CN117269115A - 一种酮肟/醛肟分子修饰的spr芯片制备方法、产品及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，按照如下三种方式中的任一种进行；方式一：在SPR CM5芯片表面，滴加EDS/NHS混合液，放置2～5小时，冲洗后干燥；取氨基酮肟或氨基醛肟溶液滴涂在表面，放置6～10小时；方式二：在SPR金芯片表面，滴加巯基十一烷酸，放置6～12小时，冲洗后干燥；滴加EDS/NHS混合液，放置2～5小时，冲洗后干燥；取氨基酮肟或氨基醛肟溶液滴涂在表面，放置6～10小时；方式三：在SPR金芯片表面，滴加巯基酮或巯基醛放置6～12小时，冲洗后干燥；滴加羟基胺硫酸溶液反应1～3小时，冲洗后干燥。本发明还公开了对应的SPR芯片及应用。本发明的SPR芯片，酮(醛)肟分子能与金属离子形成较为稳定的配合物，有效克服了分子空间位阻的影响，提升蛋白质负载量。
Description
技术领域
本发明属于SPR传感芯片技术领域，具体涉及一种酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法、产品及应用。
背景技术
表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)技术一种在分子间相互作用的分析领域中广泛使用的方法。其基本原理为利用入射光照射SPR传感芯片，使得入射光产生的倏逝波与传感芯片表面金属的表面等离子波发生共振，影响出射光的性质；此后在传感芯片表面发生相互作用反应，引起共振条件的变化，导致出射光性质发生变化，对其进行监测即可实现对相互作用反应的检测。目前已经广泛应用于蛋白质相互作用，核酸相互作用，大分子与大分子之间，小分子与大分子之间的相互作用等。
在SPR分析过程中，需要先将一种生物分子(靶分子)键合在生物传感器(SPR芯片)表面，再将含有另一种能与靶分子产生相互作用的生物分子(分析物)的溶液注入并流经生物传感器(SPR芯片)表面。
六组氨酸(His6)标记蛋白质是融合重组蛋白纯化和检测的常用标签，可以重组至蛋白质中的特定位置，从而在SPR芯片表面均匀和定向固定用于分子识别的蛋白质。现有技术中，六组氨酸(His6)标记蛋白质是采用氨基三乙酸(NTA)进行蛋白质定向固定化，其原理是NTA分子和金属离子(如Ni2+，Co2+，Zn2+，Cu2+)之间形成4配位的配合物，螯合物中金属离子的另2个游离结合位点，能够与His6标记蛋白质两个连续的组氨酸形成配位键，从而固定His6标记蛋白质。目前基于三齿配体NTA固定镍离子进而固定富含组氨酸蛋白的策略报道较多，并且也有商品化的SPR芯片。
但是，由于NTA的空间位阻等因素，使得固定的蛋白质量有限。下分别为NAT的空间结构和NTA结合蛋白质的示意：
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求中的一种或者多种，本发明提供了一种酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法、产品及应用，制备得到的SPR芯片能够有效克服了分子空间位阻的影响，提高固定蛋白质的量。
为实现上述目的，按照本发明的第一个方面，提供一种酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，按照如下三种方式中的任一种进行；
方式一：在SPR CM5芯片表面，滴加100～500μL EDS/NHS混合液，放置2～5小时，冲洗后干燥；
取50～200μL氨基酮肟溶液或氨基醛肟溶液滴涂在表面，放置6～10小时，制得酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片；
方式二：在SPR金芯片表面，滴加100～500μL巯基十一烷酸，放置6～12小时，冲洗后干燥；
继续滴加100～500μL EDS/NHS混合液，放置2～5小时，冲洗后干燥；
取50～200μL氨基酮肟溶液或氨基醛肟溶液滴涂在表面，放置6～10小时，制得酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片；
方式三：在SPR金芯片表面，滴加100～500μL巯基酮或巯基醛放置6～12小时，冲洗后干燥；
继续滴加100～500μL羟基胺硫酸溶液反应1～3小时，冲洗后干燥，制得酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片。
作为本发明的进一步改进，
方式一中，所述氨基酮肟包括氨基丁二酮肟，氨基对苯甲酮肟中的一种或多种；所述氨基醛肟包括氨基丁二醛肟、氨基对苯甲醛肟中的一种或多种；和/或，
方式二中，所述氨基酮肟包括氨基丁二酮肟，氨基对苯甲酮肟中的一种或多种；所述氨基醛肟包括氨基丁二醛肟、氨基对苯甲醛肟中的一种或多种。
作为本发明的进一步改进，方式一和方式二中，所述氨基酮肟溶液或氨基醛肟溶液的浓度为10～100mmol/L。
作为本发明的进一步改进，方式三中，所述巯基酮包括巯基丁酮、巯基丁二酮、巯基苯甲酮中的一种或多种；所述巯基醛包括巯基丁醛、巯基丁二醛、巯基苯甲醛中的一种或多种。
作为本发明的进一步改进，
