胞／ウェルの播種密度でプレートし、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ中で、２日間にわたって毎日新鮮な培地と交換して維持した。
その分化プロセス全体を通じて使用される基礎培地は、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×の非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）および１ｍＭのピルベート（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＧＭＥＭ（グラスゴー最少必須培地， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなった。
２日間にわたって約７０％コンフルエントに達した後、そのＮｕｔｒｉＳｔｅｍを、神経誘導培地（ＮＩＭ）と交換した。ＮＩＭは、９７％ 基礎培地、２％ Ｂ２７－ビタミンＡ非含有（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）補充物、１％ Ｎ２補充物（ＣＴＳ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ）および５μＭのＣＫＩ－７（Ｓｉｇｍａ）からなった。ＮＩＭを、０日目（Ｄ０）からＤ６まで２日ごとに１回交換した。
分化の７日目（Ｄ７）に、ＮＩＭを、光受容体分化培地（ＰＲＤＭ）と交換した。ＰＲＤＭは、９７％ 基礎培地、２％ Ｂ２７－ビタミンＡ非含有補充物、１％ Ｎ２補充物（ＣＴＳ）、１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）、１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子、ＰＲＯＳＰＥＣ－ＴＡＮＹ ＴＥＣＨＮＯＧＥＮＥ）、０．５μＭ レチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｄ ａｃｉｄ）（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、および１０μＭ ＤＡＰＴ（Ｎ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェナセチル－Ｌ－アラニル）］－Ｓ－フェニルグリシン ｔ－ブチルエステル、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）からなる。この培地を、Ｄ３０まで１日おきに交換した。
図２Ａは、ｈＥＳＣを光受容体に分化させる方法を示すダイアグラムである。３種の細胞培養が示される： 分化前に培養するためのＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（０日目）；神経誘導培地；および光受容体分化培地。Ｄ０、Ｄ２０、およびＤ３０での細胞を示す３枚の写真も提供する。
図２Ｂおよび図２Ｃは、ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１基材上で増殖させた細胞の５つの異なるグラフのセットである。図２Ｂの上のグラフは、Ｄ０細胞とＤ２０細胞との間でマーカーＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＢＲＡ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＰＡＸ６の発現を比較する。ＯＣＴ３／４およびＮＡＮＯＧは、Ｄ０でアップレギュレートされる一方で、ＰＡＸ６は、Ｄ２０でアップレギュレートされる。
図２Ｂの左下のグラフは、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－５２３のみに関するＰＡＸ６の発現を比較する。ＰＡＸ６は、Ｄ０と比較して、Ｄ２０およびＤ３０でアップレギュレートされる。
図２Ｂの右下のグラフは、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－５２３のみに関するＶＳＸ２（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｙｓｔｅｍ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）の発現を比較する。ＶＳＸ２は、Ｄ０と比較して、Ｄ２０およびＤ３０でアップレギュレートされる。
