CN117286077A - 一种防治急性放射性肠损伤的益生菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种防治急性放射性肠损伤的益生菌剂及其应用，所述益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.10453的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株、保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和保藏编号为CGMCC No.1.12731的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株。三种菌株存在潜在的相互作用，能够相互促进，在防治急性放射性肠损伤的功效上协同增效。

Description

一种防治急性放射性肠损伤的益生菌剂及其应用
技术领域
本发明属于益生菌剂技术领域，涉及一种防治急性放射性肠损伤的益生菌剂及其应用。
背景技术
在外科、肿瘤内科与影像诊断等学科的支持下，以设备更新和技术进步为基础，放射治疗在消化与生殖系统肿瘤治疗中的适应证不断扩大、重要性明显提高。但是，由于正常肠道组织不可避免地受到照射，放射性毒（副）反应的存在成为进一步提高疗效的主要障碍。影响放射性肠损伤严重程度的因素较多，最主要的是所采用放疗技术、照射剂量与肠道受照射体积的差异性。因此，放射性肠道损伤防治研究具有重要的临床意义。
放射性肠损伤（又称肠炎、肠病）以腹泻为主要症状，包括腹痛、便血、体重减轻和肠梗阻等临床表现。一般以放疗后三个月前后为界分为急性和慢性两种，但在综合治疗的时代，化疗等药物的使用使得急性期与慢性期的界限变得模糊。由于慢性并发症与较严重急性期病症有明显的关系，目前的研究大多集中于急性期损伤。目前临床通过药物干预、益生菌治疗、手术等治疗放射性肠损伤，但尚不能达到令人满意的效果。在该类损伤的诊治、特别防治药物的研发方面至今对于放射性肠损伤尚缺乏真正有效的、精准的治疗方案。因此，寻找有效的电离辐射致肠道损伤防护治疗手段具有重要意义。
肠道微生态系统在维持肠道健康发挥重要作用，其主要由肠道正常菌群及其所生活的环境共同构成，肠道正常菌群是其核心部分。近来，肠道微生物组的改变作为电离辐射对肠道的“非细胞毒性效应”，在急性放射性肠损伤发生发展中的潜在作用已经崭露头角，为现有的研究提供了新的启发。最近有研究表明，放疗降低了肠道菌群的多样性，而肠道菌群的改变会导致辐射引起的副作用。因此，恢复正常肠道菌群对于治疗放射性肠损伤可能是一个有效的治疗途径。目前，基于菌群调节改善放射性肠损伤的手段主要有粪菌移植、益生菌、化合物及中草药等。
由于在治疗、减轻或预防疾病方面的疗效及安全性，益生菌已受到越来越多的关注，益生菌是指给予足够剂量时有益于宿主健康的活的微生物。目前，不同的益生菌组合已被用于预防和治疗多种类型的疾病，而用于防治急性放射性肠损伤的益生菌组合物却少之又少。开发益生菌组合物，用于防治急性放射性肠损伤，不仅对广大患者是一种福音，更是拓宽益生菌组合物应用领域。因此提供一种高效且低毒的益生菌组合物产品，用以高效的防治急性放射性肠损伤是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种防治急性放射性肠损伤的益生菌剂及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种防治急性放射性肠损伤的益生菌剂，所述益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.10453的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株、保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和保藏编号为CGMCC No.1.12731的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株。
本发明所述“放射性肠损伤”是指电离辐射所致肠损伤，为能引起物质发生电离的放射性物质或直线加速器等设备发出的射线照射所导致的肠损伤。
本发明创造性地开发了一种全新的益生菌复配方式，将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株、长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株进行复配，发现三种菌株存在潜在的相互作用，能够相互促进，在防治急性放射性肠损伤的功效上协同增效，在使用总菌量一致的情况下，与单一的Lp90菌株、单一的BL21菌株或单一的LC86菌株相比，三种菌的复配在上述功效的发挥显著提高。具体表现在：（1）能够延长电离辐射肠损伤小鼠模型的生存期和降低其临床评分；（2）保护电离辐射肠损伤小鼠模型的肠道绒毛和隐窝结构；（3）促进电离辐射肠损伤小鼠模型隐窝细胞的增殖，抑制隐窝细胞的凋亡，促进肠道干细胞的增殖。因此，该益生菌剂为防治急性放射性肠损伤提供了新的策略，其可以用于制备预防、缓解或治疗急性放射性肠损伤的相关产品中。
由于植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株、长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株均为益生菌，因此其在用于制备预防、缓解或治疗急性放射性肠损伤的相关产品时，安全性高，且不易产生抗药性。
