CN117385038A - 肺癌诊断相关标志物、检测试剂及肺癌诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了肺癌诊断相关标志物、检测试剂及肺癌诊断方法，肺癌诊断相关标志物由六个血清miRNA标志物hsa‑miR‑122、hsa‑miR‑199a、hsa‑miR‑221、hsa‑miR‑27b、hsa‑miR‑4704和hsa‑miR‑6841构成；检测试剂中含有针对肺癌诊断相关标志物设计的引物，用Real‑time PCR方法检测与肺癌相关的六个血清miRNA标志物在血清中的相对表达量并据此对是否肺癌做出诊断。本发明肺癌诊断相关标志物在肺癌早期、中期、中晚期和晚期（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期）都具有较高的诊断准确度，用于肺癌检测，可对是否患有肺癌做出准确判断，对临床医生早期诊断肺癌具有积极作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术和分子生物学领域，涉及用于人类肺癌诊断的肺癌诊断相关标志物及针对肺癌诊断相关标志物设计的检测试剂以及肺癌诊断方法。
背景技术
肺癌或称为原发性支气管癌或原发性支气管肺癌，世界卫生组织（WHO）定义为起源于呼吸上皮细胞（支气管、细支气管和肺泡）的恶性肿瘤，根据组织病变，肺癌可分为小细胞癌和非小细胞癌。肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为我国恶性肿瘤死亡原因的第一位，2022年国家癌症中心数据显示，每年肺癌新发约82.81万例，死亡约65.70万例，新发及死亡人数均居我国恶性肿瘤之首。
微小核糖核酸（microRNA ，miRNA）是一类长度约为19~23nt的非编码单链小分子，在细胞内参与转录后基因表达调控。虽然目前肺癌的发病机制尚未完全明确，但近年来已有多项研究发现miRNA在肺癌中异常表达，并参与肺癌的生物调控，发挥致癌或抑癌基因的作用，有望成为新的生物标志物。
发明内容
为了提高人类肺癌诊断性能，本发明提供了用于人类肺癌各分期诊断的肺癌诊断相关标志物及针对肺癌诊断相关标志物设计的PCR检测试剂以及肺癌诊断方法。本发明提供的肺癌诊断相关标志物在肺癌早期、中期、中晚期和晚期（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期）都具有较高的诊断准确度，针对本发明提供的肺癌诊断相关标志物对受测者进行检测，可对是否患有肺癌做出准确判断，进一步提高肺癌诊断效果，提升诊断价值。
为实现发明目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一组肺癌诊断相关标志物，所述的肺癌诊断相关标志物由六个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841构成；所述hsa-miR-122的序列为tggagtgtgacaatggtgtttg，所述hsa-miR-199a的序列为cccagtgttcagactacctgttc，所述hsa-miR-221的序列为agctacattgtctgctgggtttc，所述hsa-miR-27b的序列为ttcacagtggctaagttctgc，所述hsa-miR-4704的序列为gacactaggcatgtgagtgatt，所述hsa-miR-6841的序列为tggatgtggaaggagttatct。
本发明提供了一种肺癌诊断相关标志物PCR检测试剂，所述的PCR检测试剂中含有肺癌诊断相关标志物的引物，具体含有六个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841的上、下游引物，所述hsa-miR-122的上游引物hsa-miR-122-F的序列为tggagtgtgacaatggtg；所述hsa-miR-199a的上游引物hsa-miR-199a-F的序列为cccagtgttcagactacc；所述hsa-miR-221的上游引物hsa-miR-221-F的序列为agctacattgtctgctgg；所述hsa-miR-27b的上游引物hsa-miR-27b-F的序列为ttcacagtggctaagtt；所述hsa-miR-4704的上游引物hsa-miR-4704-F的序列为gacactaggcatgtgagtt；所述hsa-miR-6841的上游引物hsa-miR-6841-F的序列为tggatgtggaaggagtt；六个血清miRNA标志物的通用下游引物Universal Rp的序列为cagtgcagggtccgaggt。
本发明还提供了一种肺癌诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 抽取被检测人员的外周血放入分离胶采血管中，经离心处理后得到外周血血清，经过抽提纯化后，得到含有总RNA的待测血清样本；