図２Ｃの左のグラフは、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－５２３のみに関するＣＲＸ（Ｃｏｎｅ Ｒｏｄ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を比較する。ＣＲＸは、Ｄ０と比較して、Ｄ２０およびＤ３０でアップレギュレートされる。
図２Ｃの右のグラフは、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－５２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－５２３のみに関するＲＣＶＲＮ（リカバリン）の発現を比較する。ＲＣＶＲＮは、Ｄ０と比較して、Ｄ３０でアップレギュレートされる。
図２Ｄおよび図２Ｅは、ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１基材上で増殖させた細胞の５つの異なるグラフのセットである。図２Ｄの上のグラフは、Ｄ０細胞とＤ２０細胞との間でマーカーＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＢＲＡ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＰＡＸ６の発現を比較する。ＯＣＴ３／４およびＮＡＮＯＧは、Ｄ０でアップレギュレートされる一方で、ＰＡＸ６は、Ｄ２０でアップレギュレートされる。
図２Ｄの左下のグラフは、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ３２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－３２３のみに関するＰＡＸ６の発現を比較する。ＰＡＸ６は、Ｄ０と比較して、Ｄ２０およびＤ３０でアップレギュレートされる。
図２Ｄの右下のグラフは、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ３２３のみに関するＶＳＸ２の発現を比較する。ＶＳＸ２は、Ｄ０と比較して、Ｄ２０およびＤ３０でアップレギュレートされる。
図２Ｅの左のグラフは、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－３２３のみに関するＣＲＸの発現を比較する。ＣＲＸは、Ｄ０と比較して、Ｄ２０およびＤ３０でアップレギュレートされる。
図２Ｅの右のグラフは、左から右に、Ｄ０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、Ｄ２０ ＬＮ－３２３のみ、Ｄ３０ ＬＮ－３２３＋ＬＮ－５２１、およびＤ３０ ＬＮ－３２３のみに関するＲＣＶＲＮの発現を比較する。ＲＣＶＲＮは、Ｄ０と比較して、Ｄ２０およびＤ３０でアップレギュレートされる。
図２Ｆおよび図２Ｇは、ＬＮ－５２１のみの基材上で増殖させた細胞の５つの異なるグラフのセットである。図２Ｆの上のグラフは、Ｄ０細胞とＤ２０細胞との間でマーカーＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ、ＢＲＡ、ＭＩＸＬ１、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、およびＰＡＸ６の発現を比較する。ＯＣＴ３／４およびＮＡＮＯＧは、Ｄ０でアップレギュレートされる一方で、ＰＡＸ６は、Ｄ２０でアップレギュレートされる。
図２Ｆの左下のグラフは、左から右に、Ｄ０、Ｄ２０、およびＤ３０に関するＰＡＸ６の発現を比較する。ＰＡＸ６は、Ｄ０と比較して、Ｄ２０およびＤ３０でアップレギュレートされる。
図２Ｆの右下のグラフは、左から右に、Ｄ０、Ｄ２０、およびＤ３０に関するＶＳＸ２の発現を比較する。ＶＳＸ２は、Ｄ０と比較して、Ｄ２０およびＤ３０でアップレギュレートされる。
図２Ｇの左のグラフは、左から右に、Ｄ０、Ｄ２０、およびＤ３０に関するＣＲＸの発現を比較する。ＣＲＸは、Ｄ０と比較して、Ｄ２０およびＤ３０でアップレギュレートされる。
図２Ｇの右下のグラフは、左から右に、Ｄ０、Ｄ２０、およびＤ３０に関するＲＣＶＲＮの発現を比較する。ＲＣＶＲＮは、Ｄ０と比較して、Ｄ２０およびＤ３０でアップレギュレートされる。
