CN117343846A - 一种霉菌发酵辅助剂及其在干腌肉制品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种霉菌发酵辅助剂及其在干腌肉制品中的应用，属于食品发酵领域。本发明利用从宣威火腿中分离的具有较高中性蛋白酶和脂肪酶活性的鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10‑1和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8，增菌培养混合制成霉菌发酵辅助剂，并将其应用于发酵肉制品的制备过程中，使其在适当范围内既能提高发酵肉制品中醛类物质含量，促进肉制品在发酵过程中特征风味物质的形成，改善产品的风味；又能提高产品的水分活度，减缓脂肪氧化程度，促进蛋白质降解，从而提高发酵肉制品的品质。

Description

一种霉菌发酵辅助剂及其在干腌肉制品中的应用
技术领域
本发明涉及一种霉菌发酵辅助剂及其在干腌肉制品中的应用，属于食品发酵领域。
背景技术
干腌肉制品是我国一类典型的传统肉制品，具有悠久的生产历史。它是利用冬季的低温条件进行腌制，以猪后腿、猪肉或牛肉等畜肉为原料，经修整定形、上盐腌制、堆码翻压、洗晒整形、上挂风干等工序后，利用特定的气候条件进行风干成熟，形成独特的风味。具有代表性的产品有金华火腿、宣威火腿、如皋火腿及腊肉制品等干腌肉制品。产品具有肉质紧密坚实、色泽红白分明、滋味咸鲜可口、风味独特、便于携带运输和耐贮藏等特点。
传统干腌肉制品加工以自然发酵为主，碳水化合物、蛋白质和脂肪等大分子物质在微生物和内源酶的共同作用下发生降解，形成干腌肉制品特有风味或风味前体物质。由于自然发酵过程依赖于地理环境、气候、微生物群落等因素，导致干腌肉制品产生风味不稳定、特征香气不足、生产周期长、易受杂菌污染等问题，难以保障产品质量。因此，利用现代微生物技术制备发酵剂，实现对肉制品发酵过程的人工控制及工业化生产，不仅提高了产品食用安全性和风味质量，而且能克服自然发酵过程时间过长，难以控制的缺点。霉菌是近年来制备发酵肉制品的一种微生物，因其生长特性，常接种于产品表面，使产品表面生成一层菌丝，减少杂菌接触食品，阻碍其它有害微生物的生长，减少腐败现象的发生；霉菌还可以降低食品水分的挥发，提高产品的水分活度；霉菌生长需要氧，可以隔绝和消耗产品内部的氧，抑制氧化反应的产生，防止酸败；霉菌生长代谢产生的多种酶类，可以降解蛋白质和脂肪，可以产生更多的风味物质，丰富发酵肉制品的风味，改善产品的品质。
陈杰(金华火腿成熟过程中霉菌生长与其品质关系，食品与发酵工业，2009，35(08))将纳地青霉(Penicillium nalgiovense)制成发酵剂接种至火腿中，并以自然发酵的火腿为对照，研究霉菌生长对火腿品质的影响，结果发现接种霉菌的样品风味及其品质显著提高。李开雄等(霉菌在发酵香肠中的应用，肉类工业，2004，(12))研究表明发酵香肠中添加霉菌，无论是从感官评定，还是从丙二醛(TBA)含量来判断，其品质都要优于未接霉菌的发酵香肠。霉菌虽然可以改善发酵肉制品风味，但是有一些霉菌会产生对人体生命安全产生威胁的毒性物质，对人体健康造成危害。因此在发酵肉制品中接种霉菌要谨慎对待，在用于发酵食品的制作时必须经过严格的安全认证与检测。
宣威火腿作为我国三大名腿之一，其生产历史悠久。传统生产的宣威火腿以肉质厚、精肉多、蛋白丰富、鲜嫩可口、咸淡相宜、食而不腻而享有盛名。按宣威人民腌制火腿的传统工艺腌制、风干、发酵、生长绿霉，次年中秋季节成熟。正是由于其特有的加工工艺，加上宣威地区独特的自然环境和气候条件，最终才形成了宣威火腿特有的风味品质。宣威火腿优良品质的形成与其成熟过程中微生物的作用分不开，尤其一些产香菌是发酵肉制品优良风味的保证。传统的发酵肉制品中，发酵微生物主要来自原料和周围环境，这些微生物在肉制品的风味形成和安全性方面发挥着各自独特的作用。而葡萄球菌和微球菌的代谢活动以及火腿表面大量霉菌的生长是宣威火腿独特风味形成的基础，是宣威火腿独特风味和优良品质的保证。因此，发现并制备能改善云南宣威干腌肉制品风味及品质的霉菌发酵剂是实现宣威特色干腌肉制品可控生产亟待解决的关键技术问题。
发明内容
本发明提出一种霉菌发酵辅助剂；利用其可以水解蛋白质、降解脂肪，促进肉制品在发酵干腌过程中特征风味物质的形成，提高其相对含量，最终改善产品的风味品质。另外，通过接种霉菌，使其在肉表形成一层微生物“保护膜”，可以减少水分的挥发，提高产品的水分活度。
用于发酵肉制品的霉菌中常见的不产毒素的霉菌是产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)和纳地青霉(Penicillium nalgiovense)，其是在成熟前在产品表面接种霉菌孢子悬浮液，霉菌可在产品表面密集、良好生长且抑制有害微生物；不仅赋予产品特有的外观；更重要的是能使产品阻氧避光和抗酸败，分解脂肪和蛋白质，从而利于产品特有风味的形成(《现代食品微生物学》吴祖芳2017，(342～346)。
本发明提供了一种霉菌发酵辅助剂，所述霉菌发酵辅助剂的菌株包括鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和所述褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8；所述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8均从宣威火腿中分离。
本发明提供了一株所述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1，所述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1已于2023年08月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231436。