S2. 制备cDNA样本：取含有总RNA的待测血清样本，加入加尾和逆转录反应体系，反应体系中的加尾试剂对小RNA进行加尾，反应体系中的逆转录试剂对加尾后的小RNA进行逆转录，得到cDNA样本；
S3. 以cDNA样本为模板，加入PCR检测试剂，用Real-time PCR方法检测出cDNA样本中六个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841在血清中的相对表达量即ΔCt值；所述的PCR检测试剂含有针对肺癌诊断相关标志物设计的引物，具体含有六个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841的上、下游引物；
S4. 将步骤S3测出的ΔCt值输入如下判别公式：
综合判断值=-7.820+1.027*ΔCt hsa-miR-122 +1.101*ΔCt hsa-miR-199a -1.431*ΔCt hsa-miR-221 +0.070*ΔCt hsa-miR-27b +2.769*ΔCt hsa-miR-4704 +2.193*ΔCt hsa-miR-6841；综合判断值≥0时，为阳性，患肺癌的风险较高；综合判断值＜0时，为阴性，患肺癌的风险较低。
为了方便临床检测使用，可以将本发明涉及的PCR检测试剂及检测过程使用的工具制备成试剂盒，本发明PCR检测试剂由含有针对肺癌诊断相关标志物（hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841）设计的引物试剂，以及阳性质控品、阴性质控品、Taq酶、dNTPs、PCR缓冲液、MgCl、TagMan探针、荧光定量PCR参比染料等试剂构成，其中，含有引物的试剂是针对本发明肺癌标志物而特别设计的，其他试剂均可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。
为了评估本发明肺癌诊断相关标志物（即hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841六个血清miRNA标志物组合）诊断肺癌的效果，本发明人以标准操作程序（SOP）采集符合标准的血液样本，建立完整的人群基础信息和临床资料，并采用了RT-PCR方法、TaqMan miRNA Array、Real-time PCR（TaqMan探针）方法的多种进行实验验证。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明提供的肺癌诊断相关标志物由六个血清miRNA标志物构成，应用针对六个血清miRNA标志物设计的PCR检测试剂，用RT-qPCR方法对大量肺癌和健康人群的外周血经处理后的待测血清样本进行检测，证实了六个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841在肺癌早期、中期、中晚期和晚期（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期）和健康人群的外周血中均具有显著差异，本发明肺癌诊断相关标志物在肺癌各期都具有较高的诊断性能，是理想可靠性的肺癌诊断相关标志物。
（2）本发明一种肺癌诊断方法提供的外周血miRNA肿瘤标志物检测属于液体活检范畴，与临床上常规的血液肿瘤标志物相比，具有特异性高、更早期发现、灵敏性高和微创的特点，是包括肿瘤在内的多种疾病诊断的新型标志物。
（3）本发明自主设计的肺癌诊断相关标志物PCR检测试剂，含有针对肺癌诊断相关标志物设计的上、下游引物，应用于本发明肺癌诊断方法，能对六个血清miRNA标志物进行半定量分析，与茎环法相比，加尾法反转录的优势是仅需通过一管反转录体系可以完成多种miRNA的反转录，具有通量高、所需血液样本量少，操作简单和成本低等多种优势。本发明自主设计的引物，在实际应用中已经证实，具有较高特异性、灵敏度和重复性，充分弥补了加尾法反转录通常引物特异性较差的缺点，在实际应用中具有很大优势。
附图说明
图1 为本发明肺癌诊断相关标志物的筛选、训练、验证阶段的实验设计流程图；
图2 为本发明肺癌诊断方法操作流程示意图；
图3 为用miRNA芯片分析六个血清miRNA标志物在肺癌患者组和健康对照组的表达量差异对比图；
图4 为训练集（n＝60）中肺癌组与对照组比较时本发明肺癌诊断相关标志物（六个血清miRNA标志物组合）的诊断价值的ROC曲线图；
图5 为本发明肺癌诊断相关标志物（六个血清miRNA标志物组合）在不同肺癌分期的诊断表现，及区分肺癌患者和非肺肿瘤患者的诊断表现；
图5中A为早期肺癌（Ⅰ期）与对照组比较时本发明肺癌诊断相关标志物的诊断价值的ROC曲线图；
图5中B为中期肺癌（Ⅱ期）与对照组比较时本发明肺癌诊断相关标志物的诊断价值的ROC曲线图；
图5中C为中晚期肺癌（Ⅲ期）与对照组比较时本发明肺癌诊断相关标志物的诊断价值的ROC曲线图；
