CN117327178A - 一种抗LILRB2全人源ScFv抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗LILRB2全人源ScFv抗体制备及其应用，其包括：ScFv抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1～18所示。本专利在制备全人源阻断抗体的基础上，验证了与其他LILR家族和无关阴性细胞的脱靶检测。

Description

一种抗LILRB2全人源ScFv抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种抗人LILRB2全人源ScFv抗体及其应用。
背景技术
白细胞免疫球蛋白样受体B2(The leukocyte Ig-like receptor subfamily B2，LILRB2)，又名ILT4或MIR-10和CD85d，是白细胞免疫球蛋白样受体LILR家族的免疫抑制成员，调节免疫细胞的活化。LILRB2是一种典型的I型跨膜蛋白，具有4个细胞外串联Ig样结构域、一个由23个氨基酸组成的跨膜区域和一个具有3个免疫受体酪氨酸抑制基序(Information Technology Investment Management，ITIM)的细胞质尾。在生理学上，通常在许多髓系细胞中表达，包括单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞。肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)高表达LILRB2，LILRB2最主要的配体是HLA-G，相关研究表明LILRB2/HLA-G结合会激活Akt磷酸化和STAT6活化，与M2巨噬细胞极化相关。PIR-B是LILRB2的小鼠同源物，研究表明PIR-B是维持小鼠髓系抑制性细胞(MDSC)M2表型的关键性靶点，在PIR-B缺陷小鼠体内TLR和IFN-γ信号在MDSC中放大，IL-4/IL-13和IL-10表达被抑制，小鼠肿瘤负荷减少，Treg活化减少。LILRB2主要表达在髓系细胞中，不在B、NK细胞中表达，在其他组织中表达有限，LILRB2是一种有前途针对M2型巨噬细胞的免疫检查点，具有免疫前景和治疗价值。
本发明提供一种具有不与同源家族结合、具有阻断HLA-G配体功能、可结合细胞表面人源LILRB2蛋白并且不与无关细胞脱靶的全人源ScFv抗体。另外本抗体从全人源噬菌体展示抗体库中通过淘选获得，得到的全ScFv抗体具有免疫原性低的效果。
目前处于临床阶段的LILRB2靶点药物共3个，针对目前研发较快的单克隆抗体药物，如MK-4830、JTX-8064，缺少抗体脱靶的相关检测，主要是细胞水平的脱靶而抗体脱靶会带来细胞毒性等不良反应以及失去抗体治疗功效，因此本发明的单克隆抗体与四种不同来源的无关细胞其中一种为正常细胞进行了脱靶检测，均证实无脱靶，抗体的特异性较高。
目前靶向LILRB2的疗法主要是单克隆抗体。目前关于该靶点主要是ScFv抗体和少量的骆驼单域抗体，尽管LILRB2主要表达在髓系细胞上，但目前该类全人源阻断抗体未针对其他无关细胞的脱靶检测进行比较，本专利在制备全人源阻断抗体的基础上，验证了与其他LILR家族和无关阴性细胞的脱靶检测。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种抗人LILRB2全人源ScFv抗体。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种抗人LILRB2全人源ScFv抗体，其包括：ScFv抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1～18所示。
