CN117414376A - 一株缓解肠易激综合征的嗜酸乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株缓解肠易激综合征的嗜酸乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供了嗜酸乳杆菌CCFM1200在缓解肠易激综合征中的新用途，能够提升肠易激综合征个体内脏疼痛阈值和减少排便次数；显著降低神经生长因子和肌球受体激酶A，进而降低肠嗜铬细胞数量，减少5‑HT的含量；调节肠道菌群，显著降低短链脂肪酸含量。本发明的嗜酸乳杆菌CCFM1200可用于制备预防和治疗肠易激综合征的药品，具有广泛的应用前景。

Description

一株缓解肠易激综合征的嗜酸乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株缓解肠易激综合征的嗜酸乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
肠易激综合征(Irritable bowel symdrome，IBS)是常见的功能性肠病，对生活质量有重大影响，全球发病率约为5％-10％。IBS的病因尚不明确，针对不同的病因会采用不同的治疗方法，但效果不理想，且长期服用药物会导致显著的不良反应及副作用。
肠道菌群与IBS关联密切，据报道，IBS患者的肠道菌群多为失衡状态，同时，短链脂肪酸和胆汁酸等代谢产物的量都呈异常状态。菌群的紊乱和代谢产物的异常会导致多种不良症状。益生菌可以调节肠道菌群，因此，筛选具有缓解肠易激综合征的益生菌有助于为治疗IBS提供新的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术药物作用时间长、有副作用等缺陷，经过动物实验体内研究获得嗜酸乳杆菌CCFM1200在缓解肠易激综合征中的新用途；
所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CCFM1200，已于2021年12月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：62128，并公开于公开号为CN114231470B的专利中。
在一种实施方式中，所述新用途是将作为嗜酸乳杆菌CCFM1200用于制备缓解肠易激综合征的药物。
在一种实施方式中，所述应用包括提高肠易激综合征个体疼痛阈值，减轻疼痛。
在一种实施方式中，所述应用包括如下至少一种作用：
(1)减少肠易激综合征个体排便颗粒数；
(2)降低肠易激综合征个体肠嗜铬细胞数量；
(3)降低肠易激综合征个体结肠5-羟色胺含量；
(4)提高肠易激综合征个体菌群多样性；
(5)恢复肠易激综合征个体肠道中乙酸、丁酸和戊酸的浓度。
在一种实施方式中，所述肠易激综合征是母婴分离应激导致的肠易激综合征。
本发明还提供了一种制备预防和/或治疗肠易激综合征的药物的方法，所述方法为以嗜酸乳杆菌CCFM1200作为药物的活性成分。
在一种实施方式中，所述药物中嗜酸乳杆菌CCFM1200的活菌数不低于1×109CFU/g或1×109CFU/mL。
在一种实施方式中，所述药物含有上述嗜酸乳杆菌CCFM1200、药物载体和/或药用辅料。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗肠易激综合征的产品，所述产品含有上述嗜酸乳杆菌CCFM1200。
在一种实施方式中，所述产品中，上述嗜酸乳杆菌CCFM1200的活菌数为不低于1×109CFU/g。
在一种实施方式中，所述产品为药物。
在一种实施方式中，所述药物含有上述嗜酸乳杆菌CCFM1200、药物载体和/或药用辅料。
在一种实施方式中，所述药物为含有嗜酸乳杆菌CCFM1200的微生物制剂。
在一种实施方式中，所述微生物制剂为菌液或菌粉。
有益效果：
本发明通过动物模型验证，证实嗜酸乳杆菌CCFM1200能够有效减少排便颗粒数、提高疼痛阈值、降低肠嗜铬细胞数量、降低结肠5-HT含量、降低神经生长因子和及肌球受体激酶A的mRNA相对表达量，提高菌群多样性和降低短链脂肪酸含量。表现出对肠易激综合征更好的治疗或预防效果，因此可以制备用于预防和治疗肠易激综合征的药品，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
