CN117363529A - 具有肠炎治疗作用的鼠李糖乳杆菌及其应用 - Google Patents

具有肠炎治疗作用的鼠李糖乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有肠炎治疗作用的鼠李糖乳杆菌及其应用，涉及微生物技术领域。所述的鼠李糖乳杆菌，拉丁学名为Lacticaseibacillus rhamnosus WOP1719，保藏号为GDMCC No:63057，于2022年12月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。本发明的鼠李糖乳杆菌和其他益生菌粉与植物活性成分进行配合使用，能够有效抑制肠道炎症水平，增加益生菌种类和数量、抑制有害菌生长和繁殖，提高益生性和防治肠道炎症性疾病效果，并且适宜人群广泛。

Description

具有肠炎治疗作用的鼠李糖乳杆菌及其应用
本申请是公开号为CN116555126A专利的分案申请；
原申请的申请日为2023年06月27日；
原申请的申请号为CN202310764824.5；
原申请的发明名称为具有肠炎治疗作用的含益生菌的组合物及其应用。
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种具有肠炎治疗作用的鼠李糖乳杆菌及其应用。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一类多种病因引起的异常免疫介导的肠道慢性及复发性炎症性疾病。主要类型包括克罗恩病(Crohn disease，CD)、溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)和非定型结肠炎。临床症状主要表现为发烧、呕吐、腹胀、腹痛、腹泻、直肠出血、粘液血便、粘膜脓便，多呈现为反复发作、久治不愈，严重影响患者生活质量和身心健康。目前认为其发病与遗传因素、环境因素、肠道黏膜屏障功能障碍、感染因素等多种因素有关。
目前炎症性肠病的主要治疗方法包括药物治疗、饮食治疗及手术治疗，其中药物治疗是最主要的方法。临床上用于治疗肠炎的传统药物主要有三类：氨基水杨酸类、糖皮质激素类和免疫抑制剂。然而，现有药物疗效有限且往往不良反应剧烈，易引起患者出现头疼、恶心、消化不良，甚至血液系统异常，且易导致机体耐药。
随着对肠炎发病机制的认识不断深入，研究者们发现肠道菌群在调控肠道健康中发挥着至关重要的作用。近年相关研究表明，只有在调节膳食结构的同时补充适量的益生菌，才能达到改善肠道微生态、治疗肠炎的目的。益生菌(Probiotics)是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道部位，并抵抗病原菌侵袭，从而改善肠腔微生态，保障机体营养和健康的有益微生物的总称。
现有技术中公开了试验组同时给与患者双歧杆菌乳杆菌三联活菌片和美沙拉秦缓释颗粒，参照组仅给与美沙拉秦缓释颗粒，观察两组患者治疗前及治疗8周后的血生化指标。研究结果显示试验组的血红蛋白、红细胞积压、白蛋白水平明显高于参照组，SOD水平及白细胞分化抗原4阳性均明显高于参照组。以上结果说明美沙拉琴联合益生菌制剂治疗炎症性肠病可以改善患者的炎症因子水平与免疫营养状态(益生菌制剂联合美沙拉秦对炎症性肠病患者预后康复的促进效果，葛领枝，李超等，临床医学研究与实践，2022,7(22)，78-80)。但美沙拉秦的主要成分为5-氨基水杨酸，容易导致人体产生不良反应。
中国专利CN115551524A于2022年12月30日公开了用于治疗炎性肠病或其至少一种症状的方法，所述的方法包括向有相应需要的受试者施用有效量的：选自免疫抑制剂和氨基水杨酸的化合物和一种或更多种乳杆菌属物种的培养基的培养物上清液或无细胞培养物滤液，所述的一种或更多种乳杆菌属物种选自布氏乳杆菌、类干酪乳杆菌、玉米乳杆菌、芜菁乳杆菌、类谷糠乳杆菌和食二酸乳杆菌。该专利采用的免疫抑制剂和氨基水杨酸化合物和一种或更多种乳杆菌属物种混合的治疗方式，多种物质的添加容易给人体带来刺激作用，对人体产生副作用。
除此之外，虽然市面上已有益生菌产品，但是大多产品耐酸耐胆碱性能较差，不能够有效抵抗胃肠道的恶劣环境，导致到达肠道后的活菌数大大减少，肠道调节和抑制炎症的效果较差。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有肠炎治疗作用的鼠李糖乳杆菌及其应用，所述的鼠李糖乳杆菌能够调节免疫炎症，抑炎效果显著。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种鼠李糖乳杆菌WOP1719，拉丁学名为Lacticaseibacillus rhamnosus WOP1719，保藏号为GDMCC No:63057，于2022年12月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
