CN117269473A - 用于放大信号的生物探针包被方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于放大信号的生物探针包被方法，其中包括将氨基化后的Ficoll 400与交联剂Ⅰ反应并还原巯基，将目标抗体经交联剂Ⅱ修饰后与已活化的Ficoll 400复合物反应，加入NEM封闭，形成包被液。引入的聚合物Ficoll 400，其与抗体形成的树状接枝结构，极大提高探针表面的抗体载量，显著提升生物探针的检测灵敏度。本方案中交联剂Ⅱ与抗体的氨基反应，抗体的氨基暴露在外可直接参与反应，因此该反应可直接适用于所有抗体，无需另外对抗体进行化学修饰使巯基暴露。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及用于放大信号的生物探针包被方法。
背景技术
现有的包被工艺中，在生物传感器的表面用APTS(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)修饰，例如：在生物传感器的表面经APTS修饰后表面接入氨基，氨基可与蛋白质等进行共价偶联，从而实现抗体(蛋白质)包被，其中，APTS的一端通过Si-O-Si键偶联至生物探针上，另一端的氨基与交联剂共价连接，如采用SMCC交联剂，SMCC一端的N-羟基琥珀酰亚胺酯与APTS一端的氨基形成酰胺键共价连接，SMCC的另一端为马来酰亚胺基团，与抗体中的巯基特异性反应生成硫醚键，两者共价偶联，至此，抗体以化学键的方式连接至生物探针上，化学键结合的包被方式通常需要较长的包被时间，加工效率较低；另外，抗体具有氨基与巯基，氨基暴露在外可直接参与反应，上述工艺中，抗体通过巯基与交联剂反应，但部分抗体的巯基未必暴露，碰到巯基未曾暴露的抗体需要先对其进行化学修饰从而使巯基暴露才能参与反应，因此，上述工艺无法直接适用于所有抗体。
同时，现有技术中，一些检测方式，如：采用磁性微粒进行化学发光法检测，由于磁性微粒比表面积大，反应面积大，因此能够提升信号强度，但是，该包被方式还存在一些问题，如：1、磁性微粒在工作液中通常容易聚集，导致其工作液均一性差，会出现CV偏高等问题；2、磁性微粒表面通常为特定基团，如氨基，氨基容易与血液中的一些负电荷物质非特异结合，干扰因素多，易造成检测结果假阳；3、磁性微粒系统检测时间较长，过程中还需要用到很多液路，如磁珠清洗，激发液与预激发液液路等，导致仪器体型庞大，结构复杂，成本较高。
石英探针可解决磁性微粒所存在的上述问题，但是，石英探针的反应面积较小，石英探针本身体积较小，且其有效反应面积是底端的部分侧面加该端端面，而磁性微粒的反应面积通常在石英探针的反应面积的10倍及以上，因此，采用与磁性微粒相同包被工艺的石英探针在进行检测时，信号比磁性微粒差很多，因此需要通过改进石英探针表面的包被工艺，从而在反应面积较小的情况下提升信号强度。
发明内容
因此，为解决上述问题，本发明提供了用于放大信号的生物探针包被方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
用于放大信号的生物探针包被方法，包括以下步骤：
(1)对Ficoll 400进行预处理，使其被氨基化；
(2)将氨基化后的Ficoll 400与交联剂Ⅰ反应，并将反应后的液体用还原剂还原巯基；
(3)目标抗体与交联剂Ⅱ混合，并通过目标抗体中的氨基与交联剂Ⅱ反应；
(4)将步骤(2)所得液体与步骤(3)所得液体进行偶联反应，反应完全后加入NEM封闭，形成包被液；
(5)对探针进行APTS气相沉积修饰，并将修饰后的探针用步骤(4)所制备的包被液包被300秒-1800秒后烘干，制得生物探针；
其中，所述交联剂Ⅰ为胺和巯基反应性的异双功能交联剂，所述交联剂Ⅱ为带有聚乙二醇的SMCC衍生双功能交联剂。
优选的，所述目标抗体与Ficoll 400的摩尔比为5:1，交联剂Ⅱ与目标抗体的摩尔比为10:1，NEM与交联剂Ⅱ的摩尔比为10:1，交联剂Ⅰ与氨基化后的Ficoll 400的摩尔比为50:1。
优选的，所述交联剂Ⅰ为SPDP，所述交联剂Ⅱ为SM(PEG)8、SM(PEG)12、SM(PEG)24中的一种。
优选的，步骤(1)包括以下步骤：
(1.1)高碘酸钠与Ficoll 400均匀混合后，用乙二醇溶液终止反应后再用脱盐柱纯化；
(1.2)将步骤(1.1)所得产物与过量乙二胺反应，用脱盐柱纯化；
(1.3)用硼氢化钠终止步骤(1.2)中的反应后，用脱盐柱纯化。
优选的，步骤(1.1)中，高碘酸钠与Ficoll 400的摩尔比为1000:1，混合后室温避光静置30分钟；乙二胺与Ficoll 400的摩尔比为50万:1，加入乙二醇溶液后室温避光静置30分钟；步骤(1.2)中，乙二胺与Ficoll 400的摩尔比为50万:1；步骤(1.3)中，硼氢化钠与Ficoll 400的摩尔比为1.0万—5.0万:1，所述还原剂为DTT，所述DTT的工作浓度要求为25mmol/L。
优选的，还包括所述脱盐柱的预制备，包括如下步骤：
(a)取9支脱盐离心柱，分别编号1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#，其中，编号为1#、2#、3#、4#、5#的脱盐离心柱的规格为5ml，编号为6#、7#、8#、9#的脱盐离心柱的规格为10ml，掰断柱子尾部并松开盖子，将柱子置于收集管中；
