CN117362462A - 一种有效提高杏鲍菇多糖活性和含量的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有效提高杏鲍菇多糖活性和含量的提取方法。采用蒸汽爆破技术对杏鲍菇进行预处理，干燥粉碎后加入蒸馏水进行提取，通过水浴、加热、提取、浓缩、醇沉、冷冻干燥等技术手段获得杏鲍菇多糖。该提取方法显著提高了杏鲍菇多糖的提取率、多糖的抗氧化活性。
Description
技术领域
本发明属于天然产物应用领域，具体涉及一种能提高杏鲍菇多糖溶出率的提取方法。
背景技术
随着科学的不断发展进步，多糖被发现是与蛋白质、核酸同等重要的生物大分子，在生物体的生长发育、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射等方面中发挥重要作用。其中，食用菌多糖是国内外的研究热点。杏鲍菇是一种集药用、保健、食疗于一体的食用菌，其多糖在免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、降血糖、降血脂和抑菌等方面均有重要的作用。当前，杏鲍菇多糖的提取方法有超声辅助酶法、热水浸提法、超声辅助热水提取法、超声提取法等。
近几年，蒸汽爆破处理技术在国内发展迅速，在农业和食品领域的应用越来越广泛，该技术的研究对农业和食品资源的开发意义较大。蒸汽爆破处理只需要通入高温高压水蒸汽，不加其他任何化学成分物质，可以对大分子物质进行改性修饰，增强相应的功能特性，提高提取效率，在植物纤维的高效分离和生物质副产物处理等领域有显著的效果，是一种安全高效的预处理新技术。已有研究表明，蒸汽爆破可使原料溶出率增加，多糖提取率显著提高。此外，蒸汽爆破处理还可以提高多糖的抗氧化活性。
目前，还未有研究将蒸汽爆破处理技术应用于杏鲍菇的多糖提取，及其活性变化。因此本发明以此进行研究，提供一种杏鲍菇多糖溶出率更高、多糖活性更高的提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杏鲍菇多糖溶出率更高、多糖活性更高的提取方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
以杏鲍菇为原料，经过蒸汽爆破预处理、干燥、粉碎、水浴、加热、提取、浓缩、醇沉、冷冻浓缩等技术手段获得杏鲍菇多糖。
主要包括以下步骤：
(1)蒸汽爆破预处理
A.称取100g干制杏鲍菇，隔夜复水至含水率20wt％～30wt％；
B.设定蒸汽爆破参数，蒸汽爆破压力1.4MPa，蒸汽爆破稳压时间60s，通入饱和蒸汽，进行蒸汽爆破预处理。
(2)干燥与粉碎
A.将预处理后的物料置于60℃的条件下进行热风干燥，干燥至含水量10wt％以下，干燥后利用粉碎机进行粉碎；
(3)杏鲍菇多糖浓缩液的制备
A.将杏鲍菇粉末与蒸馏水以1：40g/mL的料液比进行混合；
B.对混合后的溶液进行80℃的水浴加热、搅拌4h；
C.用200目的尼龙纱布过滤掉残渣，收集滤液；
D.将滤液置于旋转蒸发仪中浓缩，浓缩至原体积的1/10，得杏鲍菇多糖浓缩液。
(4)杏鲍菇多糖的制备
A.将杏鲍菇多糖浓缩液与3～4倍体积的无水乙醇进行混合；
B.将混合后的溶液置于4℃的条件下，静置24h；
C.使用布氏漏斗进行过滤，沉淀物中无乙醇残留；
D.将沉淀物重新溶于水，-80℃预冻24h，经冷冻干燥后得杏鲍菇多糖。