図３Ａ～３Ｃは、Ｄ０ 未分化ｈＥＳＣおよびＤ３８ ｈＥＳＣ由来網膜細胞の免疫細胞化学分析を示す写真のセットである。図３Ａは、ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１基材上で増殖させた細胞に関するものである。図３Ｂは、ＬＮ－５２３＋ＬＮ－５２１基材上で増殖させた細胞に関するものである。図３Ｃは、ＬＮ－５２１のみの基材上で増殖させた細胞に関するものである。各セットは、１０枚の顕微鏡視野心を含む（スケールバー＝２０μｍ）。各セットでは、上の列は、ＯＣＴ４に関してＤ０細胞の、ＰＡＸ６に関してＤ０細胞の、およびＰＡＸ６に関してＤ３８細胞の分析を示す。第２の列は、これらをＤＡＰＩと複合したものを示す。第３の列は、ＶＳＸ２に関してＤ３８細胞の、およびＲＣＶＲＮに関してＤ３８細胞の分析を示す。第４の列は、これらをＤＡＰＩと複合したものを示す。Ｄ０ 未分化幹細胞では、ＯＣＴ４は発現されるが、ＰＡＸ６（Ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ ６）は発現されない。Ｄ３８ 分化細胞では、マーカーＰＡＸ６、ＶＳＸ２、およびＲＣＶＲＮは発現される。
図３Ｄは、３種のラミニンマトリクスに対するマーカーＰＡＸ６、ＶＳＸ２、ＣＲＸ、およびＲＣＶＲＮの発現を比較する。左から右に、そのマトリクスは、ＬＮ－５２３：ＬＮ－５２１、ＬＮ－３２３：ＬＮ－５２１、およびＬＮ－５２１のみである。
実施例２
２つの独立した単一細胞ＲＮＡ配列決定法データセットを、２０日目および３０日目のＨ１胚性幹細胞に由来する網膜前駆細胞で生成した。Ｈ１細胞を、実施例１のラミニンプロトコールで２０日間および３０日間にわたって培養した。各々において、１０ｘ ｇｅｎｏｍｉｃｓキットを使用してＲＮＡを単離し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉ－Ｓｅｑ３０００配列決定プラットフォームを使用して決定した。リードを、ヒトゲノム（Ｅｎｓｅｍｂｌ ｖｅｒｓｉｏｎ ９０）にマッピングし、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ２．１．１ １０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓソフトウェアを使用して定量した。そのＣｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒソフトウェアを、遺伝子バイオタイプ：タンパク質コーディング、ｌｉｎｃＲＮＡおよびアンチセンスに関してＥｎｓｅｍｂｌトランスクリプトームをフィルタにかけることによって生成した特注の参照トランスクリプトームとともに提供した。Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒを、３０００に設定した細胞期待数パラメーター（ｅｘｐｅｃｔ－ｃｅｌｌｓ）で実行した。
そのＣｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒの細胞期待数は、２０日目および３０日目でそれぞれ、１，７９０および３，８８１であった。リードの総数は、２０日目および３０日目でそれぞれ、６３１，８０３，３３０および６８７，７２１，９９３であった。ヒトゲノムにマッピングされたリードのパーセンテージは、２０日目および３０日目でそれぞれ、９７．１％および９６．８％であった。Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒは、各遺伝子（すなわち、遺伝子カウント）および細胞と関連した特有の分子識別子（ＵＭＩ）の数を返す。次いで、Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ出力マトリクス（すなわち、ｇｅｎｅｓ．ｔｓｖおよびｂａｒｃｏｄｅｓ．ｔｓｖ）をＲに入力し、全細胞においてカウントがゼロの遺伝子を破棄した。