(b)每支脱盐离心柱均采用1000×g离心2分钟，去除储存液，并在压实树脂倾斜顶端的管壁上做标记，之后所有的离心步骤中将柱子标记处朝外放入离心机；(c)向1#、2#、3#、4#、5#中缓慢加入5次2.5ml PBS/碳酸盐缓冲液，前4次加入PBS/碳酸盐缓冲液后均采用1000×g离心2分钟去除PBS/碳酸盐缓冲液，第5次加入PBS/碳酸盐缓冲液后，拧紧盖子，静置备用；
(d)向6#、7#、8#、9#中缓慢加入5次5ml PBS，前4次加入PBS后均采用1000×g离心2分钟去除PBS，第5次加入PBS后，拧紧盖子，静置备用；
其中，步骤(c)中，1#、2#柱加入碳酸盐缓冲液，3#、4#、5#柱加入PBS。
优选的，所述步骤(1)包括以下步骤：
(1.1)高碘酸钠与Ficoll 400均匀混合后，用乙二醇溶液终止反应后再用脱盐柱纯化；
(1.1.1)取1ml Ficoll 400溶液，加入50μl NaIO4溶液后充分混匀，室温避光静置30分钟；
(1.1.2)取50μl乙二醇溶液加入上述反应液中，室温避光静置30分钟；
(1.1.3)取1#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤(1.1.2)所得溶液，
1000×g离心2分钟后收集滤液；
(1.2)将步骤(1.1)所得产物与过量乙二胺反应，用脱盐柱纯化；
(1.2.1)在步骤(1.1.3)收集的滤液中加入0.92ml乙二胺溶液，充分混匀后室温避光反应3小时；
(1.2.2)取2#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤(1.2.1)所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液；
(1.3)用硼氢化钠终止步骤(1.2)中的反应后，用脱盐柱纯化。
(1.3.1)在步骤(1.2.2)收集的滤液中加入100μl硼氢化钠溶液，充分混匀后4℃避光反应2小时；
(1.3.2)取3#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤(1.3.1)所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液，制得氨基化后的Ficoll 400。
优选的，所述步骤(2)包括以下步骤：
(2.1)在氨基化后的Ficoll 400中加入39.2μl SPDP母液，充分混匀后室温避光静置30分钟；
(2.2)取4#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤(2.1)所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液；
(2.3)在步骤(2.2)收集的滤液中加入54μl DTT溶液，充分混匀后室温避光静置30分钟；
(2.4)取5#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤(2.3)所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液，4℃暂存备用。
优选的，所述步骤(3)包括以下步骤：
(3.1)取6#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，同时取20mg抗体，若抗体浓度大于5mg/ml，则用PBS稀释至4ml，若抗体浓度小于5mg/ml则用超滤管浓缩至4ml，将抗体缓慢注入6#柱后，1000×g离心2分钟，收集滤液，获得目标抗体，并在4℃存储备用；
(3.2)取20mg目标抗体，加入86.2μl SM(PEG)8母液，充分混匀后室温避光静置30分钟；
(3.3)取7#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤(3.2)所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液。
优选的，所述步骤(4)包括以下步骤：
(4.1)将步骤(2.4)所得液体全部加入到步骤(3.3)所得液体中，充分混匀后室温避光静置2小时；
(4.2)在步骤(4.1)所得溶液中加入156.4μl NEM母液，充分混匀后室温避光静置30分钟；
(4.3)取8#、9#柱，分别在1000×g离心2分钟后弃滤液，再将步骤(4.2)所得溶液均分成两份，分别加入8#、9#柱中，继续1000×g离心2分钟后收集滤液，将滤液移至同一管中充分混匀，用微量蛋白分析仪进行蛋白浓度检测；
(4.4)将步骤(4.3)收集的滤液用PBS稀释至20μg/ml，获得包被液。
本发明技术方案的有益效果主要体现在：
1、本发明采用两种交联剂，交联剂Ⅰ与氨基化的Ficoll 400反应，再经还原剂还原得到巯基，交联剂Ⅱ与抗体的氨基反应。然后交联剂Ⅱ的马来酰亚胺与交联剂Ⅰ的巯基特异性反应生成硫醚键，将Ficoll 400与目标抗体连接。由于交联剂Ⅱ是与抗体的氨基反应，抗体的氨基天然暴露在外可直接参与反应，因此该模式可直接适用于所有抗体，无需另外对抗体进行化学修饰使其暴露巯基。
