CN115125302A - miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用 - Google Patents

miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域,具体涉及mi RNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明首次发现了对激素受体阳性乳腺癌化疗耐药具有较高诊断价值的生物标记物hsa‑mi R‑3646、hsa‑mi R‑4741、hsa‑mi R‑937‑5p、hsa‑mi R‑6730‑3p、hsa‑mi R‑6831‑5p、hsa‑mi R‑8485;通过血清mi RNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用,早期发现乳腺癌患者是否对传统化疗方案耐药,及时更换治疗策略,为临床医生快速并准确掌握患者病情,为提高个体化精准治疗奠定基础,并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

Description

miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的 应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,具体而言,涉及miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用。
背景技术
乳腺癌(BC)是全球女性最常见的死亡原因之一,是发生于乳腺上皮或导管上皮的恶性肿瘤。且乳腺癌是一种晚期多药耐药(MDR)乳腺癌,前三至五年内复发率高,总生存率(OS)短。乳腺癌耐药是乳腺癌治疗失败的重要因素,有效预测乳腺癌耐药,准确更换治疗方案对乳腺癌治疗至关重要。
但由于肿瘤的高度异质性,乳腺癌特异性诊断或化疗标志物缺乏明确的临床决定因素。先前的证据表明,miRNAs通过靶向mRNAs促进肿瘤生长、迁移、侵袭和血管生成以及细胞存活和免疫逃避。miRNAs有可能成为各种疾病(包括癌症)的生物标志物,但截至目前,针对不同耐药性的乳腺癌进行区别性诊断,尤其是能够较为准确地区分乳腺癌类型,仍然没有较好的实用方法,因此,亟待提供相应的解决方案。
发明内容
本发明的目的是提供miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用,其能够至少部分地克服了现有技术中的不足。
根据本发明的一个方面,提供一种miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用,所述miRNA选自hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p和hsa-miR-8485中的至少两种,所述hsa-miR-3646、所述hsa-miR-4741、所述hsa-miR-937-5p、所述hsa-miR-6730-3p、所述hsa-miR-6831-5p和所述hsa-miR-8485的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
通过检测hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485的表达水平,可以对待检测人群所患乳腺癌进行较为准确的分型
优选地,所述的诊断试剂或试剂盒为所述诊断试剂为血清学诊断试剂,所述试剂盒为血清学诊断试剂盒。
采用这样的试剂盒,通过检测hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485的表达水平,可以对待检测人群所患乳腺癌进行较为准确的分型
优选地,所述诊断试剂或所述试剂盒用于检测生物样品中所述hsa-miR-3646、所述hsa-miR-4741、所述hsa-miR-937-5p、所述hsa-miR-6730-3p、所述hsa-miR-6831-5p和所述hsa-miR-8485中至少两种的miRNA的表达量。
这样可以提高乳腺癌耐药性分型评估的精确度。
优选地,所述的生物样品为血清。
这样可以便于取得样品,并且样品中生物标记的浓度较高。
优选地,所述诊断试剂或所述试剂盒还包括:对所述hsa-miR-3646、所述hsa-miR-4741、所述hsa-miR-937-5p、所述hsa-miR-6730-3p、所述hsa-miR-6831-5p和所述hsa-miR-84859中的至少两种的PCR引物和至少两种具有检测特异性的探针和/或基因芯片。
这样可以便于进行乳腺癌耐药性评估。
优选地,所述的对hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485具有检测特异性的PCR引物的核苷酸序列分别如SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示。
这样的引物可以加快耐药性评估过程。
优选地,所述诊断试剂或试剂盒为采用荧光定量PCR方法检测miRNA表达量的试剂或试剂盒。
采用荧光定量PCR方法检测结果更容易观察。
优选地,基于hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485各自的表达量,获得所述乳腺癌耐药性。
这样可以提高乳腺癌耐药性分型评估的精确度。
优选地,所述乳腺癌耐药性等于0.252×hsa-miR-364的表达量-0.314×hsa-miR-4741的表达量+0.348×hsa-miR-937-5p的表达量+0.182×hsa-miR-6730-3p的表达量-0.143×hsa-miR-6831-5p的表达量-0.126×hsa-miR-8485的表达量。
这样可以提高乳腺癌耐药性分型评估的精确度。
优选地,根据所述乳腺癌耐药性判断所述样品所属的乳腺癌的类型。
这样可以提高乳腺癌耐药性分型评估的精确度。
本发明首次发现了对激素受体阳性乳腺癌耐药具有较高诊断价值的生物标记物hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485;通过血清miRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用,可以在早期评估乳腺癌患者是否选择化疗治疗,根据预测结果及时更换治疗策略,为进一步个体户精准治疗奠定基础,并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
本发明的试剂盒通过检测hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485的表达水平,可有效评估激素受体阳性乳腺癌对化疗的敏感程度:若hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485中几组miRNA的表达水平高于正常值范围,则患者发生耐药的风险较高,不适宜采用传统化疗方案。本发明采用多个生物标志物miRNA的组合模式,采用体外诊断多变量指标分析可促进诊断效果。此外,血浆miRNA不受RNA酶影响,可在低温条件下长期保存,不受冻融影响,检测方便,可实现检测技术的标准化。因此血浆中的miRNA作为肿瘤诊断标志物,具有非侵入、可动态监测的优点,从而实现了对乳腺癌类型的准确识别,增加了针对性应对的可能。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为采用本发明的试剂盒联合检测6个miRNA(hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485)与TNM分期的ROC曲线图;
图2为hsa-miR-3646的溶解曲线峰图,横轴为温度(temperature),纵轴为荧光强度的变化值(Derivative Reporter);
图3为hsa-miR-4741的溶解曲线峰图,横轴为温度(temperature),纵轴为荧光强度的变化值(Derivative Reporter);
图4为hsa-miR-937-5p的溶解曲线峰图,横轴为温度(temperature),纵轴为荧光强度的变化值(Derivative Reporter);
图5为hsa-miR-6730-3p的溶解曲线峰图,横轴为温度(temperature),纵轴为荧光强度的变化值(Derivative Reporter);
图6为hsa-miR-6831-5p的溶解曲线峰图,横轴为温度(temperature),纵轴为荧光强度的变化值(Derivative Reporter);
图7为hsa-miR-8485的溶解曲线峰图,横轴为温度(temperature),纵轴为荧光强度的变化值(Derivative Reporter);