本发明提供了一株褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8，所述褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8已于2023年08月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20231437。
本发明提供了一种霉菌发酵辅助剂，所述霉菌发酵辅助剂中含有所述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1或其发酵液，和/或所述褐藻青霉(Penicilliumfuscoglaucum)V8或其发酵液。
在本发明的一种实施方式中，所述霉菌发酵辅助剂中，所述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8是按照活菌数比例为(1×107～1×108):(1×107～1×108)进行混合后得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8是按照活菌数比例为1:1进行混合后得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述霉菌发酵辅助剂中，活菌总数为2×107～2×108CFU/mL。
本发明还提供了上述霉菌发酵辅助剂的制备方法，所述方法为，分别将所述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8的菌种转接，连续活化2次后，以0.01～0.08％的接种量接种于PDB液体培养基中，摇床培养，制备出鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1菌种浓缩液和褐藻青霉(Penicilliumfuscoglaucum)V8菌种浓缩液，混合所述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1菌种浓缩液和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8菌种浓缩液制得所述霉菌发酵辅助剂。
本发明还提供了上述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1，和/或褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8，和/或上述霉菌发酵辅助剂在发酵肉制品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵肉制品为人食用的发酵肉制品。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵肉制品包括但不限于：干腌猪肉、干腌牛肉、干腌羊肉。
在本发明的一种实施方式中，霉菌发酵辅助剂中，所述鲁本斯青霉(Penicilliumrubens)W10-1和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8是按照活菌数比例为(1×107～1×108)：(1×107～1×108)进行混合后得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8是按照活菌数比例为1:1进行混合后得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述霉菌发酵辅助剂中，活菌总数为2×107～2×108CFU/mL。
本发明还提供了一种提高发酵肉制品风味物质、水分活度的方法，所述方法为，将上述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1，和/或褐藻青霉(Penicilliumfuscoglaucum)V8，和/或上述霉菌发酵辅助剂接种至发酵肉制品表面进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵肉制品为人食用的发酵肉制品。
在本发明的一种实施方式中，所述霉菌发酵辅助剂中，所述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8是按照活菌数比例为(1×107～1×108)：(1×107～1×108)进行混合后得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8是按照活菌数比例为1:1进行混合后得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述霉菌发酵辅助剂中，活菌总数为2×107～2×108CFU/mL。
本发明还提供了一种发酵肉制品的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)原料肉的选择和修整：选择检验合格的后腿肉肉块，用刀修割肉上的疏松结缔组织，削去两边多余的肥肉和腿皮；
(2)腌制：将5％的盐由下而上，由皮面到肉面，均匀涂抹揉搓在后腿肉肉块上，排除血水，上盐后将肉块堆叠于温度为4℃，相对湿度为80％～90％的腌制室内腌制3天；
(3)清洗：腌制完成后将肉块表面清洗干净，去除表面盐分和污物；
(4)风干：将肉块悬挂于温度为10～15℃，相对湿度为45％～60％的风干室内风干3天；
(5)发酵前期：将风干完成后的肉块置于温度为15～25℃，相对湿度为55％～70％的发酵室中发酵15天；
(6)接种霉菌发酵辅助剂：将霉菌发酵辅助剂均匀喷淋涂抹在肉块的表面；
(7)发酵中期：将接种霉菌发酵辅助剂的肉块置于温度为25～30℃，相对湿度为70％～80％的发酵室发酵30天；
(8)发酵后期：将涂菌发酵结束后的肉块放在温度为25～10℃，相对湿度为70％～60％的发酵室中发酵20天至成熟。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵肉制品原料为肉块时，腌制时间为3天，风干时间为3天，发酵前期时间为15天，发酵中期时间为30天，发酵后期时间为20天。