本发明的另一个目的是提供一种抗人LILRB2全人源ScFv抗体的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种抗人LILRB2全人源ScFv抗体的制备方法，其包括如下步骤：
淘选噬菌体文库：准备宿主菌、洗涤干净磁珠并封闭处理后，结合抗原，抗原与磁珠结合后进行封闭，然后进行噬菌体的结合，洗脱后扩增，扩增产物为下一轮淘选文库；
单克隆ELISA：准备LILRB2蛋白包被板与噬菌体结合，筛选得到阳性噬菌体；
全人源LILRB2 ScFv抗体的制备：对筛选得到的噬菌体序列PCR扩增抗体基因编码区，通过同源重组与质粒载体拼接，质粒转染到293F细胞中进行抗体制备，得到ScFv抗体，进行检测和纯化。
作为本发明所述抗人LILRB2全人源ScFv抗体的制备方法的一种优选方案，其中：制得抗体中，同源重组后制得的表达载体，构建了N端为信号肽、中段为抗体、C端为Fc段的融合蛋白。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种抗人LILRB2全人源ScFv抗体的应用，其包括：ScFv抗体靶向结合LILRB2分子。
作为本发明所述抗人LILRB2全人源ScFv抗体的应用的一种优选方案，其中：ScFv抗体靶向结合LILRB2分子，使得LILRB2分子与其配体HLA-G的结合阻断。
作为本发明所述抗人LILRB2全人源ScFv抗体的应用的一种优选方案，其中：ScFv抗体与LILRA1、LILRA2、LILRB1、LILRA3未产生结合反应。
作为本发明所述抗人LILRB2全人源ScFv抗体的应用的一种优选方案，其中：ScFv抗体与人源LILRB2或者非人源LILRB2均具有靶向结合能力。
作为本发明所述抗人LILRB2全人源ScFv抗体的应用的一种优选方案，其中：ScFv抗体用于制备遏制肿瘤微环境对免疫检查点抑制剂耐药的药物或药物组合物。
作为本发明所述抗人LILRB2全人源ScFv抗体的应用的一种优选方案，其中：抗体用于制备改善肿瘤微环境，逆转TAM介导的肿瘤免疫抑制剂
本发明有益效果：
(1)本发明能够提供一种靶向人源LILRB2分子且具有阻断配体结合功能的抗体。
(2)本发明能够提供一种靶向人源LILRB2分子的且不与家族脱靶、不与无关细胞脱靶的抗体。
(3)本发明能够提供一种靶向人源LILRB2分子的阻断抗体的制备方法。
(4)本发明能够提供一种靶向人源LILRB2分子的阻断抗体的氨基酸序列及核酸序列。
(5)本发明提供一种具有不与同源家族结合、具有阻断HLA-G配体功能、可结合细胞表面人源LILRB2蛋白并且不与无关细胞脱靶的全人源ScFv抗体。
(6)本抗体从全人源噬菌体展示抗体库中通过淘选获得，为免疫原性低的全人源ScFv抗体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为实施例2中phage粗培液与人源LILRB2结合ELISA检测结果；
图2为实施例3中LILRB2抗体表达载体结构示意图；
图3为实施例3中纯化抗体SDS-PAGE电泳；
图4为实施例3中纯化抗体与超表达于细胞表面的LILRB2结合性能检测；
图5为实施例4中纯化抗体的ELISA水平阻断检测；
图6为实施例5中纯化抗体与家族同源性超80％的LILRA1、LILRA2、LILRA3、LILRB1脱靶检测；
图7为实施例6中纯化抗体与LILRB2超表达细胞系阻断能力检测；
图8为实施例7中纯化抗体与食蟹猴LILRBb超表达细胞系结合检测；
图9为实施例3中纯化抗体与LILRB2阴性细胞(MCF-10A、Jurkat、786-0、K562)的FACS检测。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本实施例用以进行噬菌体抗体文库淘选：
1)宿主菌TG1活化：制备mini agar固体培养基(称取1×M9盐，总质量2％葡萄糖，2mM MgSO4·H2O，0.1mM CaCl2，1mM维生素B1，制得)，划线法过夜培养TG1于37℃培养箱，1×M9盐为5×M9盐溶液：称取十二水合磷酸氢二钠10.74g，磷酸二氢钾1.17g，氯化钠0.25g，氯化铵0.5g，加入80mL超纯水溶解，全部溶解后定容至100mL，使用0.45μm滤膜过滤杂菌，4℃保存。1×M9为5×M9盐溶液母液稀释后制得。
