CN117305418A - 一种荧光原位杂交方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种荧光原位杂交方法，包括如下步骤：S1、对检测样本进行低渗及固定液固定处理得到细胞悬液，所得细胞悬液滴加于载玻片上烘烤制得玻片标本；S2、将探针加入所述玻片标本中的检测区域，其中探针的加入量与滴加的所述细胞悬液的配比为1μL～2μL：15μL，随后用直径为11mm～13mm的圆形盖玻片盖住所述检测区域，进行共变性及杂交处理；S3、对杂交处理后的玻片标本中的检测区域采用复染液进行复染处理。本发明提供的荧光原位杂交方法能够在不影响检测结果前提下，减少试剂量，节省成本，利于临床推广和应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种荧光原位杂交方法。
背景技术
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是20世纪80年代末发展起来的一种重要的原位杂交方法,以非放射性荧光标记取代放射性同位素标记，而形成的一种新的分子细胞遗传学技术。FISH技术作为非放射性检测体系，与放射性同位素标记的探针相比具有明显的优势：1、荧光试剂和探针较放射性同位素标记的探针更加经济安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验结果灵敏度高，特异性好，定位准确；4、多色FISH可通过在同一个核中显示不同的颜色，同时检测多种序列。
FISH技术不但可以用于已知基因或序列的染色体定位，而且可以用于动物、植物、微生物克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究，此外，FISH技术在基因定性、定量、整合和表达方面的研究中具有优势。但是，目前广泛使用的经典荧光原位杂交方法中，通常以Vysis生产的血液FISH试剂为基础，通过细胞DNA与荧光标记DNA(探针)经变性、复合方式进行检测，只要检测经荧光标记的细胞数目及亮度满足计数要求即可。其原位杂交过程是通过将试剂探针加在附有细胞悬液的载玻片上，利用盖玻片封盖密封上机检测，目前探针加样量为10μL/每样本(每样本制得细胞悬液的用量为15μL)，使用边长为18mm方形盖玻片，每盒试剂检测量为20人份。该方法中，由于商品化荧光原位杂交探针试剂昂贵，试剂盒检测量有限，成本较高，不利于市场推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荧光原位杂交方法，能够兼顾减小探针加样量和保证良好的杂交效果。
实现上述目的包括如下技术方案。
本发明提供一种荧光原位杂交方法，所述荧光原位杂交方法包括如下步骤：
S1、对检测样本进行低渗及固定液固定处理得到细胞悬液，所得细胞悬液滴加于载玻片上烘烤制得玻片标本；
S2、将探针加入所述玻片标本中的检测区域，其中探针的加入量与滴加的所述细胞悬液的配比为1μL～2μL：15μL，随后用直径为11mm～13mm的圆形盖玻片盖住所述检测区域，进行共变性及杂交处理；
S3、对杂交处理后的玻片标本中的检测区域采用复染液进行复染处理。
在其中一些实施例中，在步骤S2中，所述探针的加入量与滴加的所述细胞悬液的配比为1.3μL～1.7μL：15μL。
在其中一些实施例中，所述探针的加入量与滴加的所述细胞悬液的配比为1.45μL～1.55μL：15μL。
在其中一些实施例中，在步骤S2中，所述圆形盖玻片的直径为11.5mm～12.5mm。
在其中一些实施例中，在步骤S3中，所述复染液的加入量与滴加的所述细胞悬液的配比为1.5μL～3.5μL：15μL，并用直径为14mm～16mm的圆形盖玻片盖住所述检测区域。
在其中一些实施例中，所述复染液的加入量与滴加的所述细胞悬液的配比为2μL～3μL：15μL。
在其中一些实施例中，所述复染液的加入量与滴加的所述细胞悬液的配比为2.4μL～2.6μL：15μL。
在其中一些实施例中，在步骤S3中，所述圆形盖玻片的直径为14.5mm～15.5mm。
在其中一些实施例中，在步骤S2中，变性温度为73℃～77℃，变性时间为4min～6min；
杂交温度为36℃～38℃，杂交时间为14h～18h。