又一方面，本发明提供了一种长双歧杆菌XSL0718，拉丁学名为Bifidobacteriumlongum XSL0718，保藏号为GDMCC No:63098，于2022年12月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
又一方面，本发明提供了一种含益生菌的组合物，所述的组合物包括大肠埃希菌Nissle 1917、鼠李糖乳杆菌WOP1719、长双歧杆菌XSL0718、三峡阳菊叶提取物、母乳低聚糖、金黄海藻萃取物、海茴香提取物、防风提取物、乳香提取物和龙胆草提取物。
具体地，所述的组合物按照重量份数计包括：0.01-1份大肠埃希菌Nissle 1917、0.01-1份鼠李糖乳杆菌WOP1719、0.01-1份长双歧杆菌XSL0718、1-5份三峡阳菊叶提取物、2-8份母乳低聚糖、0.1-1份金黄海藻萃取物、0.5-1.5份海茴香提取物、0.1-2份防风提取物、0.1-1份乳香提取物和0.1-1份龙胆草提取物；所述的大肠埃希菌Nissle 1917的菌粉的活菌含量不少于100CFU/g；所述的鼠李糖乳杆菌WOP1719的菌粉的活菌含量不少于100CFU/g；所述的长双歧杆菌XSL0718的菌粉的活菌含量不少于100CFU/g。
进一步具体地，所述的组合物按照重量份数计包括：0.04-0.08份大肠埃希菌Nissle 1917、0.04-0.08份鼠李糖乳杆菌WOP1719、0.04-0.08份长双歧杆菌XSL0718、2-4份三峡阳菊叶提取物、3-6份母乳低聚糖、0.2-0.6份金黄海藻萃取物、0.6-1.0份海茴香提取物、0.5-1.5份防风提取物、0.2-0.6份乳香提取物和0.2-0.5份龙胆草提取物；所述的大肠埃希菌Nissle 1917的菌粉的活菌含量不少于100CFU/g；所述的鼠李糖乳杆菌WOP1719的菌粉的活菌含量不少于100CFU/g；所述的长双歧杆菌XSL0718的菌粉的活菌含量不少于100CFU/g。
再进一步具体地，所述的组合物按照重量份数计包括：0.05份大肠埃希菌Nissle1917、0.05份鼠李糖乳杆菌WOP1719、0.05份长双歧杆菌XSL0718、3份三峡阳菊叶提取物、4份母乳低聚糖、0.4份金黄海藻萃取物、0.8份海茴香提取物、1份防风提取物、0.4份乳香提取物和0.25份龙胆草提取物；所述的大肠埃希菌Nissle 1917的菌粉的活菌含量不少于100CFU/g；所述的鼠李糖乳杆菌WOP1719的菌粉的活菌含量不少于100CFU/g；所述的长双歧杆菌XSL0718的菌粉的活菌含量不少于100CFU/g。
具体地，所述的大肠埃希菌Nissle 1917的菌粉的活菌含量不少于100CFU/g、200CFU/g、300CFU/g、400CFU/g、500CFU/g、600CFU/g、700CFU/g、800CFU/g、900CFU/g、1×103CFU/g、1×104CFU/g、1×105CFU/g、1×106CFU/g、1×107CFU/g、1×108CFU/g、1×109CFU/g。
具体地，所述的鼠李糖乳杆菌WOP1719的菌粉的活菌含量不少于100CFU/g、200CFU/g、300CFU/g、400CFU/g、500CFU/g、600CFU/g、700CFU/g、800CFU/g、900CFU/g、1×103CFU/g、1×104CFU/g、1×105CFU/g、1×106CFU/g、1×107CFU/g、1×108CFU/g、1×109CFU/g。
具体地，所述的长双歧杆菌XSL0718的菌粉的活菌含量不少于100CFU/g、200CFU/g、300CFU/g、400CFU/g、500CFU/g、600CFU/g、700CFU/g、800CFU/g、900CFU/g、1×103CFU/g、1×104CFU/g、1×105CFU/g、1×106CFU/g、1×107CFU/g、1×108CFU/g、1×109CFU/g。
优选地，所述的组合物的制备方法，包括以下步骤：
将所述的三峡阳菊叶提取物，母乳低聚糖，金黄海藻萃取物，海茴香提取物，防风提取物，乳香提取物，龙胆草提取物干燥处理，将干燥后的上述各组份分别过筛，将通过20-60目筛的各组份与工程化表达IL-2大肠埃希菌Nissle 1917、鼠李糖乳杆菌WOP1719、长双歧杆菌XSL0718的菌粉进行混合，得到所述益生菌组合物，将上述混合粉末用全自动粉剂灌装机按10g/包的规格进行分装，将小包产品按照10包/盒的规格进行装盒，得到成品。
