CN117402921A - 一种利用d-木糖为底物生物合成d-核糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用D‑木糖为底物生物合成D‑核糖的方法。涉及生物化工领域，其特征在于，以木糖为底物，以大肠杆菌为底盘细胞，通过构建3步酶级联反应，将D‑木糖转化为D‑核糖。通过筛选D‑木糖向D‑核糖3步转化途径中有活性的异构酶，分别为：D‑木糖/D‑葡萄糖异构酶(D‑XI/GI,EC 5.3.1.5)、D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶(D‑PE,EC 5.1.3.30)、醛糖‑酮糖异构酶(EC 5.3.1.‑)，利用上述3种酶构建共表达质粒，构建出产D‑核糖的工程菌BL21/pET28a(PB)N‑XylA‑CcDPE‑Bs‑L‑RhI。结果表明，菌株BL21/pET28a(PB)N‑XylA‑CcDPE‑Bs‑L‑RhI作为全细胞催化剂，可以将D‑木糖转化为D‑核糖，以50g/L D‑木糖为底物，合成了1.522g/LD‑核糖。本发明是一种替代戊糖磷酸途径生物合成D‑核糖方法，进一步的转化工艺优化有望大幅提高D‑核糖的产量和转化率。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工领域，具体涉及一种利用D-木糖为底物生物合成D-核糖的方法。
背景技术
D-核糖是一种天然产生的戊糖，在动植物细胞的新陈代谢中发挥着极其重要的作用。在医药应用领域，D-核糖是重要的药物中间体，可用于多种核酸类药物的生产，D-核糖可用于合成口服药莫努匹韦(Molnupiravir)——默沙东，另外D-核糖可以作为类固醇、V D的结构类似物、前列腺素、核苷类药物的前体、萜类化合物、凝乳酶抑制因子、修饰氨基酸等的生产原料，也能够大量合成核黄素。在食品应用领域，D-核糖能够合成新型食品添加剂呈味核苷酸，呈味核苔酸可作为一种营养品,可作食品添加剂为提高身体素质提供核心物质基础。在临床营养和体育运动营养方面，D-核糖已广泛应用于临床营养(心脏病患者辅助治疗、肌纤维疼痛综合症)、抗高原缺氧等产品上。D-核糖在体育运动营养方面具有抗疲劳、耐缺氧的作用。
合成D-核糖的最早方法涉及酶水解，或从葡萄糖、阿拉伯糖、葡糖酸和木糖化学合成，但是这些方法存在成本高、转化率很低、纯化复杂、易造成环境污染等不足，因此没有取得太大的商业成功。接着开发了基于发酵的工艺来替代基于化学和生化的方法来商业生产D-核糖，已知几种生物，包括短青霉、爬行假单胞菌、和假丝酵母，可以自然地产生核糖。然而，由于产量低，培养这些微生物又困难，菌BL21/XylA、BL21/YIXI、BL21/YIGPI、BL21/GoXI_02、BL21/GoGPI、BL21/BsXI、BL21/BsGPI、BL21/PpXI、BL21/BtDPEase。通过筛选以上菌株，能催化D-木糖合成D-木酮糖的菌株为BL21/pET28a(PB)-XylA。
(2)将上述不同来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因(PaDPEase_01,SEQ IDNO:13)、(PpDPEase_01,SEQ ID NO:14)、(BsDPEase_01,SEQ ID NO:15)、(BtDPEase,SEQ IDNO:16)(GoDPEase,SEQ ID NO:17)、(DPEase,SEQ ID NO:18)、(CcDPEase,SEQ ID NO:19)分别使用一步克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)克隆到载体pET28a(PB)-XylA的NheI位点(所用引物见表1)，得到8个重组质粒(重组质粒图如图2所示)。其中，所有途径基因的表达均由T7启动子和T7终止子控制。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，即得到8个重组大肠杆菌，经验证能催化D-木酮糖合成D-核酮糖的菌株为BL21/pET28a(PB)-XylA-CcDPEase。