所述的杏鲍菇多糖，经冻干后干重得率为17.88±0.395％(W/W)。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种有效提高杏鲍菇多糖含量和活性的提取方法。实验结果证明，本方法的多糖含量较未经蒸汽爆破预处理的水提醇沉法提高了2.38倍，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和羟自由基清除率分别提高了3.21倍、2.21和1.10倍。
附图说明
图1为蒸汽爆破压力对杏鲍菇多糖提取率的影响；
图2为蒸汽爆破稳压时间对杏鲍菇多糖提取率的影响；
图3为水提温度对杏鲍菇多糖提取率的影响；
图4为水提时间杏鲍菇多糖提取率的影响；
图5为水提料液比杏鲍菇多糖提取率的影响；
图6为正交试验优化杏鲍菇多糖提取工艺的结果；
图7为最佳工艺条件下杏鲍菇多糖的验证结果；
图8为蒸汽爆破处理对杏鲍菇多糖DPPH自由基清除率的影响；
图9为蒸汽爆破处理对杏鲍菇多糖ABTS自由基清除率的影响；
图10为蒸汽爆破处理对杏鲍菇多糖羟自由基清除率的影响。
附表说明
表1为正交试验因素水平表
表2为正交试验设计表
表3为正交试验结果
表4为正交试验的方差分析表
具体实施方式
以下结合实际，通过具体实施案例对本发明所述的技术方案做进一步的详细说明，但是本发明不仅限于此，不能将其理解为本发明的全部保护范围。
实施例1
蒸汽爆破预处理联合水提醇沉法提取杏鲍菇多糖的单因素试验
实验方法：
(1)不同蒸汽爆破压力对杏鲍菇多糖提取率的影响
称取100g干制杏鲍菇，隔夜复水至含水率25wt％；设定蒸汽爆破参数，蒸汽爆破压力分别为：0.8、1.0、1.2、1.4、1.6MPa，稳压时间为60s；将经蒸汽爆破处理后的物料置于60℃的条件下进行热风干燥，干燥至含水量10wt％，干燥后利用粉碎机进行粉碎；将杏鲍菇粉末与蒸馏水以1：30g/mL的料液比进行混合；对混合后的溶液进行70℃的水浴加热、搅拌3h；用200目的尼龙纱布过滤掉残渣，收集滤液；将滤液置于旋转蒸发仪中浓缩，浓缩至原体积的1/10，得杏鲍菇多糖浓缩液。
将杏鲍菇多糖浓缩液与3倍体积的无水乙醇进行混合，混合后的溶液置于4℃的条件下，静置24h；使用布氏漏斗进行过滤，沉淀物中无乙醇残留；将沉淀物重新溶于水，-80℃预冻24h，经冷冻干燥后得杏鲍菇多糖，称重，按公式(1)进行计算。
式中，W1——冷冻干燥后杏鲍菇多糖的重量，单位为g；
W2——水浴时所加杏鲍菇粉末的重量，单位为g。
(2)不同蒸汽爆破稳压时间对杏鲍菇多糖提取率的影响
称取100g干制杏鲍菇，隔夜复水至含水率25wt％；设定蒸汽爆破参数，蒸汽爆破压力为1.2MPa，稳压时间分别为30、45、60、75、90s；将经蒸汽爆破处理后的物料置于60℃的条件下进行热风干燥，干燥至含水量10wt％，干燥后利用粉碎机进行粉碎；将杏鲍菇粉末与蒸馏水以1：30g/mL的料液比进行混合；对混合后的溶液进行70℃的水浴加热、搅拌3h；用200目的尼龙纱布过滤掉残渣，收集滤液；将滤液置于旋转蒸发仪中浓缩，浓缩至原体积的1/10，得杏鲍菇多糖浓缩液。
将杏鲍菇多糖浓缩液与3倍体积的无水乙醇进行混合，混合后的溶液置于4℃的条件下，静置24h；使用布氏漏斗进行过滤，沉淀物中无乙醇残留；将沉淀物重新溶于水，-80℃预冻24h，经冷冻干燥后得杏鲍菇多糖，称重，按公式(1)进行计算。
式中，W1——冷冻干燥后杏鲍菇多糖的重量，单位为g；
W2——水浴时所加杏鲍菇粉末的重量，单位为g。
(3)不同水提温度对杏鲍菇多糖提取率的影响
称取100g干制杏鲍菇，隔夜复水至含水率25wt％；设定蒸汽爆破参数，蒸汽爆破压力为1.2MPa，稳压时间为60s；将经蒸汽爆破处理后的物料置于60℃的条件下进行热风干燥，干燥至含水量10wt％，干燥后利用粉碎机进行粉碎；将杏鲍菇粉末与蒸馏水以1：30g/mL的料液比进行混合；对混合后的溶液分别进行50、60、70、80、90℃的水浴加热、搅拌3h；用200目的尼龙纱布过滤掉残渣，收集滤液；将滤液置于旋转蒸发仪中浓缩，浓缩至原体积的1/10，得杏鲍菇多糖浓缩液。