大肠埃希菌是一种革兰染色阴性杆菌，属于肠杆菌科埃希菌属，俗名大肠杆菌。大肠埃希菌广泛分布于自然界及人类和各种动物的体表和肠道内，属于正常菌群成员。大肠埃希菌(Escherichia coli，E.coli)Nissle 1917：能够过表达IL-2，能够有效靶向NK细胞，调节免疫炎症，缓解肠道炎症。
鼠李糖乳杆菌WOP1719：从牛奶中分离出的1株乳杆菌，具有调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素及提高机体免疫力等功效。
长双歧杆菌XSL0718：从母乳中提取和分离，能够促进肠道pH值降低，改善肠道菌群平衡，维持肠道健康。
三峡阳菊叶提取物：具有抗菌、抗炎、抗氧化、皮肤保护等多种生物活性。
母乳低聚糖：具有调节肠道菌群、上皮屏障和免疫功能等作用。
金黄海藻萃取物：通过增强紧密连接和促进更具功能的粘液层，在维持肠道黏膜完整性方面发挥重要作用；同时在巨噬细胞中上调具有抗炎活性的免疫介质的基因表达。
海茴香提取物：促进血管内皮生长因子(VEGF)生长，可以促进肠道上皮细胞的修复，同时也具有很强的清理自由基、抗氧化的能力。
防风提取物：具有抗氧化，抗菌消炎的作用。
乳香提取物：乳香提取物具有显著的抗炎作用，其机制与抑制促炎症反应细胞活素类的生成有关，同时可以促进溃疡再生黏膜结构和功能成熟度，提高溃疡愈合质量。
龙胆草提取物：具有舒缓、镇静、抗菌抗炎等功效。
优选地，所述的大肠埃希菌Nissle 1917为工程化表达IL-2大肠埃希菌Nissle1917。
进一步优选地，所述的工程化表达IL-2大肠埃希菌Nissle 1917是将重组质粒转化大肠埃希菌Nissle1917获得，或将编码IL-2蛋白的基因整合至大肠埃希菌Nissle1917获得。
再进一步优选地，所述的重组质粒是将编码IL-2蛋白的基因接入表达载体获得，所述的IL-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
更进一步优选地，所述表达载体选自pET-28a、pEZZ18、pTA1529、pINIII-ompA、pUB110、pE194、pUCX05-bgaB、pHT304、pMK3、pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P、PNZ8149-usp45中的一种或多种。
在本发明的一些实施例中，所述的表达载体为pET-28a，pET-28a构建获得的重组质粒为pET-28a-IL-2，所述的重组质粒pET-28a-IL-2的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
又一方面，本发明提供了上述的鼠李糖乳杆菌WOP1719或长双歧杆菌XSL0718或组合物在制备治疗或预防肠炎的药物中的应用。
具体地，所述的药物的剂型包括但不限于粉剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、油剂。
进一步具体地，所述的药物的剂型为粉剂。
具体地，所述的药物中包括医学上可接受的载体。
进一步具体地，所述的载体包括但不限于赋性剂、缓冲剂、乳化剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、防腐剂。
再进一步具体地，所述赋性剂选自微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、环糊精、羧甲基纤维素、甘露醇中的至少一种。
再进一步具体地，所述缓冲剂选自磷酸二氢钠、碳酸氢钠、碳酸氢铵、醋酸钠、枸橼酸盐、组氨酸、琥珀酸盐中的至少一种。
再进一步具体地，所述乳化剂选自硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸钙、硬脂酸甘油酯、山梨坦异硬脂酸酯、山梨坦油酸酯、甘油油酸酯、聚甘油-3聚蓖麻醇酸酯中的至少一种。
再进一步具体地，所述稳定剂选自金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚、羧甲基甲壳酯中的至少一种。
再进一步具体地，所述稀释剂选自赤藓糖醇、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、乳糖、蔗糖、玉米淀粉、马铃薯淀粉、磷酸钙、柠檬酸钙、结晶纤维素中的至少一种。
再进一步具体地，所述粘合剂选自乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
再进一步具体地，所述防腐剂选自羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、三氯叔丁醇、硫柳汞、氧氰化汞、苯氧乙醇、氯己定、苯甲酸、苯甲酸钠、氯甲酚、苯扎溴铵、苯扎氯铵、羟苯乙酯中的至少一种。