优选地，所述益生菌剂中的总活菌数不低于1×1010 CFU/mL或1×1010 CFU/g，例如1×1010 CFU/mL（CFU/g）、5×1010 CFU/mL（CFU/g）、1×1011 CFU/mL（CFU/g）、5×1011 CFU/mL（CFU/g）、1×1012 CFU/mL（CFU/g）、1×1013 CFU/mL（CFU/g）、1×1014 CFU/mL（CFU/g）等；该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株、长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株与副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的活菌数之比为(1-2):(1-2):(1-2)，例如1:1:1、2:1:1、1:2:1、1:2:1、1:2:2、2:1:2、2:2:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
基于三种菌株的潜在相互作用关系，本发明还发现当三种菌株以上述特定的活菌数配比进行复合时，其在防治急性放射性肠损伤方面的功效更加显著。
优选地，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
本发明所涉及的益生菌剂的剂型不受限制，包括最常用的冻干粉剂，或进一步制得的胶囊剂、片剂或颗粒剂。其中冻干粉剂示例性地可以采用如下方法制得：
将Lp90菌株、BL21菌株或LC86菌株分别接种于培养基中进行培养，得到培养液；培养液离心，得到菌体；菌体用冻干保护剂重悬，得到重悬液；重悬液冻干，然后按比例将三者复配；或者在离心得到菌体后按比例混合，再用冻干保护剂重悬，得到重悬液，重悬液冻干。
优选地，所述益生菌剂还包括冻干保护剂和/或功能助剂。
所述冻干保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
所述功能助剂包括麦芽糊精、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明还提供根据第一方面所述的防治急性放射性肠损伤的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗急性放射性肠损伤的药物中的应用。
优选地，所述药物中还包括辅料，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
该益生菌剂作为药物进行使用时，具有价格低廉、毒副作用小、疗效显著、用药方便安全等优势，对于急性放射病患者、涉核从业人员等均适用，在治疗或执行工作前或过程中均可用药。
第三方面，本发明还提供根据第一方面所述的防治急性放射性肠损伤的益生菌剂在制备电离辐射所致肠隐窝细胞凋亡抑制剂或肠隐窝细胞增值促进剂中的应用。
由于本发明创造性地发现了本发明涉及的益生菌剂能够抑制电离辐射所致肠隐窝细胞凋亡以及促进肠隐窝细胞增值，因此，该益生菌剂也可以用于基础科研中，作为探究肠隐窝细胞生理行为的一种试验类试剂，也具有实际意义。
第四方面，本发明还提供根据第一方面所述的防治急性放射性肠损伤的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗电离辐射所致肠道结构损伤的药物中的应用。
第五方面，本发明还提供根据第一方面所述的防治急性放射性肠损伤的益生菌剂在制备逆转电离辐射所致肠道干细胞减少的药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地开发了一种全新的益生菌复配方式，将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株、长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株进行复配，发现三种菌株存在潜在的相互作用，能够相互促进，在防治急性放射性肠损伤的功效上协同增效，在使用总菌量一致的情况下，与单一的Lp90菌株、单一的BL21菌株或单一的LC86菌株相比，三种菌的复配在上述功效的发挥显著提高。具体表现在：（1）能够延长电离辐射肠损伤小鼠模型的生存期和降低其临床评分；（2）保护电离辐射肠损伤小鼠模型的肠道绒毛和隐窝结构；（3）促进电离辐射肠损伤小鼠模型隐窝细胞的增殖，抑制隐窝细胞的凋亡，促进肠道干细胞的增殖。因此，该益生菌剂为防治急性放射性肠损伤提供了新的策略，其可以用于制备预防、缓解或治疗急性放射性肠损伤的相关产品中。
附图说明
图1是各组小鼠的小肠组织HE染色图；
图2是各组小鼠的小肠组织绒毛长度的统计结果图；
图3是各组小鼠的小肠组织Ki67抗体免疫组化染色图；
图4是各组小鼠的平均每个隐窝的Ki67阳性细胞数和Ki67阳性隐窝数的统计结果图；
图5是各组小鼠的小肠组织抗Lgr5抗体免疫组化染色图；
图6是各组小鼠的平均每个隐窝的Lgr5阳性细胞数的统计结果图；
图7是各组小鼠的小肠组织TUNEL染色图；
图8是各组小鼠的平均每个隐窝的凋亡细胞数的统计结果图；
图9是各组小鼠的生存曲线图；
图10是各组小鼠的临床评分结果图；
