CN117286241A - 一种用于检测易漏检RhD阴性表型的SNP标记 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测RhD阴性血型的SNP标记，所述的SNP位点位于序列为SEQ ID NO:1的RHD血型基因Exon 4的第273位，为A>G的纯合突变。本发明通过检测筛选获得的SNP位点，进一步完善了RhD血型基因诊断途径，防止仅通过检测外显子区域而忽略或遗漏了本位点，导致对RhD血型的漏检甚至误判。可以有效的避免溶血性输血反应，并完善严重胎儿新生儿溶血病发生的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询，应用效果表明本发明所提供的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床输血患者及血液中心献血员进行RHD基因Exon 4剪切区域突变位点的的快速检测。

Description

一种用于检测易漏检RhD阴性表型的SNP标记

技术领域

本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种用于检测红细胞RhD阴性血型的SNP标记。

背景技术

截止到2023年3月，ISBT(International Society of Blood Transfusion)一共登记确认44个血型系统，而其中最重要且最复杂的依然是Rh血型系统。Rh血型系统的抗原是蛋白质，不同于ABO血型系统的糖蛋白抗原，所以Rh血型系统的免疫原性强，当输入不同表型Rh抗原的红细胞时，极易产生抗Rh系统的抗体，引发输血反应或胎儿新生儿溶血病(HDFN)，从而在临床输血、新生儿溶血病的诊治中占有重要地位。

Rh血型系统中最重要的当属RhD，其免疫原性最强，且多态性最为复杂。RhD表型按照血清学定型结果可以分为D阴性、D阳性、弱D(weak D)、部分D(partial D)及DEL型(放散型)，后三种统称为D变异型。D变异型的红细胞表面上表达不完全的、或者变异的D抗原，这一特点决定D变异型个体不能接受包含完全D抗原的D阳性献血者的血液。同样，这些D变异型的献血者的血液也不能用于D阴性的个体。若RhD阴性个体输注了RhD阳性或者变异型的血液，D抗原会刺激D阴性个体产生抗-D抗体。如果再次输入RhD阳性或者变异型的血液，即可导致溶血性输血反应。同样，若RhD阴性妇女由于妊娠或输血刺激体内产生抗-D抗体，再次怀孕则会导致胎儿新生儿溶血病的发生。

鉴于以上特点，准确鉴定RhD血型是确保临床安全用血的根本保证。由于目前血清学实验受样本的质量、疾病及不规则抗体等干扰，同时本身也存在检测技术的局限性(比如DEL型只能通过吸收放散试验才能检测到)，为进一步提高输血安全，就需要利用分子生物学的方法在基因水平进行诊断，而对SNP位点(外显子和侧翼序列)的充分发掘和完善对基因分型技术的广泛应用提供了安全保障。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测RhD阴性血型的SNP标记，通过检测该SNP标记可以准确的对红细胞RhD阴性血型进行确证，并完善RHD基因库的数据，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种Rh血型系统中RHD变异型基因突变相关的SNP位点，所述的SNP位点位于序列为SEQ ID NO:1的RHD血型基因Exon 4的第273位，为A>G的纯合突变(c.487-2A>G)AGTGGCGCATGCCTGTAATCCCAGCTACTAGGGAAGCTGAGGCAGGAGAATCGCGTGAACCTGGGAGGCAAATGTTCCAGTGAGCCGAGATCGTGCCATTGCACTCCAGCCTGGGCAGAGCCTGCTGGGTTGGGCTGGGTAAGCTCTGAACACCAGTCTCATGGCTTCAAGTCACACCTCCTAAGTGAAGCTCTGAACTTTCTCCAAGGACTATCAGGGCTTGCCCCGGGCAGAGGATGCCGACACTCACTGCTCTTACTGGGTTTTATTGCAGACAGACTACCACATGAACATGATGCACATCTACGTGTTCGCAGCCTATTTTGGGCTGTCTGTGGCCTGGTGCCTGCCAAAGCCTCTACCCGAGGGAACGGAGGATAAAGATCAGACAGCAACGATACCCAGTTTGTCTGCCATGCTGGGTAAGGACAAGGTGGGGTGAGTGGTCTCCTACTTGGGCTGAGCAGAATGGCTCAGAAAAGGCTCTGGCTGAAAAAATCTCCCTCCTTTACCAAGTTCCCCTGGGTGTCTGAAGCCCTTCCATCATGATTCATTTCTTTGAGTAGTGTTTGCTAAATTCATA(SEQ ID NO:1)；

