CN117362332A - 一种具有i型光敏反应和光热协同效应的二元酞菁及其制备和应用 - Google Patents

一种具有i型光敏反应和光热协同效应的二元酞菁及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有I型光敏反应和光热协同效应的二元酞菁及其制备和应用。所述二元酞菁为酞菁硅‑酞菁锌偶联物或酞菁锌‑酞菁锌偶联物，其可以在水中发生自组装。在水中，二元酞菁的自组装体不但可产生有效的I型光敏反应而且可产生光热效应，因而可作为光敏剂、光热剂或光动力‑光热联用药物，且其在作为光动力‑光热联用药物时，可在近红外激光的照射及乏氧条件下产生较高量的超氧阴离子与明显的光热效应，即其在有氧与无氧条件下都具有较高的抗癌活性，在乏氧肿瘤的治疗领域具有显著的应用前景。此外，在体实验证明二元酞菁能够经过肾脏清除并随尿液排出体外，可有效避免治疗后药物富集所引起的潜在的生物毒性，从而显著提高生物安全性。

Description

一种具有I型光敏反应和光热协同效应的二元酞菁及其制备 和应用
技术领域
本发明属于光动力治疗药物和光热治疗药物领域，具体涉及一种二元酞菁及其制备与在制药领域的应用。
背景技术
当前恶性肿瘤已成为影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一，但是传统的肿瘤治疗方法包括手术和化疗等均存在较大缺点和不足，致使肿瘤的防治已经成为当前急需解决的问题。随着科技的发展，一些新型的恶性肿瘤治疗方法不断涌现，这其中就包括了光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)和光热治疗(Photothermal therapy,PTT)。PDT和PTT作为非侵入性的治疗手段，因其具有毒副作用小、收效快、重复应用下不会产生耐药性等优点而备受人们关注与期待。
光敏剂(或称光动力药物)和光热剂(或称光热药物)分别是决定光动力治疗和光热治疗效果的关键因素。光热治疗主要是通过光热剂吸收光子的能量，并将光子的能量转化为热能，从而破坏肿瘤细胞和组织。光动力治疗是光敏剂在光激发下发生光敏化反应，产生活性氧，从而破坏肿瘤细胞和组织。其中产生活性氧的机制有I型反应和II型反应二种类型。处于基态(S0)的光敏剂吸收光子的能量跃迁到激发单线态(S1)，激发单线态通过系间窜越转换至寿命相对较长的激发三线态(T1)，之后，处于激发三线态的光敏剂通过电子转移和底物相互作用，产生超氧阴离子(O2 ·－)等活性氧，此过程称为I型反应。处于激发三线态的光敏剂也可直接将能量转移给基态的分子氧，产生活性较高的单线态氧(1O2)，此过程称为II型反应。无论是I型反应还是II型反应，它们产生的活性氧都可以起到杀伤癌细胞、破坏肿瘤组织的治疗作用。大部分光敏剂是通过II型反应产生活性氧，具有有效I型光敏反应的光敏剂极少见。II型反应高度依赖于环境中的氧气，而I型反应对氧气的依赖性较低。由于缺氧是实体肿瘤的主要特征之一，具有I型反应机制的光敏剂在光动力抗实体瘤方面拥有更好的应用价值。此外，光热治疗过程也不需要氧气的参与。
由于在光疗窗口(600-900nm)吸收强、暗毒性低、结构易于修饰等优点，酞菁作为新一代光敏剂的应用备受关注。酞菁属于苯并氮杂卟啉类衍生物，是由18个π电子组成的大环共轭体系。可通过引入不同的周环取代和轴向取代，以及更换不同的中心离子来合成不同结构和功能的酞菁。目前已经有一种酞菁(Photosens)被批准临床使用、三种酞菁(Pc 4、CGP55847、福大赛因)进入临床试验。但是，以上酞菁光敏剂都是单元酞菁，且都是通过对氧气依赖性较高的II型光敏反应机制发挥作用，对实体瘤的光动力治疗效果受到限制。将两个酞菁分子共价偶联形成二元酞菁，有望获得性能更为优异的光敏剂，目前对于二元酞菁在光动力治疗领域中的应用还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有I型光敏反应和光热协同效应的二元酞菁及其制备方法和应用，该二元酞菁不但可产生有效的I型光敏反应而且可产生光热效应，且在体内发挥作用后容易通过肾脏清除并随尿液排出体外，在实体瘤的光动力治疗中具有显著的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明所提供的二元酞菁为酞菁硅-酞菁锌偶联物或酞菁锌-酞菁锌偶联物，其在水中能够发生自组装。
所述酞菁硅-酞菁锌偶联物具体为轴向不对称单羧基取代酞菁硅-周环不对称三取代“氮桥”吗啉基三乙二醇基酞菁锌偶联物，其结构式为：
所述酞菁锌-酞菁锌偶联物具体为周环不对称三取代“氮桥”吗啉基酞菁锌-周环不对称三取代“氮桥”吗啉基酞菁锌偶联物，其结构式为：
所述酞菁硅-酞菁锌偶联物的制备方法包括以下步骤：
(1)制备结构分别为的含有吗啉基的邻苯二甲腈衍生物和含有三乙二醇基的邻苯二甲腈衍生物：以N-氨基乙基吗啉或三乙二醇分别与3-硝基邻苯二甲腈的原料为反应物，使用分子筛净化过的二甲亚砜为溶剂，在三乙胺或者无水碳酸钾存在和氮气保护下，20-80℃下搅拌反应17-72小时，通过薄层色谱法监控，当3-硝基邻苯二甲腈基本消耗完毕时终止反应，通过溶剂法和柱层析法纯化目标产物；