2、本发明引入Ficoll 400聚合物，其与抗体形成的树状接枝结构，可极大提高探针的抗体载量，大大增加探针的反应面积，在将单分子Ficoll 400上的羟基全部转化为氨基时，单分子Ficoll 400与交联剂Ⅰ之间可达到8个连接点，即理论上单分子Ficoll 400可通过交联剂Ⅱ与8个抗体偶联，又因聚蔗糖Ficoll400是由约400个单分子Ficoll 400聚合而成，所以其与抗体偶联最终形成的树状接枝结构，相对于现有技术中采用APTS一端通过交联剂SMCC与目标抗体连接的单链结构来说，可成百上千倍地增加探针表面的抗体数量，从而增强信号，有效解决探针反应面积不足的问题，同时提高生物探针的检测灵敏度，提升检测上限，提高了试剂盒的整体试剂性能。
3、本发明使用带有聚乙二醇的SMCC衍生双功能交联剂与抗体反应，该交联剂上修饰的聚乙二醇具有无毒、非免疫原性、高亲水性、良好水溶性和高度柔韧性。因此用该交联剂修饰的抗体，不仅引入了反应必备的马来酰亚胺基团，还进行了蛋白质聚乙二醇化，蛋白质聚乙二醇化可以提高修饰蛋白的稳定性，保护其免受蛋白水解消化，增加其在生物应用中的半衰期，掩盖其引起免疫原性反应，降低其抗原性或潜在毒性，提高其溶解度，减少聚集的可能性，并最大限度地减少体外和体内的干扰应用，从而增加交联率，增强了反应信号，提高反应性。
4、本发明的包被方法中，生物探针表面的APTS与抗体因物理吸附而快速结合，即两者在疏水作用力下产生了结合，在包被过程中，生物探针与包被液之间无需再通过化学键结合，较现有技术极大缩短了一轮包被周期，因此，APTS探针的包被时间在500秒时即可达到较好的检测效果，大大降低了时间成本。
附图说明
图1：本发明实施例1所用工艺包被的生物探针在进行检测三后所获得的线性范围示意图；
图2：现有包被工艺所制备的生物探针在进行检测三后所获得的线性范围示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、优点和特点能够更加清楚、详细地展示，将通过下面优选实施例的非限制性说明进行图示和解释。该实施例仅是应用本发明技术方案的典型范例，凡采取等同替换或者等效变换而形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
本发明揭示了用于放大信号的生物探针包被方法，包括以下步骤：
(1)对Ficoll 400进行预处理，使其被氨基化；
(2)将氨基化后的Ficoll 400与交联剂Ⅰ反应，并将反应后的液体用还原剂还原巯基；
(3)目标抗体与交联剂Ⅱ混合，并通过目标抗体中的氨基与交联剂Ⅱ反应；
(4)将步骤(2)所得液体与步骤(3)所得液体进行偶联反应，反应完全后加入NEM封闭，形成包被液；
(5)对探针进行APTS气相沉积修饰，并将修饰后的探针用步骤(4)所制备的包被液包被300秒-1800秒后烘干，制得生物探针；
其中，所述交联剂Ⅰ为胺和巯基反应性的异双功能交联剂，所述交联剂Ⅱ为带有聚乙二醇的SMCC衍生双功能交联剂。
所述Ficoll 400为聚合物，平均分子量为400000道尔顿，其单分子结构式如下：
由上述结构式可知，Ficoll 400在单分子状态下具备8个羟基，本文所述将Ficoll400“氨基化”是指将羟基转化为氨基，从而使Ficoll 400可与交联剂Ⅰ反应，在将单分子Ficoll 400上的羟基全部转化为氨基时，单分子Ficoll400与交联剂Ⅰ之间可达到8个连接点，即理论上单分子Ficoll 400可通过交联剂Ⅱ与8个抗体偶联，又因聚蔗糖Ficoll 400是由约400个单分子Ficoll 400聚合而成，所以其与抗体偶联最终形成的树状接枝结构，相对于现有技术中APTS一端通过交联剂SMCC与目标抗体连接的单链结构，理论上可成百上千倍地增加探针表面偶联的抗体数量，从而增强信号，有效解决了探针反应面积不足的问题。
在一些实施例中，所述目标抗体与Ficoll 400的摩尔比为5:1，交联剂Ⅱ与目标抗体的摩尔比为10:1，NEM与交联剂Ⅱ的摩尔比为10:1，交联剂Ⅰ与氨基化后的Ficoll 400的摩尔比为50:1。
在一些实施例中，所述交联剂Ⅰ为SPDP，所述交联剂Ⅱ为SM(PEG)8、SM(PEG)12、SM(PEG)24中的一种，在一优选实施例中，所述交联剂Ⅰ为ThermoFisher所产的货号为21857的SPDP，其中，SPDP试剂是胺和巯基反应性的异双功能交联剂，反应基团为N-羟基琥珀酰亚胺酯和吡啶基二硫化物，其中，氨基化后的Ficoll400通过氨基与交联剂SPDP上的N-羟基琥珀酰亚胺酯形成稳定酰胺键，所述交联剂Ⅱ为ThermoFisher所产的货号为22108的SM(PEG)8，SM(PEG)8的反应基团包括N-羟基琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺基团，抗体上的氨基与交联剂SM(PEG)8上的N-羟基琥珀酰亚胺酯形成酰胺键，SPDP经DTT还原后暴露巯基，巯基与SM(PEG)8上的马来酰亚胺基团特异性反应生成硫醚键，使得氨基化的Ficoll 400与抗体经两种交联剂之间的偶联结合在一起。