(3)将不同来源的醛糖异构酶编码基因：(Bs-L-RhI,SEQ ID NO:1)、(CdRPI*(R133D),SEQ ID NO:2)、(PfGPI*(T85Q),SEQ ID NO:3)、(YIXI,SEQ ID NO:5)、(YIGPI,SEQID NO:6)、(GoXI_02,SEQ ID NO:7)、(GoGPI,SEQ ID NO:8)、(BsXI,SEQ ID NO:9)、(BsGPI,SEQ ID NO:10)、(PpXI_02,SEQ ID NO:11)、(AgoG2GI,SEQ ID NO:12)、(BtDPEase,SEQ IDNO:16)分别使用一步克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)克隆到载体pET28a(PB)-XylA-CcDPEase的NheI位点(所用引物见表1)，得到12个重组质粒(重组质粒图如图3所示)。其中，所有途径基因的表达均由T7启动子和T7终止子控制。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，即得到12重组大肠杆菌。上述12个重组菌株中能将D-木糖合成为D-核糖为：BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPE-Bs-L-RhI、BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-CdRPI*(R133D)、BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-PfGPI*(T85Q)。
可选的，使用上述重组菌株BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPE-Bs-L-RhI、BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-CdRPI*(R133D)、BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-PfGPI*(T85Q)。将D-木糖转化为核糖的条件为：培养重组大肠杆菌至OD600＝0.6-0.8，添加终浓度为0.5mM的IPTG，在25℃，200rpm条件下诱导8h。在4℃，4000rpm条件下离心收集菌体，使用灭菌的超纯水洗涤菌体去除培养基，然后使用20mM、pH为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬菌体，即得到静息细胞，可作为全细胞催化剂用于后续反应。
可选的，所述的底物D-木糖的浓度为50g/L。
可选的，所述的转化条件为65℃反应10h。
相比于现有的技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明使用廉价的原料D-木糖作为底物，大大降低了D-核糖的生产成本，适合大规模生产。
(2)本发明相比于磷酸戊糖途径生产D-核糖，反应过程单一，且不消耗能量，反应副产物少，便于后续的分离纯化。
(3)全细胞转化相较于酶法催化，避免了繁琐的酶的纯化步骤及辅因子等一系列问题，且反应条件温和，更加适合工业化生产。
附图说明
图1.D-木糖转化为D-核糖的合成途径示意图。该途径由D-木糖异构酶、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶、醛糖-酮糖异构酶组成。
图2.D-木糖异构酶(XylA，SEQ ID NO:20)串联不同来源D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组质粒图。分别为pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase、pET28a(PB)N-XylA-DPEase、pET28a(PB)N-XylA-BtDPEase、pET28a(PB)N-XylA-PpDPEase-01、pET28a(PB)N-XylA-PaDPEase-01、pET28a(PB)N-XylA-BsDPEase、pET28a(PB)N-XylA-GoDPEase重组质粒图。重组质粒含有D-木糖异构酶编码基因(XylA,SEQ ID NO:4)串联不同来源D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因，这些基因的表达均由T7启动子和T7终止子控制，以单顺反子的形式串联，组成D-木糖到D-核酮糖的转化途径。
图3.D-木糖异构酶(XylA,SEQ ID NO:20)和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(CcDPEase,SEQ ID NO:21)串联不同来源醛糖-酮糖异构酶重组质粒图。