又一方面，本发明提供了一种治疗或预防肠炎的药物，所述的药物包括上述的鼠李糖乳杆菌WOP1719或长双歧杆菌XSL0718或组合物。
具体地，所述的药物的剂型包括但不限于粉剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、油剂。
进一步具体地，所述的药物的剂型为粉剂。
具体地，所述的药物中包括医学上可接受的载体。
进一步具体地，所述的载体包括但不限于赋性剂、缓冲剂、乳化剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、防腐剂。
再进一步具体地，所述赋性剂选自微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、环糊精、羧甲基纤维素、甘露醇中的至少一种。
再进一步具体地，所述缓冲剂选自磷酸二氢钠、碳酸氢钠、碳酸氢铵、醋酸钠、枸橼酸盐、组氨酸、琥珀酸盐中的至少一种。
再进一步具体地，所述乳化剂选自硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸钙、硬脂酸甘油酯、山梨坦异硬脂酸酯、山梨坦油酸酯、甘油油酸酯、聚甘油-3聚蓖麻醇酸酯中的至少一种。
再进一步具体地，所述稳定剂选自金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚、羧甲基甲壳酯中的至少一种。
再进一步具体地，所述稀释剂选自赤藓糖醇、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、乳糖、蔗糖、玉米淀粉、马铃薯淀粉、磷酸钙、柠檬酸钙、结晶纤维素中的至少一种。
再进一步具体地，所述粘合剂选自乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
再进一步具体地，所述防腐剂选自羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、三氯叔丁醇、硫柳汞、氧氰化汞、苯氧乙醇、氯己定、苯甲酸、苯甲酸钠、氯甲酚、苯扎溴铵、苯扎氯铵、羟苯乙酯中的至少一种。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的鼠李糖乳杆菌与其他益生菌粉与植物活性成分进行配合使用，能够有效抑制肠道炎症水平，增加益生菌种类和数量、抑制有害菌生长和繁殖，从而达到对肠道菌群的选择性调节作用，提高益生菌组合物的益生性和防治肠道炎症性疾病效果，并且适宜人群广泛。
(2)本发明的鼠李糖乳杆菌及其制剂在人体胃肠道中具有更好的抑制炎症水平、调理肠胃、增强机体免疫力等多重方面功效。
保藏说明：
保藏编号：GDMCC No：63098；
分类命名：Bifidobacterium longum；
保藏时间：2022年12月28日；
保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；
保藏单位简称：GDMCC；
保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
保藏说明：
保藏编号：GDMCC No：63057；
分类命名：Lacticaseibacillus rhamnosus；
保藏时间：2022年12月28日；
保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；
保藏单位简称：GDMCC；
保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1为Western Blot验证结果图。
图2为小鼠肠道上皮细胞的存活率统计图，图中，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图3为小鼠肠道上皮细胞的膜电位统计图，图中，**p＜0.01，****p＜0.0001。
图4为小鼠血液中促炎因子TNF-α的结果统计图，图中，**p＜0.01，****p＜0.0001。
图5为小鼠血液中促炎因子IL-6的结果统计图，图中，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图6为小鼠血液中促炎因子IFN-γ的结果统计图，图中，**p＜0.01，***p＜0.001。
图7为小鼠血液中抗炎因子IL-10的结果统计图，图中，*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
实验材料的购买厂家及货号：