2)磁珠洗涤及封闭：吸取50μl磁珠(购自Invitrogen)，置于磁力架上，吸附后吸去液体，1mL PBS重悬、洗涤两次，用1mL 1.5％脱脂奶粉+1.5％BSA的封闭剂(第二轮、第三轮淘选时封闭剂浓度逐渐增加)封闭1小时，去除液体。
3)抗原结合：按16μg/mL的浓度将人源LILRB2蛋白(购自Kactus Biosystems，以后各轮淘选时抗原浓度逐渐降低)用PBS中(pH7.2-7.4)稀释至1mL，重悬磁珠，旋转孵育1小时。
4)库封闭：与抗原结合至磁珠同步，取1011pfu噬菌体病毒颗粒(来自于原始抗体库或淘选扩增产物)，用1mL 1.0％脱脂奶粉+1.0％BSA的封闭剂旋转孵育1小时。
5)噬菌体结合：将磁珠置于磁力架上，去除液体。将封闭后的库加入磁珠，重悬并旋转孵育1小时，去除液体。
6)洗涤：用1mL PBST[0.01M PBS(pH7.4),0.1％ Tween-20(第二、三轮Tween-20浓度分别用0.2％、0.3％)]洗涤，再用0.01M PBS(pH7.4)洗涤。
7)洗脱：吸去液体，用300μL 0.2M甘氨酸-盐酸(pH2.2)洗脱10min，加入20μL中和液[1M Tris-Cl(pH9.0)]混匀，暂时保存于4℃。
8)测滴度：取2μL、0.2μL(原液用2×YT培养基稀释10倍后取2μL)、0.02μL(原液用2×YT培养基稀释100倍后取2μL)洗脱液，与0.2mL对数中期(OD600＝0.5)的TG1混匀，室温孵育30min，均匀涂于2×YT-GA100[含2％葡萄糖，100μg/mL氨苄青霉素]平板上，37℃过夜培养，计数约50个克隆的平板上的克隆数，根据稀释倍数计算滴度。
9)噬菌体扩增：在淘选进行的同时，挑取mini agar平板上的TG1单克隆，接种于10mL 2×YT培养液中，37℃下，250rpm振荡培养至对数中期(OD600＝0.5)。加入200μL淘选获得的洗脱产物，37℃孵育30min。加入辅助噬菌体M13KO7，37℃再孵育30min，37℃下，250rpm振荡培养1小时。4500rpm离心10min去上清，用20mL包含工作浓度100μg/mL氨苄青霉素和工作浓度50μg/mL卡那霉素的2×YT重悬，30℃，220rpm振荡培养过夜。
10)噬菌体沉淀：10000rpm离心15min去除菌体，上清中加入1/5体积的2.5M NaCl/20％ PEG8000，冰浴2h。10000rpm离心10min得到噬菌体沉淀，将残液去除干净，加入0.2mL0.01M PBS(pH7.4)液重悬沉淀，如上文测滴度。
11)重复步骤2)-10)两或三次，获得结合力强的噬菌体展示抗体，制得的纯化后抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.9所示，抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.10～SEQ ID No.18所示，重链的氨基酸对应的编码抗体的核苷酸序列依次如SEQ ID No.19～SEQ ID No.27所示，轻链的氨基酸对应的编码抗体的核苷酸序列依次如SEQ ID No.28～SEQ ID No.36所示。
实施例2
本实施例用以进行单克隆ELISA：
1)0.3μg/mL链霉亲和素4℃过夜包被酶标板，2％BSA/PBS封闭液处理2h，并用PBS洗涤3次。
2)从2×YT-GA100平板上挑取的单克隆菌落，振荡培养至对数中期，加入辅助噬菌体M13KO7，37℃孵育30min。37℃，220rpm振荡培养1小时，4000rpm离心15min。用400μL含工作浓度100μg/mL氨苄青霉素和工作浓度50μg/mL卡那霉素的2×YT重悬，30℃，220rpm振荡培养过夜。4000rpm离心15min，沉淀菌体。