图1为各组疼痛阈值的变化，疼痛阈值即大鼠在达到弓背状态时体内的气囊压力，表明嗜酸乳杆菌CCFM1200降低大鼠疼痛阈值；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(p<0.05)。
图2为各组10分钟内的粪便数量，表明嗜酸乳杆菌CCFM1200减少大鼠的排便次数；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(p<0.05)。
图3为各组结肠组织中5-HT的含量，表明嗜酸乳杆菌CCFM1200降低结肠组织中5-HT含量；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(p<0.05)。
图4为各组结肠肠嗜铬细胞免疫荧光染色切片。表明嗜酸乳杆菌CCFM1200显著降低大鼠结肠肠嗜铬细胞数量；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(p<0.05)。
图5为各组结肠神经生长因子的mRNA的相对表达量的变化，表明嗜酸乳杆菌CCFM1200能降低大鼠结肠神经生长因子的表达量；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(p<0.05)。
图6为各组结肠肌球受体激酶A的mRNA的相对表达量的变化，表明嗜酸乳杆菌CCFM1200能降低结肠肌球受体激酶A的表达量；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(p<0.05)。
图7为各组大鼠粪便16S rDNA测序中的α多样性的Chao1指数的变化，表明嗜酸乳杆菌CCFM1200能提高菌群的α多样性；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(p<0.05)。
图8为各组大鼠粪便的乙酸含量，表明嗜酸乳杆菌CCFM200能降低大鼠粪便的乙酸含量。图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(p<0.05)。
图9为各组大鼠粪便的丁酸含量，表明嗜酸乳杆菌CCFM200能降低大鼠粪便的丁酸含量。图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(p<0.05)。
图10为各组大鼠粪便的戊酸含量，表明嗜酸乳杆菌CCFM200能降低大鼠粪便的戊酸含量。图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(p<0.05)。
具体实施方式
在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度或比例的“％”或百分比均为重量百分比。
本发明的一些实施方式中涉及以下培养基：
MRS液体培养基：胰蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、柠檬酸氢二铵2g、醋酸钠5g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.5g、一水合硫酸锰0.25g，吐温80 1mL，加水至1000mL。
MRS固体培养基是在以上基础添加以液体培养基总重计1.5％琼脂得到的。
实施例1：嗜酸乳杆菌CCFM1200改善母婴分离导致的肠易激综合征大鼠内脏高敏感
1.实验动物
雄性SPF级Wistar孕鼠，购买自中国北京斯贝福生物技术有限公司。大鼠饲养在聚丙烯笼子里，每笼1只大鼠，笼子里装有食物和水，控制温度(22℃)，相对湿度(50％±10％)，自由饮水，用标准饲料喂养。
2.嗜酸乳杆菌CCFM1200培养
(1)活化培养：
采用MRS液体培养基，37℃普通培养箱中静置培养。
培养目标：取冷冻保存的菌体，挑单菌落于液体MRS液体培养基中，在37℃普通培养箱中静置培养约24h，活化嗜酸乳杆菌CCFM1200。
(2)一级培养：
采用MRS液体培养基，37℃普通培养箱中静置培养。
培养目标：将活化培养的嗜酸乳杆菌CCFM1200以培养基体积计2％接种量转接至MRS液体培养基，传两代。
(3)二级培养：
培养基及培养条件同一级培养。
将经过一级培养的嗜酸乳杆菌CCFM1200以培养基体积计2％接种量转接至1L MRS液体培养基中，37℃普通培养箱中静置培养约24h，收集菌体。用生理盐水洗涤两遍，接着重悬于30％甘油溶液中，活菌数为1.1×1010CFU/mL，或调节为1×109CFU/mL。后续试验使用时，离心弃去甘油，用生理盐水洗涤一遍后重悬于生理盐水中。
