CN117265013A - 一种靶向cd7的car-t细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向CD7的CAR‑T细胞的制备方法，涉及生物医药技术领域。本发明提供的方法有效提高了CAR的转导效率，同时缩短了细胞生产时间，提高了生产效率。另外，CAR‑T细胞的细胞增殖效率也得到了明显提高，减少了细胞回输前的损耗，实现了意想不到的技术效果。

Description

一种靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法。
背景技术
表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞是一种很有前途的肿瘤免疫治疗方法。这种靶向治疗在B细胞白血病和淋巴瘤方面已经显示出巨大的潜力。有研究小组报告了CD7特异性CAR-T，但是CD7在T细胞上的表达导致严重的自杀现象，造成CAR-T细胞无法在体外扩增。
CAR-T细胞上表达CAR所靶向的目标分子，会造成因配体结合而引起CAR-T细胞持续激活，导致CAR-T细胞的自杀和加速细胞的终末分化,使其在体内不能长期存活。由于CD7是一种泛T细胞抗原，在大部分T细胞上均有表达，因此CD7抗原特异性的CAR-T细胞在制备过程中可产生严重的自杀现象，从而造成生产失败。目前，常采用如下两种策略来减少这种自杀现象：1)使用基因组编辑工具如CRISPR/Cas9系统敲除CD7基因；2)通过将CD7分子锚定在内质网的方法阻止CD7蛋白转运到细胞表面。这两种方法都可以有效地降低CD7在细胞表面的表达，并最大限度地减少靶向CD7的CAR-T细胞的自杀现象。另外，CD7的缺失并不影响CAR-T细胞的增殖和短期效应功能，使具有高抗肿瘤活性的CAR-T细胞得以扩增。
从细胞表面上去除CD7后，CD7 CAR-T细胞在体外和体内对原发性CD7阳性T淋巴细胞白血病(T-ALL)和淋巴瘤具有较强的抗肿瘤活性。因此制备靶向CD7的CAR-T细胞对治疗T细胞恶性肿瘤具有重大意义，目前采用CRISPR/Cas9技术敲除CD7基因的做法被广泛采用，但由于CD7蛋白半衰期很长(通常为4-5天)，因此进行基因敲除后需等待较长时间才能采用慢病毒或其它载体对CD7阴性T细胞进行转导CAR操作。若CD7分子未完全降解就表达CAR，残存的CD7阳性细胞仍然会被CAR识别并杀伤。但长时间等待一方面会造成CAR-T细胞生产周期变长，增加生产成本；另一方面会使病毒感染效率变低。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法，以使CAR转导时间提前，提高了CAR转导效率，缩短了生产时间，有效提高了生产效率。
本发明是这样实现的：
一种靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法，其包括如下任意一种制备方法：
方法(1)：将CD7基因敲除后的T细胞进行病毒转导，然后用抗CD7的抗体或其功能性结合片段对病毒转导后的细胞进行封闭，封闭后进行细胞分选，再进行CAR-T细胞培养；
方法(2)：将CD7基因敲除后的T细胞用抗CD7的抗体或其功能性结合片段进行封闭，然后进行病毒转导，细胞分选后进行CAR-T细胞培养。
发明人发现，在CD7敲除后，无需等待CD7完全降解，就可以提前进行病毒转导，然后用抗CD7的抗体或其功能性结合片段封闭T细胞表面未降解的CD7，防止自相残杀；或者将CD7基因敲除后的T细胞用抗CD7的抗体或其功能性结合片段进行封闭，此时，未完全降解CD7的细胞会被抗CD7的抗体或其功能性结合片段识别细胞表面表达的CD7，结合后实现细胞表面CD7分子的封闭。这样可以大幅缩短CD7的敲除后CD7 CAR转导所需的等待时间，部分未降解的CD7的细胞通过抗CD7抗体进行封闭，这样同时避免了部分未降解的CD7的细胞自相残杀。
本发明提供的方法有效提高了CAR的转导效率，同时缩短了细胞生产时间。另外，CAR-T细胞的细胞增殖效率也得到了明显提高，减少了细胞回输前的损耗，实现了意想不到的技术效果。
其中，方法(2)相较于方法(1)更为简单快捷，能够在封闭后直接进行病毒转导。
此外，需要说明的是，发明人意外的发现CD7基因敲除后对残留CD7进行封闭对于细胞生长和CAR阳性表达尤为关键，若不进行CD7基因敲除而直接进行CD7封闭会导致T细胞数量显著下降，扩增倍数明显下降，CAR阳性率显著下降。
在本发明应用较佳的实施方式中，方法(1)中，在病毒转导后的12h-24h后，用抗CD7的抗体或其功能性结合片段对病毒转导后的细胞进行封闭；
在本发明应用较佳的实施方式中，方法(2)中，将CD7基因敲除24h-48h后用抗CD7的抗体或其功能性结合片段进行封闭。
在一种可选的实施方式中，将CD7基因敲除24h-30h，或30h-40h，或32h-48h均在本发明的保护范围之内。