3)取50μL 4％BSA/PBS加入到酶标板中，同时取50μL噬菌体上清，混匀，孵育1小时。
4)去除液体，0.1％PBST洗5次，PBS洗3次，去除液体。
5)将HRP标记抗M13噬菌体抗体(购自北京义翘神州)用2％BSA稀释3000倍，取100μL加入到酶标板中，孵育1小时，去除液体，0.1％PBST洗3次，拍干残液。
6)加入100μL TMB显色液，37℃孵育10min或至蓝色充分显现，加入100μL 1M硫酸终止反应，在酶标仪上读取OD450。数据见图1和表1，图1中在噬菌体淘选过程中，用含有phage病毒颗粒的2×YT培养基50μL做检测。其原始数据如表1所示，其中数值为450nm处的吸光值及其比值。
表1：phage粗培液与人源LILRB2结合ELISA检测
No ID 对照组 实验组 实验/空白
1 0.04 2.6 65
2 0.05 1.99 39.8
3 0.12 2.29 19.08
4 0.22 2.38 10.81
5 0.03 1.92 64
6 0.05 3.55 71
7 0.03 1.74 58
8 0.06 2.04 34
9 0.11 2.63 23.9
由表1和图1可得，液相淘选所得到的噬菌体与LILRB2有较强结合。
实施例3
本实施例用以进行人源LILRB2单抗制备及流式检测：
1)从2×YT-GA100平板上挑取的单克隆菌落，液体振荡培养过夜，培养条件为使用200mL三角瓶在恒温摇床37℃，220rpm过夜振荡培养(LB液体培养基，单克隆来自噬菌体扩增计数的平板)，按质粒提取法提取噬菌粒(phagemid)。
2)合成引物，PCR扩增噬菌体展示的抗体基因编码区。
3)将以上核酸片段通过NheⅠ单酶切，使用同源重组的方法将抗体基因插入到质粒载体Abexp-uIgG4sa中(图2，图中NheⅠ为单酶切位点，靶基因通过同源重组插入此位置)。
同源重组条件为设计引物，引物包括同源臂和抗体部分序列，同源重组条件：a.ddH2O 1μL、2×重组酶2.5μL、线性载体1μL、插入片段0.5μL，b.PCR程序设定为："50℃，20min→48℃，20min→12℃，∞"。
构建以编码N端为信号肽、中段为抗体、C端为Fc标签的融合蛋白。
4)制备无菌无内毒素的质粒。取23μg，用0.75mL的稀释液(OPM-293CD05培养基)稀释，同时取70μL的转染试剂(PEI溶液)加入到0.75mL的稀释液中，稀释液采用OPM-293CD05培养基(奥浦迈公司)轻柔混匀。将PEI稀释液加入质粒稀释液中，立即轻柔混匀，室温静置15min，避免扰动。
5)加入到25mL 293F细胞及其培养液中，85rpm，37℃，5％CO2条件下培养24小时，再加入25mL OPM-293CD05培养基，85rpm，37℃，5％CO2继续培养72小时。
6)10000rpm离心10min，取上清。与平衡后的ProteinA亲和磁珠旋转孵育1小时，置于磁力架上，去除上清。
7)用30mL PBS洗杂3次，加入5mL 0.1M甘氨酸(pH 3.0)洗脱10min，置于磁力架上，吸取上清立即用1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)至中性，即获得纯化的抗体。
8)SDS-PAGE检测纯化抗体，同时进行浓度测定。
得到的凝胶电泳图如图3所示，采用还原电泳，抗体分子中的二硫键被打开，分子以伸展的单肽链状态进行电泳迁移。
由图3可得，条带单一，条带位置正确，纯化较好
9)流式细胞术检测纯化抗体的细胞结合能力：
①将LILRB2表达(细胞结合检测，如超表达LILRB2的CHOK1)或不表达(脱靶检测，如MCF-10A、Jurkat、786-0、K562)用0.25％的胰酶充分消化，血清终止消化，600g离心500g收集细胞，PBS轻轻吹打制备单细胞悬液。