有益效果
(1)本发明利用从宣威火腿中筛选出的霉菌，在干腌肉制品发酵过程中添加具有较高中性蛋白酶和脂肪酶活性的霉菌发酵辅助剂，利用协同作用，以及对产品风味的贡献，生产一种营养健康、风味品质高的具有独特风味的发酵肉制品。
(2)本发明提供的霉菌发酵辅助剂，可以促进醛类物质的产生。醛类物质通常具有脂肪味、青草味和果香，在干腌肉制品风味的形成中起重要作用，被称为发酵肉制品独特风味的主要贡献者。
(3)本发明提供的霉菌发酵辅助剂，可以提高蛋白质降解的能力，促进风味物质产生，提高产品品质。
(4)本发明采用微生物发酵，利用霉菌作为发酵辅助剂，应用于火腿和干腌肉等发酵干腌肉制品中。一方面，利用其可以减少脂肪氧化，促进肉制品在发酵干腌过程中特征风味物质的形成，增加风味物质的含量。另一方面，可以增加蛋白质降解的能力，减少水分的挥发，提高产品的水分活度，改善产品品质。
(5)本发明提供的霉菌发酵辅助剂均具生物安全性，不产真菌毒素。
(6)本发明利用霉菌发酵辅助剂生产的干腌肉制品，其发酵性能优良，产品肉质紧实颜色均匀，滋味咸鲜可口，可接受度较高，能满足消费者对口感和营养的需求。
生物材料保藏
一株鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1，分类学命名为鲁本斯青霉W10-1Penicillium rubens W10-1，已于2023年08月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231436，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
一株褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8，分类学命名为褐藻青霉V8Penicillium fuscoglaucum V8，已于2023年08月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231437，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1为鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1平板及镜检图。
图2为褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8平板及镜检图。
图3为实施例4～9和对照例1干腌肉制品不同霉菌发酵辅助剂的水分活度；其中，图中的a、b、c和d代表不同的处理之间具有显著性差异(P<0.05)。
图4为实施例4～9和对照例1干腌肉制品不同霉菌发酵辅助剂的硫代巴比妥酸反应产物值(TBARS)；其中，图中的a、b、c和d代表不同的处理之间具有显著性差异(P<0.05)。
图5为实施例4～9和对照例1干腌肉制品不同霉菌发酵辅助剂的蛋白降解指数(PI)；其中，图中的a、b、c、d和e代表不同的处理之间具有显著性差异(P<0.05)。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。下述实施例中所涉及的鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W12-2，是发明人从宣威火腿中分离得到的。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
液体PDB培养基：葡萄糖1.0g、酵母膏1.0g、蛋白胨2.0g、(NH4)2SO4 1.0g、K2HPO41.0g、MgSO4.7H2O 0.1g、FeSO4.7H2O 0.01g、蒸馏水1L。将各成分溶解于蒸馏水中，用NaOH溶液校正pH至5.6，121℃高压灭菌15min。
固体PDA培养基：葡萄糖1.0g、酵母膏1.0g、蛋白胨2.0g、(NH4)2SO4 1.0g、K2HPO41.0g、MgSO4.7H2O 0.1g、FeSO4.7H2O 0.01g、琼脂15.0g、蒸馏水1L。将各成分溶解于蒸馏水中，用NaOH溶液校正pH至5.6，121℃高压灭菌15min。
液体PDB培养基分别用于鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8的活化、培养和制备发酵剂，固体PDA培养基用于鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8的短期保存、活化和平板计数。用于短期保存、培养鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8的液体PDB培养基和固体PDA培养基，是半选择性培养基，其成分配比已经趋于成熟、稳定。
下述实施例涉及到的检测和评定方法：
水分活度(Aw)测定：
参照GB 5009.238-2016《食品安全国家标准食品中水分活度的测定》。
硫代巴比妥酸反应产物值(TBARS)的测定：
取2g样品加入3mL硫代巴比妥酸溶液和17mL三氯乙酸-盐酸溶液，混匀后，沸水浴中反应30min，冷却。取5mL上清液加入等体积的氯仿，3000rpm下离心10min，532nm下读取吸光值。TBARS值以每千克脂质氧化样品中丙二醛的毫克数数表示。
计算公式如下：
式中A532为溶液的吸光值；m为样品的质量；9.48为常数。
蛋白降解指数(PI)的测定：
取0.7g样品与7mL蒸馏水混匀并在8000rpm条件下均质30s。取提取液150μL，用600μL12.5％三氯乙酸(TCA)稀释至蛋白沉淀。在4℃2000rpm离心10min，取上清液300μL用300μL2mM NaOH中和，使得溶液最终pH为9.0，加入180μL荧光胺(0.6mg/mL溶解于丙酮)，25℃避光反应1h，分别以375nm和475nm作为激发和发射波长。用三氯乙酸处理前的原液浓度为基准，测定氨基酸水平N端肉制品a-氨基的水平，以每克肉制品的甘氨酸当量g表示(A)，在TCA处理前，均质液中的总蛋白浓度用BCA试剂盒测定，结果以每克肉制品所含蛋白质的克数表示(B)。