在本发明应用较佳的实施方式中，每106个CD7阳性T细胞用过量抗CD7的抗体或其功能性结合片段进行封闭。优选每106个CD7阳性T细胞用至少2uL抗CD7的抗体或其功能性结合片段进行封闭。本领域的技术人员容易想到，过量封闭能够起到更好的封闭效果，能够自适应调整抗CD7的抗体或其功能性结合片段的添加量。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述功能性片段，通常具有与其来源抗体相同的结合特异性，功能性片段选自抗CD7的抗体的F(ab’)2、Fab、scFv、VHH、CD7配体或其它人工合成的靶向CD7的功能分子中的任意一种，只要它们展示出所期望的抗原结合活性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗原结合片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。
上述抗体或功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
在本发明应用较佳的实施方式中，方法(1)封闭后到分选的时间为24-48h，方法(2)封闭后到病毒转导间隔时间为0-24h。方法(2)的封闭时间更短，本领域的技术人员可以封闭后直接进行病毒转导。
在本发明应用较佳的实施方式中，方法(1)或方法(2)的封闭包括：在0-25℃下孵育，期间进行摇匀。
在一种可选的实施方式中，每隔1-5min进行摇匀。这样有助于更快速的达到预期的封闭效果。
在本发明应用较佳的实施方式中，细胞分选包括：将CD7阳性细胞的分选去除，选择CD7阴性细胞进行CAR-T细胞培养。
在本发明应用较佳的实施方式中，分选是采用偶联或物理结合有配偶体的载体对结合抗CD7的抗体或其功能性结合片段的CD7阳性细胞进行分选去除。
载体与配偶体的连接方式为偶联和/或物理连接。物理连接包括不限于静电吸附等。
在本发明应用较佳的实施方式中，配偶体为抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白；抗CD7的抗体或其功能性结合片段标记有生物素；
在本发明应用较佳的实施方式中，载体为纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球、微流控芯片或多孔材料；在其他实施方式中，多孔材料选自ELISA板或其他的固相支持物。
在一种可选的实施方式中，纳米颗粒选自有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
磁珠也称磁性微球，磁性微球是指通过适当的方法使有机高分子和无机磁性纳米粒子结合起来形成特殊结构的具有一定磁性复合微球。磁珠包括不限于纳米磁珠和微米磁性微球。在一种可选的实施方式中，磁珠包括不限于：羧基磁珠、氨基磁珠、油胺修饰磁珠、硅羟基磁珠、磺酸基磁性微球、巯基磁性微球、PEG修饰磁珠、无修饰四氧化三铁磁珠、单分散硅包磁、环氧基磁珠、单分散介孔硅包磁、金包磁性纳米颗粒、链霉亲和素修饰磁珠、多聚赖氨酸修饰磁珠、镍磁珠、磁性聚苯乙烯微球、二氧化硅磁性微球。
乳胶微球是由无定形聚合物(通常是聚苯乙烯)形成的胶体尺寸范围内的球形聚合物颗粒，例如直径小于100nm的颗粒，或者粒径为0.3-0.5μm的颗粒，或者粒径超过1μm的颗粒。
乳胶微球包括不限于表面修饰有羟基、羧基或Toysal中至少一种功能基团的乳胶微球。
在本发明应用较佳的实施方式中，抗生物素的载体是为偶联有链霉亲和素，亲和素或抗生物的蛋白的磁珠。
在本发明应用较佳的实施方式中，分选是在方法(1)封闭后24-48h或方法(2)病毒转导24-48h后进行。
在本发明应用较佳的实施方式中，病毒转导包括将CD7基因敲除后的T细胞或经封闭后的T细胞与病毒载体混合，培养；病毒载体选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒和逆转录病毒中的至少一种。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法，在CD7敲除后，无需等待CD7完全降解，就可以提前进行病毒转导，然后用抗CD7的抗体或其功能性结合片段封闭T细胞表面未降解的CD7，防止自相残杀；或者将CD7基因敲除后的T细胞用抗CD7的抗体或其功能性结合片段进行封闭，此时，未完全降解CD7的细胞会被抗CD7的抗体或其功能性结合片段识别细胞表面表达的CD7，结合后实现细胞表面CD7分子的封闭。这样可以大幅缩短CD7的敲除时间，部分未降解的CD7的细胞通过抗CD7抗体进行封闭，这样同时避免了部分未降解的CD7的细胞自相残杀。
本发明提供的方法有效提高了CAR的转导效率，同时缩短了细胞生产时间。另外，CAR-T细胞的细胞增殖效率也得到了明显提高，减少了细胞回输前的损耗，实现了意想不到的技术效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1，实施例2和对比例1的制备方法流程图；
图2为实施例1提供的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法与对比例1提供的CAR-T细胞的制备方法制备的CD7特异性阳性CAR-T细胞的水平对比图；