(2)制备不对称三取代吗啉基三乙二醇基锌酞菁：以步骤(1)制备的含有吗啉基的邻苯二甲腈衍生物以及含有三乙二醇基的邻苯二甲腈衍生物为反应物，以正辛醇为溶剂，加入相应的氯化锌化合物，以1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯为催化剂，150-170℃下搅拌反应12-48小时，通过薄层色谱法监控反应终点，生成相应的酞菁锌，进而通过溶剂法或者色谱法纯化目标产物；
(3)轴向不对称单羧基取代酞菁硅-周环不对称三取代“氮桥”吗啉基三乙二醇基酞菁锌偶联物的制备是以轴向不对称单羧基取代硅酞菁和步骤(2)制备的周环不对称三取代“氮桥”吗啉基三乙二醇基酞菁锌为反应物，使用N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为缩合剂、4-二甲氨基吡啶为催化剂，于25-45℃下搅拌反应12-48小时，通过薄层色谱法监控反应终点，再通过溶剂法或色谱法纯化目标产物，得到轴向不对称单羧基取代酞菁硅-周环不对称三取代“氮桥”吗啉基酞菁锌偶联物；
其中，所用轴向不对称单羧基取代硅酞菁、周环不对称三取代“氮桥”吗啉基酞菁锌、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:1.2～1:1.2～5.7:1.9～7.5；
所述轴向不对称单羧基取代硅酞菁的结构式为：所述周环不对称三取代“氮桥”吗啉基三乙二醇基酞菁锌的结构式为：/>
所述酞菁锌-酞菁锌偶联物的制备方法包括以下步骤：
(1)制备结构为的邻苯二甲腈偶联物：以三乙二醇与3-硝基邻苯二甲腈的原料为反应物，使用分子筛净化过的二甲亚砜为溶剂，在无水碳酸钾存在和氮气保护下，20-80℃下搅拌反应17-72小时，通过薄层色谱法监控，当3-硝基邻苯二甲腈基本消耗完毕时终止反应，通过溶剂法和柱层析法纯化目标产物；
(2)制备酞菁锌-酞菁锌偶联物：以步骤(1)制备的邻苯二甲腈偶联物以及上述制备的含有吗啉基的邻苯二甲腈衍生物为反应物，以正辛醇为溶剂，加入相应的氯化锌化合物，以1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯为催化剂，150-170℃下搅拌反应12-48小时，通过薄层色谱法监控反应终点，生成相应的锌酞菁，进而通过溶剂法或者色谱法纯化目标产物。
本发明所提供的二元酞菁可用于光动力药物、光热药物、光动力-光热联用药物、光敏药剂、光热药剂、光热成像试剂或光声成像试剂。所述光敏药剂，或简称光敏剂，或称光敏药物制剂，又称为光动力药剂。所述光热药剂，或简称光热剂，或称光热药物制剂，又称为光热药剂。所制备的光动力药物或光敏药剂可用于光动力治疗、光动力诊断或光动力消毒。所制备的光热药物或光热药剂可用于光热治疗、光热诊断或光动力消毒。所述的治疗可以是恶性肿瘤的治疗，或是良性肿瘤的治疗，或是白血病的骨髓体外净化治疗，或是非癌症疾病的治疗。所述的非癌症疾病，可以是细菌感染，或是口腔疾病，或是黄斑变性眼病，或是动脉硬化，或是创伤感染，或是皮肤病，或是病毒感染。所述的消毒可以是血液或血液衍生物的灭菌净化，或是水的灭菌消毒，或是医用或生活用器的消毒。
利用本发明所述的二元酞菁制备光敏(或光热)药剂的方法是：用水，或水和其它物质的混和溶液，其中其它物质的质量分数不高于10％，作为溶剂，溶解本发明所述的二元酞菁，配制成含一定浓度的光敏(或光热)药剂，二元酞菁的浓度不高于其饱和浓度；在制成的溶液中加入抗氧化剂、缓冲剂和等渗剂作为添加剂以保持光敏(或光热)药剂的化学稳定性和生物相容性。所述的其它物质是蓖麻油聚氧乙烯35醚、二甲亚砜、乙醇、甘油、N，N-二甲基甲酰胺、聚乙二醇300-3000、环糊精、葡萄糖、吐温、聚乙二醇单硬脂酸酯中的一种或几种的混和物。对于局部给药用的制剂，可以将本发明所述的二元酞菁溶解在渗透性溶剂中，或将其注入到软膏、洗液或凝胶中。所述渗透性溶剂优选5-35％(wt％)二甲亚砜的水溶液。
本发明所述二元酞菁在光动力(或光热)治疗、光动力(或光热)诊断、光动力(或光热)消毒和光动力(或光热)降解污染物中的应用，需配套适宜的光源，所述适宜的光源可以由普通光源连接合适的滤光片来提供或由特定波长的激光或LED灯或其他灯源来提供，光源的波长范围为600～900nm。
本发明的有益效果和突出优势是：
(1)在水中，本发明所述二元酞菁及其自组装体不但可产生有效的I型光敏反应而且可产生光热效应，因而可作为光敏剂、光热剂或光动力-光热联用药物，且其在作为光动力-光热联用药物时，可在近红外激光的照射及乏氧条件下产生较高量的超氧阴离子与明显的光热效应。其中，其所发挥的I型光敏机制是其他类型酞菁光敏剂不具有的。
(2)细胞实验证明，利用所述二元酞菁或其自组装体所制备的光动力-光热联用药物，在有氧与无氧条件下都具有较高的抗癌活性，显示了较高的光动力治疗和光热治疗协同效应。动物实验表明，所述二元酞菁或其自组装体具有良好的肿瘤靶向性和光动力-光热联合治疗效应，在乏氧肿瘤的治疗领域具有显著的应用前景。
(3)动物实验表明，所述二元酞菁或其自组装体能够被生物体通过肾脏清除并随尿液排出体外，显著提高了生物安全性。
(4)本发明所述二元酞菁可以在水中发生自组装，自组装体的形成可增强其I型光敏效率和光热效应。
(5)本发明二元酞菁的制备过程操作简单、性质稳定、便于储存、有利于在工业生产中大批量的制备，产业化前景良好。
附图说明
图1为实施例3和4所得二元酞菁(4μM)在N,N-二甲基甲酰胺、水以及1％CEL水溶液中的电子吸收光谱图。