在一些实施例中，所述步骤(1)包括以下步骤：
(1.1)高碘酸钠与Ficoll 400均匀混合后，用乙二醇溶液终止反应后再用脱盐柱纯化；
(1.2)将步骤(1.1)所得产物与过量乙二胺反应，用脱盐柱纯化；
(1.3)用硼氢化钠终止步骤(1.2)中的反应后，用脱盐柱纯化。
在一优选实施例中，步骤(1.1)中，高碘酸钠与Ficoll 400的摩尔比为1000:1，混合后室温避光静置30分钟，乙二胺与Ficoll 400的摩尔比为50万:1，加入乙二醇溶液后室温避光静置30分钟。
在一优选实施例中，步骤(1.2)中，乙二胺与Ficoll 400的摩尔比为50万:1。
在一些实施例中，步骤(1.3)中，硼氢化钠与Ficoll 400的摩尔比为1.0万—5.0万:1，所述还原剂为DTT，所述DTT的工作浓度要求为25mmol/L。
实施例1：
脱盐柱的预制备：
(a)取9支脱盐离心柱，分别编号1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#，其中，编号为1#、2#、3#、4#、5#的脱盐离心柱的规格为5ml，编号为6#、7#、8#、9#的脱盐离心柱的规格为10ml，掰断柱子尾部并松开盖子，将柱子置于收集管中；
(b)每支脱盐离心柱均采用1000×g离心2分钟，去除储存液，并在压实树脂倾斜顶端的管壁上做标记，之后所有的离心步骤中将柱子标记处朝外放入离心机；(c)向1#、2#、3#、4#、5#中缓慢加入5次2.5ml PBS/碳酸盐缓冲液，前4次加入PBS/碳酸盐缓冲液后均采用1000×g离心2分钟去除PBS/碳酸盐缓冲液，第5次加入PBS/碳酸盐缓冲液后，拧紧盖子，静置备用；
(d)向6#、7#、8#、9#中缓慢加入5次5ml PBS，前4次加入PBS后均采用1000×g离心2分钟去除PBS，第5次加入PBS后，拧紧盖子，静置备用；
其中，步骤(c)中，1#、2#柱加入碳酸盐缓冲液，3#、4#、5#柱加入PBS。包被液中各反应溶液配制：
1、Ficoll 400溶液：称取100mg Ficoll 400溶解于10ml去离子水中，充分溶解后备用；
2、NaIO4溶液：称取1.0695克NaIO4溶解于10ml去离子水中，充分溶解，现配现用；
3、乙二醇溶液：取2.787ml乙二醇与7.213ml去离子水，充分混匀后备用；
4、乙二胺溶液：为乙二胺，一水(厂家阿拉丁，货号E112132)；
5、NaBH4溶液：称取2.2253克NaBH4溶解于10ml去离子水中，充分溶解，现配现用；
6、SPDP母液：称取5mg SPDP溶解于0.5ml二甲基亚砜中，充分溶解后备用；
7、DTT溶液：为DTT溶液(厂家阿拉丁，货号D301909)，浓度1M；
8、SM(PEG)8母液：称取5mg SM(PEG)8溶解于0.5ml去离子水中，充分溶解，现配现用；
9、NEM溶液：称取5mg NEM溶解于0.5ml去离子水中，充分溶解，现配现用；10、PBS：称取NaHPO4·12H2O 14.31克，KH2PO4 1.08克，NaCl 9.0克，KCl 0.2克，溶于950ml去离子水中，用6M NaOH/HCl微调pH值至7.4±0.01，最后定容至1000ml；
11、碳酸盐缓冲液：称取0.75g碳酸钠与1.46g碳酸氢钠溶于480ml去离子水中，用6M NaOH/HCl微调pH值至9.60±0.01，最后定容至500ml；
12、乙二胺母液：取5ml乙二胺，一水(产品品牌为阿拉丁，货号为E112132)用去离子水定容至50ml，配制成10％母液，现配现用。
还包括以下步骤：
(1)对Ficoll 400进行预处理，使其被氨基化；
(1.1)高碘酸钠与Ficoll 400均匀混合后，用乙二醇溶液终止反应后再用脱盐柱纯化；
(1.1.1)取1ml Ficoll 400溶液，加入50μl NaIO4溶液后充分混匀，室温避光静置30分钟；
(1.1.2)取50μl乙二醇溶液加入上述反应液中，室温避光静置30分钟；
(1.1.3)取1#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤(1.1.2)所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液；
(1.2)将步骤(1.1)所得产物与过量乙二胺反应，用脱盐柱纯化；
(1.2.1)在步骤(1.1.3)收集的滤液中加入0.92ml乙二胺溶液，充分混匀后室温避光反应3小时；
(1.2.2)取2#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤(1.2.1)所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液；
(1.3)用硼氢化钠终止步骤(1.2)中的反应后，用脱盐柱纯化。
(1.3.1)在步骤(1.2.2)收集的滤液中加入100μl硼氢化钠溶液，充分混匀后4℃避光反应2小时；
(1.3.2)取3#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤(1.3.1)所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液，制得氨基化后的Ficoll 400；