分别为pET28a(PB)N-XylA-CcDPE-Bs-L-RhI、pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-CdRPI*(R133D)、pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-AgoG2GI、pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-YIXI、pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-YIGPI、pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-BtDPEase、pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-GoXI-02、pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-GoGPI、pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-BsGPI、pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-BsXI、pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-PpXI、pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-PfGPI*(T85Q)的重组质粒图。重组质粒含有D-木糖异构酶编码基因(XylA,SEQ ID NO:4)和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因(CcDPEase,SEQ ID NO:19)串联不同来源醛糖-酮糖异构酶编码基因，这些基因的表达均由T7启动子和T7终止子控制，以单顺反子的形式串联，组成D-木糖到D-核糖的转化的三个途径。
图4.不同来源D-木糖/D-葡萄糖异构酶(D-XI/GI,EC5.3.1.5)功能验证。(A)不同来源D-木糖/D-葡萄糖异构酶(D-XI/GI,EC5.3.1.5)蛋白表达情况。(B)D-木糖到D-木酮糖反应离子色谱图
图5.不同来源D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-PE,EC5.1.3.30)功能验证。(A)不同来源D-阿洛酮糖-3-差向异构酶蛋白表达情况。(B)D-木糖到D-核酮糖反应离子色谱图。
图6.不同来源醛糖-酮糖异构酶(EC5.3.1.-)功能验证。(A)不同来源醛糖-酮糖异构酶(EC5.3.1.-)蛋白表达情况。(B)D-木糖到D-核糖反应离子色谱图。
图7.D-木糖全细胞合成D-核糖产量对比图。对照BL21/XylA-CcDPEase也能检测出少量核糖，分析原因，细胞本身会释放出少量核糖。和对照BL21/XylA-CcDPEase相比，菌株BL21/XylA-CcDPEase-CdRPI*(R133D)、BL21/XylA-CcDPEase-PfGPI*(T85Q)和BL21/XylA-CcDPEase-Bs-L-RhI都能催化D-木糖生成D-核糖，其中BL21/XylA-CcDPEase-Bs-L-RhI的产量最高，催化50g/LD-Xylose产生1.522g/L的D-ribose。
具体实施方法
本发明提供了一种以D-木糖为底物的D-核糖全细胞合成方法，所述D-核糖合成方法通过构建重组大肠杆菌工程菌株可以直接将D-木糖转化为D-核糖。
下面结合实施例对本发明提供的利用D-木糖全细胞合成D-核糖的方法及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明的保护范围的限定。
具体实施方式
实施例1：D-木糖异构酶的筛选
将分别含有不同来源D-木糖异构酶/D-葡萄糖异构酶编码基因(XylA,SEQ ID NO:4)、(YIXI,SEQ ID NO:5)、(YIGPI,SEQ ID NO:6)、(GoXI_02,SEQ ID NO:7)、(GoGPI,SEQ IDNO:8)、(BsXI,SEQ ID NO:9)、(BsGPI,SEQ ID NO:10)、(PpXI_02,SEQ ID NO:11)、(BtDPEase,SEQ ID NO:16)的工程菌BL21/XylA、BL21/YIXI、BL21/YIGPI、BL21/GoXI_02、BL21/GoGPI、BL21/BsXI、BL21/BsGPI、BL21/PpXI、BL21/BtDPEase在LB培养基中37℃、200rpm条件下培养过夜，以2％(v/v)的接种量转接到装有25mL新鲜LB培养基的250mL三角瓶中，37℃、200rpm条件下培养至对数期。添加终浓度为500μM的IPTG，在25℃、200rpm条件下继续培养8h，使D-木糖合成D-木酮糖的途径基因表达。