图2为实施例3和4所得二元酞菁(10μM)在水中的粒径分布图以及粒径稳定性图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
周环不对称三取代“氮桥”吗啉基三乙二醇基锌酞菁的合成：
(1)邻苯二甲腈衍生物1的制备：
以3-硝基邻苯二甲腈(10mmol)和三乙二醇(10-40mmol，优选20mmol)为反应物，以二甲亚砜(DMSO)(20-100mL，优选30mL)为溶剂，在碳酸钾(30-90mmol，优选50mmol)存在和氮气保护下，20-45℃(优选45℃)下搅拌反应17-24小时，通过薄层色谱监控反应终点。反应结束后，将反应液用布什漏斗抽滤，旋蒸。少量二氯甲烷溶解过硅胶柱，以乙酸乙酯为洗脱剂，收集，旋蒸，干燥，得产物，产率为58％。
表征数据：1H NMR(300MHz,CDCl3,ppm):7.72-7.59(m,1H,Ar-H),7.37-7.26(m,2H,Ar-H),4.33-4.24(m,2H,CH2),3.90(dd,J＝5.2,4.0Hz,2H,CH2),3.75-3.70(m,2H,CH2),3.68-3.62(m,4H,CH2),3.59-3.54(m,2H,CH2).HRMS(ESI):m/z calcd for C14H17N2O4[M+H]+,277.1182；found 277.1187.Relative error:1.8ppm.HRMS(ESI):m/z calcd forC14H16N2O4Na[M+Na]+,299.1002；found 299.1008.Relative error:2.01ppm。
(2)邻苯二甲腈衍生物2的制备：
以3-硝基邻苯二甲腈(10mmol)和N-氨基乙基吗啉(10-40mmol，优选20mmol)为反应物，以二甲亚砜(DMSO)(20-100mL，优选30mL)为溶剂，在三乙胺(30-90mmol，优选50mmol)存在和氮气保护下，20-45℃(优选45℃)下搅拌反应17-24小时，通过薄层色谱监控反应终点。反应结束后，将反应液用，倒入200mL冰水混合物中，析出黄色沉淀。静置一夜，抽滤，以去离子水洗涤，收集滤饼，干燥后得淡黄色固体。二氯甲烷溶解，过硅胶，以二氯甲烷洗脱，收集有荧光吸收的组分，旋干，干燥，得产物，产率为38％。
表征数据：1HNMR(300MHz,CDCl3):7.56-7.39(m,1H,Ar-H),7.03(dd,J＝7.5,0.8Hz,1H,Ar-H),6.89(d,J＝8.7Hz,1H,Ar-H),5.82(s,1H,NH),3.82-3.74(m,4H,CH2),3.33-3.23(m,2H,CH2),2.76-2.68(m,2H,CH2),2.59-2.49(m,4H,CH2).HRMS(ESI):m/zcalcd for C14H17N4O[M+H]+,257.1402；found 257.1403.Relative error:0.39ppm。
(3)目标酞菁锌配合物的制备：将上述邻苯二甲腈衍生物1(1.0mmol)和邻苯二甲腈衍生物2(4-6mmol，优选5.0mmol)为反应物，以正辛醇(20-35mL，优选30mL)为溶剂，加入氯化锌(1-4mmol，优选2mmol)，以1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.4-1.2mL，优选0.6mL)为催化剂，150-170℃下搅拌反应12-48小时，通过薄层色谱监控反应终点，生成相应的锌酞菁配合物。反应结束后旋蒸至干，用少量N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，过硅胶柱，分别以体积比二氯甲烷：甲醇＝1:1为洗脱剂洗去杂质带，最后以DMF为洗脱剂洗下酞菁带并收集，旋蒸去除有机溶剂，加入少量的DMF溶解，过Bio-Beads S-X3型DMF凝胶柱，收集第一带酞菁带，加入少量的二氯甲烷溶剂溶解，倒入300mL的正己烷中析出抽滤，加入己烷冲洗后，干燥得产物，产率为21％。
表征数据：1H NMR(300MHz,DMSO,ppm):9.47(s,1H,Pc-Hα),9.18-8.83(m,3H,Pc-Hα),8.79-8.46(m,3H,Pc-Hα),8.19-7.80(m,5H,Pc-Hα),7.72(s,1H,OH),7.33(s,3H,NH),5.00(dd,J＝12.1,13.7Hz,4H,CH2),4.59(s,2H,CH2),4.39(s,2H,CH2),4.29-4.03(m,5H,CH2),3.78(dd,J＝10.2,11.6Hz,14H,CH2),3.68-3.54(m,5H,CH2),3.48-3.34(m,8H,CH2),3.12(s,4H,CH2),2.79(s,4H,CH2).HRMS(ESI):m/z calcd for C56H65N14O7Zn[M+H]+,1109.4446；found 1109.4457.Relative error:0.99ppm.HRMS(ESI):m/z calcd forC56H64N14O7ZnNa[M+Na]+,1131.4266；found 1131.4285.Relative error:1.68ppm。
实施例2
轴向不对称单羧基取代酞菁硅的合成：
按照现有专利(201410108985.X)进行合成，其具体步骤如下：