图5中D为晚期肺癌（Ⅳ期）与对照组比较时本发明肺癌诊断相关标志物的诊断价值的ROC曲线图；
图6为本发明miRNA标志物序列及公共数据库信息列表（表1）；
图7为本发明用miRNA芯片分析对比肺癌组和健康对照组的miRNA差异表达结果（表3）；
图8为本发明训练集中六个血清miRNA标志物表达情况及诊断效能列表（表5）；
图9为本发明验证集的检测结果（表6）；
图10为本发明验证集中区分肺癌患者和非肺肿瘤患者的检测结果（表7）。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的阐明。
本发明提供了一组肺癌诊断相关标志物，所述的肺癌诊断相关标志物由六个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841构成；所述hsa-miR-122的序列为tggagtgtgacaatggtgtttg，所述hsa-miR-199a的序列为cccagtgttcagactacctgttc，所述hsa-miR-221的序列为agctacattgtctgctgggtttc，所述hsa-miR-27b的序列为ttcacagtggctaagttctgc，所述hsa-miR-4704的序列为gacactaggcatgtgagtgatt，所述hsa-miR-6841的序列为tggatgtggaaggagttatct。六个血清miRNA标志物具体如图6所示。图6为本发明miRNA标志物序列及公共数据库信息列表（表1）。
本发明提供了一种肺癌诊断相关标志物PCR检测试剂，所述的PCR检测试剂含有针对肺癌诊断相关标志物设计的引物，具体含有六个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841的上、下游引物，所述hsa-miR-122（SEQ ID No.1）的上游引物hsa-miR-122-F的序列为tggagtgtgacaatggtg（SEQID No.7）；所述hsa-miR-199a（SEQ ID No.2）的上游引物hsa-miR-199a-F的序列为cccagtgttcagactacc（SEQ ID No.8）；所述hsa-miR-221（SEQ ID No.3）的上游引物hsa-miR-221-F的序列为agctacattgtctgctgg（SEQ ID No.9）；所述hsa-miR-27b（SEQ ID No.4）的上游引物hsa-miR-27b-F的序列为ttcacagtggctaagtt（SEQ ID No.10）；所述hsa-miR-4704（SEQ ID No.5）的上游引物hsa-miR-4704-F的序列为gacactaggcatgtgagtt（SEQ IDNo.11）；所述hsa-miR-6841（SEQ ID No.6）的上游引物hsa-miR-6841-F的序列为tggatgtggaaggagtt（SEQ ID No.12）；六个血清miRNA标志物的通用下游引物Universal Rp的序列为cagtgcagggtccgaggt（SEQ ID No.13）。
本发明提供的PCR检测试剂包含6个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841的上游引物及6个血清miRNA标志物的通用下游引物Universal Rp，还包含内参基因RNU6-1反向引物、通用RT引物、探针，涉及的引物、探针序列如表2所示。
表2.引物、探针序列
| 引物名称 | 对应miRNA引物序列（5′→ 3′ ） |
| hsa-miR-122-F | tggagtgtgacaatggtg（SEQ ID No.7） |
| hsa-miR-199a-F | cccagtgttcagactacc（SEQ ID No.8） |
| hsa-miR-221-F | agctacattgtctgctgg（SEQ ID No.9） |
| hsa-miR-27b-F | ttcacagtggctaagtt（SEQ ID No.10） |
| hsa-miR-4704-F | gacactaggcatgtgagt（SEQ ID No.11） |
| hsa-miR-6841-F | tggatgtggaaggagtt（SEQ ID No.12） |
| RNU6-1-F | aacaagcgcaaggatgacacg |
| Universal Rp | cagtgcagggtccgaggt（SEQ ID No.13） |
| Universal RT primer | cagtgcagggtccgaggtcagagccacctgggcaattttttttttttvn |
| Universal Taqman Probe | FAM-tgcccaggtggct-MGBNFQ |
如图2所示，本发明还提供了一种肺癌诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 抽取被检测人员的外周血放入分离胶采血管中，经离心处理后得到外周血血清，经过抽提纯化后，得到含有总RNA的待测血清样本；