将杏鲍菇多糖浓缩液与3倍体积的无水乙醇进行混合，混合后的溶液置于4℃的条件下，静置24h；使用布氏漏斗进行过滤，沉淀物中无乙醇残留；将沉淀物重新溶于水，-80℃预冻24h，经冷冻干燥后得杏鲍菇多糖，称重，按公式(1)进行计算。
式中，W1——冷冻干燥后杏鲍菇多糖的重量，单位为g；
W2——水浴时所加杏鲍菇粉末的重量，单位为g。
(4)不同水提时间对杏鲍菇多糖提取率的影响
称取100g干制杏鲍菇，隔夜复水至含水率25wt％；设定蒸汽爆破参数，蒸汽爆破压力为1.2MPa，稳压时间为60s；将经蒸汽爆破处理后的物料置于60℃的条件下进行热风干燥，干燥至含水量10wt％，干燥后利用粉碎机进行粉碎；将杏鲍菇粉末与蒸馏水以1：30g/mL的料液比进行混合；对混合后的溶液进行70℃的水浴加热、分别搅拌1、2、3、4、5h；用200目的尼龙纱布过滤掉残渣，收集滤液；将滤液置于旋转蒸发仪中浓缩，浓缩至原体积的1/10，得杏鲍菇多糖浓缩液。
将杏鲍菇多糖浓缩液与3倍体积的无水乙醇进行混合，混合后的溶液置于4℃的条件下，静置24h；使用布氏漏斗进行过滤，沉淀物中无乙醇残留；将沉淀物重新溶于水，-80℃预冻24h，经冷冻干燥后得杏鲍菇多糖，称重，按公式(1)进行计算。
式中，W1——冷冻干燥后杏鲍菇多糖的重量，单位为g；
W2——水浴时所加杏鲍菇粉末的重量，单位为g。
(5)不同水提料液比对杏鲍菇多糖提取率的影响
称取100g干制杏鲍菇，隔夜复水至含水率25wt％；设定蒸汽爆破参数，蒸汽爆破压力为1.2MPa，稳压时间为60s；将经蒸汽爆破处理后的物料置于60℃的条件下进行热风干燥，干燥至含水量10wt％，干燥后利用粉碎机进行粉碎；将杏鲍菇粉末与蒸馏水分别以1：10、1：20、1：30、1：40、1：50g/mL的料液比进行混合；对混合后的溶液进行70℃的水浴加热、搅拌3h；用200目的尼龙纱布过滤掉残渣，收集滤液；将滤液置于旋转蒸发仪中浓缩，浓缩至原体积的1/10，得杏鲍菇多糖浓缩液。
将杏鲍菇多糖浓缩液与3倍体积的无水乙醇进行混合，混合后的溶液置于4℃的条件下，静置24h；使用布氏漏斗进行过滤，沉淀物中无乙醇残留；将沉淀物重新溶于水，-80℃预冻24h，经冷冻干燥后得杏鲍菇多糖，称重，按公式(1)进行计算。
式中，W1——冷冻干燥后杏鲍菇多糖的重量，单位为g；
W2——水浴时所加杏鲍菇粉末的重量，单位为g。
实验结果：
如图1所示，随着蒸汽爆破压力的增加，杏鲍菇多糖得率增加，最高达14.46±0.15％。当蒸汽爆破压力超过1.4MPa时，杏鲍菇多糖得率开始下降。
如图2所示，随着蒸汽爆破稳压时间的增加，杏鲍菇多糖得率增加，最高达15.06±0.41％。当蒸汽爆破稳压时间超过60s时，杏鲍菇多糖得率开始下降。
如图3所示，随着水提温度的增加，杏鲍菇多糖得率增加，最高达15.31±0.02％。当水提温度超过80℃时，杏鲍菇多糖得率开始下降。
如图4所示，随着水提时间的增加，杏鲍菇多糖得率增加，最高达13.26±0.37％。当水提时间超过3h时，杏鲍菇多糖得率趋于平稳。
如图5所示，随着水提料液比的增加，杏鲍菇多糖得率增加，最高达12.99±0.10％。当水提料液比超过1：40g/mL时，杏鲍菇多糖得率趋于平稳。
实施例2
蒸汽爆破预处理联合水提醇沉法提取杏鲍菇多糖的正交试验
实验方法：
在实施例1基础上，选择蒸汽爆破压强、蒸汽爆破稳压时间、水提料液比、水提时间和水提温度5个因素做L8(27)正交实验设计进行试验，因素水平见表1，设计表见表2(列F与列G为空列，可做误差列)。