图8为内参miR-39的溶解曲线峰图,横轴为温度(temperature),纵轴为荧光强度的变化值(Derivative Reporter);
图9为建模组的临床预后与预测风险相关性散点图;
图10为验证组的临床预后与预测风险相关性散点图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施例仅用于解释相关发明,而非对该发明的限定。为了便于描述,附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等《分子克隆:实验室指南》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例
收集乳腺癌化疗敏感及耐药患者血清取自新疆医科大学附属肿瘤医院2017年至2021年的138例患者,作为“乳腺癌病例组”,另外选择与病例年龄匹配的健康女性的样本作为“健康女性对照组”。
采用高通量芯片技术分别对乳腺癌化疗敏感及耐药患者血清标本进行miRNA芯片检测,结合生物信息学分析和文献,我们选择hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485进行验证。并通过单因素方差分析、多因素方差分析、Lasso回归等建立了一个miRNA特征诊断模型,并确定了一个用于诊断TNBC耐药的6-miRNA特征模型。
本发明所述用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒的一种实施例,所述试剂盒包括6个miRNA(hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485)以及内参miR-39的扩增引物;用于提取RNA的试剂;用于配制逆转录反应体系的试剂;和用于配制定量PCR反应体系的试剂。
hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:
SEQ ID NO:1:aaaaugaaaugagcccagccca;
SEQ ID NO:2:cgggcuguccggaggggucggcu;
SEQ ID NO:3:gugagucaggguggggcugg;
SEQ ID NO:4:ccugacaccccaucugcccuca;
SEQ ID NO:5:uagguagagugugaggaggagguc;
SEQ ID NO:6:cacacacacacacacacguau。
用于配制逆转录反应体系的试剂包括逆转录酶、dNTP、Random primers、Oligo(dT)12-18、RNasin、逆转录缓冲液和纯水。所述用于配制定量PCR反应体系的试剂SYBRGreen I、无核酸酶纯水。
优选的荧光定量PCR反应及溶解曲线分析程序过程可以是:使用SYBRPremixExTaq(购自TAKARA),在20ul的实时荧光定量PCR反应体系中加入2ul反转录产物作为模板,10ul2×SYBRPremixExTaq,0.4ul正向引物(10uM),0.4ul反向引物(10uM),0.4ul50×ROXReference染料,加灭菌蒸馏水至20ul。设置实时荧光定量PCR程序:步骤1:95℃,10分钟。步骤2:95℃,15秒。步骤3:60℃到95℃每秒上升0.5℃并且读值,结束循环。使用β-tubulin作为过氧化氢酶信使RNA的内参。
所使用的对hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485具有检测特异性的PCR引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示:
SEQ ID NO:7:gcgcagaaaatgaaatgagc;
SEQ ID NO:8:ctgtccggaggggtc;
SEQ ID NO:9:gcaggtgagtcagggt;
SEQ ID NO:10:ctgacaccccatctgc;
SEQ ID NO:11:cagtaggtagagtgtgaggag;
SEQ ID NO:12:agcacacacacacacac。
根据上述结果,本发明人通过对2组血浆样品(“乳腺癌病例组”和“健康女性对照组”)的miRNAs表达水平的分析,以探索性人群健康女性对照组hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485表达量的单侧95%参考值范围为标准,对这6种miRNA进行评分,表达量小于第95百分位数评分为0分,表达量大于等于第95百分位数评分为1分,以回归系数为权重,进一步求得危险分值,以危险分值的中位数为界值,绘制ROC来评估预测的灵敏性和特异性,进而评估这6种miRNAs高表达对乳腺癌发病的判断能力。所有数据采用均值±标准差表示,运用SPSS19.0软件对各组中各基因含量进行统计学分析,采用秩和检验分析方法统计:P<0.05表明有显著性差异。所绘制的ROC结果如图1所示,从图1中可以看出,本发明所提出的6种miRNA能够较好地区分乳腺癌的类型。
如图2至图8所示为hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485以及内参miR-39的溶解曲线图,均为单峰,无非特异性峰出现;
优选的情况下,可以采用风险值判断是否为化疗耐药高危型乳腺癌,其具体的公式为:Risk score=0.252(status of hsa-miR-3646)-0.314(status of hsa-miR-4741)+0.348(status of hsa-miR-937-5p)+0.182(status of hsa-miR-6730-3p)-0.143(statusof hsa-miR-6831-5p)-0.126(status of hsa-miR-8485)。
优选的情形中,高危患者筛选:cut-off值为5.44。样本Riskscore<5.44为低危,Riskscore≥5.44为高危。
图9及图10为采用本发明的试剂盒检测样本的建模组和验证组的临床预后与预测风险相关性散点图,结果显示,在138例样本中,运用本发明预测出的为低风险的基本无5年复发转移,而出现5年复发转移的样本均为本发明预测出的高风险病例。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解,本申请中所涉及的发明范围,并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案,同时也应涵盖在不脱离发明构思的情况下,由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
序列表
<110> 新疆医科大学第三附属医院
<120> miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aaaaugaaau gagcccagcc ca 22
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
cgggcugucc ggaggggucg gcu 23
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gugagucagg guggggcugg 20
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ccugacaccc caucugcccu ca 22
<210> 5
<211> 24
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
uagguagagu gugaggagga gguc 24
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
cacacacaca cacacacgua u 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
gcgcagaaaa tgaaatgagc 20
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
ctgtccggag gggtc 15
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
gcaggtgagt cagggt 16
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
ctgacacccc atctgc 16
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
cagtaggtag agtgtgagga g 21
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
agcacacaca cacacac 17