在氮气保护下，将二氯硅酞菁(100mg，0.164mmol)、对羟基苯丙酸(1.640-3.280mmol，优选4.920mmol)和NaH(0.01～0.02mmol，优选0.016mmol)加入到甲苯7-15ml(优选10ml)中，回流12-24小时(优选12小时)。真空旋转蒸发去除溶剂，水洗，得蓝色粗产物。粗产物加少量DMF溶解，过硅胶柱，以体积比DCM:EA＝1:10的混合溶剂为洗脱剂，洗下蓝色酞菁带，旋蒸将有机溶剂除去，加入少量的THF溶解，过Bio-Beads S-X3型凝胶柱，收集第一带蓝色酞菁带，旋蒸除去THF，同法(以单纯EA为洗脱剂收集酞菁带)再过一次硅胶柱，旋蒸除去有机溶剂，加入10mL的DMF溶解，再将其加入到150mL的去离子水中析出，抽滤，大量的去离子水洗涤，45℃烘干得产物，产率17％。
表征数据：1H NMR(400MHz,DMSO,ppm):9.81–9.63(m,8H,Pc-Hα),8.95(s,1H,OH),8.62–8.50(m,8H,Pc-Hβ),5.98(d,J＝8.0Hz,2H,Ar-H),5.45(d,J＝8.0Hz,2H,Ar-H),5.15(d,J＝8.0Hz,2H,Ar-H),2.25(d,J＝7.9Hz,2H,Ar-H),1.86(t,J＝8.0Hz,2H,CH2),1.65(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),0.19(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),-0.48(t,J＝7.5Hz,2H,CH2).HRMS(ESI):m/z calcd for C50H34N8O6Si[M]+,870.2365；found 870.2369。
实施例3
轴向不对称单羧基取代酞菁硅-周环不对称三取代“氮桥”吗啉基酞菁锌偶联物的合成：
将实施例2合成的轴向不对称单羧基取代酞菁硅(0.055mmol)以及实施例1合成的周环不对称三取代“氮桥”吗啉基三乙二醇基酞菁锌(0.055mmol)作为反应物，以EDCI(0.078-0.314mmol，优选0.157mmol)为缩合剂以及DMAP(0.102-0.410mmol，优选0.205mmol)为催化剂，以DMF(5-15mL，优选10mL)为溶剂，25-45℃下搅拌反应12-48小时，通过薄层色谱监控反应终点，待反应结束后，旋蒸除去反应液，加入少量的DCM溶解过硅胶柱，使用甲醇为洗脱液除去杂质带，用DMF洗下酞菁带，旋蒸除去有机溶剂，加入少量的DMF溶解，过Bio-Beads S-X3型凝胶柱，收集第一带蓝色酞菁带，旋蒸除去有机溶剂，加入少量的DCM溶解，加入大量的己烷析出抽滤，收集滤饼，真空抽干得产物，产率为29％。
表征数据：1H NMR(300MHz,DMSO,ppm):9.85-9.38(m,8H,Pc-Hα),9.16-8.86(m,6H,Pc-Hα,Pc-Hβ),8.76-8.31(m,8H,Pc-Hβ),8.16-7.95(m,4H,Pc-Hβ),7.85(s,1H,Pc-Hβ),7.74(s,1H,Pc-Hβ),7.64-7.30(m,3H,NH),5.96(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H),5.45(d,J＝8.2Hz,2H,Ar-H),5.13(d,J＝8.5Hz,2H,Ar-H),4.88(s,2H,CH2),4.39(s,4H,CH2),4.20(s,4H,CH2),4.07(s,4H,CH2),3.91-3.70(m,15H,CH2),3.60-3.49(m,9H,CH2),3.42(s,8H,CH2),3.08(dd,J＝7.3,4.7Hz,2H,CH2),2.26(d,J＝8.8Hz,2H,Ar-H),2.02(s,2H,CH2),1.72(d,J＝13.9Hz,2H,CH2),0.16(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),-0.53(t,J＝7.5Hz,2H,CH2).HRMS(ESI):m/zcalcd for C106H96N22O12SiZn[M]+,1960.6633；found 1960.6626.Relative error:0.36ppm。
实施例4
(1)邻苯二甲腈偶联物的制备：
以3-硝基邻苯二甲腈(10mmol)和三乙二醇(0-10mmol，优选5mmol)为反应物，以二甲亚砜(DMSO)(20-100mL，优选30mL)为溶剂，在碳酸钾(30-90mmol，优选50mmol)存在和氮气保护下，20-45℃(优选45℃)下搅拌反应17-24小时，通过薄层色谱监控反应终点。反应结束后，将反应液倒入200mL冰水混合物中，析出黄色沉淀。静置一夜，抽滤，以去离子水洗涤，收集滤饼，干燥后得白色固体，产率为35％。
表征数据：1H NMR(300MHz,CDCl3,ppm):7.72-7.53(m,2H,Ar-H),7.38-7.11(m,4H,Ar-H),4.28-4.22(m,3H,CH2),3.89(dd,J＝9.2,4.8Hz,3H,CH2),3.71-3.53(m,6H,CH2).HRMS(ESI):m/z calcd for C22H18N4O4Na[M+Na]+,425.1220；found425.1227.Relativeerror:1.65ppm。