本发明还提供用于检测上述SNP位点的引物对，其一种具体的序列信息如下：

上游引物：AGTGGCGCATGCCTGTAATC(SEQ ID NO:2)、

下游引物：TATGAATTTAGCAAACACTACTCAAAGAAA(SEQ ID NO:3)、

本发明的另一个方面是提供检测上述SNP标记的引物对的一种应用，是在制备用于检测红细胞RhD阴性血型制品中的应用；

所述的制品，为PCR扩增测序分子试剂盒。

根据本发明的另一个方面是提供一种检测红细胞RhD阴性血型的方法，所述的方法是通过检测所述的SNP位点存在与否来进行检测。

上述的方法，是通过能扩增上述SNP标记的引物对待检测的血样DNA进行PCR扩增，扩增产物进行测序后进行基因型分析，确定待检样品是否存在上述的SNP标记。

本发明通过检测筛选获得的SNP位点，进一步完善了RhD血型基因诊断途径，防止仅通过检测外显子区域而忽略或遗漏了本位点，导致对RhD血型的漏检甚至误判。可以有效的避免溶血性输血反应，并完善严重胎儿新生儿溶血病发生的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询，应用效果表明本发明所提供的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床输血患者及血液中心献血员进行RHD基因Exon 4剪切区域突变位点的快速检测。

附图说明

图1：正常人群RHD基因Exon 4剪切区域测序图，参比序列来源于NCBI RefSeq(NG_007494.1)；

图2：先证者RHD基因Exon 4剪切区域测序图，RHD基因编码区域由起始密码子起至第487位碱基(Exon 4第1个碱基，SEQ ID NO:1的第273位)上游第2个碱基发生A>G的纯合突变(c.487-2A>G)。

具体实施方式

申请人对一个1号常染色体1p34.3-1p36.1显性遗传的RHD血型基因变异的先证者进行了测序，找到了该先证者RHD基因存在遗传上的突变，由于在Intron 3末端靠近Exon 4剪切位点-2bp处存在A>G的纯合突变(c.487-2A>G)，造成了该RHD基因虽然Exon 1-10完全存在，但Exon 4-10却无法正确剪切，从而影响RhD抗原在红细胞表面的表达。为了避免其通过输血引发溶血性输血反应和严重新生儿溶血病，从而促成了本项发明。

RHD基因位于染色体1p34.3-1p36.1区域，由10个外显子和9个内含子组成，可转录成2837bp的mRNA(NCBI登录号为NM_016124.6)，最终翻译形成417个氨基酸组成的蛋白质。

Rh血型系统中RHD变异型基因突变相关的SNP位点，该基因位于1号染色体1p34.3-1p36.1，为Rh血型基因(NCBI Reference Sequence:NG_007494.1)编码区Exon 4的侧翼序列。本发明所发现的SNP位点位于序列为SEQ ID NO:1的RHD血型基因Exon 4的第273位，为A>G的纯合突变(c.487-2A>G)。

RhD阴性个体接受妊娠、输血等免疫刺激极易产生抗-D抗体，抗体一旦产生无法消除，只能通过代谢缓慢减弱表达量。如果这些产生抗-D的RhD阴性个体在紧急输血时，只能输注RhD阴性血，这可能会因血源不足而耽误急救时间；如果她们妊娠生产，则会产生严重的新生儿溶血病。为了避免其通过输血或妊娠产生不规则抗体，就需要预先检测发现这种RhD阴性血型的个体。采用分子生物学的手段，建立RHD基因检测系统并应用于临床和采供血工作当中，有助于RhD阴性个体的准确检出，有助于降低受血者不规则抗体的产生，有助于产前不规则抗体的预防和监测，有助于降低新生儿溶血病的发生。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：SNP标记的筛选