Claims (10)

1.miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述miRNA选自hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p和hsa-miR-8485中的至少两种,所述hsa-miR-3646、所述hsa-miR-4741、所述hsa-miR-937-5p、所述hsa-miR-6730-3p、所述hsa-miR-6831-5p和所述hsa-miR-8485的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示。
2.根据权利要求1所述的miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述诊断试剂为血清学诊断试剂,所述试剂盒为血清学诊断试剂盒。
3.根据权利要求1所述的miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述诊断试剂或所述试剂盒用于检测生物样品中所述hsa-miR-3646、所述hsa-miR-4741、所述hsa-miR-937-5p、所述hsa-miR-6730-3p、所述hsa-miR-6831-5p和所述hsa-miR-8485中至少两种的miRNA的表达量。
4.根据权利要求3所述的miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述生物样品为血清。
5.根据权利要求2所述的miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述诊断试剂或所述试剂盒还包括:对所述hsa-miR-3646、所述hsa-miR-4741、所述hsa-miR-937-5p、所述hsa-miR-6730-3p、所述hsa-miR-6831-5p和所述hsa-miR-84859中的至少两种的PCR引物和至少两种具有检测特异性的探针和/或基因芯片。
6.根据权利要求5所述的miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述PCR引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
7.根据权利要求2所述的miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述诊断试剂为采用荧光定量PCR方法检测miRNA表达量的试剂,所述试剂盒为采用荧光定量PCR方法检测miRNA表达量的试剂盒。
8.根据权利要求2所述的miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,基于hsa-miR-3646、hsa-miR-4741、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-6730-3p、hsa-miR-6831-5p、hsa-miR-8485各自的表达量,获得所述乳腺癌耐药性。
9.根据权利要求8所述的miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,所述乳腺癌耐药性等于0.252×hsa-miR-364的表达量-0.314×hsa-miR-4741的表达量+0.348×hsa-miR-937-5p的表达量+0.182×hsa-miR-6730-3p的表达量-0.143×hsa-miR-6831-5p的表达量-0.126×hsa-miR-8485的表达量。
10.根据权利要求9所述的miRNA在制备乳腺癌耐药性评估的诊断试剂或试剂盒中的应用,其特征在于,根据所述乳腺癌耐药性判断所述样品所属的乳腺癌的类型。
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