优选地，在步骤S2中，变性温度为74.5℃～75.5℃，变性时间为4.5min～5.5min；
杂交温度为36.5℃～37.5℃，杂交时间为14h～18h。
在其中一些实施例中，步骤S2中，在将探针加入所述玻片标本中的检测样本区域之前，还包括如下步骤：将探针预温至室温，经离心后再通过涡旋混匀。
在其中一些实施例中，所述复染液为DAPI II复染液。
本发明的在荧光原位杂交方法中，发明人发现，在杂交的过程中，将边长为18mm方形盖玻片改换用11mm～13mm的圆形盖玻片，以及控制探针的加样量与滴加的样本所制细胞悬液的用量比(1μL～2μL：15μL，特别是1.5μL：15ul效果更优)，能够获得很好的杂交效果，并且能极大地减小探针的用量。通过这样的改进方法，可以使得每盒探针试剂检测量可以从20人份增加至133人份左右，并通过对杂交效果的验证发现，在减小探针加样量以及减小杂交面积的方式下，并不影响杂交效果，其中信号亮度、每视野细胞量、染色背景、核内非特异信号及核外信号与现有的杂交方法结果一致，每样本计数细胞达到200-1000个，满足计数要求。
在此发现基础上，发明人进一步发现，在复染步骤中，将边长为20mm方形盖玻片改换为14mm～16mm的圆形盖玻片，以及控制复染液的加样量与滴加的样本所制细胞悬液的用量比，通过这样的改进方法，可以极大地减小复染液的用量，使得每盒复染液试剂检测量从50人份增加至200人份左右，且不会影响杂交效果。
故此，本发明提供的荧光原位杂交方法能够在不影响检测结果前提下，减少试剂量，节省成本，利于临床推广和应用。
附图说明
图1是对比组的探针加样量为10μL/每样本，使用边长为18mm方形盖玻片盖住检测区域的效果图。
图2是复染液(DAPI II)加样量10μL/每样本，使用边长为20mm方形盖玻片的效果图。
图3是采用对比组的步骤获得的杂交后的效果图(使用徕卡DM6000B荧光显微镜拍摄)。
图4是将探针加样量为1.5μL/每样本，使用直径为12mm的圆形盖玻片盖住检测区域的效果图。
图5是复染液(DAPI II)加样量2.5μL/每样本，使用直径为15mm的圆形盖玻片盖住检测区域的效果图。
图6是采用实验组的步骤获得的杂交后的效果图(使用徕卡DM6000B荧光显微镜拍摄)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
现有技术中，原位杂交过程是通过将试剂探针加在附有细胞悬液的载玻片上，利用盖玻片封盖密封上机检测，目前探针加样量为10μL/每样本(每样本所制细胞悬液用量为15μL。此外，以下如非特殊说明，每样本细胞悬液的用量均为15μL)，使用边长为18mm方形盖玻片，每盒试剂检测量为20人份。复染液(DAPI II)加样量10μL/每样本，使用边长为20mm方形盖玻片，每盒试剂检测量为50人份。每次计数细胞数目为200-500个。
本发明的在荧光原位杂交方法中，发明人发现，在杂交的过程中，将边长为18mm方形盖玻片改换用11mm～13mm的圆形盖玻片，以及控制探针的加样量与滴加的样本所制细胞悬液的用量比(1μL～2μL：15μL，特别是1.5μL：15μL效果更优)，能够获得很好的杂交效果，并且能极大地减小探针的用量。通过这样的改进方法，可以使得每盒探针试剂检测量可以从20人份增加至133人份左右，并通过对杂交效果的验证发现，在减小探针加样量以及减小杂交面积的方式下，并不影响杂交效果，其中信号亮度、每视野细胞量、染色背景、核内非特异信号及核外信号与现有的杂交方法结果一致，每样本计数细胞达到200-1000个，满足计数要求。
在此发现基础上，发明人进一步发现，在复染步骤中，将边长为20mm方形盖玻片改换为14mm～16mm的圆形盖玻片，以及控制复染液的加样量与滴加的样本所制细胞悬液的用量比，通过这样的改进方法，可以极大地减小复染液的用量，使得每盒复染液试剂检测量从50人份增加至200人份左右，且不会影响杂交效果。
故此，本发明提供的荧光原位杂交方法能够在不影响检测结果前提下，减少试剂量，节省成本，利于临床推广和应用。
以下结合具体的实施例说明本发明方案。
实施例1
本实施例提供一种荧光原位杂交方法，包括如下步骤：
常规前处理：