使用蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)对其蛋白表达情况进行检验。蛋白凝胶电泳检验蛋白表达情况方法如下：蛋白凝胶电泳型号为赛默飞聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳仪，使用150V的电压，30min。蛋白凝胶电泳分析结果表明，D-木糖异构酶蛋白：XylA、YIXI、GoGPI、GoXI_02、PpXI、BsXI、BtDPEase、YIGPI、BsGPI对应的分子量大小分别为53.0kDa、48.1kDa、41.5kDa、30.6kDa、33.1kDa、53.7kDa、36.1kDa、65.3kDa、53.9kDa。
空白对照(大肠杆菌BL21/pET28a(PB)N)没有明显的蛋白条带；实验组(大肠杆菌BL21/XylA、BL21/GoGPI、BL21/PpXI、BL21/BsXI、BL21/BtDPEase、BL21/YGPI和BL21/BsGPI)有明显的蛋白条带(图4A)。表明上述七个基因已表达，BL21/YIXI、BL21/GoXI_02无明显的蛋白条带，表明上述两个基因没有表达。
将上述诱导后的体系在4℃、4000rpm条件下离心5min，收集菌体，使用灭菌的超纯水洗涤菌体去除培养基，然后使用20mM、pH为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬菌体，即得到静息细胞。使用带有空质粒pET28a(PB)N的大肠杆菌BL21/pET28a(PB)N作为空白对照，其他操作条件相同。
向上述反应体系中加入终浓度为50g/L的D-木糖，1mM的CoCl2，20mM的MgCl2，在60℃下反应2h。取反应上清液使用离子色谱进行检测。
离子色谱分析D-木糖和D-木酮糖的方法如下：离子色谱型号为赛默飞ICS-6000高压离子色谱仪，所用检测器为电化学检测器，色谱柱型号为PA-1，流动相A为超纯水，流动相B为200mMNaOH水溶液，洗脱液为A：(100％)，B：(25％)，时间20min，恒定流速1mL/min，进样量为25μL，柱温箱和检测器温度均为30℃。
离子色谱分析结果表明，D-木糖和D-木酮糖的出峰时间分别为4.434min和7.134min(如图4B所示)。
空白对照(大肠杆菌BL21/pET28a(PB)N)没有合成D-木酮糖；实验组上述8个工程菌只有BL21/XylA能将D-木糖合成D-木酮糖。
实施例2：D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的筛选
PCR扩增不同来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因(PaDPEase_01,SEQ IDNO:13)、(PpDPEase_01,SEQ ID NO:14)、(BsDPEase_01,SEQ ID NO:15)、(BtDPEase,SEQ IDNO:16)(GoDPEase,SEQ ID NO:17)、(DPEase,SEQ ID NO:18)、(CcDPEase,SEQ ID NO:19)，用NheI消化质粒pET28a(PB)-XylA，用DpnI消化上述不同来源D-PE基因，将上述消化后的不同来源D-PE基因使用一步克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)分别克隆到载体pET28a(PB)-XylA的NheI位点(所用引物见表1)，得到分别含有不同来源D-PE基因的8个重组质粒(重组质粒图如图2所示)。其中，所有途径基因的表达均由T7启动子和T7终止子控制。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，即得到8个重组大肠杆菌，将重组大肠杆菌在LB培养基中37℃、200rpm条件下培养过夜，以2％(v/v)的接种量转接到装有25mL新鲜LB培养基的250mL三角瓶中，37℃、200rpm条件下培养至对数期。添加终浓度为500μM的IPTG，在25℃、200rpm条件下继续培养8h，使D-木糖合成D-核酮糖的途径基因表达。
使用蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)对其蛋白表达情况进行检验。蛋白凝胶电泳检验蛋白表达情况方法如下：蛋白凝胶电泳型号为赛默飞聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳仪，使用150V的电压，30min。蛋白凝胶电泳分析结果表明，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶蛋白：CcDPEase、PpDPEase_01、GoDPEase、BtDPEase、BsDPEase_01、PaDPEase_01对应的分子量大小分别为36.3kDa、48.2kDa、34.8kDa、36.1kDa、38.0kDa、32.6kDa。空白对照(大肠杆菌BL21/pET28a(PB)N)没有明显的蛋白条带；实验组(大肠杆菌BL21/CcDPEase、BL21/GoDPEase、BL21/BtDPEase、BL21/BsDPEase_01和BL21/PaDPEase_01)有明显的蛋白条带(图5A)。表明上述五个基因已表达，BL21/PpDPEase_01无明显的蛋白条带，表明基因没有表达。