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α超级感受态细胞：购自上海碧云天生物技术有限公司，货号为D1031S；
大肠杆菌Nissle1917 Escherichia coli Nissle1917：购自北纳生物(BeNaCulture)，货号为BNCC361741；
重组质粒pET-28a-EGFP，购自淼灵生物质粒平台，货号为pET-28a-EGFP；
无水乙醇：购自天津大茂化学试剂公司，货号为04005322；
细菌质粒DNA提取试剂盒：购自Omega生物，货号为D6950-03；
三峡阳菊叶提取物购买自上海格莱德科技股份有限公司，货号为P75；
母乳低聚糖购买自山东恒鲁生物科技有限公司，货号为P90；
金黄海藻萃取物购买自山东洁晶集团股份有限公司，货号P10；
海茴香提取物购买自深圳宝安区桑珍源食品商行，货号为P10；
防风提取物购买自陕西慧科植物开发有限公司，货号为P10；
乳香提取物购买自贝塔莱福(天津)生物科技有限公司，货号为P10；
龙胆草提取物购买自蓝力生物技术(西安)有限公司，货号为P98。
LB液体培养基配方为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl；
LB固体培养基配方为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、1.5％琼脂。
基础实施例1
鼠李糖乳杆菌WOP1719的分离
收集牛奶样本，将牛奶进行过滤后加热至80℃，20min，将牛奶样本接种在MRS琼脂培养基上，放在37℃的厌氧产气袋中进行培养36-72h。观察并记录菌落的形态，选择不同形态的菌落在MRS琼脂培养基上划线分离，37℃培养48h后，继续选择不同形态的单菌落进行划线分离，得到形态一致的纯单菌落，挑取纯单菌落在5mL MRS液体培养基中接种，于37℃培养24h，将1mL菌液接种在无菌离心管中，8000rpm，5min，弃掉上清，收集沉淀悬浮于30％甘油溶液中，将菌株保存在-80℃中。
形态学和分子学鉴定：
经过筛选，得到1株潜在益生菌特性的菌株，命名为鼠李糖乳杆菌WOP1719，对其进行了16S r RNA基因测序，16S r RNA的序列见SEQ ID NO:3。
经过上述鉴定，鼠李糖乳杆菌WOP1719于2022年12月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63057，分类命名为Lacticaseibacillus rhamnosus。
长双歧杆菌XSL0718的分离
收集母乳样本5mL，用离心机离心，10000rpm，去掉上清，去除母乳中的脂肪和其他杂质，将沉淀保存在-80℃备用。制备培养基，将处理后的母乳样本接种在MRS琼脂培养基上，放在37℃的厌氧产气袋中进行培养36-72h。观察并记录菌落的形态，选择不同形态的菌落在MRS琼脂培养基上划线分离，37℃培养48h后，继续选择不同形态的单菌落进行划线分离，得到形态一致的纯单菌落，挑取纯单菌落在5mL MRS液体培养基中接种，于37℃培养24h，将1mL菌液接种在无菌离心管中，8000rpm，5min，弃掉上清，收集沉淀悬浮于30％甘油溶液中，将菌株保存在-80℃中。
形态学和分子学鉴定：
经过筛选，得到1株潜在益生菌特性的菌株，命名为长双歧杆菌XSL0718，对其进行了16S r RNA基因测序，其16S r RNA的序列见SEQ ID NO:4。
经过上述鉴定，长双歧杆菌XSL0718于2022年12月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63098，分类命名为Bifidobacterium longum。
基础实施例2构建高表达IL-2蛋白的工程化益生菌
1、重组质粒的构建
pET-28a-IL-2质粒由淼灵生物科技有限公司合成。
2、用重组质粒转化E.coli DH5α大肠杆菌
从-80℃冰箱中取出DH5α感受态细胞，在冰盒上放置10-20分钟，使其融化；取50μL感受态细胞加入2μL质粒，用手指轻轻拨打几次混匀，将混合物在冰上放置30min；42℃热激45s后，迅速放回冰上静置2min；加500μL室温的LB液体培养基(不含抗生素)，37℃、200rpm振摇培养1h活化；取120μL上述菌液涂布于含有15μg/mL卡那霉素的平板上，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，在37℃条件下培养16h。
3、转化成功菌落扩增培养
挑取单克隆，在5mL含有15μg/mL的卡那霉素的液体培养基中扩增培养6h，再将成功转入重组质粒的菌株转接至250mL含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中过夜放大培养。上述培养条件为：转速200rpm，温度为37℃。