(1)取外周血或骨髓的检测样本1～2mL至15mL离心管中，加入8mL低渗液，充分混匀，在37℃水浴箱中低渗40分钟；
(2)低渗后加入固定液2mL充分混匀，2200rpm条件下离心7min；
(3)弃上清，加入8～10mL的固定液重悬细胞，2200rpm条件下离心7min；
(4)重复第3步1～2次；
(5)弃去上清液，加入适量的固定液重悬细胞得到细胞悬液；
(6)将细胞悬液均匀的滴落在干净的载玻片上，每例样本滴两张，放入56℃烤箱中烘烤30min以上，得到玻片标本备用。
杂交：
(1)打开ThermoBriteTM杂交仪，用蒸馏水浸湿ThermoBriteTM盖通道，预热30min；
(2)将玻片浸入50mL 2×SSC中，2缸各洗涤3min；
(3)于70％、80％、100％酒精中依次放置3min进行梯度脱水(≤6个载玻片/缸)；
(4)风干玻片；
注意：以下步骤必须在暗室中完成操作。
(5)将探针预温至室温，以降低探针的粘度使能够准确地进行移取；
(6)旋涡混匀。将探针管置于台式微型离心机内离心2～3秒，使探针下沉至管底部。再次轻轻旋涡以混匀；
(7)按顺序放置检测样本，在玻片标本的检测区域加入探针，通过直径为盖玻片盖住该检测区域，如图1所示，用封片胶封闭盖玻片四周，防止探针溢出。封片过程若出气泡则将其轻轻挤出，以防影响杂交；
(8)运行程序，参数如下：75℃度变性5mins，37℃杂交14-18h；
洗片：
(1)从-20℃取出DAPI II复染液，置于室温解冻。
(2)加入50mL杂交后洗涤缓冲液(0.4×SSC/0.3％NP-40)至考普林缸内，水浴升温至72±1℃注意：在对各批次进行洗涤之前，洗涤液温度必须重新确定是否到72±1℃。
(3)再取一个考普林缸(Coplin缸)，加入50mL杂交后洗涤缓冲液，室温放置；
注意：杂交后洗涤缓冲液使用期限为1天
(4)用镊子小心的揭开封片胶，移去盖玻片，去掉玻片上多余的封片胶；也可将载玻片浸没在室温的杂交后洗涤缓冲液中，使盖玻片自然脱落。此步最长不超过4分钟；
(5)将载玻片浸没在72±1℃的杂交后洗涤缓冲液内3分钟(≤6个载玻片/缸)；
(6)从洗涤缓冲液中取出所有载玻片，暗室直立风干(使用密闭抽屉或密闭室内的架子即可)；
(7)在玻片标本中的检测区域上加入DAPI II复染液，并用盖玻片盖住所述检测区域。
(8)细胞计数、信号模板观察以及结果记录。
按照上述的步骤，设置实验组和对比组：
对比组设置：参照上面的步骤，将探针加样量修改为10μL/每样本(15μL细胞悬液，以下每样本均为15μL细胞悬液)，使用边长为18mm方形盖玻片盖住检测区域；
复染液(DAPI II)加样量10μL/每样本，使用边长为20mm方形盖玻片。其他条件不变。
实验组设置：参照上面的步骤，将探针加样量修改为1.5μL/每样本，使用直径为12mm的圆形盖玻片盖住检测区域；
复染液(DAPI II)加样量2.5μL/每样本，使用直径为15mm的圆形盖玻片盖住检测区域。其他条件不变。
采用上面的实验组和对比组的步骤对BCR/ABL融合基因进行检测，其比对结果如下图1-图6。其中图1是对比组的探针加样量为10μL/每样本，使用边长为18mm方形盖玻片盖住检测区域的效果图，图2是复染液(DAPI II)加样量10μL/每样本，使用边长为20mm方形盖玻片的效果图。图3是采用该对比组的步骤获得的杂交后的效果图(使用徕卡DM6000B荧光显微镜拍摄)。
图4是将探针加样量为1.5μL/每样本，使用直径为12mm的圆形盖玻片盖住检测区域的效果图，图5是复染液(DAPI II)加样量2.5μL/每样本，使用直径为15mm的圆形盖玻片盖住检测区域的效果图，图6是采用该实验组的步骤获得的杂交后的效果图(使用徕卡DM6000B荧光显微镜拍摄)。
由图3和图6观察可知，实验组中的每视野细胞量及信号强度与对比组的无明显差别(显微镜下人眼判断)，两次计数偏差在±5％内可接受，诊断需要的总体细胞计数是200-500个，而优化的实验组中的总体细胞计数可达到平均700-800个。
以BCR/ABL(编号BCR)探针为例，采用实验组和对比组进行处理，拓展到临床应用的PML/RARA(编号RARA)、EGR1/D5S23、D5S721(编号5q)、D7S486/CEP 7(编号7q)、Del 20q(编号20q)、CEP8(编号CEP8)6种探针，每探针使用20例临床样本进行比对验证，结果见表1，由表1可知，两种方法检测结果一致性为100％，T检验结果为0.71，两组方法结果无差异。