(2)将步骤(1.3.2)制得的氨基化后的Ficoll 400与交联剂Ⅰ反应，并将反应后的液体用还原剂还原巯基；
(2.1)在氨基化后的Ficoll 400中加入39.2μl SPDP母液，充分混匀后室温避光静置30分钟；
(2.2)取4#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤(2.1)所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液；
(2.3)在步骤(2.2)收集的滤液中加入54μl DTT溶液，充分混匀后室温避光静置30分钟；
(2.4)取5#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤(2.3)所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液，4℃暂存备用
(3)目标抗体与交联剂Ⅱ混合，并通过目标抗体中的氨基与交联剂Ⅱ反应；
(3.1)取6#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，同时取20mg抗体，若抗体浓度大于5mg/ml，则用PBS稀释至4ml，若抗体浓度小于5mg/ml则用超滤管浓缩至4ml，将抗体缓慢注入6#柱后，1000×g离心2分钟，收集滤液，获得目标抗体，并在4℃存储备用；
(3.2)取20mg目标抗体，加入86.2μl SM(PEG)8母液，充分混匀后室温避光静置30分钟；
(3.3)取7#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤(3.2)所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液。
(4)将步骤(2)所得液体与步骤(3)所得液体进行偶联反应，反应完全后加入NEM封闭，形成包被液；
(4.1)将步骤(2.4)所收集的滤液全部加入到步骤(3.3)所收集的滤液中，充分混匀后室温避光静置2小时；
(4.2)在步骤(4.1)所得溶液中加入156.4μl NEM母液，充分混匀后室温避光静置30分钟；
(4.3)取8#、9#柱，分别在1000×g离心2分钟后弃滤液，再将步骤(4.2)所得溶液均分成两份，分别加入8#、9#柱中，继续1000×g离心2分钟后收集滤液，将滤液移至同一管中充分混匀，用微量蛋白分析仪进行蛋白浓度检测；
其中，若短期内(一周内)需使用该“滤液”，则放置于4℃保存，否则添加等体积甘油放置于-20℃保存；
(4.4)将步骤(4.3)收集的滤液用PBS稀释至20μg/ml，获得包被液。
上述工艺中，不随抗体种类与抗体数量而改变的各反应溶液的量值如下：
a.交联时目标抗体与Ficoll 400的摩尔比为5:1(实施例1中所用的目标抗体的分子量为160KD)；
b.交联剂SM(PEG)8与目标抗体的摩尔比为10:1；
c.NEM与SM(PEG)8的摩尔比为10:1；
d.SPDP与氨基化Ficoll 400的摩尔比为50:1；
e.NaIO4与Ficoll 400的摩尔比为1000:1；
f.乙二醇与NaIO4的摩尔比为10:1；
g.乙二胺与Ficoll 400的摩尔比为50万:1；
h.NaBH4与Ficoll 400的摩尔比约为2.4万:1；
i.DTT的工作浓度要求为25mM；
(5)对探针进行APTS气相沉积修饰，并将修饰后的探针用步骤(4.4)所制备的包被液进行包被；。
其中，包被的具体步骤包括：
(5.1)将步骤(4.4)所制备的包被液添加至96孔板中，每孔210μl，放96孔板于塔式包被机相应位置；
(5.2)用塔式包被机对APTS探针进行包被，包被时间为500秒，每孔包被20人份探针，共计约9.5万人份；
(5.3)将该批次生物探针移至42℃烘箱烘6小时。
随后，将包被后的生物探针用MAX盒收装并进行密封干燥保存，所述生物探针优选采用石英针。
对比测试实施例1和现有包被工艺：
现有探针包被工艺，采用现有的包被工艺，在生物传感器的表面经APTS修饰后，APTS的一端通过Si-O-Si键偶联至生物探针上，另一端的氨基与SMCC交联剂共价连接，并通过SMCC交联剂连接目标抗体；如图1、图2所示，例如如下步骤：
S1：取210μL SMCC母液，用PBS稀释至21mL(所述SMCC工作液浓度为0.1mg/mL)，将SMCC工作液添加至第一96孔板中，每孔210μL，将第一96孔板放置于塔式包被机的第一包被区域；
S2：将200μL处理过的抗体用PBS稀释至20mL，制得浓度为20μg/ml的抗体工作液，将抗体工作液添加至第二96孔板中，每孔200μL，并将第二96孔板放置于塔式包被机的第二包被区域；
S3：将PBS添加至第三96孔板中，每孔230μL，并将第三96孔板放置于塔式包被机的第三包被区域；
S4：开机，塔式包被机会自动对APTS探针进行包被，96根APTS探针进入第一包被区域，并伸入第一96孔板中进行包被，包被时间为30分钟，然后再进入第三包被区域，并伸入第三96孔板中进行清洗，清洗时间为20秒，最后再进入第二包被区域，并伸入第二96孔板中反应，包被时间为30分钟；