用miRNeasy血清/血浆升级版试剂盒（miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit），按照厂家（Qiagen）提供的使用说明来抽提总RNA，用Qubit 4.0荧光定量仪来定量检测其浓度，制备成含有总RNA的待测血清样本。
S2. 制备cDNA样本：取含有总RNA的待测血清样本，加入加尾和逆转录反应体系，反应体系中的加尾试剂对小RNA进行加尾，反应体系中的逆转录试剂对加尾后的小RNA进行逆转录，得到cDNA样本；
S3. 以cDNA样本为模板，加入PCR检测试剂，用Real-time PCR方法检测cDNA样本中六个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841在血清中的相对表达量，相对表达量用ΔCt值表示；所述的PCR检测试剂含有针对肺癌诊断相关标志物设计的引物，具体含有六个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841的上、下游引物；
S4. 将步骤S3测出的ΔCt值输入如下判别公式：
综合判断值=-7.820+1.027*ΔCt hsa-miR-122 +1.101*ΔCt hsa-miR-199a -1.431*ΔCt hsa-miR-221 +0.070*ΔCt hsa-miR-27b +2.769*ΔCt hsa-miR-4704 +2.193*ΔCt hsa-miR-6841；综合判断值≥0时，为阳性，患肺癌的风险较高；综合判断值＜0时，为阴性，患肺癌的风险较低。
为了方便临床检测使用，可以将本发明涉及的PCR检测试剂及检测过程使用的工具制备成试剂盒，本发明PCR检测试剂由含有针对肺癌诊断相关标志物（hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841的组合）设计的引物试剂，以及阳性质控品、阴性质控品、Taq酶、dNTPs、PCR缓冲液、MgCl、TagMan探针、荧光定量PCR参比染料等试剂构成，其中，含有引物的试剂是针对本发明肺癌标志物而特别设计的，其他试剂均可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。
实施例1
图1为本发明肺癌诊断相关标志物的筛选、训练、验证阶段的实验设计流程图。如图1所示流程进行实验，具体操作如下：
（一）研究对象选择和分组依据
在2020年6月到2022年6月间，230个满足合格标准的血液样本被预先从山东大学齐鲁医院和山东省立医院采集。这些样本从75个健康捐献者、125个肺癌患者和30个非肺肿瘤患者获得。所选择的肺癌患者血清样本均为首诊，无手术以及用药史，且住院后经病理确认为肺癌的病人；所选择的非肺肿瘤患者血清样本无手术以及用药史，且经病理确认为胃癌、肝癌、食管癌、胰腺癌或结直肠癌等；健康人群为体检中心体检合格的健康人群。这些样本被按照时间先后顺序划归为3个阶段：图1所示的筛选、训练、验证阶段。
（二）制备待测血清样本
抽取外周血（2ml）放入分离胶采血管中，轻轻地180°上下颠倒混匀，持续5-6次，12小时内，将促凝采血管在3,000×g条件下离心10分钟。然后，随后得到待测外周血血清，在-80℃储存。
用miRNeasy血清/血浆升级版试剂盒（miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit），按照厂家（Qiagen）提供的使用说明来抽提总RNA，用Qubit 4.0荧光定量仪来定量检测其浓度，制备成含有总RNA的待测血清样本。
（三）在筛选阶段用 miRNA芯片分析miRNAs表达差异
用miRNA芯片分析对比肺癌组和健康对照组的miRNA表达量的差异。筛选出存在差异表达的肺癌患者、健康对照者的血清miRNAs包括hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841。其中hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b在肺癌患者血清中的拷贝数显著高于对照组；而hsa-miR-4704、hsa-miR-6841在肺癌患者血清中的拷贝数显著低于对照组，具体的用miRNA芯片分析对比肺癌组和健康对照组的miRNA差异表达结果参见图7，图7为本发明用miRNA芯片分析对比肺癌组和健康对照组的miRNA差异表达结果（表3）。
（四）在60个样本的训练集中对miRNA芯片筛选出的六个miRNA进行验证
分别对30例健康对照者、30例肺癌患者的血清进行六个miRNA的定量Real-timePCR检测。