4、提取重组质粒DNA
用AXYGEN公司的质粒小提试剂盒提取质粒。
5、将重组质粒转入大肠埃希菌(E.coli)Nissle 1917菌株
从-80℃冰箱中取出大肠埃希菌(E.coli)Nissle 1917化学感受态细胞，在冰盒上放置10-20分钟，使其融化。从中取出50μL感受态细胞加入5μL质粒，用手指轻轻拨打几次混匀，将混合物在冰上放置30min；在42℃热激45s后，迅速放回冰上静置2min；加0.5mL室温的LB液体培养基(不含抗生素)，37℃，200rpm振摇培养1h；取120μL上述菌液涂布于含有15μg/mL卡那霉素的平板上，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，在37℃条件下培养16h。
6、转化成功菌落扩增培养
挑取单克隆，在含有15μg/mL的卡那霉素的液体培养基中扩增培养，之后离心收集全菌液、培养上清和菌体裂解物进行Western Blot验证，结果如图1所示，图1中，M：Marker；1：表达前全菌液；2：全菌液；3：培养基上清菌体；4：菌体裂解物，验证正确得到重组菌株。
以下实施例1-4和对比例2-12中所述的大肠埃希菌Nissle 1917均为基础实施例2制备的工程化表达IL-2的大肠埃希菌Nissle 1917。
以下实施例和对比例中大肠埃希菌Nissle 1917的菌粉的活菌含量为100CFU/g、鼠李糖乳杆菌WOP1719的菌粉的活菌含量为100CFU/g、长双歧杆菌XSL0718的菌粉的活菌含量为100CFU/g。
实施例1一种含益生菌的组合物
所述的含益生菌的组合物包括：0.04份工程化表达IL-2大肠埃希菌Nissle1917、0.04份鼠李糖乳杆菌WOP1719、0.04份长双歧杆菌XSL0718、2份三峡阳菊叶提取物、3份母乳低聚糖、0.2份金黄海藻萃取物、0.6份海茴香提取物、0.5份防风提取物、0.2份乳香提取物和0.2份龙胆草提取物。
实施例2一种含益生菌的组合物
所述的含益生菌的组合物包括：0.05份工程化表达IL-2大肠埃希菌Nissle1917、0.05份鼠李糖乳杆菌WOP1719、0.05份长双歧杆菌XSL0718、3份三峡阳菊叶提取物、4份母乳低聚糖、0.4份金黄海藻萃取物、0.8份海茴香提取物、1份防风提取物、0.4份乳香提取物和0.25份龙胆草提取物。
实施例3一种含益生菌的组合物
所述的含益生菌的组合物包括0.06份工程化表达IL-2大肠埃希菌Nissle1917、0.06份鼠李糖乳杆菌WOP1719、0.06份长双歧杆菌XSL0718、3份三峡阳菊叶提取物、5份母乳低聚糖、0.5份金黄海藻萃取物、0.9份海茴香提取物、1.2份防风提取物、0.5份乳香提取物和0.3份龙胆草提取物。
实施例4一种含益生菌的组合物
所述的含益生菌的组合物包括0.08份工程化表达IL-2大肠埃希菌Nissle1917、0.08份鼠李糖乳杆菌WOP1719、0.08份长双歧杆菌XSL0718、4份三峡阳菊叶提取物、6份母乳低聚糖、0.6份金黄海藻萃取物、1.0份海茴香提取物、1.5份防风提取物、0.6份乳香提取物和0.5份龙胆草提取物。
对比例1
对比例1与实施例2的区别在于，对比例1中将工程化表达IL-2大肠埃希菌Nissle1917替换为大肠埃希菌Nissle 1917，其余皆相同。
对比例2
对比例2与实施例2的区别在于，对比例2中未添加鼠李糖乳杆菌WOP1719，防风提取物的添加量为1.05份，其余皆相同。
对比例3
对比例3与实施例2的区别在于，对比例3中未添加长双歧杆菌XSL0718，防风提取物的添加量为1.05份，其余皆相同。
对比例4
对比例4与实施例2的区别在于，对比例4中未添加三峡阳菊叶提取物，母乳低聚糖的添加量为7份，其余皆相同。
对比例5
对比例5与实施例2的区别在于，对比例5中未添加母乳低聚糖，三峡阳菊叶提取物的添加量为7份，其余皆相同。
对比例6
对比例6与实施例2的区别在于，对比例6中未添加金黄海藻萃取物，三峡阳菊叶提取物的添加量为3.4份，其余皆相同。
对比例7
对比例7与实施例2的区别在于，对比例7中未添加海茴香提取物，三峡阳菊叶提取物的添加量为3.8份，其余皆相同。
对比例8
对比例8与实施例2的区别在于，对比例8中未添加防风提取物，三峡阳菊叶提取物的添加量为4份，其余皆相同。
对比例9
对比例9与实施例2的区别在于，对比例9中未添加乳香提取物，三峡阳菊叶提取物的添加量为3.4份，其余皆相同。
对比例10
对比例10与实施例2的区别在于，对比例10中未添加龙胆草提取物，三峡阳菊叶提取物的添加量为3.25份，其余皆相同。