其中，第二96孔板、第三96孔板中的每孔均包被20人份APTS探针，即每个孔中的试剂均可重复进行20轮包被，每轮包被完成后，在下一轮包被开始前，需重新制备并替换所述第一96孔板中的SMCC工作液；
S5：将该批次生物探针移至42℃烘箱烘6小时；
S6：用MAX盒收装生物探针并进行密封干燥保存。
上述包被工艺中，各材料的预制备方法如下：
PBS：称取NaHPO4·12H2O 14.31克，KH2PO4 1.08克，NaCl 9.0克，KCl 0.2克，溶于950ml去离子水中，用6M NaOH/HCl微调pH值至7.4±0.01，最后定容至1000ml；
SMCC母液：称取5mg SMCC(厂家ThermoFisher，货号22360)溶解于0.5ml二甲基亚砜中，充分溶解后备用；
脱盐柱预处理：
取1支0.5ml规格的脱盐离心柱(厂家ThermoFisher，货号87767)，编号10#，进行如下操作：1.掰断柱子尾部并松开盖子，将柱子置于一个收集管中，通过1000×g离心2分钟去除管中储存液，在压实树脂倾斜顶端的管壁上做一个标记，之后所有的离心步骤中将柱子标记处朝外放入离心机；2.向柱子中缓慢加入200μL PBS，1000×g离心2分钟去除PBS；3.重复步骤2，重复5次，最后一次离心后加入200μL PBS，拧紧盖子，静置备用。
抗体预处理：
取10#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，取0.4mg细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)抗体用PBS稀释至200μL(若抗体浓度小于2mg/ml则用超滤管浓缩至200μL)，缓慢注入脱盐离心柱中，尽量避免产生气泡，1000×g离心2分钟，收集滤液，4℃暂存备用。
APTS探针准备：
用专业设备对探针进行APTS气相沉积修饰，制得APTS探针。
分别使用上述现有包被工艺制成的生物探针和本发明实施例1所包被的生物探针对不同浓度的校准品进行上机检测，检测中所采用的校准品、样品以及其他检测试剂均一致，测试数据如下：
检测一：对不同浓度的校准品进行测试，测试数据如下：
检测二：针对空白校准品(浓度为0.0ng/ml的校准品)、低浓度校准品(浓度为2.5ng/ml的校准品)、中等浓度校准品(浓度为10.0ng/ml的校准品)以及高浓度校准品(浓度为160.0ng/ml的校准品)进行复测，共复测10次，记录每次测试结果如下：
上述测试结果中，从分离度上看，由于实施例1的生物探针包被方法放大了信号，使得检测灵敏度，尤其是低浓度校准品的灵敏度明显优于现有工艺，使0.1ng/ml浓度的校准品得以被准确检测，另外高浓度校准品分离度也明显提升，从分离度上看500ng/ml可以被准确检测，因此检测上限完全可以达到500ng/ml以上，而现有工艺将检测上限提高至500ng/ml以上时，难以实现准确检测；从LOD上看，现有工艺的LOD在0.1ng/ml之上，实施例1所用工艺包被的生物探针的LOD在0.1ng/ml之下，有效提升了试剂的灵敏度。
检测三：取已有知名厂家的权威测值的25份血浆/血清样本，其中，10份样本值在0.1ng/ml-0.3ng/ml(低值)，5份样本值在4.0ng/ml左右(CutOff值)，5份样本值在50ng/ml左右(中值)，5份样本值在500ng/ml(高值)左右，测值数据如下：
其中，相关性R优选应大于0.99，偏差值优选应小于10％，最低标准中，相关性R应大于0.95，偏差值应小于15％；根据上述样本测值可知，通过本发明实施例1的包被工艺所制得的生物探针，在检测0.1ng/ml-0.3ng/ml的低值样本与500ng/ml左右的高值样本时，其相关性和偏差幅度均符合要求，而现有工艺无法达到上述相关性和偏差标准。
综上所述，本发明工艺对反应信号有明显的增强作用，提升了试剂盒的性能。
实施例2：
按照实施例1的包被方法，将降钙素原(PCT)抗体和甲胎蛋白(AFP)抗体作为目标抗体进行小样包被，然后对相应校准品进行测值，与现有工艺进行信号比对，比对结果如下：
在包被不同项目抗体后，本发明的检测结果均优于现有技术，现有技术中，对碰到巯基未暴露的抗体需要对其先进行化学修饰使其暴露巯基才能进行抗体包被，而本发明工艺用的是抗体的氨基，抗体均有氨基暴露在外，所以本发明理论上适用于所有抗体包被，同时本发明还可以统一生产工艺，方便生产管控，减少因额外因素涉入而造成的生产事故。
对比例1：
将实施例1的交联剂Ⅱ由SM(PEG)8母液替换为SMCC母液，且步骤(3.2)中，SMCC母液的添加量调整为41.8μl，此时SMCC与目标抗体的摩尔比保持不变(10:1)，其余数量关系也不变，按照探针包被步骤进行小样包被，包被出来的生物探针与现有工艺生产的生物探针以及实施例1生产的生物探针进行信号比对，比对结果如下：