图1-10中数据使用R语言（R 4.2.2）ggplot2函数进行统计分析，与模型组（照射组）相比，“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01，“***”表示 p<0.001。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述内容中涉及的蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、酵母粉、柠檬酸氢二铵、K2PO4·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4、吐温80和半胱氨酸盐酸盐购自国药集团化学试剂有限公司；SPF级雄性6周龄C57BL/6J小鼠及普通饲料购自上海斯莱克公司。
下述实施例中涉及的培养基配方如下：
MRS培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
下述实施例所涉及的Lp90菌株的分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2015年01月27日，保藏编号为CGMCC No.10453，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述实施例所涉及的BL21菌株的分类命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2015年01月27日，保藏编号为CGMCC No.10452，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述实施例所涉及的LC86菌株的分类命名为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年07月20日，保藏编号为CGMCC No.1.12731，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述实施例中涉及的菌悬液：将各菌株分别接种于脱脂乳中，37℃下培养18 h进行活化，得到活化液；将活化液按4%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养20h，得到菌液；用生理盐水稀释即得。
实施例1
本实施例验证益生菌剂对X射线辐射致肠道损伤小鼠模型的肠道结构和隐窝结构的影响，步骤如下：
（1）试验动物：6周龄C57BL/6雄性小鼠（23±2g）36只，动物房（室温：23-25℃，湿度：50-70%，照明10±0.5 h）中用普通饲料适应性饲养一周（自由饮食和饮水）。
（2）分组：适应性饲养后，将小鼠随机分成6组：对照组、模型组（照射组）、Lp90组、BL21组、LC86组、复合益生菌组（Lp90+BL21+LC86组），6只/组。
（3）干预方法：
益生菌干预组（Lp90组、BL21组、LC86组、复合益生菌组）分别均以1×109 CFU/天的总菌液灌胃（复合益生菌组中Lp90、BL21、LC86的活菌数之比为1:1:1），对照组灌胃同等体积的生理盐水，连续30天。然后除对照组外，其他各组小鼠均用X射线源对小鼠进行全腹单次均匀照射，照射剂量为13Gy。
（4）对小鼠肠道结构的影响：
分别于照射后3天取小鼠小肠组织，固定、蜡块包埋，切片后进行HE染色。结果如图1所示，由图可知，电离辐射会明显导致小鼠小肠绒毛断裂、脱落；益生菌干预后肠道结构与正常对照组类似，绒毛整齐、完整。对各组的绒毛长度进行定量分析，统计结果如图2所示，由图可知，与单一菌株相比，复合益生菌组在延长接受电离辐射照射小鼠的小肠绒毛长度方面的效果更好。
（5）对小鼠肠道隐窝细胞增殖的影响：
按照（4）的处理方式收集小鼠小肠组织，固定、蜡块包埋，切片后用抗Ki67抗体进行免疫组化染色，Ki67是细胞增殖的标志分子之一。结果如图3所示，由图可知，正常对照组小鼠肠道隐窝呈Ki67阳性，表明隐窝细胞具有持续增殖能力，照射组小鼠照后3天的肠道Ki67阳性隐窝数显著降低，益生菌干预后可以不同程度地缓解肠道Ki67阳性隐窝数的降低。对各组小鼠肠道平均每个隐窝的Ki67阳性细胞数和Ki67阳性隐窝数进行统计，结果如图4所示，由图可知，与单一菌株相比，复合益生菌组在提高平均每个隐窝的Ki67阳性细胞数和Ki67阳性隐窝数方面的效果更好。
（6）对小鼠肠道干细胞数量的影响：
按照（4）的处理方式收集小鼠小肠组织，固定、蜡块包埋，切片后用抗Lgr5抗体进行免疫组化染色，Lgr5为肠道干细胞的标志物。结果如图5所示，由图可知，照射组小鼠照后3天的肠道Lgr5阳性细胞比例显著降低，益生菌干预后可以不同程度地缓解肠道Lgr5阳性细胞的降低。对各组小鼠肠道平均每个隐窝的Lgr5阳性细胞数进行统计，结果如图6所示，由图可知，与单一菌株相比，复合益生菌组在提高平均每个隐窝的Lgr5阳性细胞数方面的效果更好。
实施例2
本实施例验证益生菌剂对X射线辐射致肠道损伤小鼠模型的隐窝细胞凋亡的影响，步骤如下：
（1）试验动物：6周龄C57BL/6雄性小鼠（23±2g）36只，动物房（室温：23-25℃，湿度：50-70%，照明10±0.5 h）中用普通饲料适应性饲养一周（自由饮食和饮水）。
（2）分组：适应性饲养后，将小鼠随机分成6组：对照组、模型组（照射组）、Lp90组、BL21组、LC86组、复合益生菌组（Lp90+BL21+LC86组），6只/组。
（3）干预方法：
益生菌干预组（Lp90组、BL21组、LC86组、复合益生菌组）分别均以1×109 CFU/天的总菌液灌胃（复合益生菌组中Lp90、BL21、LC86的活菌数之比为1:1:1），对照组灌胃同等体积的生理盐水，连续30天。然后除对照组外，其他各组小鼠均用X射线源对小鼠进行全腹单次均匀照射，照射剂量为13Gy。