各サンプル（すなわち、２０日目および３０日目の網膜前駆細胞）に関して、独立した分析を行った。各分析では、細胞品質管理を、以下を除去することによって行った：（ａ）ライブラリーサイズが非常に低いかまたは非常に高い細胞（すなわち、全細胞ライブラリーサイズの５パーセンタイルおよび９９パーセンタイルを、それぞれ下回るおよび上回る細胞）；（ｂ）検出された遺伝子数が低い細胞（すなわち、各細胞において検出された遺伝子の総数によって形成される分布の５パーセンタイルを下回る細胞）；ならびに（ｃ）それらの全遺伝子カウントの１０％超がミトコンドリア遺伝子に由来する細胞。細胞品質管理工程に合格しなかった細胞委を除去した後に、遺伝子カウントパーミリオン（ＣＰＭ）を、全ての遺伝子に関して計算した。遺伝子ＣＰＭは、生の遺伝子カウントマトリクスを、ｓｃａｔｅｒ １．８．４ Ｒパッケージ（ＭｃＣａｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｓｃａｔｅｒ： ｐｒｅ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ， ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ ｉｎ Ｒ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｂｔｗ７７７）の関数ｃａｌｃｕｌａｔｅＣＰＭに提供することによって計算した。その関数ｃａｌｃｕｌａｔｅＣＰＭを、ＦＡＬＳＥに設定したｕｓｅ＿ｓｉｚｅ＿ｆａｃｔｏｒｓパラメーターで実行した。
さらに、各別個の分析において、以下の５つの遺伝子品質管理工程を採用した：（ａ）「検出可能」な遺伝子のみを維持し、全細胞のうちの少なくとも１％において１より多くの転写物とともに検出される遺伝子として規定；（ｂ）そのデータにおいて平均発現が低い遺伝子（すなわち、生の平均遺伝子カウント発現が０．０１を下回る遺伝子。このカットオフは、全細胞および全遺伝子にわたる平均遺伝子発現の全分布に基づいて設定した）を除去した；（ｃ）ドロップアウト率の高い遺伝子を、Ｍ３Ｄｒｏｐ ３．０９ Ｒパッケージ（Ａｎｄｒｅｗｓ， ２０１７， Ｍ３Ｄｒｏｐ： Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｏｐｏｕｔｓ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ
ＲＮＡＳｅｑ）を使用して除去した。この工程では、Ｍ３Ｄｒｏｐ偽発見率（ＦＤＲ）を使用して、低ＦＤＲから高ＦＤＲまでの全ての遺伝子をランク付けし、次いで、遺伝子のうちの下位２５％（すなわち、ドロップアウト率が最高の遺伝子）を除去した；（ｄ）遺伝子発現分布におけるアウトライアー遺伝子（すなわち、「ＭＡＬＡＴ１」遺伝子）を除去した；ならびに（ｅ）ミトコンドリアゲノム上にコードされる遺伝子を除去した。
その遺伝子品質管理工程の後に、遺伝子カウントを、ｓｃｒａｎ １．８．４ Ｒパッケージ（Ｌｕｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ａ ｓｔｅｐ－ｂｙ－ｓｔｅｐ ｗｏｒｋｆｌｏｗ ｆｏｒ ｌｏｗ－ｌｅｖｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ． Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５， ２１２２）で正規化した。Ｓｃｒａｎサイズ因子を、そのデータの事前クラスター化をｑｕｉｃｋＣｌｕｓｔｅｒ関数で行うことによって、細胞プールから計算した。この関数の出力対象物を、ｃｏｍｐｕｔｅＳｕｍＦａｃｔｏｒｓ関数へと提供し、次いで、Ｌｏｇ２変換して正規化したカウントを、ｓｃａｔｅｒ １．８．４
Ｒパッケージ（デフォルトパラメーター化を用いる）（ＭｃＣａｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｓｃａｔｅｒ： ｐｒｅ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， ｑｕａｌｉｔｙ