(2)目标酞菁锌-酞菁锌偶联物的制备：将上述邻苯二甲腈偶联物(1.0mmol)和含有“氮桥”吗啉基邻苯二甲腈衍生物2(6.0-12.0mmol，优选10.0mmol)为反应物，以正辛醇(20-35mL，优选30mL)为溶剂，加入氯化锌(1-4mmol，优选2mmol)，以1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.4-1.2mL，优选0.6mL)为催化剂，150-170℃下搅拌反应12-48小时，通过薄层色谱监控反应终点，生成相应的锌酞菁配合物。反应结束后旋蒸至干，用少量N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，过硅胶柱，以体积比二氯甲烷：甲醇＝1:1为洗脱剂洗去杂质带，最后以DMF为洗脱剂洗下酞菁带并收集，旋蒸去除有机溶剂，加入少量的DMF溶解，过Bio-Beads S-X3型DMF凝胶柱，收集第一带酞菁带，加入少量的二氯甲烷溶剂溶解，倒入300mL的正己烷中析出抽滤，加入己烷冲洗后，干燥得产物，产率为21％。
表征数据：1H NMR(300MHz,DMSO,ppm):9.30-8.89(m,5H,Pc-Hα),8.87-8.54(m,5H,Pc-Hα,Pc-Hβ),8.45-7.93(m,8H,Pc-Hβ),7.84-7.30(m,6H,Pc-Hβ),4.58-4.29(m,10H,CH2),4.16-3.90(m,20H,CH2),3.87-3.67(m,14H,CH2),3.60-3.26(m,40H,CH2).HRMS(ESI):m/zcalcd for C106H114N28O10Zn2K[M+K]+,2105.7487；found 2105.7544.Relative error:2.71ppm。
实施例5
将实施例1-4所述制备的二元酞菁溶于DMSO中，配置成1mM的母液，利用紫外可见分光光度计测试它们在不同溶液中的分散状态，不同的溶液包括DMF、1％CEL以及纯水。详细的实验步骤可参照Eur.J.Med.Chem.,2016,114,380-389。
测试结果表明，实施例3与4所得二元酞菁在DMF以及1％CEL中的Q带为强而尖的峰，说明二元酞菁在DMF以及1％CEL中均是以单体的形式存在。但是在纯水中呈现出宽而矮的Q带，说明二元酞菁在纯水中是以聚集体形式存在的。分别见图1。
实施例6
利用粒度分布仪测定实施例3与4所制备的二元酞菁在水中的粒径分布情况以及粒径的稳定性。详细的实验步骤可参照J.Mater.Chem.B,2021,9,2845。
测试结果表明，实施例3与4所制备的二元酞菁(10μM)在水中均可以发生自组装，形成均一的纳米颗粒，并且所形成的纳米颗粒都具有较好的稳定性。实施例3所得酞菁硅-酞菁锌偶联物在水中形成的纳米颗粒的粒径大小为10nm左右，可以稳定存在7天；实施例4所得酞菁锌-酞菁锌偶联物在水中形成的纳米颗粒的粒径大小为25nm左右，可以稳定存在7天。分别见图2。
实施例7
将实施例1与2制备的酞菁锌与酞菁硅配合物以及实施例3与4所制备的二元酞菁分别溶于DMF，配置成1mM的母液，再分别稀释到去离子水中，测试它们的活性氧总量(ROS)。
活性氧总量测试采用水解的2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为荧光探针。DCFH-DA是一种常用于检测活性氧的探针，DCFH-DA能够被氧活化形成能在波长520nm处发射荧光信号的二氯荧光素。2,7-双氯荧光素蛋白乙酸盐(DCF)的制备方法是：将2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)溶解于甲醇配置成5mM的DCFH-DA溶液，-20℃保存。待测时，将DCFH-DA溶液与0.1mol/L的氢氧化钠溶液混合避光反应30min后，用pH 7.4的PBS溶液稀释成为浓度为200μM的母液。
在石英比色皿中配置总量为2mL的酞菁(4μM)和上述活化好的活性氧探针(5μM)的混合去离子水溶液，使用655nm的光(15mW/cm2)对比色皿进行照射，测定不同光照时间下活性氧探针荧光强度的变化情况(488nm激发，扫描范围在500nm-600nm处的荧光)。将522nm处的相对荧光强度(Ft-F0)与光照时间(T)作图，单位时间内Ft-F0的值越大说明产生ROS的能力越强。
实验结果见表1。
表1不同样品产生活性氧的总量对比
从表中可见，酞菁硅-酞菁锌偶联物产生ROS的能力最强，是实施例1所得酞菁锌的2.9倍，是实施例2所得酞菁硅的21.5倍；同时，酞菁硅-酞菁锌偶联物产生ROS的能力也显著高于常见光敏剂亚甲基蓝，是亚甲基蓝的2.2倍。
实施例8
将实施例1与2制备的酞菁锌与酞菁硅配合物以及实施例3与4所制备的二元酞菁分别溶于DMF，配置成1mM的母液，再分别稀释到去离子水中，测试它们在常氧条件下产生超氧阴离子(O2 ·-)的能力，以及实施案例3与4所制备的二元酞菁在缺氧条件下产生超氧阴离子(O2 ·-)的能力。测试过程中，采用常见光敏剂亚甲基蓝(MB)作为对照组。