（4）对小鼠肠道隐窝细胞凋亡的影响：
分别于照射后6 h后取小鼠小肠组织，固定、蜡块包埋，切片后进行TUNEL染色。结果如图7所示，由图可知，电离辐射会导致肠道隐窝细胞发生凋亡，破坏肠道结构的再生能力，而益生菌干预后可以显著抑制电离辐射诱发的小鼠肠道隐窝细胞凋亡。对各组小鼠肠道平均每个隐窝的凋亡细胞数进行统计，结果如图8所示，由图可知，与单一菌株相比，复合益生菌组在抑制肠道隐窝细胞凋亡方面的效果更好。
实施例3
本实施例验证益生菌剂对X射线辐射致肠道损伤小鼠模型的生存期以及临床评分的影响，步骤如下：
（1）试验动物：6周龄C57BL/6雄性小鼠（23±2g）36只，动物房（室温：23-25℃，湿度：50-70%，照明10±0.5 h）中用普通饲料适应性饲养一周（自由饮食和饮水）。
（2）分组：适应性饲养后，将小鼠随机分成6组：对照组、模型组（照射组）、Lp90组、BL21组、LC86组、复合益生菌组（Lp90+BL21+LC86组），6只/组。
（3）干预方法：
益生菌干预组（Lp90组、BL21组、LC86组、复合益生菌组）分别均以1×109 CFU/天的总菌液灌胃（复合益生菌组中Lp90、BL21、LC86的活菌数之比为1:1:1），对照组灌胃同等体积的生理盐水，连续30天。然后除对照组外，其他各组小鼠均用X射线源对小鼠进行全腹单次均匀照射，照射剂量为13Gy。
（4）对小鼠生存期以及临床评分的影响：
对各组小鼠的死亡情况进行统计，绘制生存曲线，结果如图9所示，由图可知，本发明所涉及的益生菌剂可以显著延长电离辐射小鼠的生存期，比单一Lp90、BL21或LC86干预的效果更好。且对各组小鼠一般情况和体征指标进行统计，计算临床评分，临床评分评判方法如下表：
临床评分统计结果如图10所示，由图可知，本发明所涉及的益生菌剂可以显著降低电离辐射小鼠的临床评分值，比单一Lp90、BL21或LC86干预的效果更好（其中照射组小鼠死亡无粪便产出）。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种防治急性放射性肠损伤的益生菌剂及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种防治急性放射性肠损伤的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.10453的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株、保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和保藏编号为CGMCCNo.1.12731的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株。
2.根据权利要求1所述的防治急性放射性肠损伤的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中的总活菌数不低于1×1010 CFU/mL或1×1010 CFU/g。
3.根据权利要求1所述的防治急性放射性肠损伤的益生菌剂，其特征在于，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株、长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株与副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的活菌数之比为(1-2):(1-2):(1-2)。
4.根据权利要求1所述的防治急性放射性肠损伤的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
5.根据权利要求1所述的防治急性放射性肠损伤的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括冻干保护剂和/或功能助剂；
所述冻干保护剂包括脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合；
所述功能助剂包括麦芽糊精、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的防治急性放射性肠损伤的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗急性放射性肠损伤的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物中还包括辅料，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的防治急性放射性肠损伤的益生菌剂在制备电离辐射所致肠隐窝细胞凋亡抑制剂或肠隐窝细胞增值促进剂中的应用。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的防治急性放射性肠损伤的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗电离辐射所致肠道结构损伤的药物中的应用。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的防治急性放射性肠损伤的益生菌剂在制备逆转电离辐射所致肠道干细胞减少的药物中的应用。
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