ｃｏｎｔｒｏｌ， ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ ｉｎ Ｒ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｂｔｗ７７７）の関数ｎｏｒｍａｌｉｚｅを使用して計算した。次いで、細胞周期効果を説明するために、Ｇ２ＭおよびＧ１細胞周期スコアを、ｓｃａｔｅｒ １．８．４ Ｒパッケージ（ＭｃＣａｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）からのｃｙｃｌｏｎｅ関数を使用することによって各細胞に関して計算した。この関数を、（Ｓｃｉａｌｄｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｃｙｃｌｅ ｓｔａｇｅ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｄａｔａ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８５， ５４－６１）において提供されるヒト細胞周期遺伝子のセットとともに供給した。その後、そのＬｏｇ２－ｓｃｒａｎ正規化遺伝子カウントを、そのカウントおよび共変量「細胞周期Ｇ２Ｍスコア」および「細胞周期Ｇ１スコア」を、ｌｉｍｍａ ３．３６．３ Ｒパッケージ（Ｒｉｔｃｈｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， ｌｉｍｍａ ｐｏｗｅｒｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４３， ｅ４７－ｅ４７）の関数ｒｅｍｏｖｅＢａｔｃｈＥｆｆｅｃｔに提供することによって、細胞周期効果に関して補正した。
網膜前駆細胞の不均質なセット内の細胞亜集団をマーキングする遺伝子を識別するために、細胞クラスター化を、ＳＣ３ １．８ Ｒパッケージ（Ｋｉｓｅｌｅｖ ｅｔ ａｌ．， ２０１７ ＳＣ３： ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １４， ４８３－４８６）を使用して行った。高度に変動性の遺伝子を、ｓｃｒａｎ １．８．４
Ｒパッケージ（Ｌｕｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）のｔｒｅｎｄＶａｒおよびｄｅｃｏｍｐｏｓｅＶａｒ関数を使用することによって識別した。得られる偽発見率（ＦＤＲ）値（低から高まで）によって全ての遺伝子をランク付けし、遺伝子のうちの上位５０％（変動性が最高の遺伝子を表す）を、ＳＣ３での細胞クラスター化に使用した。ＳＣ３を、細胞周期効果に関して補正した後のＬｏｇ２－ｓｃｒａｎ正規化遺伝子カウントおよび変動性の高い遺伝子のみの計算したセットを使用して実行した。ＳＣ３を、クラスター数（すなわち、Ｋパラメーター（これは、ＳＣ３ Ｒパッケージ関数ｓｃ３＿ｅｓｔｉｍａｔｅ＿ｋを実行することによって得られる））の自動化検出で実行した。これは、２０日目および３０日目の網膜前駆細胞においてそれぞれ識別される１９の細胞クラスターおよび２１の細胞クラスターを生じた。
２０日目の網膜前駆細胞では、ＰＡＸ６遺伝子を発現する細胞のマーカー遺伝子を識別した。３０日目の網膜前駆細胞では、マーカー遺伝子を、異なる細胞亜集団に関して識別した：（ａ）ＰＡＸ６を発現する細胞；（ｂ）ＣＲＸを発現する細胞；および（ｃ）ＶＳＸ２を発現する細胞。
これらの細胞セットに関するマーカー遺伝子を識別するために、以前に計算した２つのクラスターセット（２０日目および３０日目に関してそれぞれ１９の細胞クラスターおよび２１の細胞クラスター）の各々において、その目的遺伝子（例えば、ＰＡＸ６）のメジアン発現レベルを、細胞周期効果に関して補正した後のＬｏｇ２－ｓｃｒａｎ正規化遺伝子カウントを使用することによって計算した。次いで、単一の目的遺伝子陽性細胞クラスターを得るために、０．５８（この値は、対数化していない遺伝子カウントにおける０．５に相当する）より高い目的遺伝子のメジアンＬｏｇ２発現レベルを有する細胞のクラスターを、一緒に複合した。次いで、ペアワイズ発現差異分析を、残りの全てのクラスターと目的遺伝子陽性細胞クラスターとの間で行った。この発現差異分析を、ｅｄｇｅＲ ３．２２．３ Ｒパッケージ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， ｅｄｇｅＲ： ａ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｇｉｔａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６， １３９－１４０）で行った。ＥｄｇｅＲを、正規化していない（生の）遺伝子カウント、ｓｃｒａｎ