②10mL PBS洗涤细胞1次，1000rpm离心5min,再用1mL PBS悬浮细胞，细胞计数。
③取2.5×105个细胞于96孔细胞培养板中，600g离心5min收集细胞。
④加入100μL 10μg/mL本实施例步骤8)中的纯化抗体，混匀，4℃孵育30min至1小时。
⑤600g离心5min收集细胞，用300μL PBS洗涤细胞1次。
⑥加入100μl用PBS稀释200倍的荧光标记(如FITC、APC)抗体，室温下避光反应20min。
⑦用1mL PBS洗涤细胞1次，1000rpm离心8min，去除上清液。
⑧加入100μl PBS重悬成单细胞悬液，用流式细胞仪(贝克曼科研型流式细胞仪CytoFLEX)上机检测。数据如图4、表2、图9所示，图4中流式细胞术运用于该检测，其中J19、1E1为阳性对照，hIgG4为阴性对照，每个抗体均用野生型细胞(灰色曲线)和LILRB2超表达细胞(黑色曲线)检测。其原始数据如表2所示，其中数值为荧光强度中值(MFI)。图9中流式细胞术用于该检测，抗体浓度使用10μg/mL、100μg/mL。hIgG4做为阴性对照设置为平行检测，其中数值为荧光强度中值(MFI)。
表2：纯化抗体与超表达于细胞表面的LILRB2结合性能检测
野生型 超表达 超表达/野生
hIgG4 77.5 192.6 2.48
No.ID 1 102.5 3145.4 30.69
No.ID 2 60.8 6818.6 112.15
No.ID 3 47.6 5233 109.94
No.ID 4 63.1 5802.5 91.96
No.ID 5 56.8 1488.9 26.21
No.ID 6 54.9 10210.8 185.99
No.ID 7 61 3540.7 56.57
No.ID 8 66.9 3526.7 52.72
No.ID 9 60.4 3378.9 55.94
J-19 58.8 5725.4 97.37
1E1 52 5261.4 101.18
由图4、表2可得，纯化抗体与LILRB2超表达细胞系有较强的结合能力。图9表明纯化抗体具有很好的特异性。
实施例4
本实施例用以进行纯化ELISA水平阻断检测：
1)将HLA-G四聚体(Human HLA-G Tetramer Protein，买自KACTUS)用包被缓冲液稀释，4℃包被过夜。次日去掉包被液，PBS洗涤。
2)加入封闭液于37℃下封闭1h，PBS洗涤。同时将抗体从30μg/mL开始倍比稀释，获得8个梯度浓度的抗体溶液，浓度分别为30，15，7.5，3.75，1.875，0.938，0.468μg/mL，取出稀释抗体50μL加入50μL终浓度4μg/mL的LILRB2-mFc，混匀37℃，30min。
3)将混匀液体100μL加入到封闭后的酶标板中，30℃下结合30min，PBST洗涤。
4)按1:2000稀释倍数，加入HRP标记抗鼠IgG的二抗(购自Biolegend)，30℃下结合30min，PBST洗涤。
5)加入100μL TMB显色液，37℃孵育10min或至蓝色充分显现，加入100μL 1M硫酸终止反应，在酶标仪上读取OD450。数据如图5和表3所示。ELISA运用于该检测，其中J19、1E1为阳性对照。hIgG4为阴性对照，因其不结合因而无线性关系而无IC50值，抗体IC50数据如表3所示。
表3：纯化抗体阻断固相载体的IC50检测
1 2 3 4
IC50(μg/mL) 3.294 2.492 5.03 3.263
5 6 7 8
IC50(μg/mL) 7.902 4.842 2.921 3.843
9 hIgG4 J19 1E1
IC50(μg/mL) 3.409 - 5.659 3.631
由图5和表3可得，发明中提供的抗体可以有效阻断LILRB2与其配体的结合。
实施例5
本实施例用以进行纯化抗体ELISA水平与同源家族脱靶检测
1)将LILRA1、LILRA2、LILRA3、LILRB1蛋白分别用包被缓冲液稀释，分别稀释到1μg/mL，4℃包被过夜。