挥发性风味物质的测定：
气相色谱-质谱(GC-MS)法，将样品置于顶空瓶中，加入1,2-二氯苯(100mg/L)作为内标，用聚四氟乙烯(PTFE)硅胶隔垫片密封。在45℃水浴摇床中平衡10min，选用二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)纤维头，将其暴露在顶空瓶的顶空在45℃萃取30min。最后，采用气相色谱-质谱联用仪定性和定量。设置GC-MS参数条件：GC条件：DB WAX色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)，氦气(99.999％)，流速1mL·min-1，进样口温度250℃，SPME纤维头GC进样口解吸5min，分流模式进样，分流比5:1。色谱柱初始温度为40℃，保持2min，以3℃/min升至90℃，保持5min，再以3℃/min升至200℃，最后以15℃/min升至230℃，保持10min。MS条件：电轰击离子源(EI)，电子能量70ev，离子源温度230℃，采用全扫描模式采集信号，质量扫描范围45～450aum。根据化合物的保留时间，通过与NIST 21质谱库进行检索，以及线性保留指数(LRI)对化合物进行定性分析，配合手动检索筛选相似度大于90％的化合物，对化合物进行半定量。通过与内标面积比较，计算各化合物的含量。每个样品测量3个重复，最终结果以干基计算。
感官评定：
选择10位专业人士对干腌肉制品进行感官评价。采用九点快感标度法，1＝极端厌恶；2＝非常厌恶；3＝一般厌恶；4＝稍微厌恶；5＝既不喜欢也不厌恶；6＝稍微喜欢；7＝一般喜欢；8＝非常喜欢；9＝极端喜欢，分别对肉制品的色泽、质地、滋味、气味、总体接受度进行评定。将肉制品切成2～3mm的薄片，然后在感官评价室进行评价。评价过程中要去除外界干扰，参与人士之间不得进行交流。当品评完一个样品后，用清水漱口，再进行下一个样品的评价。将分数汇总，计算平均值和误差值，分析其品质。
实施例1：菌种的分离、鉴定
具体步骤如下：
(1)霉菌的富集培养
本发明所用菌种从宣威火腿中分离所得。在超净工作台中用灭过菌的剪刀取5g火腿，剪碎，放入灭菌的装有9mL 0.9％生理盐水的试管中，使用摇床于25℃、250rpm条件下培养30min。然后将溶液分别稀释10-3、10-4、10-5倍，取100μL稀释液用涂布棒涂布于PDA固体培养基上，静置30min后，将平板在28℃恒温培养箱中倒置培养48h。
(2)菌种的分离纯化
观察记录PDA固体培养基上菌落的生长形态，挑取其中生长状况好的菌落，分别在平板上划线分离纯化，直到出现单菌落且整个平板和镜下观察菌落形态一致，然后测定菌株的生理生化指标。在-80℃条件下，利用甘油保存纯化的菌种。
(3)菌种的鉴定
霉菌基因组DNA提取：用植物基因组DNA抽提试剂盒提取霉菌DNA，提取产物用引物ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)和ITS5(5′-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAGG-3′)进行PCR扩增。扩增结束后，对PCR产物进行测序，测序结果通过NCBI数据库进行BLAST比对分析。
鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1的ITS序列如SEQ ID NO.1所示；褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8序列的ITS序列如SEQ ID NO.2所示。
霉菌发酵辅助剂包括鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8，其镜检图见图1和图2。
实施例2：霉菌发酵辅助剂的制备
具体步骤如下：
(1)鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1、褐藻青霉(Penicilliumfuscoglaucum)V8和鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W12-2的种子液的制备：
分别挑取鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1、鲁本斯青霉(Penicilliumrubens)W12-2和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8单菌落，接种至装有10mL的PDB液体培养基的试管中，使用摇床于28℃、180rpm条件下培养24h，按照上述方法连续活化2次后，分别制备得到种子液；
分别将得到的种子液再进行扩大培养，即将得到的种子液，按照2％(v/v)的接种量，接种至PDB液体培养基中，在28℃条件下培养至所述青霉菌的对数生长期(培养72h)，分别制备得到菌液；
分别将制备得到的菌液置于4℃离心机内，以5000rpm离心10min，弃去上清液，添加等量无菌水，分别得到所述鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1、鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W12-2和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8的浓缩液，分别检测得到的鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1浓缩液、鲁本斯青霉(Penicilliumrubens)W12-2浓缩液和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8浓缩液中的活菌数，分别为：1×107～1×108CFU/mL。
(2)复合霉菌发酵辅助剂的制备