采用二氢乙锭(DHE)作为检测超氧阴离子的探针。在超氧阴离子的存在下，DHE被氧化成溴化乙锭，再与四周的RNA或者DNA结合后，发出明亮的红色荧光(激发波长在500-510nm左右，发射波长在600nm左右)。荧光越强说明产生的超氧阴离子的量越多。具体的步骤为：在去离子水中加入所需测定的酞菁配合物及其二元酞菁偶联物(酞菁浓度为4μM)，DHE探针(25μM)，以及小牛胸腺DNA(250μg/mL)，混合均匀。测试开始时的荧光强度，之后使用波长655nm的光(光照密度为1mW/cm2)光照12min，使用荧光分度计来记录探针荧光强度的变化，以此来判断超氧阴离子的产生。
缺氧条件下的测试超氧阴离子的方法：测试前将所使用的净化水煮沸20min并超声以排除氧气，之后大量通入氮气以防氧气的进入，并使用上海雷磁JPB607A型便携式溶解氧测定仪对氧气含量进行检测，以检查水中的缺氧状态。选取提前备好的去氧水(氧气量1.0-2.5mg/L)，加入所需测定的二元酞菁(酞菁浓度为4μM)，DHE探针(25μM)，以及小牛胸腺DNA(250μg/mL)混合均匀后通入一定时间的氮气，密封，测试开始时的荧光强度，之后使用655nm的光(光照密度为1mW/cm2)光照12min，光照期间使用搭配好的装置继续通入氮气除氧，然后使用荧光分度计来记录探针荧光强度的变化，以此来判断超氧阴离子的产生。
实验结果见表2、3。
表2不同样品在常氧条件下产生超氧阴离子的荧光强度对比
表3不同样品在缺氧条件下产生超氧阴离子的荧光强度对比
从表2可见，在常氧条件下，酞菁硅-酞菁锌偶联物产生超氧阴离子的能力最高，且显著高于常见光敏剂MB(高了3.9倍)。
从表3可见，酞菁硅-酞菁锌偶联物在缺氧条件下也可高效产生超氧阴离子，产生能力与在有氧条件下接近，且显著高于常见光敏剂MB(高了2.8倍)。
以上实验结果表明，在酞菁光敏剂母体结构上引入吗啉基氮桥的酞菁锌，可使得偶联物具有显著的通过电子转移产生活性氧的能力，进而使得二元酞菁无论是在有氧条件还是在无氧条件下，均可有效产生超氧阴离子，并且两种情况下的荧光强度差距较小，表明超氧阴离子的产生与氧气的浓度无明显相关性。
实施例9
将实施例1与2制备的酞菁锌与酞菁硅配合物以及实施例3与4所制备的二元酞菁分别溶于DMSO，配置成1mM的母液，再分别稀释到去离子水中，测试它们产生光热的能力以及光热转换效率。
利用光热成像仪测试酞菁在纯水中以及在近红外光照射下的温度变化情况。使用去离子水将配置好的1mM的酞菁母液稀释至10μM，取100μL加入到96孔板中，使用808nm的激光照射(0.5W/cm2)并使用光热成像仪检测温度变化情况(测试期间最好保持室温条件大致相同且黑暗的条件下进行)。以常见光热剂ICG作为参照。光热转换效率实验条件与上述相一致，先测定光照10min的升温情况，再测试并记录下关闭光照时的降温情况(10min)，通过以温度(℃)与时间(t)作图，并依据相关文献(Chem.Sci.,2018,9,2098)计算出光热转换效率。
实验结果表明：实施例1与2制备的酞菁配合物以及实施例4所制备的酞菁锌-酞菁锌偶联物在水中几乎没有任何的光热效应，而实施例3所制备的酞菁硅-酞菁锌偶联物具有光热效应，光照下可以升至48.5℃，光热转换效率为15.6％。而参照物ICG的光热转换效率为5.6％。这说明酞菁硅-酞菁锌偶联物具有较高的光热效应，光热转换效率显著高于常见光热剂ICG。
实施例10
利用本发明所述的酞菁硅-酞菁锌偶联物制备光敏剂或光疗(光动力/光热治疗)药物的方法是：先将酞菁硅-酞菁锌偶联物使用DMF或DMSO溶解配置成1-2mM的母液，再使用水进行稀释，配置成一定浓度的药物水溶液。
本发明所制备的酞菁硅-酞菁锌偶联物光敏剂或者光疗药物，在应用过程中需要配套适宜的光源，适宜的光源可以用655nm和808nm激光等光源。
实施例11
测试酞菁硅-酞菁锌偶联物在常氧与乏氧条件下在人肝癌细胞HepG2和小鼠乳腺癌细胞4T1中产生超氧阴离子的情况以及光疗抗癌活性。
常氧与乏氧条件下细胞内超氧阴离子的测定：使用二氢乙锭(DHE)为探针检测细胞内的超氧阴离子的产生情况。在放置有洁净无菌盖玻片的培养板中接种处于对数生长期的4T1和HepG2细胞(每板细胞的数量约为1×105个)，分别在37℃、5％CO2(常氧)或者3％O2、5％CO2和92％N2(乏氧)进行培养，24h后移出培养液，并加入混合有二元酞菁硅-酞菁锌偶联物光敏剂的培养基(400μL)，继续培养2h。之后加入PBS缓冲溶液进行两次清洗，清洗掉含药物的培养基，再加入配置好的探针DHE继续孵育30min，使用波长655nm的光(光照密度为0.1W/cm2)对细胞光照30s，之后利用荧光共聚焦仪进行检测，激发波长为488nm，收集570-630nm的荧光信号。
将实施例3的酞菁硅-酞菁锌偶联物溶于DMF配置成1mM的母液，进而将其稀释到细胞培养液中，制成含不同浓度酞菁硅-酞菁锌偶联物的细胞培养液。在放置有洁净无菌盖玻片的培养板中接种处于对数生长期的4T1细胞(每板细胞的数量约为1×105个)，分别在37℃\5％CO2(常氧)或者3％O2，5％CO2和92％N2(乏氧)进行培养，24h后移出培养液，将癌细胞分别在含有不同浓度偶联物的培养液中培养2小时，之后弃培养液，用PBS缓冲溶液清洗细胞后，加入新的培养液(不含上述所述偶联物)。对于光照实验组，使用激发光光源为波长808nm(0.5W/cm2)和655nm(0.1W/cm2)的光对细胞分别进行光照射3分钟；对于不照光组，将细胞置于暗处6分钟。最后对于两组实验的细胞的存活率使用MTT法考察。详细实验步骤参见Eur.J.Med.Chem.,2018,155,24-33。