（1）制备cDNA样品：（a）取已制备好的含有总RNA的待测血清样本，加入加尾和反转录体系；（b）使用加尾试剂对小RNA进行加尾（E.coli Poly(A) Polymerase，Vazyme），（c）使用逆转录试剂对加尾后的小RNA进行逆转录（HiScript® II Reverse Transcriptase，Vazyme），得到cDNA。加尾和反转录体系见表4。
表4.加尾和反转录体系
| 成分 | 体积（μL） |
| 10×Poly（A）Polymerase Buffer | 2 |
| E.coli Poly（A）Polymerase（5U/μL） | 0.5 |
| ATP（10mM） | 1 |
| dNTP Mix（10μM） | 1 |
| HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase（200U/μL） | 1 |
| RNase inhibitor（40μM） | 1 |
| RT primer universal（5μM） | 1 |
| RNA | 10 |
| RNase-free ddH2O | 2.5 |
| 合计 | 20 |
（2）Real-time PCR检测：使用探针法实时荧光定量PCR（Taq Pro U MultipleProbe qPCR MIX，Vazyme）检测并比较健康对照组和肺癌患者血清样本中miRNA表达量的变化，各组样本血清miRNA表达水平是以RNU6-1为内参检测得到。
使用Kruskal-Wallis检验对肺癌组和健康对照组进行比较，使用Mann-Whitney未配对检验对肺癌组和健康对照组进行比较。使用逐步逻辑回归模型基于训练集选择miRNA肺癌诊断相关标志物，使用肺癌的预测概率作为替代标志物来建立受试者工作特征（ROC）曲线，使用ROC曲线下面积（AUC）作为评价肺癌miRNA标志物组合的诊断效能，使用MedCalc（19.8）软件进行ROC和回归分析。从结果分析得到，hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841这6个miRNA在健康对照者和肺癌患者间有显著差异，具体如图3所示。
6个miRNA标志物在训练集中的表达谱和诊断效能如图8所示，图8为训练集中六个血清miRNA标志物表达情况及诊断效能列表（表5）；注：在图8（表5）中，6miRNA组合* AUC=0.968（96.67%，90.32%）
*Logit（p＝HCC）=-7.820+1.027*ΔCt hsa-miR-122 +1.101*ΔCt hsa-miR-199a-1.431*ΔCt hsa-miR-221 +0.070*ΔCt hsa-miR-27b +2.769*ΔCt hsa-miR-4704 +2.193*ΔCt hsa-miR-6841。
图4 为训练集（n＝60）中肺癌组与对照组比较时本发明肺癌诊断相关标志物（六个血清miRNA标志物组合）的诊断价值的ROC曲线图；如图4所示，六个肺癌miRNA标志物组合的AUC为0.968，[CI]0.887~0.996，Spensitivity=96.67%，specificity=90.32%。
（五）在110个样本的验证集中验证上述六个血清miRNA标志物组合肺癌诊断性能。
从训练集中估计的参数被用于独立的验证集（30例健康者血清，80例肺癌患者血清）上预测被诊断患有肺癌的概率，同样地，采用定量PCR检测方法来进行实验，验证集的检测结果如图9（表6）所示，使用本发明所述的肺癌miRNA标志物组合，对肺癌的敏感性（真阳性率）为92.50%，即漏诊率为7.5%；特异性（真阴性率）为96.7%，即误诊率为3.3%；验证集全部110例样本总正确率为93.6%。
（六）测试本发明肺癌诊断相关标志物在不同肺癌分期的诊断表现
本发明肺癌诊断相关标志物（六个血清miRNA标志物组合）在不同肺癌分期的诊断表现被进一步评价。在诊断早期、中期、中晚期和晚期肺癌（Ⅰ期20例、Ⅱ期20例、Ⅲ期20例和Ⅳ期20例）方面，本发明肺癌诊断相关标志物（六个血清miRNA标志物组合）都具有较高的诊断准确度，如图5所示：Ⅰ期AUC=0.977，[CI]0.888~0.999；Ⅱ期，AUC=0.950，[CI]0.848~0.992；Ⅲ期，AUC=0.958，[CI]0.860~0.995；Ⅳ期，AUC=0.960，[CI]0.863~0.995。
图5中，5A为早期肺癌（Ⅰ期）与对照组比较时肺癌诊断相关标志物（六个血清miRNA标志物组合）的诊断价值的ROC曲线图；5B为中期肺癌（Ⅱ期）与对照组比较时肺癌诊断相关标志物（六个血清miRNA标志物组合）的诊断价值的ROC曲线图；5C为中晚期肺癌（Ⅲ期）与对照组比较时肺癌诊断相关标志物（六个血清miRNA标志物组合）的诊断价值的ROC曲线图；5D为晚期肺癌（Ⅳ期）与对照组比较时肺癌诊断相关标志物（六个血清miRNA标志物组合）的诊断价值的ROC曲线图。
（七） 测试本发明肺癌miRNA标志物组合区分肺癌患者和非肺肿瘤患者的诊断表现