1、提取外周血基因组DNA：

在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取RhD阴性个体及家系成员外周静脉血2-5mL，放入EDTA-Na₂抗凝管内，混匀；DNA提取使用LIFE公司的DNA提取试剂盒，具体操作流程如下：

取500μL混匀后EDTA抗凝血放于离心管，加入等体积的红细胞裂解液(pH 8.0)，涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。重复加入红细胞裂解液500μL涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。

沉淀物涡旋混匀5分钟，加入核裂解液50μL，涡旋混匀5分钟，置于56℃金属浴15分钟。从水浴中取出样品，加入蛋白清除液135μL。涡旋充分混匀，至于4℃30分钟。

室温下12000rpm离心5分钟，吸取上清液(约200μl)至一新离心管中。加入冰乙醇500μL，反复震荡离心管，直至白色DNA沉淀物析出。室温12000rpm离心2分钟，弃上清。向DNA沉淀加入75％乙醇，漂洗一次，室温12000rpm离心3分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。

对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。

2、直接测序法寻找先证者RHD基因的突变位点

PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：

(1)PCR反应条件：95℃预变性10分钟；94℃60秒，63℃90秒，72℃60秒，10个循环；94℃60秒，61℃90秒，72℃60秒，25个循环；72℃延伸10min，扩增产物10℃保温。

(2)反应体系：(TAKARA Ex-Taq polymerase)

应用该反应体系进行先证者的基因组DNA模板与上述相同的RHD-E4F、RHD-E4R引物的扩增反应。

PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，其中应用引物对的序列信息如下：

RHD-E4F:5′-AGTGGCGCATGCCTGTAATC-3′(SEQ ID NO:2)、RHD-E4R:5′-TATGAATTTAGCAAACACTACTCAAAGAAA-3′(SEQ ID NO:3)。

在先证者的序列为SEQ ID NO:1的RHD血型基因的第273位发生A>G的纯合突变。多次测序结果表明该突变位点的确存在该突变，并非由扩增或测序错误引进的(图2)。

该突变为一新发现的突变，该突变不存在于下面的两个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database)，国际输血协会(ISBT)血型基因突变库(004_RHCE_alleles_v4.0_180208)，表明该突变非常罕见，为本发明人在国际范围内首次发现该突变。

该SNP突变导致了先证者RHD基因Exon 4-Exon 10不能被正确剪切，虽然先证者的RHD基因1-10外显子均完整存在，但D蛋白无法正确合成，先证者红细胞表面不表达RhD抗原，若通过输血或妊娠的免疫刺激，先证者血浆中会存在同种抗-D抗体，若再次输注RhD阳性血液时就会发生溶血性输血反应，从而危及患者生命；先证者妊娠也会导致严重的新生儿溶血病。而在300余例正常当地人群的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。

通过上述的分析，证明该方法可以准确测定RHD基因，从而可以更加精准的确定待测者的RhD血型，对于患者制定输血政策具有重要意义。

Claims (10)

1.一种Rh血型系统中RHD变异型基因突变相关的SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点位于序列为SEQ ID NO:1的RHD血型基因Exon 4的第273位，为A>G的纯合突变。

2.一种引物对，其特征在于，所述的引物对用于检测权利要求1所述的SNP位点。

3.如权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述的引物对，其上游引物的序列为SEQID NO:2，下游引物的序列为SEQ ID NO:3。

4.权利要求2所述的引物对在制备用于检测红细胞RhD阴性血型的制品中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的制品为PCR扩增测序分子试剂盒。

6.一种用于检测红细胞RhD阴性血型的PCR扩增测序分子试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有用于检测权利要求1所述的SNP位点的引物对。

7.如权利要求6所述的PCR扩增测序分子试剂盒，其特征在于，所述的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:2，下游引物的序列为SEQ ID NO:3。

8.一种检测红细胞RhD阴性血型的方法，其特征在于，所述的方法是通过检测权利要求1所述的SNP位点存在与否来进行血型检测。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法，是使用权利要求2所述的引物对进行检测。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法，是使用权利要求6所述的PCR扩增测序分子试剂盒进行检测。