方式一中，EDS/NHS混合液为包括0.01mol/l的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和0.002mol/l的N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液；和/或，
方式二中，EDS/NHS混合液为包括0.01mol/l的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和0.002mol/l的N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液。
作为本发明的进一步改进，方式二中，所述巯基十一烷酸的浓度为0.01mol/l。
作为本发明的进一步改进，方式三中，所述羟基胺硫酸溶液的浓度为0.1mol/L。
按照本发明的第二个方面，提供一种酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片，采用述的制备方法得到。
按照本发明的第三个方面，提供一种所述的酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片在固定His6标记蛋白质中的应用，应用方法为：将所述SPR芯片放入SPR仪的芯片舱中，分别注入乙醇胺、EDTA、金属离子、His6标记蛋白质。
作为本发明的进一步改进，所述金属离子包括Ni2+、Co2+、Zn2+或Cu2+。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明的基于酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，酮(醛)肟分子能与金属离子(如Ni2+，Co2+，Zn2+，Cu2+)形成较为稳定的配合物，从而在芯片表面定向固定蛋白质。此方法形成的配合物更加稳定，有效克服了分子空间位阻的影响，蛋白质的附载量更大，提高了SPR检测的灵敏度。
(2)本发明的基于氨基酮肟/氨基醛肟的SPR芯片制备方法，使用的化学试剂易得，价格便宜；制备方法简单，不需昂贵设备；芯片的修饰剂稳定，易于保存。
附图说明
图1为本发明实施例1的芯片C1结合His6标记蛋白质的响应图；
图2为本发明实施例4的芯片C2结合His6标记蛋白质的响应图；
图3为本发明实施例7的芯片C3结合His6标记蛋白质的响应图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
在本发明第一个实施例中，一种酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，包括如下步骤：
(11)在SPR CM5芯片表面，滴加100～500μL EDS/NHS混合液，放置2～5小时，冲洗后干燥；
(12)取50～200μL氨基酮肟溶液或氨基醛肟溶液滴涂在表面，放置6～10小时，制得酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片。
本实施例中，氨基酮肟包括氨基丁二酮肟，氨基对苯甲酮肟中的一种或多种；氨基醛肟包括氨基丁二醛肟、氨基对苯甲醛肟中的一种或多种。
优选地，氨基酮肟溶液或氨基醛肟溶液的浓度为10～100mmol/L。
优选地，EDS/NHS混合液为包括0.01mol/l的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和0.002mol/l的N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液。
本实施例步骤(11)中，由于CM5芯片表面富含羧基，先通过EDS/NHS混合液对芯片表面的羧基基团进行活化，有利于与氨基形成稳定的共价键；步骤(22)中氨基与活化的羧基基团作用，形成稳定的共价键，从而将氨基酮肟或氨基醛肟固定在芯片表面。进而能够与金属离子生成配合物，固定组氨酸标记蛋白质。
在本发明的第二个实施例中，一种酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，包括如下步骤：
(21)在SPR金芯片表面，滴加100～500μL巯基十一烷酸，放置6～12小时，冲洗后干燥；
(22)继续滴加100～500μL EDS/NHS混合液，放置2～5小时，冲洗后干燥；
(23)取50～200μL氨基酮肟溶液或氨基醛肟溶液滴涂在表面，放置6～10小时，制得酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片。
本实施例中，氨基酮肟包括氨基丁二酮肟，氨基对苯甲酮肟中的一种或多种；氨基醛肟包括氨基丁二醛肟、氨基对苯甲醛肟中的一种或多种。
优选地，氨基酮肟溶液或氨基醛肟溶液的浓度为10～100mmol/L。
优选地，巯基十一烷酸的浓度为0.01mol/l。
优选地，EDS/NHS混合液为包括0.01mol/l的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和0.002mol/l的N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液。