称取100g干制杏鲍菇，隔夜复水至含水率25wt％；根据设计表设定实验参数，将经蒸汽爆破处理后的物料置于60℃的条件下进行热风干燥，干燥至含水量10wt％，干燥后利用粉碎机进行粉碎；将杏鲍菇粉末与蒸馏水进行混合；对混合后的溶液进行水浴加热、搅拌；用200目的尼龙纱布过滤掉残渣，收集滤液；将滤液置于旋转蒸发仪中浓缩，浓缩至原体积的1/10，得杏鲍菇多糖浓缩液。
将杏鲍菇多糖浓缩液与3倍体积的无水乙醇进行混合，混合后的溶液置于4℃的条件下，静置24h；使用布氏漏斗进行过滤，沉淀物中无乙醇残留；将沉淀物重新溶于水，-80℃预冻24h，经冷冻干燥后得杏鲍菇多糖，称重，按公式(1)进行计算。
式中，W1——冷冻干燥后杏鲍菇多糖的重量，单位为g；
W2——水浴时所加杏鲍菇粉末的重量，单位为g。
表1正交试验因素水平表
表2正交试验设计表
实验结果：
如表3所示，根据K值大小，可得各因素的最佳水平，即杏鲍菇多糖的最佳提取工艺：蒸汽压力1.4MPa，稳压时间60s，料液比1：40g/mL，水提时间4h，温度80℃。根据极差大小，可得各因素对多糖得率的影响大小：料液比>蒸汽压力>稳压时间>水提时间>水提温度。
由表4方差分析表，可得：蒸汽爆破压力与水提料液比对杏鲍菇多糖提取率有显著影响(p<0.001)，蒸汽爆破稳压时间、水提温度和水提时间的影响不显著(p>0.1)。
根据正交试验得到的最佳工艺条件，比较了经蒸汽爆破处理与未经蒸汽爆破处理的杏鲍菇多糖得率差异，结果如图7所示，蒸汽爆破处理较未处理显著提高了杏鲍菇多糖得率，经蒸汽爆破处理的多糖得率是未处理的2.38倍。
表3正交试验结果
表4正交试验的方差分析表
实施例3
蒸汽爆破处理对杏鲍菇多糖抗氧化活性的体外研究
实验方法：
使用索莱宝试剂盒比较未经汽爆处理的多糖与经汽爆处理的多糖两者之间的抗氧化活性，包括ABTS、DPPH、ABTS。冻干多糖配制成1mg/mL的样品浓液，待测。
(1)对DPPH自由基清除试验
依据索莱宝DPPH自由基清除能力检测试剂盒的使用说明及操作步骤进行试验。试验DPPH粉剂用6.08mL无水乙醇振荡溶解，根据实验所需量与无水乙醇按照4∶21的体积比配置成工作液(现配现用)，10mg/mL维生素C溶液用提取液配置成0.5mg/mL的维生素C溶液做阳性对照。取25μL提取液和975μL工作液于1.5mL EP管中，记作A空白，涡旋混匀后室温避光放置30min，在515nm处(无水乙醇调零)测定吸光值。A测定、A对照用上清液代替提取液，用无水乙醇代替工作液，A阳性对照用维生素C溶液代替工作液。
样品中阳性对照的DPPH自由基清除能力以清除率DVC％计，DPPH自由基清除能力以清除率D％计，按公式(2)(3)计算：
DVC％＝(A空白-A阳性对照)/A空白×100％ 公式(2)
D％＝(A空白-(A测定-A对照))/A空白×100％ 公式(3)
式中：
A空白——空白管的吸光值；
A阳性对照——阳性对照管的吸光值；
A测定——测定管的吸光值；
A对照——对照管的吸光值。
(2)对ABTS自由基清除试验
依据索莱宝ABTS自由基清除能力检测试剂盒的使用说明及操作步骤进行试验。按照要求将试验所需的试剂二、试剂三工作液、试剂四工作液、试剂五、ABTS工作液配置完成后，取50μL蒸馏水、100μL试剂四工作液和850μLABTS工作液于EP管中，记作A空白，充分混匀，室温避光静置6min，测定405nm处的吸光度。A测定、A对照用上清液代替蒸馏水，用950μL试剂一代替100μL试剂四工作液和850μLABTS工作液，A阳性对照用不同浓度的VC溶液代替蒸馏水。