以嗜酸乳杆菌FCQHC4LH1为对照，嗜酸乳杆菌FCQHC4LH1公开于论文《ComparativeGenomics and Specific Functional Characteristics Analysis of Lactobacillusacidophilus》中。
3、实验方法
(1)生命早期母婴分离应激导致的肠易激综合征大鼠模型的建立
待幼鼠出生后，空白组不做处理；其余以出生当天为第0天，第2-14天每天的9：00-12：00将幼鼠单独分离，第21天分笼，使用雄性幼鼠实验。
(2)实验分组及给药
未作处理的空白组10只。其余30只随机分为3组，即模型组、嗜酸乳杆菌CCFM1200处理组和嗜酸乳杆菌FCQHC4LH1组。从第21天起开始灌胃，灌胃剂量为2×109/只/天；空白组和模型组灌胃相同体积的生理盐水。全部组别灌胃至8周龄，测量疼痛阈值后处死。
肠易激综合征最显著的发病特点是腹痛，多项研究表明，腹痛是由于内脏高敏感导致的，即内脏疼痛阈值的降低。内脏疼痛阈值的测量方法为腹壁撤退反射：将一可充气的小气囊使用三通与压力计和充气装置连接，将大鼠麻醉后，将气囊插入肛门6厘米，待大鼠苏醒稳定后，缓慢充气，直至大鼠出现弓背，记录此刻的压力值，即为大鼠的内脏疼痛阈值。
图1表明，模型组相比于空白组疼痛阈值显著降低(p<0.05)，嗜酸乳杆菌CCFM1200可以显著的提升疼痛阈值(p<0.05)并恢复至正常水平，而嗜酸乳杆菌FCQHC4LH1无此作用。
实施例2：嗜酸乳杆菌CCFM1200改善母婴分离导致的肠易激综合征大鼠的排便次数
菌株培养及动物实验见实施例1。
腹泻型肠易激综合征会导致排便次数的增加，影响患者的生活质量，降低排便次数是缓解病情的重要指标。将大鼠单独放置于边长为1米的正方形的旷场中，无干扰状态下，10分钟后，检查大鼠的排便颗粒数，即为大鼠的排便次数。
图2表明，在10分钟内，模型组比空白组的粪便颗粒数显著增加(p<0.05)，证明大鼠排便次数增加，嗜酸乳杆菌CCFM1200可以显著降低排便次数(p<0.05)，且接近正常水平，而嗜酸乳杆菌FCQHC4LH1无此作用。
实施例3：嗜酸乳杆菌CCFM1200改善肠易激综合征大鼠结肠肠嗜铬细胞数量和5-HT含量
菌株培养及动物实验见实施例1。
解剖部分结肠组织，经样品前处理后使用高效液相色谱测量5-HT含量；另一部分结肠使用4％多聚甲醛固定24h，脱水、石蜡包埋、石蜡切片脱蜡至水、抗原修复、血清封闭、加一抗、加二抗、自发荧光猝灭、DAPI复染细胞核、封片和镜检拍照。
5-HT与腹泻和内脏高敏感存在紧密的联系，肠嗜铬细胞的增多会导致5-HT的增多。多项研究表明腹泻型肠易激综合征患者的5-HT含量增高。图3表明，与空白组相比，模型组的5-HT显著增高至3.2倍(p<0.05)。嗜酸乳杆菌CCFM1200可以降低5-HT含量(p<0.05)，与模型组相比降低了56.1％；而嗜酸乳杆菌FCQHC4LH1无此作用。
图4表明，与空白组相比，模型组的肠嗜铬细胞数量显著增高至2.2倍(p<0.05)。嗜酸乳杆菌CCFM1200可以降低肠嗜铬细胞的数量(p<0.05)，与模型组相比降低了37.2％；而嗜酸乳杆菌FCQHC4LH1无此作用。
实施例4：嗜酸乳杆菌CCFM1200改善肠易激综合征大鼠结肠神经生长因子和肌球受体激酶A的mRNA的相对表达量
菌株培养及动物实验见实施例1。
取一部分结肠使用Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA后使用定量PCR(qPCR)法检测神经生长因子与肌球受体激酶A的含量。
先前的研究表明，母婴分离应激会导致神经生长因子与肌球受体激酶A的mRNA的相对表达量增加，进而导致肠道干细胞向肠嗜铬细胞分化。最终导致5-HT的增加。降低神经生长因子与肌球受体激酶A的mRNA的相对表达量可以缓解肠易激综合征。
图5和图6表明，与空白组相比，模型组的结肠神经生长因子和肌球受体激酶A的mRNA的相对表达量显著增加，分别增加至2.31倍和2.48倍(p<0.05)，嗜酸乳杆菌CCFM1200可以降低结肠神经生长因子和肌球受体激酶A的mRNA的相对表达量(p<0.05)，与模型组相比，分别降低了37.9％和29.6％；而嗜酸乳杆菌FCQHC4LH1无此作用。
实施例5：嗜酸乳杆菌CCFM1200改善肠易激综合征大鼠的粪便菌群多样性
菌株培养及动物实验见实施例1。