本实施例步骤(21)中，巯基十一烷酸可以在金芯片表面形成自组装膜，在金芯片表面引入羧基，利用自组装膜的优点是空间位阻更小，引入的羧基更多；步骤(22)中通过EDS/NHS混合液对芯片表面的引入的羧基基团进行活化；步骤(23)中氨基与活化的羧基作用，形成稳定的共价键，从而将氨基酮肟或氨基醛肟固定在芯片表面。进而能够与金属离子生成配合物，固定组氨酸标记蛋白质。
在本发明的第三个实施例中，一种酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，包括如下步骤：
(31)在SPR金芯片表面，滴加100～500μL巯基酮或巯基醛放置6～12小时，冲洗后干燥；
(32)继续滴加100～500μL羟基胺硫酸溶液反应1～3小时，冲洗后干燥，制得酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片。
本实施例中，巯基酮包括巯基丁酮、巯基丁二酮、巯基苯甲酮中的一种或多种；巯基醛包括巯基丁醛、巯基丁二醛、巯基苯甲醛中的一种或多种。
优选地，羟基胺硫酸溶液的浓度为0.1mol/L。
本实施例中，巯基与Au共价键形式固定酮(醛)官能团，再与羟胺反应，在金芯片表面形成含有酮(醛)肟的膜。进而能够与金属离子生成配合物，固定组氨酸标记蛋白质。
本发明实施例一至实施例三中，冲洗后干燥，具体优选采用水冲洗后，在氮气或惰性气氛中干燥。
另外需要说明的是，本发明实施例一至实施例三中采用的CM5和金芯片，由英柏生物科技有限公司提供。
本发明的酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，制备得到的SPR芯片，用于固定His6标记蛋白质。其应用方法(即SPR芯片表面定向固定His6标记蛋白质)为：将所述SPR芯片放入SPR仪的芯片舱中，分别依次注入乙醇胺、EDTA、金属离子(包括Ni2+，Co2+，Zn2+，Cu2+)、His6标记蛋白质。
本发明制备得到的SPR芯片，酮(醛)肟分子能与金属离子(如Ni2+，Co2+，Zn2+，Cu2+)形成较为稳定的配合物(如下所示)，从而在芯片表面定向固定蛋白质。本发明中所选择的酮(醛)肟分子为线性，所占的空间位置少，因此结合的金属离子多，从而结合更多的蛋白质分子，因此本发明形成的配合物更加稳定，有效克服了分子空间位阻的影响，蛋白质的附载量更大。
为更好地理解本发明的制备方法、产品及应用，提供如下实施例：
下列具体实施例中芯片测试使用的SPR仪为英柏生物科技有限公司生产的SPR仪MS-200E。
实施例1
(1)在SPR CM5芯片表面，滴涂200μL EDS/NHS混合液，放置2小时，冲洗，干燥后，取100μL氨基丁二醛肟(100mmol/L)溶液滴涂在表面，放置6小时，制得醛肟修饰的SPR芯片(C1)；
(2)将步骤(1)制备得到的C1芯片放入SPR仪的芯片舱中，在芯片二个通道中，按程序设定，分别注入乙醇胺(0.01M)，EDTA，镍离子(1通道不注入，作为对比)，His6标记蛋白质。
本实施例制得的芯片C1结合His6标记蛋白质的响应图如图1所示，结果表明，本实施例制备得到的C1芯片能有效地固定His6标记蛋白质。
实施例2
本实施例与实施例1相比，区别在于：
在SPR CM5芯片表面，滴涂100μL EDS/NHS混合液，放置3小时，冲洗，干燥后，取50μL氨基对苯甲酮肟(10mmol/L)溶液滴涂在表面，放置8小时，制得酮肟修饰的SPR芯片。
实施例3
本实施例与实施例1相比，区别在于：
在SPR CM5芯片表面，滴涂500μL EDS/NHS混合液，放置5小时，冲洗，干燥后，取200μL氨基丁二酮肟(100mmol/L)溶液滴涂在表面，放置10小时，制得酮肟修饰的SPR芯片。
实施例4
(1)在SPR金芯片表面，滴加200μL巯基十一烷酸(0.01mol/l)，放置12小时，冲洗并干燥后，滴加200μL EDS/NHS混合液，放置3小时，冲洗，干燥后，取200μL氨基丁二酮肟(100mmol/L)溶液滴涂在表面，放置8小时，制得酮肟修饰的SPR芯片；
(2)将步骤(1)制备得到的C2芯片放入SPR仪的芯片舱中，在芯片2个通道中，按程序设定，分别注入乙醇胺，EDTA，镍离子(1通道不注入，作为对比)，His6标记蛋白质。
本实施例制得的芯片C2结合His6标记蛋白质的响应图如图2所示，结果表明，本实施例制备得到的C2芯片能有效地固定His6标记蛋白质。
实施例5
本实施例与实施例4相比，区别在于：
在SPR金芯片表面，滴加100μL巯基十一烷酸(0.01mol/l)，放置6小时，冲洗并干燥后，滴加100μL EDS/NHS混合液，放置2小时，冲洗，干燥后，取50μL氨基对苯甲酮肟(50mmol/L)溶液滴涂在表面，放置6小时，制得酮肟修饰的SPR芯片。
实施例6
本实施例与实施例4相比，区别在于：
在SPR金芯片表面，滴加500μL巯基十一烷酸(0.01mol/l)，放置12小时，冲洗并干燥后，滴加500μL EDS/NHS混合液，放置5小时，冲洗，干燥后，取100μL氨基对苯甲醛肟(10mmol/L)溶液滴涂在表面，放置10小时，制得醛肟修饰的SPR芯片。
实施例7
(1)在SPR金芯片表面，滴加200μL巯基丁酮放置12小时，冲洗并干燥后，滴加200μL羟基胺硫酸溶液(0.1mol/L)反应2小时，冲洗并干燥后，制得酮肟分子修饰的SPR芯片(C3)；