2)次日去掉包被液，PBS洗涤。
3)加入封闭液于37℃下封闭1h，PBS洗涤。将抗体稀释至10μg/mL。
4)将10μg/mL的抗体溶液分别取100μL加入到封闭后的四种酶标板中，30℃下结合30min，PBST洗涤
5)按1:10000稀释倍数，加入HRP标记抗人IgG的二抗(购自Biolegend)，30℃下结合30min，PBST洗涤。
6)加入100μL TMB显色液，37℃孵育10min或至蓝色充分显现，加入100μL 1M硫酸终止反应，在酶标仪上读取OD450。数据如图6和表4所示，图6中超出数据如表4所示。
表4纯化抗体与LILRA1、LILRA2、LILRA3、LILRB1脱靶检测
LILRA1 LILRA2 LILRA3 LILRB1
1 0.456 0.891 0.727 0.667
2 0.253 0.534 0.432 0.376
3 0.326 0.735 0.462 0.458
4 0.154 0.587 0.243 0.276
5 0.359 0.896 0.338 0.465
6 0.625 0945 0.347 0.608
7 0.359 0.334 0.5 0.289
8 0.396 0.918 0.349 0.384
9 0.229 0.48 0.363 0.489
由图6和表4可得，本发明提供的纯化抗体对于LILRB2有较好的特异性，与其余LILRB2家族成员未发生结合反应。
实施例6
本实施例用以进行纯化抗体细胞水平阻断检测：
1)准备LILRB2-CHOK1超表达细胞，提前复苏超表达细胞系培养至对数生长期，细胞贴壁程度达到80％，用胰酶消化后，countstar细胞计数仪计数，吸取实验所需细胞于离心管中，500×g 5min离心后，以2E5/孔加到96孔圆底板中。
2)样品孵育：同时将抗体浓度从60μg/mL开始倍比稀释，获得8个梯度浓度的抗体溶液，浓度分别为60，30，15，7.5，3.75，1.875，0.938，0.468μg/mL，取出稀释抗体50μL加入到50μL细胞悬液中混匀获得终浓度30μg/mL倍比稀释8个梯度的共孵育混溶液，4℃，30min。。
3)细胞清洗：样品孵育结束后，每孔加入150μL 1×PBS，600×g，5min，吸去上清，轻拍板壁使细胞分开。
4)配体孵育：用1×PBS稀释PE-Labeled Human HLA-G Tetramer Protein至1μg/mL，按100μL每孔加入细胞中，轻柔混匀。4℃孵育30min。
5)细胞清洗：样品孵育结束后，每孔加入150μL 1×PBS，600×g，5min，吸去上清，轻拍板壁使细胞分开，再重复一次清洗，第二次PBS加入200μL。
6)上机检测：60μL/孔加入1×PBS重悬细胞，用流式细胞仪(贝克曼科研型流式细胞仪CytoFLEX)检测，如图7和表5所示，图7中，流式细胞术运用于该检测，其中hIgG4为阴性对照，J19、1E1为阳性对照。阻断率如图所示，其中阻断率计算方式为：1-HLA-G四聚体和抗体共孵育的荧光强度中值(MFI)/单加HLA-G四聚体的荧光强度中值(MFI)，IC50如表5所示。
表5：纯化抗体细胞水平阻断HLA-G四聚体的IC50检测
1 2 3 4
IC50(μg/mL) 1.125 1.204 2.497 1.709
5 6 7 8
IC50(μg/mL) 1.607 2.2 1.211 0.7525
9 hIgG4 J19 1E1
IC50(μg/mL) 1.684 - 2.01 1.787
由图7和表5可得，本发明提供的纯化抗体，对于LILRB2超表达细胞系与配体HLA-G的结合也有较强的阻断功能。
实施例7
本实施例用流式细胞术检测纯化抗体与食蟹猴LILRBb超表达细胞结合能力：
1)①将食蟹猴LILRBb超表达细胞系用0.25％的胰酶充分消化，血清终止消化，600g离心5min收集细胞，PBS轻轻吹打制备单细胞悬液。