由上表可知，在同样工艺下，使用SM(PEG)8比使用SMCC的检测效果更好，使用SM(PEG)8修饰抗体后包被的生物探针，其反应信号比使用SMCC要高两到三倍，这是由于SMCC不溶于水，使用时需先溶于二甲基亚砜配制成母液，再取母液添加到反应液中使用，因其溶解度问题，反应过程中交联率相对低，另外，SMCC聚乙二醇化即SM(PEG)8可以提高修饰蛋白的稳定性，增加其在生物应用中的半衰期，提高其溶解度，减少聚集的可能性，并最大限度地减少体外和体内的干扰应用。
另外，在本发明的包被工艺下，将交联剂Ⅱ替换为SMCC母液后，对比例2的测试效果仍然优于现有技术。
对比例2：
将实施例1的步骤(1.2.1)中，乙二胺溶液的添加量由0.92ml，依次改成添加92.0μl、9.20μl、0.920μl乙二胺溶液以及添加0.920μl乙二胺母液，此时乙二胺与Ficoll 400的摩尔比依次为5万:1、5千:1、500:1、50:1，其它条件均保持不变，按照实施例1中的包被步骤进行小样包被，与实施例1生产的生物探针进行信号比对。比对结果如下：
由上表可以看出，当乙二胺与Ficoll 400的摩尔比在5000:1的时候，反应已接近上限，但是因为自偶联问题，导致CV不好，所以在低值检测的时候容易出现跳动，这时一般采取过滤的方式将因自偶联而特别大的抗体团聚块去除，但是此法在生产过程中需添加操作步骤，加工效率低，实施例1采用过量添加乙二胺的方式，可解决上述问题，实验结果显示，在乙二胺与Ficoll 400的摩尔比为50万:1的条件下，自偶联问题可以被解决。
对比例3：
将实施例1步骤(5)中的包被时间由500秒依次设置为300秒，900秒和1800秒，在其它条件保持不变的前提下进行小样包被，分别制得生物探针，并与实施例1所制得的生物探针进行信号比对，比对结果如下：
由上表可以看出，对于可进行自动包被的塔式包被机，包被时间在500秒-1800秒时，即可达到较好的检测效果，且包被时间在500秒时与包被时间在900秒和1800秒时的检测数据的差异性小，因此，在一优选实施例中，为提高生产效率，包被时间优选为500秒，而在现有工艺中(例如采用实施例1中的现有技术时)，包被一轮所需时间通常在1小时及以上，因此，本发明可大大节省生产时间，这是由于本发明的包被工艺中，抗体以疏水作用结合到APTS探针上，而现有工艺中，抗体以化学键的方式连接至APTS探针上，前者比后者省去了各种生化反应时间。
本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，例如，除上述实现方式之外，采用本发明所解释的用于放大信号的生物探针包被方法所制得的生物探针、其他生物传感器以及试剂盒等产品及其制备工艺，均应落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于放大信号的生物探针包被方法，其特征在于：包括以下步骤：
对Ficoll 400进行预处理，使其被氨基化；
（1）将氨基化后的Ficoll 400与交联剂Ⅰ反应，并将反应后的液体用还原剂还原巯基；
（2）目标抗体与交联剂Ⅱ混合，并通过目标抗体中的氨基与交联剂Ⅱ反应；
（3）将步骤（2）所得液体与步骤（3）所得液体进行偶联反应，反应完全后加入NEM封闭，形成包被液；
（4）对探针进行APTS气相沉积修饰，并将修饰后的探针用步骤（4）所制备的包被液包被300秒-1800秒后烘干，制得生物探针；
其中，所述交联剂Ⅰ为胺和巯基反应性的异双功能交联剂，所述交联剂Ⅱ为带有聚乙二醇的SMCC衍生双功能交联剂。
2.根据权利要求1所述的用于放大信号的生物探针包被方法，其特征在于：所述目标抗体与Ficoll 400的摩尔比为5:1，交联剂Ⅱ与目标抗体的摩尔比为10:1，NEM与交联剂Ⅱ的摩尔比为10:1，交联剂Ⅰ与氨基化后的Ficoll 400的摩尔比为50:1。
3.根据权利要求1所述的用于放大信号的生物探针包被方法，其特征在于：所述交联剂Ⅰ为SPDP，所述交联剂Ⅱ为SM(PEG)8、SM(PEG)12、SM(PEG)24中的一种。
4.根据权利要求3所述的用于放大信号的生物探针包被方法，其特征在于：步骤（1）包括以下步骤：
（1.1）高碘酸钠与Ficoll 400均匀混合后，用乙二醇溶液终止反应后再用脱盐柱纯化；
（1.2）将步骤（1.1）所得产物与过量乙二胺反应，用脱盐柱纯化；
（1.3）用硼氢化钠终止步骤（1.2）中的反应后，用脱盐柱纯化。
5.根据权利要求4所述的用于放大信号的生物探针包被方法，其特征在于：步骤（1.1）中，高碘酸钠与Ficoll 400的摩尔比为1000:1，混合后室温避光静置30分钟，乙二胺与Ficoll 400的摩尔比为50万:1，加入乙二醇溶液后室温避光静置30分钟；步骤（1.2）中，乙二胺与Ficoll 400的摩尔比为50万:1；步骤（1.3）中，硼氢化钠与Ficoll 400的摩尔比为1.0万—5.0万:1；所述还原剂为DTT，所述DTT的工作浓度要求为25mmol/L。
6.根据权利要求4所述的用于放大信号的生物探针包被方法，其特征在于：还包括所述脱盐柱的预制备，包括如下步骤：
（a）取9支脱盐离心柱，分别编号1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#，其中，编号为1#、2#、3#、4#、5#的脱盐离心柱的规格为5ml，编号为6#、7#、8#、9#的脱盐离心柱的规格为10ml，掰断柱子尾部并松开盖子，将柱子置于收集管中；