分别将上述得到的鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1浓缩液和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8浓缩液按照活菌数为：1:1的比例进行混合，制得所述霉菌复合发酵辅助剂1：鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1+褐藻青霉(Penicilliumfuscoglaucum)V8，检测霉菌复合发酵辅助剂中的活菌数，为：2×107～2×108CFU/mL；
分别将上述得到的鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W12-2浓缩液和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8浓缩液按照活菌数为：1:1的比例进行混合，制得所述霉菌复合发酵辅助剂2：鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W12-2+褐藻青霉(Penicilliumfuscoglaucum)V8，检测霉菌复合发酵辅助剂中的活菌数，为：2×107～2×108CFU/mL；
分别将上述得到的鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1浓缩液、鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W12-2浓缩液和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8浓缩液按照活菌数为：1:1:1的比例进行混合，制得所述霉菌复合发酵辅助剂3：鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1+鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W12-2+褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8，检测霉菌复合发酵辅助剂中的活菌数，为：3×107～3×108CFU/mL。
实施例3：霉菌发酵辅助剂安全性评价
根据推荐性农业行业标准NY/T 3803-2020，采用串联质谱法检测霉菌发酵辅助剂是否产生常见的37种真菌毒素。
具体方法如下：
将上述实施例2制备得到的霉菌发酵辅助剂分别以2％(v/v)的接种量，接种至PDB液体培养基中，在28℃条件下培养至所述霉菌发酵辅助剂的对数生长期(培养72h)，分别制备得到菌液后，在进行毒素的检测，结果如表1所示。
表1：霉菌发酵辅助剂安全性评价
结果显示，这三种霉菌发酵辅助剂的检测结果如表1所示，均未检出常见真菌毒素，可见使用的霉菌安全无毒性。
实施例4：添加鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1+褐藻青霉(Penicilliumfuscoglaucum)V8制备发酵干腌肉制品
具体步骤如下：
(1)选择检验合格的后腿肉肉块，用刀修割肉上的疏松结缔组织，削去两边多余的肥肉和腿皮。将5％的盐由下而上，由皮面到肉面，均匀涂抹揉搓在后腿肉肉块上进行腌制，排除血水。上盐后将肉块堆叠于温度为4℃，相对湿度为80％～90％的腌制室内腌制3天。腌制完成后将肉块表面清洗干净，去除表面盐分和污物后，将肉块悬挂于温度为10～15℃，相对湿度为45％～60％的风干室内风干3天。
(2)将风干完成后的肉块置于温度为15～25℃，相对湿度为55％～70％的发酵室中发酵15天；
(3)将实施例2制备得到的霉菌复合发酵辅助剂1，均匀喷淋涂抹在发酵前期结束后的肉块表面后，置于温度为25～30℃，相对湿度为70％～80％的发酵室发酵30天；
将发酵中期结束后的肉块置于温度为25～10℃，相对湿度为70％～60％的发酵室中发酵20天至成熟。
得到干腌肉制品。
实施例5：仅添加鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1制备发酵干腌肉制品
具体步骤如下：
(1)选择检验合格的后腿肉肉块，用刀修割肉上的疏松结缔组织，削去两边多余的肥肉和腿皮。将5％的盐由下而上，由皮面到肉面，均匀涂抹揉搓在后腿肉肉块上进行腌制，排除血水。上盐后将肉块堆叠于温度为4℃，相对湿度为80％～90％的腌制室内腌制3天。腌制完成后将肉块表面清洗干净，去除表面盐分和污物后，将肉块悬挂于温度为10～15℃，相对湿度为45％～60％的风干室内风干3天。
(2)将风干完成后的肉块置于温度为15～25℃，相对湿度为55％～70％的发酵室中发酵15天；
(3)将实施例2制备得到的鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1种子液(菌浓为：1×107～1×108CFU/mL)均匀喷淋涂抹在发酵前期结束后的肉块表面后，置于温度为25～30℃，相对湿度为70％～80％的发酵室发酵30天；
将发酵中期结束后的肉块置于温度为25～10℃，相对湿度为70％～60％的发酵室中发酵20天至成熟。
得到干腌肉制品。
实施例6：仅添加褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8制备发酵干腌肉制品
具体步骤如下：
选择检验合格的后腿肉肉块，用刀修割肉上的疏松结缔组织，削去两边多余的肥肉和腿皮。将5％的盐由下而上，由皮面到肉面，均匀涂抹揉搓在后腿肉肉块上进行腌制，排除血水。上盐后将肉块堆叠于温度为4℃，相对湿度为80％～90％的腌制室内腌制3天。腌制完成后将肉块表面清洗干净，去除表面盐分和污物后，将肉块悬挂于温度为10～15℃，相对湿度为45％～60％的风干室内风干3天。
将风干完成后的肉块置于温度为15～25℃，相对湿度为55％～70％的发酵室中发酵15天；