(2)将步骤(1)制备得到的C3芯片放入SPR仪的芯片舱中，在芯片二个通道中，按程序设定，分别注入乙醇胺，EDTA，镍离子(1通道不注入，作为对比)，His6标记蛋白质。
本实施例制得的芯片C3结合His6标记蛋白质的响应图如图3所示，结果表明，本实施例制备得到的C3芯片能有效地固定His6标记蛋白质。
实施例8
本实施例与实施例7相比，区别在于：
在SPR金芯片表面，滴加100μL巯基丁二酮放置6小时，冲洗并干燥后，滴加100μL羟基胺硫酸溶液(0.1mol/L)反应2小时，冲洗并干燥后，制得酮肟分子修饰的SPR芯片。
实施例9
本实施例与实施例7相比，区别在于：
在SPR金芯片表面，滴加500μL巯基丁醛放置12小时，冲洗并干燥后，滴加500μL羟基胺硫酸溶液(0.1mol/L)反应2小时，冲洗并干燥后，制得醛肟分子修饰的SPR芯片。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，其特征在于，按照如下三种方式中的任一种进行；
方式一：在SPR CM5芯片表面，滴加100～500μL EDS/NHS混合液，放置2～5小时，冲洗后干燥；
取50～200μL氨基酮肟溶液或氨基醛肟溶液滴涂在表面，放置6～10小时，制得酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片；
方式二：在SPR金芯片表面，滴加100～500μL巯基十一烷酸，放置6～12小时，冲洗后干燥；
继续滴加100～500μL EDS/NHS混合液，放置2～5小时，冲洗后干燥；
取50～200μL氨基酮肟溶液或氨基醛肟溶液滴涂在表面，放置6～10小时，制得酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片；
方式三：在SPR金芯片表面，滴加100～500μL巯基酮或巯基醛放置6～12小时，冲洗后干燥；
继续滴加100～500μL羟基胺硫酸溶液反应1～3小时，冲洗后干燥，制得酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片。
2.根据权利要求1所述的酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，其特征在于，
方式一中，所述氨基酮肟包括氨基丁二酮肟，氨基对苯甲酮肟中的一种或多种；所述氨基醛肟包括氨基丁二醛肟、氨基对苯甲醛肟中的一种或多种；和/或，
方式二中，所述氨基酮肟包括氨基丁二酮肟，氨基对苯甲酮肟中的一种或多种；所述氨基醛肟包括氨基丁二醛肟、氨基对苯甲醛肟中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，其特征在于，方式一和方式二中，所述氨基酮肟溶液或氨基醛肟溶液的浓度为10～100mmol/L。
4.根据权利要求1所述的酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，其特征在于，方式三中，所述巯基酮包括巯基丁酮、巯基丁二酮、巯基苯甲酮中的一种或多种；所述巯基醛包括巯基丁醛、巯基丁二醛、巯基苯甲醛中的一种或多种。
5.根据权利要求1或2所述的酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，其特征在于，
方式一中，EDS/NHS混合液为包括0.01mol/l的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和0.002mol/l的N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液；和/或，
方式二中，EDS/NHS混合液为包括0.01mol/l的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和0.002mol/l的N-羟基琥珀酰亚胺的混合水溶液。
6.根据权利要求1或2所述的酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，其特征在于，方式二中，所述巯基十一烷酸的浓度为0.01mol/l。
7.根据权利要求1或4所述的酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片制备方法，其特征在于，方式三中，所述羟基胺硫酸溶液的浓度为0.1mol/L。
8.一种酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片，采用权利要求1-7任一项所述的制备方法得到。
9.一种如权利要求8所述的酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片在固定His6标记蛋白质中的应用，其特征在于，应用方法为：将所述SPR芯片放入SPR仪的芯片舱中，分别注入乙醇胺、EDTA、金属离子、His6标记蛋白质。
10.根据权利要求9所述的酮肟/醛肟分子修饰的SPR芯片在固定His6标记蛋白质中的应用，其特征在于，所述金属离子包括Ni2+、Co2+、Zn2+或Cu2+。
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