（b）每支脱盐离心柱均采用1000×g离心2分钟，去除储存液，并在压实树脂倾斜顶端的管壁上做标记，之后所有的离心步骤中将柱子标记处朝外放入离心机；
（c）向1#、2#、3#、4#、5#中缓慢加入5次2.5ml PBS/碳酸盐缓冲液，前4次加入PBS/碳酸盐缓冲液后均采用1000×g离心2分钟去除PBS/碳酸盐缓冲液，第5次加入PBS/碳酸盐缓冲液后，拧紧盖子，静置备用；
（d）向6#、7#、8#、9#中缓慢加入5次5ml PBS，前4次加入PBS后均采用1000×g离心2分钟去除PBS，第5次加入PBS后，拧紧盖子，静置备用；
其中，步骤（c）中，1#、2#柱加入碳酸盐缓冲液，3#、4#、5#柱加入PBS。
7.根据权利要求6所述的用于放大信号的生物探针包被方法，其特征在于：所述步骤（1）包括以下步骤：
（1. 1）高碘酸钠与Ficoll 400均匀混合后，用乙二醇溶液终止反应后再用脱盐柱纯化；
（1.1.1）取1ml Ficoll 400溶液，加入50μl NaIO4溶液后充分混匀，室温避光静置30分钟；
（1.1.2）取50μl 乙二醇溶液加入上述反应液中，室温避光静置30分钟；
（1.1.3）取1#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤（1.1.2）所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液；
（1.2）将步骤（1.1）所得产物与过量乙二胺反应，用脱盐柱纯化；
（1.2.1）在步骤（1.1.3）收集的滤液中加入0.92ml乙二胺溶液，充分混匀后室温避光反应3小时；
（1.2.2）取2#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤（1.2.1）所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液；
（1.3）用硼氢化钠终止步骤（1.2）中的反应后，用脱盐柱纯化；
（1.3.1）在步骤（1.2.2）收集的滤液中加入100μl硼氢化钠溶液，充分混匀后4℃避光反应2小时；
（1.3.2）取3#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤（1.3.1）所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液，制得氨基化后的Ficoll 400。
8.根据权利要求7所述的用于放大信号的生物探针包被方法，其特征在于：所述步骤（2）包括以下步骤：
（2.1）在氨基化后的Ficoll 400中加入39.2μl SPDP母液，充分混匀后室温避光静置30分钟；
（2.2）取4#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤（2.1）所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液；
（2.3）在步骤（2.2）收集的滤液中加入54μl DTT溶液，充分混匀后室温避光静置30分钟；
（2.4）取5#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤（2.3）所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液，4℃暂存备用。
9.根据权利要求8所述的用于放大信号的生物探针包被方法，其特征在于：所述步骤（3）包括以下步骤：
（3.1）取6#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，同时取20mg抗体，若抗体浓度大于5mg/ml，则用PBS稀释至4ml，若抗体浓度小于5mg/ml则用超滤管浓缩至4ml，将抗体缓慢注入6#柱后，1000×g离心2分钟，收集滤液，获得目标抗体，并在4℃存储备用；
（3.2）取20mg目标抗体，加入86.2μl SM(PEG)8母液，充分混匀后室温避光静置30分钟；
（3.3）取7#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤（3.2）所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液。
10.根据权利要求9所述的用于放大信号的生物探针包被方法，其特征在于：所述步骤（4）包括以下步骤：
（4.1）将步骤（2.4）所得液体全部加入到步骤（3.3）所得液体中，充分混匀后室温避光静置2小时；
（4.2）在步骤（4.1）所得溶液中加入156.4μl NEM母液，充分混匀后室温避光静置30分钟；
（4.3）取8#、9#柱，分别在1000×g离心2分钟后弃滤液，再将步骤（4.2）所得溶液均分成两份，分别加入8#、9#柱中，继续1000×g离心2分钟后收集滤液，将滤液移至同一管中充分混匀，用微量蛋白分析仪进行蛋白浓度检测；
（4.4）将步骤（4.3）收集的滤液用PBS稀释至20μg/ml，获得包被液。
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