１．８．４ Ｒパッケージ関数ｓｉｚｅＦａｃｔｏｒｓ、ならびにｅｄｇｅＲ Ｒパッケージ関数ｅｓｔｉｍａｔｅＤｉｓｐ、ｇｌｍＱＬＦｉｔおよびｇｌｍＱＬＦＴｅｓｔで計算したサイズ因子で行った。上記の全ての品質管理工程に合格した遺伝子および細胞のみを使用した。細胞周期効果を説明するために、「細胞周期Ｇ２Ｍスコア」および「細胞周期Ｇ１スコア」を、上記で計算したとおりのｅｄｇｅＲモデルに含めた。差次的発現を行った後に、細胞クラスターマーカー遺伝子を、以下の２つの条件を満たす遺伝子として識別した：（ａ）他の全てのクラスターと比較した場合に、２より高いペアワイズＬｏｇ２倍率変化値、および（ｂ）その遺伝子がマーカーと表示されたクラスターにおいて１より高いＬｏｇ２メジアン発現レベル。この発現値は、対数化されていない遺伝子カウントにおける１に相当する。
３０日目の網膜前駆細胞では、遺伝子マーカーを、以下のさらに２種の細胞クラスターに関しても計算した：（ａ）ＳＣ３アルゴリズムをＫパラメーター２で実行した場合に得た細胞クラスター番号１（ＳＴＭＮ２＋クラスターと示される）；（ｂ）ＳＣ３アルゴリズムをＫパラメーター３で実行した場合に得た細胞クラスター番号３（ＣＮＴＮ２＋クラスターと示される）。遺伝子マーカーを、発現差異分析および上記の工程を実行することによって、これら細胞クラスターに関して計算した。
これらの細胞亜集団（すなわち、２０日目のＰＡＸ６＋ 細胞および３０日目のＰＡＸ６＋ 細胞、ＶＳＸ２＋ 細胞、ＣＲＸ＋ 細胞、ＳＴＭＮ２＋ 細胞およびＣＮＴＮ２＋ 細胞）の各々をマーキングする上位の遺伝子を選択し、それらの遺伝子－遺伝子ペアワイズピアソン相関レベルを、スケーリングおよびデフォルトパラメーター化なしのＲパッケージ ｇｐｌｏｔｓ ３．０．１（Ｗａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， ｇｐｌｏｔｓ： Ｖａｒｉｏｕｓ Ｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｐｌｏｔｔｉｎｇ Ｄａｔａ）の関数ｈｅａｔｍａｐ．２を使用することによって、ヒストグラムにおいてプロットして、図５および図６を得た。
２０日目および３０日目の前駆細胞を、ｔ分布型確率的近傍埋め込みアルゴリズム、ｔ－ＳＮＥ（ＭｃＣａｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）を使用することによって別個に可視化した。ｔ－ＳＮＥを、二次元で、およびＬｏｇ２ ｓｃｒａｎ正規化しかつ細胞周期調整した遺伝子カウントをｓｃａｔｅｒ １．８．４ Ｒパッケージ（ＭｃＣａｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）の関数ｐｌｏｔＴＳＮＥに提供することによって計算した。そのｔ－ＳＮＥ ｐｅｒｐｌｅｘｉｔｙパラメーターを、品質管理に合格した細胞数を５で除算したものに設定した。そのｔ－ＳＮＥグラフでは、各ドットは、個々の細胞に相当し、各細胞を、２０日目および３０日目の網膜前駆細胞の亜集団の各々をマーキングする遺伝子の発現レベルにマッピングすることによって、細胞亜集団をまたこれらのグラフにおいて可視化した（図４Ｃ～４Ｄ、図７Ａ～７Ｊ）。最小および最大の色を、そのプロットされた遺伝子の各々の最小および最大の発現レベルに設定した。ｔ－ＳＮＥグラフを、遺伝子ＮＡＮＯＧおよびＰＯＵ５Ｆ１の発現レベルによって着色した２０日目の網膜前駆細胞に関しても生成した（図４Ａ～４Ｂ）。
２０日目の網膜前駆細胞は、遺伝子ＮＡＮＯＧおよびＰＯＵ５Ｆ１の発現を欠くことが見出された（図４Ａ～４Ｂ）。２０日目の網膜前駆細胞はまた、特定の細胞亜集団においてＰＡＸ６を発現することが見出された（図４Ｃ）。
ＰＡＸ６を発現するこの２０日目の細胞亜集団に属する２０日目の網膜前駆細胞に関する以下の遺伝子マーカーも識別した（図５）： ＤＡＰＬ１、ＳＩＸ６、ＳＦＲＰ２、ＬＨＸ２、ＰＡＸ６、ＣＤＨ２、ＣＬＤＮ１、ＴＲＰＭ３、ＲＥＬＮ、ＤＣＴ、およびＰＭＥＬ。
３０日目の網膜前駆細胞では、５種の別個の細胞亜集団を識別した（図６）。これら細胞亜集団は、以下の遺伝子の発現によってマーキングされた：
（ａ）ＣＲＸ、Ｃ１１ｏｒｆ９６、ＮＸＰＨ４、ＮＴＳ、ＤＣＴ、ＰＲＤＭ１、ＮＥＵＲＯＤ４、Ｓ１００Ａ１３、ＲＣＶＲＮ、ＦＡＭ５７Ｂ、ＳＹＴ４、ＤＬＬ３、ＳＳＴＲ２、ＣＨＲＮＡ５、およびＲＯＢＯ２（図７Ａおよび図７Ｂにおいて強調された細胞を含む、ＣＲＸ＋ 亜集団）；