样品中阳性对照的ABTS自由基清除能力以清除率DVC％计，ABTS自由基清除能力以清除率D％计，按公式(4)(5)计算：
DVC％＝(A空白-A阳性对照)/A空白×100％ 公式(4)
D％＝(A空白-(A测定-A对照))/A空白×100％ 公式(5)
式中：
A空白——空白管的吸光值；
A阳性对照——阳性对照管的吸光值；
A测定——测定管的吸光值；
A对照——对照管的吸光值。
(3)对羟自由基(·OH)清除试验
依据索莱宝ABTS自由基清除能力检测试剂盒的使用说明及操作步骤进行试验。按照要求将试验所需的试剂一、试剂二、试剂三、样本、试剂四配置完成后，取0.15mL试剂一、0.3试剂二、0.3mL试剂三于EP管后充分混匀后加入0.75mLH2O，记作A空，涡旋混匀，置于37℃水浴锅/恒温培养箱准确反应60min，10000rpm，取各上清分别测定536nm处的吸光度。A对用0.15mL试剂四与0.60mLH2O代替0.75mLH2O，A测用0.15mL上清液、0.15mL试剂四和0.45mLH2O代替0.75mLH2O。
样品中羟自由基清除能力以清除率D％计，按公式(6)计算：
D％＝(A测-A对)/(A空-A对)×100％ 公式(6)
式中：
A空——空白管的吸光度；
A测——测定管的吸光度；
A对——对照管的吸光度。
实验结果：
如图8、图9和图10所示，处理组的杏鲍菇多糖的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和羟自由基清除率分别是未处理组的3.21、2.21、1.10倍。其中，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率均是被极显著提升(p<0.001)，羟自由基清除率被显著提升(p＝0.0478)。这表明，蒸汽爆破处理技术对提高杏鲍菇多糖活性有显著作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (5)
1.一种有效提高杏鲍菇多糖活性和含量的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取干制杏鲍菇，复水调整物料含水率，进行蒸汽爆破预处理；
(2)经蒸汽爆破处理后的物料采用热风干燥，用粉碎机对干燥物料进行打粉；
(3)将杏鲍菇粉末溶于蒸馏水中进行水浴，保留滤液进行真空浓缩；
(4)采用醇沉法处理浓缩液，保留沉淀物进行冷冻干燥，得杏鲍菇粗提多糖。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（1）中，复水调整物料含水量为20~30wt%；蒸汽爆破处理时，蒸汽爆破压力为1.4 MPa，蒸汽稳压时间为60 s，通入饱和蒸汽，进行蒸汽爆破处理。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，物料于60℃条件下进行热风干燥，干燥至物料水分10wt%以内。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（3）中，水浴温度80℃，料液比1：40 g/mL，提取时间4 h，浓缩是指将滤液浓缩至原体积的1/10。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（4）中，浓缩液与3~4倍体积无水乙醇混合，4 ℃下静置24 h，过滤得沉淀物，冷冻干燥后得多糖样品。
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