对比例11
对比例11与实施例2的区别在于，对比例11中未添加鼠李糖乳杆菌WOP1719和长双歧杆菌XSL0718，三峡阳菊叶提取物的添加量为3.15份，海茴香提取物的添加量为0.75份，其余皆相同。
对比例12
对比例12中包括以下组分：0.05份大肠埃希菌Nissle 1917、0.05份鼠李糖乳杆菌WOP1719、0.05份长双歧杆菌XSL0718、发酵大豆蛋白粉3份，低聚半乳糖4份，营养酵母粉(富含B族)0.4份，姜黄0.8份，蔓越莓果粉1份，针叶樱桃果粉0.4份，刺梨果粉0.25份。
实验例1组合物对LPS诱导的肠道炎症细胞的影响
实验步骤：
1、肠道上皮细胞(IEC)铺在96孔板中，放在二氧化碳培养箱中培养，细胞密度达到60％，去掉旧培养基，设置空白组、0加药组、加药组。空白组不包含细胞，只添加培养基。0加药组包含细胞和培养基。加药组包含细胞、1ug/mL LPS及各组益生菌组合溶液的细胞培养基(LPS组)。各组益生菌组合物溶液的工作浓度是2ug/mL，在二氧化碳培养箱中培养24h。
2、益生菌组给药溶液的配制：
取2mg的益生菌组合物溶解在PBS中，制成2mg/mL的益生菌组合物溶液。
3、CCK-8实验包括以下步骤：
各组在细胞培养箱中培养24h后，去掉培养基，加入10uL CCK-8和90uL无血清培养基，在37℃培养箱中培养1h后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算细胞活力。
细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100；
A(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的OD值；
A(0加药)：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的OD值；
A(空白)：没有细胞的孔的OD值；
细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力。
4、线粒体膜电位的检测包括以下步骤：
用PBS缓冲液将肠道上皮细胞洗涤3次，在肠道上皮细胞中加入5μMFura-2-AM荧光探针，将细胞放入二氧化碳培养箱中孵育30分钟。将细胞用PBS缓冲液洗涤三次，去除未结合的Fura-2-AM。使用荧光分光光度计以适当的荧光激发波长(340nm)激发Fura-2分子，记录荧光发射强度(通常为510nm)。记录LPS组、实施例和对比例组的细胞中的Fura-2的荧光强度，并根据预先建立的标准曲线计算细胞内的钙离子浓度。
5、实验结果：
CCK-8实验检测结果如图2所示，从图2中可以看出，相对于LPS组，实施例1-4组的组合物能够较好的促进肠道上皮细胞(IEC)的增殖。与实施例1-4相比，对比例1-12促进肠道上皮细胞的增殖的效果较差。对比例1中将工程化表达IL-2大肠埃希菌Nissle 1917替换为大肠埃希菌Nissle 1917，对比例1与实施例1-4相比，对比例1促进肠道上皮细胞的增殖的效果较差，这证明表达IL-2的大肠埃希菌Nissle 1917能够促进肠道上皮细胞的增殖。对比例2-11中缺少了组合物中的某一单个组分，其增殖效果均较实施例1-4差，说明该益生菌组合物中的各组分相互作用，进一步促进了肠道上皮细胞的增殖。按照对比例12添加各组分和含量的组合物其促进肠道细胞增殖的效果较实施例1-4差，说明实施例1-4中所使用的含益生菌的组合物有益于肠道上皮细胞的增殖，有益于恢复肠道健康。
使用LPS诱导的肠道上皮细胞炎症模型，炎症发生后，细胞会发生线粒体损伤，线粒体损伤会影响细胞内的钙离子浓度。通过检测线粒体的钙离子浓度，检测结果如图3所示，从图3中可以看出，LPS组钙离子浓度下降。与模型组相比，实施例1-4的组合物能够促进钙离子浓度进一步恢复。此外，实施例1-4能够有效恢复线粒体膜电位，促使钙离子进入线粒体。与实施例1-4组相比，对比例1-12组的钙离子浓度显著下降。这说明实施例所使用的表达IL-2的益生菌以及益生菌和植物活性成分协调发挥着抗炎作用，恢复细胞的线粒体膜电位，促进钙离子浓度恢复正常。
实验例2组合物对结直肠炎小鼠的抑炎作用
实验步骤：
1、DSS诱导小鼠结直肠炎的模型的构建：
构建过程如下：BALB/c小鼠，6-8周，25g，用无菌水配置3％ DSS饮用水，然后用0.22μm的滤膜过滤，给小鼠连续饮用7天。
2、通过ELISA实验检测DSS诱导的小鼠结直肠炎的血液中的促炎因子和抗炎因子，包括TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-10。
小鼠血液的提取包括以下步骤：