在测量疼痛阈值前收集大鼠粪便，置于-80℃冰箱保存用于后续实验。使用快速DNA提取试剂盒提取粪便DNA后进行16s rDNA测序，用于分析菌群的变化；粪便经样品前处理后，使用GC-MS测量短链脂肪酸的含量。
肠道微生态的稳定非常重要，肠易激综合征患者多伴随肠道菌群失调。主要表现为肠道菌群多样性的降低。恢复肠道菌群的稳态可以有效的缓解肠易激综合征。
图7表明，与空白组相比，模型组的菌群多样性显著降低，嗜酸乳杆菌CCFM1200可以缓解菌群多样性的降低，并使其与空白组无显著差异。而嗜酸乳杆菌FCQHC4LH1无此作用。
实施例6：嗜酸乳杆菌CCFM1200改善肠易激综合征大鼠的短链脂肪酸含量
菌株培养及动物实验见实施例1。
在测量疼痛阈值前收集大鼠粪便，置于-80℃冰箱保存用于后续实验。粪便经样品前处理后，使用GC-MS测量短链脂肪酸的含量。
多项研究表明，腹泻型肠易激综合征患者粪便的短链脂肪酸显著高于健康人群，使短链脂肪酸恢复至正常水平有助于缓解病情。
图8表明，与空白组相比，模型组粪便的乙酸含量增高，嗜酸乳杆菌CCFM1200可以降低粪便中乙酸的含量(p<0.05)，与模型组相比降低了44.8％；而嗜酸乳杆菌FCQHC4LH1无此作用。
图9表明，与空白组相比，模型组粪便的丁酸含量显著增高至1.3倍(p<0.05)，嗜酸乳杆菌CCFM1200可以降低粪便中丁酸的含量(p<0.05)，与模型组相比降低了37.6％；而嗜酸乳杆菌FCQHC4LH1无此作用。
图10表明，与空白组相比，模型组粪便的戊酸含量显著增高至1.6倍(p<0.05)，嗜酸乳杆菌CCFM1200可以降低粪便中戊酸的含量(p<0.05)，与模型组相比降低了44.3％；而嗜酸乳杆菌FCQHC4LH1无此作用。
以上实验结果表明，嗜酸乳杆菌CCFM1200能缓解大鼠肠易激综合征，具体表现为降低内脏疼痛阈值和减少排便次数。此外，本发明通过实验证明了嗜酸乳杆菌CCFM1200缓解IBS是通过降低神经生长因子和肌球受体激酶A，降低肠嗜铬细胞数量的异常增高，进而降低结肠5-HT的含量。同时，该菌株还调节了肠道菌群，并降低了异常增高的乙酸、丁酸和戊酸，基本恢复至正常水平。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CCFM1200在制备缓解肠易激综合征的药物中的应用，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌CCFM1200的保藏号为GDMCC No：62128。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括提高肠易激综合征个体疼痛阈值，减轻疼痛。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，还包括如下至少一种作用：
(1)减少肠易激综合征个体排便颗粒数；
(2)降低肠易激综合征个体肠嗜铬细胞数量；
(3)降低肠易激综合征个体结肠5-羟色胺含量；
(4)提高肠易激综合征个体菌群多样性；
(5)恢复肠易激综合征个体肠道中乙酸、丁酸和戊酸的浓度。
4.根据权利要求1～3任一所述的应用，其特征在于，所述药物中嗜酸乳杆菌CCFM1200的活菌数不低于1×109CFU/g或1×109CFU/mL。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物含有所述嗜酸乳杆菌CCFM1200、药物载体和/或药用辅料。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为含有嗜酸乳杆菌CCFM1200的微生物制剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂为菌液或菌粉。
8.根据权利要求1～7任一所述的应用，其特征在于，所述肠易激综合征是母婴分离应激导致的肠易激综合征。
9.一种用于预防和/或治疗肠易激综合征的产品，所述产品含有上述嗜酸乳杆菌CCFM1200。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品中，嗜酸乳杆菌CCFM1200的活菌数不低于1×109CFU/g。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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