（ｂ）ＳＴＭＮ２、ＯＮＥＣＵＴ２、ＡＴＯＨ７、ＥＬＡＶＬ４、およびＧＡＰ４３（図７Ｃおよび図７Ｄにおいて強調された細胞を含む、ＳＴＭＮ２＋ 亜集団）；
（ｃ）ＣＮＴＮ２、ＮＥＦＭ、ＮＥＦＬ、ＰＲＰＨ、ＰＯＵ４Ｆ２、およびＣＸＣＲ４（図７Ｅおよび図７Ｆにおいて強調された細胞を含む、ＣＮＴＮ２＋ 亜集団）；
（ｄ）ＰＡＸ６、ＳＩＸ３およびＳＬＣ２Ａ１ （図７Ｇおよび図７Ｈにおいて強調された細胞を含む、ＰＡＸ６＋ 亜集団）；ならびに
（ｅ）ＶＳＸ２、ＰＴＨ２、ＦＺＤ５、ＲＡＲＲＥＳ２、ＤＩＯ３、ＳＯＸ２およびＣＹＰ１Ｂ１ （図７Ｉおよび図７Ｊにおいて強調された細胞を含む、ＶＳＸ２＋ 亜集団）。
本開示は、例示的実施形態を参照しながら記載されてきた。改変および変更は、先の詳細な説明を読んで理解した際に他者に想起される。本開示は、それらが添付の請求項またはその均等物の範囲内にある限りにおいて、全てのこのような改変および変更を含むと解釈されるべきことが意図される。

Claims (9)

  1. 網膜光受容体前駆細胞または光受容体を生成するための方法であって、該方法は：
    多能性ヒト幹細胞を、ラミニンマトリクスを有する細胞培養表面にプレートする工程であって、ここで該ラミニンマトリクスは、（ｉ）ラミニン－５２１である第１のラミニンであって、該ラミニン－５２１は無傷のタンパク質またはタンパク質フラグメントのいずれかである、第１のラミニン、および（ｉｉ）ラミニン－３２３およびラミニン－５２３からなる群より選択される第２のラミニンであって、該第２のラミニンは、無傷のタンパク質またはタンパク質フラグメントのいずれかである、第２のラミニンを含む、工程；ならびに
    該多能性ヒト幹細胞を培養して、該網膜光受容体前駆細胞または光受容体を得る工程；
    を含む、方法。
  2. 前記多能性ヒト幹細胞が、
    前記細胞を、ＴＧＦβインヒビターおよびＷｎｔインヒビターを含む神経誘導培地中で第１の期間にわたって培養する工程；ならびに
    前記細胞を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、レチノイン酸、およびγセクレターゼインヒビターを含む光受容体分化培地中で第２の期間にわたって培養する工程
    によって培養される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の期間が約１２０時間～約１６８時間である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記第２の期間が約２８８時間～約８１６時間である、請求項２または３に記載の方法。
  5. 前記神経誘導培地が、
    ５μＭ～１５μＭの前記ＴＧＦβインヒビター；および
    ５μＭ～１５μＭの前記Ｗｎｔインヒビター
    を含む、請求項２～４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記ＴＧＦβインヒビターがＳＢ４３１５４２であるか；または
    前記ＷｎｔインヒビターがＣＫＩ－７である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記光受容体分化培地が、
    １ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬの前記脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；
    １ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬの前記毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；
    ０．１μＭ～５μＭの前記レチノイン酸；および
    ５μＭ～１５μＭの前記γセクレターゼインヒビター
    を含む、請求項２～６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記γセクレターゼインヒビターがＤＡＰＴである、請求項２～７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記第２のラミニン対前記第１のラミニンの重量比が１：１～４：１である、前述の請求項１～８のいずれかに記載の方法。
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