将上述诱导后的体系在4℃、4000rpm条件下离心5min，收集菌体，使用灭菌的超纯水洗涤菌体去除培养基，然后使用20mM、pH为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬菌体，即得到静息细胞。使用带有空质粒pET28a(PB)N的大肠杆菌BL21/pET28a(PB)N和BL21/XylA作为空白对照，其他操作条件相同。
向上述反应体系中加入终浓度为50g/L的D-木糖，1mM的C℃l2，20mM的MgCl2，在60℃下反应8h。取反应上清液使用离子色谱进行检测。
离子色谱分析D-木糖和D-木酮糖的方法同实施例1
离子色谱分析结果表明，D-木糖、D-木酮糖、D-核酮糖的出峰时间分别为:5.150min、5.867min、8.792min(如图5B所示)。
空白对照(大肠杆菌BL21/pET28a(PB)N和BL21/XylA)没有合成D-核酮糖；实验组只有重组大肠杆菌BL21/pET28a(PB)-XylA-CcDPEase能将D-木糖合成D-核酮糖。
实施例3：醛糖-酮糖异构酶的筛选。
PCR扩增不同来源的醛糖-酮糖异构酶编码基因：(Bs-L-RhI,SEQ ID NO:1)、(CdRPI*(R133D),SEQ ID NO:2)、(PfGPI*(T85Q),SEQ ID NO:3)、(YIXI,SEQ ID NO:5)、(YIGPI,SEQ ID NO:6)、(GoXI_02,SEQ ID NO:7)、(GoGPI,SEQ ID NO:8)、(BsXI,SEQ IDNO:9)、(BsGPI,SEQ ID NO:10)、(PpXI_02,SEQ ID NO:11)、(AgoG2GI,SEQ ID NO:12)、(BtDPEase,SEQ ID NO:16)，用NheI消化pET28a(PB)-XylA-CcDPEase，用DpnI消化上述异构酶基因，将上述消化后的不同来源的醛糖-酮糖异构酶基因分别使用一步克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)克隆到载体pET28a(PB)-XylA-CcDPEase的NheI位点(所用引物见表1)，得到12个含有上述不同来源异构酶的重组质粒(重组质粒图如图3所示)。其中，所有途径基因的表达均由T7启动子和T7终止子控制。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，即得到12个重组大肠杆菌。
表1本发明所用引物
将重组大肠杆菌在LB培养基中37℃、200rpm条件下培养过夜，以2％(v/v)的接种量转接到装有25mL新鲜LB培养基的250mL三角瓶中，37℃、200rpm条件下培养至对数期。添加终浓度为500μM的IPTG，在25℃、200rpm条件下继续培养8h，使D-木糖合成D-核糖的途径基因表达。
使用蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)对其蛋白表达情况进行检验。蛋白凝胶电泳检验蛋白表达情况方法如下：蛋白凝胶电泳型号为赛默飞聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳仪，使用150V的电压，30min。蛋白凝胶电泳分析结果表明，醛糖-酮糖异构酶蛋白：Bs-L-RhI、CdRPI*(R133D)、PfGPI*(T85Q)、AgoG2GI、PpX、BsXI、BsGPI、BtDPEase、YIXI、YIGPI、GoXI_02、GoGPI对应的分子量大小分别为52.1kDa、19.6kDa、24.9kDa、53.4kDa、33.1kDa、53.7kDa、53.9kDa、36.1kDa、48.1kDa、65.3kDa、30.6kDa、41.5kDa。空白对照(大肠杆菌BL21/pET28a(PB)N)没有明显的蛋白条带；实验组(大肠杆菌BL21/Bs-L-RhI、BL21/CdRPI*(R133D)、BL21/PfGPI*(T85Q)、BL21/AgoG2GI、BL21/PpXI、BL21/BsXI、BL21/BsGPI、BL21/BtDPEase、BL21/YGPI、BL21/GoGPI)有明显的蛋白条带(图6A)。上述五个基因已表达，BL21/YIXI、BL21/GoXI_02无明显的蛋白条带，表明基因没有表达。