将实施例2制备得到的褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8种子液(菌浓为：1×107～1×108CFU/mL)均匀喷淋涂抹在发酵前期结束后肉块的表面后，置于温度为25～30℃，相对湿度为70％～80％的发酵室发酵30天；
将发酵中期结束后的肉块置于温度为25～10℃，相对湿度为70％～60％的发酵室中发酵20天至成熟。
得到干腌肉制品。
实施例7：仅添加鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W12-2制备发酵干腌肉制品
具体步骤如下：
选择检验合格的后腿肉肉块，用刀修割肉上的疏松结缔组织，削去两边多余的肥肉和腿皮。将5％的盐由下而上，由皮面到肉面，均匀涂抹揉搓在后腿肉肉块上进行腌制，排除血水。上盐后将肉块堆叠于温度为4℃，相对湿度为80％～90％的腌制室内腌制3天。腌制完成后将肉块表面清洗干净，去除表面盐分和污物后，将肉块悬挂于温度为10～15℃，相对湿度为45％～60％的风干室内风干3天。
将风干完成后的肉块置于温度为15～25℃，相对湿度为55％～70％的发酵室中发酵15天；
将实施例2制备得到的鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W12-2种子液(菌浓为：1×107～1×108CFU/mL)均匀喷淋涂抹在发酵前期结束后的肉块表面后，置于温度为25～30℃，相对湿度为70％～80％的发酵室发酵30天；
将发酵中期结束后的肉块置于温度为25～10℃，相对湿度为70％～60％的发酵室中发酵20天至成熟。
得到干腌肉制品。
实施例8：添加鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W12-2+褐藻青霉(Penicilliumfuscoglaucum)V8制备发酵干腌肉制品
具体步骤如下：
选择检验合格的后腿肉肉块，用刀修割肉上的疏松结缔组织，削去两边多余的肥肉和腿皮。将5％的盐由下而上，由皮面到肉面，均匀涂抹揉搓在后腿肉肉块上进行腌制，排除血水。上盐后将肉块堆叠于温度为4℃，相对湿度为80％～90％的腌制室内腌制3天。腌制完成后将肉块表面清洗干净，去除表面盐分和污物后，将肉块悬挂于温度为10～15℃，相对湿度为45％～60％的风干室内风干3天。
将风干完成后的肉块置于温度为15～25℃，相对湿度为55％～70％的发酵室中发酵15天；
将实施例2制备得到的复合发酵辅助剂2，均匀喷淋涂抹在发酵前期结束后肉块的表面后，置于温度为25～30℃，相对湿度为70％～80％的发酵室发酵30天；
将发酵中期结束后的肉块置于温度为25～10℃，相对湿度为70％～60％的发酵室中发酵20天至成熟。
得到干腌肉制品。
实施例9：添加鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1+鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W12-2+褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8制备发酵干腌肉制品
具体步骤如下：
选择检验合格的后腿肉肉块，用刀修割肉上的疏松结缔组织，削去两边多余的肥肉和腿皮。将5％的盐由下而上，由皮面到肉面，均匀涂抹揉搓在后腿肉肉块上进行腌制，排除血水。上盐后将肉块堆叠于温度为4℃，相对湿度为80％～90％的腌制室内腌制3天。腌制完成后将肉块表面清洗干净，去除表面盐分和污物后，将肉块悬挂于温度为10～15℃，相对湿度为45％～60％的风干室内风干3天。
将风干完成后的肉块置于温度为15～25℃，相对湿度为55％～70％的发酵室中发酵15天；
将实施例2制备得到的复合发酵辅助剂2，均匀喷淋涂抹在发酵前期结束后肉块的表面后，置于温度为25～30℃，相对湿度为70％～80％的发酵室发酵30天；
将发酵中期结束后的肉块置于温度为25～10℃，相对湿度为70％～60％的发酵室中发酵20天至成熟。
得到干腌肉制品。
对照例1：自然发酵制备干腌肉制品
选择检验合格的后腿肉肉块，用刀修割肉上的疏松结缔组织，削去两边多余的肥肉和腿皮。将5％的盐由下而上，由皮面到肉面，均匀涂抹揉搓在后腿肉肉块上进行腌制，排除血水。上盐后将肉块堆叠于温度为4℃，相对湿度为80％～90％的腌制室内腌制3天。腌制完成后将肉块表面清洗干净，去除表面盐分和污物后，将肉块悬挂于温度为10～15℃，相对湿度为45％～60％的风干室内风干3天。
将风干完成后的肉块置于温度为15～25℃，相对湿度为55％～70％的发酵室中发酵15天；
将发酵前期结束后的肉块置于温度为25～30℃，相对湿度为70％～80％的发酵室发酵30天；
将发酵中期结束后的肉块置于温度为25～10℃，相对湿度为70％～60％的发酵室中发酵20天至成熟。
得到干腌肉制品。
实施例10：基于霉菌发酵辅助剂的干腌肉制品的水分活度
具体方法为：
分别将实施例4～9和对照例1制备得到的样品切成约小于3mm×3mm×3mm的小块，混匀后置于水分活度仪的检测器皿内检测，每个样品检测10min，至少做3次平行。
水分活度(Aw)是评价肉制品水分自由度的重要指标，一般情况下，干腌肉制品成品的水分活度均在0.750左右，但水分活度过低，则会加速脂肪的氧化酸败，结果如图3所示。
结果显示，由图3可以看出，喷淋涂抹了鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和/或褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8的实施例4～6的肉制品Aw分别为0.733、0.734、0.733，其显著高于实施例7～9和对照例1。
这是由于喷淋了鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和或褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8，肉制品表面形成一层菌丝，水分损失速度慢且损失量少，从而水分活度较高，在有效范围内，水分活度高有利于风味的形成。