从训练集中估计的参数被用于评估区分肺癌患者和非肺肿瘤患者的概率。同样地，采用PCR检测方法来进行实验。检测结果如图10（表7）所示，使用本发明所述的肺癌miRNA标志物组合，对肺癌的敏感性（真阳性率）为92.5%，即漏诊率为7.5%；特异性（真阴性率）为90.0%，即误诊率为10.0%；验证集全部110例样本总正确率为91.18%。证明肺癌miRNA标志物组合可以有效的鉴别肺癌患者和非肺肿瘤患者。
所获得的结果证实肺癌miRNA标志物组合在肺癌患者血清中的特异性表达。因此，这里规定的miRNA集可作为独特的miRNA生物标志物，通过肺癌血清miRNA表达谱分析，不仅可以诊断肺癌的发生（尤其是早期肺癌），也可区别肺癌和非肺肿瘤。
综上所述，本发明肺癌诊断相关标志物在肺癌早期、中期、中晚期和晚期（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期）都具有较高的诊断准确度，应用本发明检测试剂，使用Real-time PCR方法检测与肺癌相关的六个血清miRNA标志物在血清中的相对表达量，并据此对否患有肺癌做出准确判断，可以进一步提高肺癌诊断效果，提升诊断价值，对临床医生早期诊断肺癌具有积极作用。
Claims (3)
1.一组肺癌诊断相关标志物，其特征在于，所述的肺癌诊断相关标志物由六个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841构成；所述hsa-miR-122的序列为tggagtgtgacaatggtgtttg，所述hsa-miR-199a的序列为cccagtgttcagactacctgttc，所述hsa-miR-221的序列为agctacattgtctgctgggtttc，所述hsa-miR-27b的序列为ttcacagtggctaagttctgc，所述hsa-miR-4704的序列为gacactaggcatgtgagtgatt，所述hsa-miR-6841的序列为tggatgtggaaggagttatct。
2. 一种肺癌诊断相关标志物PCR检测试剂，其特征在于，所述的PCR检测试剂中含有针对肺癌诊断相关标志物设计的引物，具体含有六个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841的上、下游引物，所述hsa-miR-122的上游引物hsa-miR-122-F的序列为tggagtgtgacaatggtg；所述hsa-miR-199a的上游引物hsa-miR-199a-F的序列为cccagtgttcagactacc；所述hsa-miR-221的上游引物hsa-miR-221-F的序列为agctacattgtctgctgg；所述hsa-miR-27b的上游引物hsa-miR-27b-F的序列为ttcacagtggctaagtt；所述hsa-miR-4704的上游引物hsa-miR-4704-F的序列为gacactaggcatgtgagtt；所述hsa-miR-6841的上游引物hsa-miR-6841-F的序列为tggatgtggaaggagtt；六个血清miRNA标志物的通用下游引物Universal Rp的序列为cagtgcagggtccgaggt。
3.一种肺癌诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 抽取被检测人员的外周血放入分离胶采血管中，经离心处理后得到外周血血清，经过抽提纯化后，得到含有总RNA的待测血清样本；
S2. 制备cDNA样本：取含有总RNA的待测血清样本，加入加尾和逆转录反应体系，反应体系中的加尾试剂对小RNA进行加尾，反应体系中的逆转录试剂对加尾后的小RNA进行逆转录，得到cDNA样本；
S3. 以cDNA样本为模板，加入PCR检测试剂，用Real-time PCR方法检测出cDNA样本中六个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841在血清中的相对表达量即ΔCt值；所述的PCR检测试剂含有针对肺癌诊断相关标志物设计的引物，具体含有六个血清miRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-199a、hsa-miR-221、hsa-miR-27b、hsa-miR-4704和hsa-miR-6841的上、下游引物；
S4. 将步骤S3测出的ΔCt值输入如下判别公式：
综合判断值=-7.820+1.027*ΔCt hsa-miR-122 +1.101*ΔCt hsa-miR-199a -1.431*ΔCt hsa-miR-221 +0.070*ΔCt hsa-miR-27b +2.769*ΔCt hsa-miR-4704 +2.193*ΔCthsa-miR-6841；综合判断值≥0时，为阳性，患肺癌的风险较高；综合判断值＜0时，为阴性，患肺癌的风险较低。
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