无论是在常氧还是在乏氧条件下，实施例3制备的酞菁硅-酞菁锌偶联物均能导致4T1和HepG2细胞内超氧阴离子荧光探针的响应，且常氧与乏氧条件下超氧阴离子探针荧光强度几乎一样，说明酞菁硅-酞菁锌偶联物在细胞能有效光敏产生超氧阴离子，且在乏氧条件下也能高效产生超氧阴离子。
实验结果还表明：在不进行光照时，实施例3所得酞菁硅-酞菁锌偶联物对4T1细胞均没有杀伤和生长抑制作用，表明上述酞菁硅-酞菁锌偶联物没有暗毒性。但经光照射后，实施例5-8所得酞菁硅-酞菁锌偶联物均显示出高的光动力抗癌活性，且呈现量效关系。以上结果说明本发明制备的酞菁硅-酞菁锌偶联物在常氧与乏氧条件下对4T1细胞均具有较高的光动力抗癌活性，IC50值(半数致死浓度，即杀死50％癌细胞所需的药物浓度)低至0.15μM。
实施例12
将实施例3的酞菁硅-酞菁锌偶联物溶于DMF，配置成1mM的母液，再用水进行稀释，制成浓度为200μM的光敏药剂水溶液。测试其对种有肝癌细胞(H22)的固体瘤的KM小鼠的荧光成像和光热成像情况。
对种有H22的荷瘤小鼠尾静脉注射100μL浓度为200μM的上述光敏药剂水溶液。使用小动物荧光成像仪监测上述药物在小鼠肿瘤部位的富集情况，24小时后对小鼠进行解剖，使用小动物荧光成像仪监测药物在小鼠各个组织器官的分布情况。详细实验步骤参见ACS Appl.Mater.Interfaces 2019,11,36435-36443。
对种有H22的荷瘤小鼠尾静脉注射100μL浓度为200μM的上述光敏药剂水溶液。使用光声成像仪监测上述药物在小鼠肿瘤部位的富集情况。详细实验步骤参见BioconjugateChem.2020,31,1438-1448。
在体荧光成像实验结果表明：实施例3的酞菁硅-酞菁锌偶联物显示出了较高的肿瘤靶向性。在静脉注射光敏剂1小时后，在肿瘤部位便可观察到荧光，在2小时达到峰值，而且只能在肿瘤部位看到荧光。24小时后，小鼠进行解剖获取各器官，并观察它们的荧光成像情况，发现除了小鼠的肿瘤部位可以观察到较为明显的荧光，其它各个器官组织中未发现明显的药物残留情况。
在光声实验结果表明：尾静脉注射光敏剂溶液后，肿瘤部位的光声信号强度逐渐增加，在静脉注射2小时后肿瘤部位的光声信号强度达到最大，之后肿瘤部位的光声信号强度逐渐降低。这也说明本发明所制备的酞菁硅-酞菁锌偶联物在小鼠体内具有较好在肿瘤部位富集。
实施例13
将实施例3的酞菁硅-酞菁锌偶联物溶于DMSO，配置成1mM的母液，再用水进行稀释，制成浓度为200μM的光敏药剂水溶液。测试其对种有肝癌细胞(H22)的固体瘤的KM小鼠的体内清除情况。
对种有H22的荷瘤小鼠尾静脉注射100μL浓度为200μM的上述光敏药剂水溶液。分别在2小时和24小时后对小鼠进行解剖，使用小动物荧光成像仪监测药物在小鼠各个组织器官的分布情况。详细实验步骤参见ACSAppl.Mater.Interfaces 2019,11,36435-36443。
对种有H22的荷瘤小鼠尾静脉注射100μL浓度为200μM的上述光敏药剂水溶液。分别在不同的时间段收集小鼠的尿液和粪便，使用小动物荧光成像仪监测药物在小鼠不同时间段的尿液和粪便的荧光情况，并使用高分辨质谱对小鼠的尿液进行表征。
体外器官荧光成像实验结果表明：在静脉注射光敏剂2小时后，在肝，脾，肺和肾脏上均可观察到明显的荧光信号。而24小时后，发现除了小鼠的肿瘤部位可以观察到较为明显的荧光，其它各个器官组织中未发现明显的药物残留情况。相较于2小时解剖小鼠的肝，脾，肺和肾脏荧光信号强度，24小时解剖小鼠的肝，脾，肺和肾脏的荧光强度值分别降低了2.5，3.7，6.9和6.2倍，说明实施例3的酞菁硅-酞菁锌偶联物在小鼠体内可以被清除。避免了治疗后药物富集所引起的潜在生物毒性，提高了生物安全性。
体外尿液荧光成像实验结果表明：在静脉注射光敏剂2小时后，小鼠的尿液中可以检测到有荧光，之后小鼠的尿液的荧光开始逐渐减弱。尾静脉注射24小时后，小鼠的尿液中无荧光，说明此时小鼠体内的药物已经随尿液几乎完全排出体外。此外在测试的时间段内，小鼠的粪便均无荧光，说明药物主要是通过肾脏清除，并随尿液排出体外。与此同时，高分辨质谱的检测到药物的信号峰，进一步说明药物主要是通过肾脏清除，并随尿液排出体外。
实施例14
测试实施例3的酞菁硅-酞菁锌偶联物光疗(光动力治疗/光热治疗)抗肿瘤效果。参照文献方法(ACS Appl.Mater.Interfaces 2019,11,36435-36443)建立皮下移植H22肝癌细胞的KM小鼠。将H22荷瘤KM小鼠分为8个实验组：单纯给药组，单纯PBS组，单纯655nm光照组，单纯808nm组，给药+655nm光照组，给药+808nm光照组，给药+808nm+655nm光照组，每组5只；给药+激光照射是待肿瘤长到60-100mm3大小时，静脉注射100μL浓度为200μM的二元酞菁硅-酞菁锌偶联物水溶液，然后在给药24小时后使用808nm的光655nm的光分别照射肿瘤部位5分钟，655nm的光照强度0.1W/cm2，808nm的光照强度为0.5W/cm2。将各组小白鼠按要求处理后，继续饲养小白鼠，隔日观察小鼠情况，测量小白鼠的体重，用游标卡尺测量肿瘤的长直径与短直径，一共测量14天。按照文献方法(ACSAppl.Mater.Interfaces 2019,11,36435-36443)计算抑瘤率。
使用小动物光热成像仪监测药物在小鼠尾静脉注射后光热治疗情况，分别使用655nm(光照强度0.1W/cm2)的光和808nm(光照强度0.5W/cm2)的光对小鼠的肿瘤部位连续照射5min，使用小动物光热成像仪连续监测小鼠肿瘤部位的温度变化情况。