使用0.9％戊巴比妥钠麻醉小鼠，使用1mL注射器对小鼠进行心头取血，血液放在EP管中静置2h，离心，3000rpm，10min，收集上层血清用于ELISA检测血清中的细胞因子。
ELISA法检测小鼠血液中的TNF-α包括以下步骤：使用预包被的ELISA试剂盒，向样品孔中加入100μL样品血清，空白对照孔加入100μL 1×Dilution Buffer R工作液。每孔加入50μL 1×Biotinylated Antibody工作液。盖上封板膜，37℃孵育90分钟。扣去孔内液体，每孔加入300μL 1×Washing Buffer工作液，停留1分钟后弃去孔内液体。重复4次，最后一次在滤纸上扣干。每孔加入100μL1×Streptavidin-HRP工作液。盖上封板膜，37℃孵育30分钟。洗板4次。每孔加入100μL TMB，37℃避光孵育5-30分钟。根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应。显色完成后，在每孔中迅速加入100μL Stop Solution终止反应。终止后10分钟内，用检测波长450nm读值。根据标准曲线计算每个样本血清中的细胞因子的浓度。
ELISA法检测小鼠血液中的IL-6包括以下步骤：
步骤同上，使用Mouse IL-6Precoated ELISAKit(购自达优公司，货号：1210602)。
ELISA法检测小鼠血液中的IFN-γ包括以下步骤：
步骤同上，使用Mouse IFN-γPrecoated ELISAKit(购自达优公司，货号：1210002)。
ELISA法检测小鼠血液中的IL-10包括以下步骤：
步骤同上，使用Mouse IL-10Precoated ELISAKit(购自达优公司，货号：1211002)。
3、实验结果：
通过ELISA实验检测DSS诱导的小鼠结直肠炎的血液中的促炎因子和抗炎因子，如图4-7所示，从图4-6中可以看出，与DSS组(模型组)相比，实施例1-4组小鼠血液中的促炎细胞因子TNF-α，IFN-γ和IL-6显著性下降，与实施例1-4组相比，对比例1-12组的小鼠血液中的促炎细胞因子TNF-α，IFN-γ和IL-6显著上升。从图7中可以看出，与DSS组相比，实施例1-4组小鼠血液中的抗炎细胞因子IL-10显著上升，与实施例1-4组相比，对比例1-12组的IL-10显著下降，这说明实施例1-4中的组合物能够有效发挥抗炎作用。此外，相较于对比例1-12，实施例1-4通过将合成生物学表达IL-2的益生菌以及植物活性成分进行科学有效的搭配组合，能够更加有效改善结直肠炎小鼠体内的过度炎症。
综上所述，含益生菌的组合物通过构建工程化益生菌，增加益生菌中IL-2蛋白的含量。该组合物能够有效调节肠道炎症疾病，从细胞实验上证明了其能够有效对抗肠道细胞的炎症，促进肠道上皮细胞的增殖，并且还能有效恢复炎性肠道上皮细胞的线粒体膜电位，有效调节肠道上皮细胞的恢复。在结直肠炎小鼠模型中证明了其能够有效改善全身炎症水平，这充分展示了该组合物能够有效防治肠道炎症疾病。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种鼠李糖乳杆菌WOP1719，其特征在于，拉丁学名为Lacticaseibacillusrhamnosus WOP1719，保藏号为GDMCC No:63057，于2022年12月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌WOP1719在制备治疗或预防肠炎的药物中的应用。
3.一种治疗或预防肠炎的药物，其特征在于，所述的药物包括权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌WOP1719。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述的药物的剂型为粉剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂或油剂。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述的药物的剂型为粉剂。
6.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述的药物中包括医学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述的载体选自赋性剂、缓冲剂、乳化剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、防腐剂中的一种或多种。
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