表1不同加样量结果比对
综上，通过实验组在杂交步骤中将边长为18mm方形盖玻片改换用12mm的圆形盖玻片，以及控制探针的加样量为1.5μL/每样本，能够获得很好的杂交效果，并且能极大地减小探针的用量。通过这样的改进方法，可以使得每盒探针试剂检测量可以从20人份增加至133人份左右，并通过对杂交效果的验证发现，在减小探针加样量以及减小杂交面积的方式下，并不影响杂交效果，其中信号亮度、每视野细胞量、染色背景、核内非特异信号及核外信号与现有的杂交方法结果一致，每样本计数细胞达到200-1000个，满足计数要求。
在复染步骤中，将边长为20mm方形盖玻片改换为15mm的圆形盖玻片，以及控制复染液的加样量为1.5μL/每样本，通过这样的改进方法，可以极大地减小复染液的用量，使得每盒复染液试剂检测量从50人份增加至200人份左右，且不会影响杂交效果。
故此，本发明提供的荧光原位杂交方法能够在不影响检测结果前提下，减少试剂量，节省成本，利于临床推广和应用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种荧光原位杂交方法，其特征在于，所述荧光原位杂交方法包括如下步骤：
S1、对检测样本进行低渗及固定液固定处理得到细胞悬液，所得细胞悬液滴加于载玻片上烘烤制得玻片标本；
S2、将探针加入所述玻片标本中的检测区域，其中探针的加入量与滴加的所述细胞悬液的配比为1μL～2μL：15μL，随后用直径为11mm～13mm的圆形盖玻片盖住所述检测区域，进行共变性及杂交处理；
S3、对杂交处理后的玻片标本中的检测区域采用复染液进行复染处理。
2.如权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，在步骤S2中，所述探针的加入量与滴加的所述细胞悬液的配比为1.3μL～1.7μL：15μL。
3.如权利要求2所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述探针的加入量与滴加的所述细胞悬液的配比为1.45μL～1.55μL：15μL。
4.如权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，在步骤S2中，所述圆形盖玻片的直径为11.5mm～12.5mm。
5.如权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，在步骤S3中，所述复染液的加入量与滴加的所述细胞悬液的配比为1.5μL～3.5μL：15μL，并用直径为14mm～16mm的圆形盖玻片盖住所述检测区域。
6.如权利要求5所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述复染液的加入量与滴加的所述细胞悬液的配比为2μL～3μL：15μL。
7.如权利要求6所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述复染液的加入量与滴加的所述细胞悬液的配比为2.4μL～2.6μL：15μL。
8.如权利要求5所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，在步骤S3中，所述圆形盖玻片的直径为14.5mm～15.5mm。
9.如权利要求1至8任一项所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，在步骤S2中，变性温度为73℃～77℃，变性时间为4min～6min；
杂交温度为36℃～38℃，杂交时间为14h～18h。
10.如权利要求1至8任一项所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤S2中，在将探针加入所述玻片标本中的检测样本区域之前，还包括如下步骤：将探针预温至室温，经离心后再通过涡旋混匀。
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