实验结果显示：(1)单纯给药组，单纯PBS组，单纯655nm光照组，单纯808nm组对小鼠肿瘤均无抑制肿瘤生长效应(肿瘤增长了大约12倍)。(2)给药+655nm光照组显示了良好的抑制肿瘤生长的作用，抑瘤率可达53％(p<0.001)，给药+808nm+655nm光照组显示了极高的抑制肿瘤生长活性，抑瘤率高达88％(p<0.001)。由此进一步证明，两种光照下可有效引发光热效应和光动力效应，且给药+808nm+655nm组的极高抑瘤率应该是酞菁硅-酞菁锌偶联物的光动力治疗和光热效应协同作用的结果。(3)单纯给药组、给药+655nm光照组，给药+808nm光照组，给药+808nm+655nm光照组的小鼠在14天内体重呈增加趋势，说明酞菁硅-酞菁锌偶联物对小鼠均没有明显毒性，具有良好的生物相容性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种具有I型光敏反应和光热协同效应的二元酞菁，其特征在于：所述二元酞菁为酞菁硅-酞菁锌偶联物或酞菁锌-酞菁锌偶联物，其在水中能够发生自组装。
2.根据权利要求1所述的具有I型光敏反应和光热协同效应的二元酞菁，其特征在于：所述酞菁硅-酞菁锌偶联物具体为轴向不对称单羧基取代酞菁硅-周环不对称三取代“氮桥”吗啉基酞菁锌偶联物，其结构式为：
。
3.根据权利要求1所述的具有I型光敏反应和光热协同效应的二元酞菁，其特征在于：所述酞菁锌-酞菁锌偶联物具体为周环不对称三取代“氮桥”吗啉基酞菁锌-周环不对称三取代“氮桥”吗啉基酞菁锌偶联物，其结构式为：
。
4.一种如权利要求2所述的具有I型光敏反应和光热协同效应的二元酞菁的制备方法，其特征在于，所述的酞菁硅-酞菁锌偶联物的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备结构分别为和的含有吗啉基的邻苯二甲腈衍生物和含有三乙二醇基的邻苯二甲腈衍生物：以N-氨乙基吗啉或三乙二醇分别与3-硝基邻苯二甲腈的原料为反应物，使用分子筛净化过的二甲亚砜为溶剂，在三乙胺或者无水碳酸钾存在和氮气保护下，20-80 ℃下搅拌反应17-72小时，通过薄层色谱法监控，当3-硝基邻苯二甲腈基本消耗完毕时终止反应，分别通过溶剂法和柱层析法纯化目标产物；
（2）制备不对称取代“氮桥”吗啉基三乙二醇基锌酞菁：以步骤（1）制备的含有吗啉基的邻苯二甲腈衍生物以及含有三乙二醇基的邻苯二甲腈衍生物为反应物，以正辛醇为溶剂，加入相应的氯化锌化合物，以1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯为催化剂，150-170 ℃下搅拌反应12-48小时，通过薄层色谱法监控反应终点，生成相应的酞菁锌，进而通过溶剂法或者色谱法纯化目标产物；
（3）制备轴向不对称单羧基取代酞菁硅-周环不对称三取代“氮桥”吗啉基三乙二醇基酞菁锌偶联物：以轴向不对称单羧基取代硅酞菁和步骤（2）制备的周环不对称三取代“氮桥”吗啉基三乙二醇基酞菁锌为反应物，使用N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐为缩合剂、4-二甲氨基吡啶为催化剂，于25-45 ℃下搅拌反应12-48小时，通过薄层色谱法监控反应终点，再通过溶剂法或色谱法纯化目标产物，得到轴向不对称单羧基取代酞菁硅-周环不对称三取代“氮桥”吗啉基三乙二醇基酞菁锌偶联物；
其中，所用轴向不对称单羧基取代酞菁硅、周环不对称三取代“氮桥”吗啉基三乙二醇基酞菁锌、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:1.2~1:1.2~5.7:1.9~7.5；
所述轴向不对称单羧基取代硅酞菁的结构式为：，所述周环不对称三取代“氮桥”吗啉基三乙二醇基酞菁锌的结构式为：/>。
5.一种如权利要求2所述的具有I型光敏反应和光热协同效应的二元酞菁的制备方法，其特征在于，所述的酞菁锌-酞菁锌偶联物的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备结构分别为和的邻苯二甲腈偶联物和含有吗啉基的邻苯二甲腈衍生物：以三乙二醇或N-氨乙基吗啉分别和3-硝基邻苯二甲腈的原料为反应物，使用分子筛净化过的二甲亚砜为溶剂，在无水碳酸钾存在和氮气保护下，20-80 ℃下搅拌反应17-72小时，通过薄层色谱法监控，当3-硝基邻苯二甲腈基本消耗完毕时终止反应，分别通过溶剂法和柱层析法纯化目标产物；
（2）制备酞菁锌-酞菁锌偶联物：以步骤（1）制备的邻苯二甲腈偶联物以及含有吗啉基的邻苯二甲腈衍生物为反应物，以正辛醇为溶剂，加入相应的氯化锌化合物，以1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯为催化剂，150-170 ℃下搅拌反应12-48小时，通过薄层色谱法监控反应终点，生成目标酞菁锌-酞菁锌偶联物，进而通过溶剂法或者色谱法纯化目标产物。
6.一种如权利要求1所述的二元酞菁的应用，其特征在于：将所述二元酞菁用于制备光动力治疗和光热治疗协同作用的药物或光动力药物或光热药物或光敏剂或光敏药剂或光热成像试剂或光声成像试剂。
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