实施例11：基于霉菌发酵辅助剂干腌肉制品的硫代巴比妥酸反应产物值(TBARS值)
分别取2g实施例4～9和对照例1制备得到的样品加入配好的溶液，经过一系列反应，532nm下读取吸光值。通过公式计算TBARS值。
TBARS值是评价脂肪氧化程度的重要指标。在肉制品的成熟过程中，会不断发生脂肪的氧化，脂肪氧化水解后产生的挥发性物质形成了肉制品独特的风味。国家标准规定在国家限量范围内TBARS值≤1mg/kg，脂肪氧化程度较轻，肉制品品质较好，结果如图4所示。
结果显示，由图4可以看出，喷淋涂抹了鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和/或褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8的实施例4～6的TBARS值分别为0.744、0.798、0.774，均低于实施例7～9和对照例1(1.288)，尤其是添加鲁本斯青霉(Penicilliumrubens)W10-1+褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8的实施例4，其表现出最低的TBARS值，说明鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和/或褐藻青霉(Penicilliumfuscoglaucum)V8霉菌发酵辅助剂有助于降低发酵肉制品的脂肪氧化程度，即减轻其哈败程度，同时也说明其具有更好的抗脂肪氧化的能力。
实施例12：基于霉菌发酵辅助剂的干腌肉制品的蛋白降解指数(PI)
取实施例4～9和对照例1的0.7g样品与7mL蒸馏水混匀均质，均质液中的总蛋白浓度用BCA试剂盒测定，取提取液加入配好的溶液分别以375nm和475nm作为激发和发射波长，测定氨基酸水平N端肉制品α-氨基的水平，以每克肉制品的甘氨酸当量g表示(A)，在TCA处理前，结果以每克肉制品所含蛋白质的克数表示(B)。
蛋白质水解通过分解肌肉结构来改善干腌肉制品的口感和风味。PI通常用于评价干腌肉制品加工过程中蛋白质水解的强度。高品质意大利和西班牙干腌火腿的PI分别在22％～30％和33％～36％之间，而金华火腿的PI在14％～20％之间，结果如图5所示。
结果显示，由图5可知，实施例4～9和对照例1的PI值均小于14％，蛋白水解程度较低，
因此，PI越高越有利于香气和滋味的形成。
喷淋涂抹了鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和/或褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8的实施例4～6的PI分别为10.55％、8.84％和11.28％，均高于实施例7～9(8.68％、8.10％、7.73％)和对照例1(7.30％)，尤其是添加鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1+褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8和褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8的实施例4和6，其表现出较高的PI值，说明鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和/或褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8霉菌发酵辅助剂促进肉制品蛋白质降解，能促进产生更好的风味。
实施例13：基于霉菌辅助剂的干腌肉制品的风味分析
醛类化合物主要通过脂质氧化和蛋白质降解反应产生。醛因其高浓度和低香气阈值被称为发酵肉制品独特风味的主要贡献者。己醛、壬醛和辛醛是干腌肉制品中最丰富的醛，是肉制品中的主要挥发性化合物。己醛被认为是干腌肉制品中的主要脂质氧化产物，具有脂肪味和青草味。壬醛具有强烈的油脂气味和甜橙香气。辛醛具有强烈的果香，有令人愉快的甜橙味。但由于阈值低，它们在低浓度时会产生特殊的青草、脂肪或牛油香气，而在高浓度时会导致腐臭、油漆或其他令人不快的味道。
(1)通过GC-MS方法，检测实施例4～9和对照例1的挥发性化合物种类及含量，结果如表2所示。
表2：实施例4～9和对照例1干腌肉制品中挥发性化合物种类及含量
结果显示，结果如表2所示，对照例1(自然发酵)的醛类物质含量为73.81％，且其TBARS高于1mg/Kg，说明自然发酵的干腌肉制品发生了过度氧化现象，即出现了明显的哈败现象。而添加鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和/或褐藻青霉(Penicilliumfuscoglaucum)V8的实施例4～6中醛类物质分别有12、13、13种，相对含量分别为39.97％、40.50％、48.17％，均高于其他霉菌发酵剂发酵的干腌肉制品醛类物质的含量。在TBARS小于1的条件下，醛类物质的含量高有助于干腌肉制品形成特征香气，因此添加鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和/或褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8的干腌肉制品显示出较高的醛类物质含量，被认为其香气较佳。
(2)为了进一步评估霉菌发酵辅助剂对干腌肉制品香气的影响，计算了所有实施例和对照例的气味活性值(OAV)。气味活性值(OAV)为物质浓度与阈值之比，OAV大于1的风味化合物可能对整体风味有重要贡献，而OAV小于1的化合物则贡献较小，结果如表3所示。
表3：实施例4～9和对照例1干腌肉制品中的挥发性化合物及其气味活性值OAV
结果显示：由表3可以看出，己醛、辛醛、壬醛、异戊醛、2-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、正己酸乙酯、2-戊酮、2-正戊基呋喃和二甲基三硫为干腌肉制品中贡献较大的香气化合物。