在4℃、4000rpm条件下离心5min，收集菌体，使用灭菌的超纯水洗涤菌体去除培养基，然后使用50mM、pH为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬菌体，即得到静息细胞。使用BL21/XylA-CcDPEase作为空白对照，其他操作条件相同。
向上述反应体系中加入终浓度为50g/L的D-木糖，1mM的CoCl2，20mM的MgCl2，在65℃下反应10h。取反应上清液使用离子色谱进行检测。
离子色谱分析D-木糖和D-木酮糖的方法如下：离子色谱型号为赛默飞ICS-6000高压离子色谱仪，所用检测器为电化学检测器，色谱柱型号为PA-20，流动相A为超纯水，流动相B为200mMNaOH水溶液，梯度洗脱为(B％)：0min10％，15min10％，15.1min100％，25min100％，25.1min10％，35min10％，恒定流速0.5mL/min，进样量为25μL，柱温箱和检测器温度均为30℃。
离子色谱分析结果表明，D-木糖和D-核糖的出峰时间分别为:7.859min和9.642min(如图6B所示)。
对照(大肠杆菌BL21/XylA-CcDPEase)检测出少部分D-核糖，分析原因细胞本身会产生少量核糖，和对照组相比，实验组能将D-木糖合成为D-核糖的菌株为BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPE-Bs-L-RhI、BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-CdRPI*(R133D)、BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-PfGPI*(T85Q)，其中BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPE-Bs-L-RhI利用D-木糖全细胞合成D-核糖的产量不低于1.522g/L(如图7所示)。该结果表明，本发明所构建的D-木糖全细胞合成D-核糖方法，具有较大的应用潜力。
以上所述仅是本发明的可选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种利用D-木糖为底物生物合成D-核糖的方法。其特征在于，以木糖为底物，以大肠杆菌为底盘细胞，通过筛选不同来源的D-木糖/D-葡萄糖异构酶(D-XI/GI,EC 5.3.1.5)、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-PE,EC 5.1.3.30)、醛糖-酮糖异构酶(EC 5.3.1.-)，将D-木糖直接转化为D-核糖(反应过程如图1所示)。
2.根据权利要求1所述醛糖-酮糖异构酶(EC 5.3.1.-)具体包括:(1)不同来源的D-木糖异构酶又称D-葡萄糖异构酶(D-XI/GI,EC 5.3.1.5)；(2)来源于Bacillus subtilis 168的L-鼠李糖异构酶编码基因(Bs-L-RhI,SEQ ID NO:1)；(3)来源于Clostridium difficile关键位点突变后的D-核糖-5-磷酸酶异构酶编码基因(CdRPI*(R133D)，SEQ ID NO:2)；(4)来源于Pyrococcusfuriosus关键位点突变后的D-葡萄糖-6-磷酸异构酶编码基因(PfGPI*(T85Q),SEQ ID NO:3)。
3.根据权利要求1、权利要求2所述D-木糖/D-葡萄糖异构酶(D-XI/GI,EC 5.3.1.5)。主要包括：(1)来源于Escherichia coli MG1655的D-XI编码基因(XylA,SEQ ID NO:4)；(2)来源于Yarrowia lipolytica Po1f的D-XI和D-GI分别编码基因(YIXI,SEQ ID NO:5)和(YIGPI,SEQ ID NO:6)；(3)来源于Gluconobacter oXydans 621H的D-XI和D-GI分别编码基因(GoXI_02,SEQ ID NO:7)和(GoGPI,SEQ ID NO:8)；(4)来源于Bacillus subtilissubsp.subtilis str.168的D-XI和D-GI分别编码基因(BsXI,SEQ ID NO:9)和(BsGPI,SEQID NO:10)；(5)来源于Pseudomonasputida KT2440的D-XI编码基因(PpXI,SEQ ID NO:11)；(6)来源于Bacillus thuringiensis ATCC 10792的D-PE又称(D-XI)编码基因(BtDPEase,SEQ ID NO:16)；(7)来源于AnoXybacillus gonensis G2T的D-GI编码基因(AgoG2GI,SEQID NO:12)。