②10mL PBS洗涤细胞1次，1000rpm离心5min,再用1mL PBS悬浮细胞，细胞计数。
③取2×105个细胞于96孔细胞培养板中，600g离心5min收集细胞。
④加入100μL 10μg/mL加入实施例3中步骤8)中的纯化抗体，混匀，4℃孵育30min。
⑤600g离心5min收集细胞，用300μL PBS洗涤细胞1次。
⑥加入100μl用PBS稀释200倍的荧光标记(APC)抗体，室温下避光反应20min。
⑦用1mL PBS洗涤细胞1次，1000rpm离心8min，去除上清液。
⑧加入100μl PBS重悬成单细胞悬液，用流式细胞仪(贝克曼科研型流式细胞仪CytoFLEX)上机检测。数据如图8所示，图8中流式细胞术用于该检测，抗体浓度使用10μg/mL、100μg/mL。抗体与细胞结合后，通过荧光二抗检测结合于细胞表面的待测抗体，其中数值为荧光强度中值(MFI)。
由图8可得，本发明制备的抗体与食蟹猴LILRBb同源基因存在交叉结合，可作为食蟹猴动物实验的候选抗体。
本发明相应表格中对应的No.ID1～9与SEQ ID No.1～SEQ ID No.9代表的抗体的重链依次对应；更进一步的，抗体的重链对应抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.10～SEQ ID No.18所示，重链的氨基酸对应的编码抗体的核苷酸序列依次如SEQ ID No.19～SEQ ID No.27所示，轻链的氨基酸对应的编码抗体的核苷酸序列依次如SEQ ID No.28～SEQ ID No.36所示。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种抗人LILRB2全人源ScFv抗体，其特征在于：ScFv抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1～18所示。
2.一种抗人LILRB2全人源ScFv抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
淘选噬菌体文库：准备宿主菌、洗涤干净磁珠并封闭处理后，结合抗原，抗原与磁珠结合后进行封闭，然后进行噬菌体的结合，洗脱后扩增，扩增产物为下一轮淘选文库；
单克隆ELISA：准备LILRB2蛋白包被板与噬菌体结合，筛选得到阳性噬菌体；
全人源LILRB2 ScFv抗体的制备：对筛选得到的噬菌体序列PCR扩增抗体基因编码区，通过同源重组与质粒载体拼接，质粒转染到293F细胞中进行抗体制备，得到ScFv抗体，进行检测和纯化。
3.根据权利要求2所述的抗人LILRB2全人源ScFv抗体的制备方法，其特征在于：所述制得抗体中，同源重组后制得的表达载体，构建了N端为信号肽、中段为抗体、C端为Fc段的融合蛋白。
4.一种抗人LILRB2全人源ScFv抗体的应用，其特征在于：所述ScFv抗体靶向结合LILRB2分子。
5.根据权利要求4所述的抗人LILRB2全人源ScFv抗体的应用，其特征在于：所述ScFv抗体靶向结合LILRB2分子，使得LILRB2分子与其配体HLA-G的结合阻断。
6.根据权利要求4或5所述的抗人LILRB2全人源ScFv抗体的应用，其特征在于：所述ScFv抗体与LILRA1、LILRA2、LILRA3、LILRB1未发生结合。
7.根据根据权利要求4或5所述的抗人LILRB2全人源ScFv抗体的应用，其特征在于：所述ScFv抗体与人源LILRB2或者非人源LILRBb均具有靶向结合能力。
8.根据权利要求4所述的抗人LILRB2全人源ScFv抗体的应用，其特征在于：所述ScFv抗体用于制备遏制肿瘤微环境对免疫检查点抑制剂耐药的药物或药物组合物。
9.根据权利要求4或5所述的抗人LILRB2全人源ScFv抗体的应用，其特征在于：所述抗体用于制备改善肿瘤微环境，逆转TAM介导的肿瘤免疫抑制剂。
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