通过对比实施例和对照例发现，添加鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和/或褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8的实施例4～6中己醛、辛醛、壬醛、异戊醛、2-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、正己酸乙酯、2-戊酮、2-正戊基呋喃和二甲基三硫的OAV值均大于实施例7～9，说明鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和/或褐藻青霉(Penicilliumfuscoglaucum)V8能明显促进己醛、辛醛、壬醛、异戊醛、2-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、正己酸乙酯、2-戊酮、2-正戊基呋喃和二甲基三硫等关键香气化合物的形成和积累，有助于增强干腌肉制品的香气。而对照例1的OAV则过高，可能是因为其脂肪氧化过度而引起的，过高的OAV会引起不愉快的气味。
实施例14：基于霉菌发酵辅助剂的干腌肉制品的感官评定分析
具体步骤如下：
(1)对实施例和对照例的干腌肉制品的色泽、质地、滋味、香气和总体接受度进行分析，结果如表4所示。
表4实施例4～9和对照例1干腌肉制品的感官评定结果
结果显示，添加鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和/或褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8的实施例4～6的色泽、质地、滋味、香气和总体接受度评分均高于实施例7～9和对照例1，尤其是显著高于对照例1。说明相较于自然发酵(对照例1)，霉菌发酵辅助剂对各组肉制品的色泽、质地、滋味和香气具有一定的正面影响。
(2)对实施例4～9和对照例1干腌肉制品不同霉菌发酵辅助剂的有益效果进行总结，结果如表5所示。
表5实施例4～9和对照例1干腌肉制品不同霉菌发酵辅助剂的有益效果
结果显示：结合实施例4～9和对照例1可知，将霉菌发酵辅助剂(鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1和/或褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8)喷淋涂抹于干腌肉制品上发酵，能达到提高产品水分活度、减缓脂肪氧化、促进蛋白质降解和改善风味品质的效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株鲁本斯青霉(Penicillium rubens)W10-1，已于2023年08月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231436。
2.一株褐藻青霉(Penicillium fuscoglaucum)V8，已于2023年08月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20231437。
3.一种霉菌发酵辅助剂，其特征在于，所述霉菌发酵辅助剂中含有权利要求1所述的鲁本斯青霉W10-1或其发酵液，和/或权利要求2所述的所述褐藻青霉V8或其发酵液。
4.根据权利要求3所述的霉菌发酵辅助剂，其特征在于，所述霉菌发酵辅助剂为，将所述鲁本斯青霉W10-1和褐藻青霉V8按照活菌数比例为1:1进行混合后得到的。
5.根据权利要求4所述的霉菌发酵辅助剂，其特征在于，所述霉菌发酵辅助剂中的活菌总数为2×107～2×108CFU/mL。
6.权利要求1所述的鲁本斯青霉W10-1，和/或权利要求2所述的褐藻青霉V8，和/或权利要求3～5任一所述的霉菌发酵辅助剂在发酵肉制品的制备中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵肉制品包括但不限于：干腌猪肉、干腌牛肉、干腌羊肉。
8.一种提高发酵肉制品风味物质、水分活度的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1所述的鲁本斯青霉W10-1，和/或权利要求2所述的褐藻青霉V8，和/或权利要求3～5任一所述的霉菌发酵辅助剂接种至发酵肉制品表面进行发酵。
9.一种发酵肉制品的制备方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1所述的鲁本斯青霉W10-1，和/或权利要求2所述的褐藻青霉V8，和/或权利要求3～5任一所述的霉菌发酵辅助剂进行发酵制备得到。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)原料肉的选择和修整：选择检验合格的后腿肉肉块，用刀修割肉上的疏松结缔组织，削去两边多余的肥肉和腿皮；
(2)腌制：将5％的盐由下而上，由皮面到肉面，均匀涂抹揉搓在后腿肉肉块上，排除血水，上盐后将肉块堆叠于温度为4℃，相对湿度为80％～90％的腌制室内腌制3天；
(3)清洗：腌制完成后将肉块表面清洗干净，去除表面盐分和污物；
(4)风干：将肉块悬挂于温度为10～15℃，相对湿度为45％～60％的风干室内风干3天；
(5)发酵前期：将风干完成后的肉块置于温度为15～25℃，相对湿度为55％～70％的发酵室中发酵15天；
(6)接种霉菌发酵辅助剂：将权利要求1所述的鲁本斯青霉W10-1，和/或权利要求2所述的褐藻青霉V8，和/或权利要求3～5任一所述的霉菌发酵辅助剂均匀喷淋涂抹在肉块的表面；
(7)发酵中期：将接种霉菌发酵辅助剂的肉块置于温度为25～30℃，相对湿度为70％～80％的发酵室发酵30天；
(8)发酵后期：将涂菌发酵结束后的肉块放在温度为25～10℃，相对湿度为70％～60％的发酵室中发酵20天至成熟。
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