4.根据权利要求1所述不同来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-PE,EC 5.1.3.30)具体包括：(1)来源于pseudomonas aeruginosa PA01的D-PE编码基因(PaDPEase_01,SEQ IDNO:13)；(2)来源于pseudomonas putida KT2440的D-PE编码基因(PpDPEase_01,SEQ IDNO:14)；(3)来源于Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168的D-PE编码基因(BsDPEase_01,SEQ ID NO:15)；(4)来源于Bacillus thuringiensis ATCC 10792的D-PE编码基因(BtDPEase,SEQ ID NO:16)；(5)来源于Gluconobacter oXydans 621H的D-PE编码基因(GoDPEase,SEQ ID NO:17)；(6)来源于Agrobacterium tumefaciens NclM:2942D-PE编码基因(DPEase,SEQ ID NO:18)；(7)来源于Clostridium cellulolyticum H10的D-PE编码基因(CcDPEase,SEQ ID NO:19)。
5.根据权利要求1所述的D-核糖合成方法，其特征在于，以质粒pET28a(PB)N(序列如SEQ ID NO:20)为上述转化途径的表达载体，构建出含有所有途径基因的重组质粒。
6.根据权利要求1、权利要求5，以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到含有所有途径基因的工程菌株。
7.根据权利要求1所述的D-核糖全细胞合成方法和权利要求6所述的重组工程菌株，其特征在于，所使用的转化条件如下：(1)在LB培养基中，培养大肠杆菌重组工程菌至OD600＝0.6-0.8，添加终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在25℃，200rpm条件下诱导基因表达8h；(2)在4℃，4000rpm条件下离心收集菌体，使用灭菌的超纯水洗涤菌体去除培养基，然后使用20mM、pH为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬菌体，即得到静息细胞；(3)添加终浓度为50g/L的D-木糖作为底物，添加终浓度为1mM CoCl2和20mM MgCl2作为催化离子，65℃反应2-10h；(4)使用离子色谱仪分别分析D-木酮糖、D-核酮糖、D-核糖的产量。
8.根据权利要求1、权利要求7所述的D-核糖合成方法，其特征在于，筛选过程如下:(1)筛选含有不同来源的D-木糖/D-葡萄糖异构酶基因的工程菌，结果能催化D-木糖合成D-木酮糖的为BL21/XylA；(2)筛选含有D-木糖异构酶(XylA,SEQ ID NO:21)串联不同来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的工程菌；能催化D-木糖合成D-核酮糖的为BL21/XylA-CcDPEase，(3)筛选含有D-木糖异构酶(XylA,SEQ ID NO:21)和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(CcDPEase,SEQ ID NO:22)串联不同来源醛糖-酮糖异构酶的菌株，能催化D-木糖合成D-核糖的菌株为BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPE-Bs-L-RhI、BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPE-CdRPI*(R133D)、BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPEase-PfGPI*(T85Q)，表明L-鼠李糖异构酶(Bs-L-RhI,SEQ ID NO:23)、D-核糖-5-磷酸酶异构酶(CdRPI*(R133D),SEQ ID NO:24)和(D-葡萄糖-6-磷酸异构酶PfGPI*(T85Q),SEQ ID NO:25)能催化D-核酮糖合成D-核糖。其中BL21/pET28a(PB)N-XylA-CcDPE-Bs-L-RhI利用D-木糖全细胞催化合成D-核糖的产量不低于1.522g/L。
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