图3为实施例1提供的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法与对比例1提供的CAR-T细胞的制备方法获得的总T细胞数量(以T细胞激活开始后第4天为基线)对比图；
图4为实施例2提供的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法与对比例1提供的CAR-T细胞的制备方法制备的CD7特异性CAR-T细胞阳性率对比图；
图5为实施例2提供的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法与对比例1提供的CAR-T细胞的制备方法获得的总T细胞数量(以T细胞激活开始后第4天为基线)对比图；
图6为实施例1提供的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法与对比例2提供的CAR-T细胞的制备方法制备的CD7特异性CAR-T细胞阳性率对比图；
图7为实施例1提供的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法与对比例2提供的CAR-T细胞的制备方法获得的总T细胞数量(以T细胞激活开始后第4天为基线)对比图；
图8为实施例1与对比例2的工艺流程图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1(创新生产工艺1)
本实施例提供了一种靶向CD7的工程化免疫细胞嵌合抗原受体(CD7 CAR-T)的生产方法，制备方法流程图参照图1中的创新生成工艺，CD7敲除后，不用等待CD7完全降解就进行病毒转导操作，并用特异性抗体封闭细胞表面CD7的表达。具体步骤如下：
1)细胞复苏/PanT分选、激活。
打开生物安全柜，紫外灯照射灭菌30min，通风10min后待用。
完全培养基配制：从2～8℃冰箱中取出CTSTM AIM VTM SFM基础培养基、CTSTMImmue Cell SR、IL-2(100万IU/瓶)，表面擦拭消毒后放入生物安全柜中。用1mL基础培养基溶解IL-2,按照CTSTM AIM VTM SFM基础培养基：CTSTM Immue Cell SR：IL-2(100万IU/mL)＝95：5：0.020的体积比进行配制。配制结束后，标注配制日期及有效期后(一般为14天)放入2～8℃冰箱中待用。
将冻存的PBMC(50×106cells/mL，1mL/支)在37℃水浴锅中快速融解(时间控制在1～2min)，转移至生物安全柜中用移液器吸取细胞悬液置于装有40mL AIM培养基的50mL离心管中(每50mL离心管最多加6支PBMC洗涤)，轻轻吹打混匀，取20μl使用细胞计数仪进行细胞活力、数目检测；将50mL离心管放入离心机中离心(离心速度：300g,离心时间：10min、离心温度：23℃，升速：8，降速：8)。离心结束后弃去上清后用autoMACS Running Buffer重悬细胞按照每107细胞加40uL autoMACS Running Buffer重悬细胞。
将Pan T Cell Isolation Kit从4℃冰箱拿出后，每107细胞加10uL Pan T CellBiotin-Antibody Cocktail，拧紧瓶盖放入4℃冰箱低温孵育5min。孵育结束后，在孵育体系中补加每107细胞加30uL autoMACS Running Buffer后吹打混匀待用。每107细胞加20uLPan T Cell Microbead Cocktail。混匀，4℃冰箱孵育10min。
在距孵育结束还有五分钟时，在生物安全柜中将分选柱(LS)装在MACS分选磁力架上，并放置滤器，柱子下方放置无菌的15mL离心管，之后在分选柱中加入3mL autoMACSRunning Buffer进行润洗。
孵育完成后，向细胞悬液中加入3mL autoMACS Running Buffer轻轻吹悬。待柱中液面消失时向柱中缓慢加入准备好的细胞悬液(每个LS分选柱最大分选量为1.00×108cells)，在柱中细胞悬液过柱完成时加入3mL autoMACS Running Buffer静置待其不再有液体滴落，重复此步骤一次。收集通过柱子的未标记细胞，待其完全滴落后将15mL离心管中细胞悬液吹打混匀计数后进行离心(离心速度：300g，离心时间：10min、离心温度：23℃，升速：8，降速：8)。离心结束后根据计数结果用完全培养基重悬细胞至2.0×106cells/mL密度于合适的培养瓶中。
根据计数结果算出CD3/CD28 Dynabeads的添加量(beads体积：1.0×106cells/25μl)。取出对应量的磁珠加入装有适量培养基的50mL离心管中吹打混匀后，将离心管置于50mL磁力架上静置3min，待管中液体澄清后，将培养基吸出弃去；重复洗涤一次(注：吹打混匀磁珠均需将离心管从磁力架取出操作)。最后用1～2mL完全培养基重悬磁珠，将磁珠加入到调整好细胞培养密度的培养瓶中轻轻吹打混匀后静置培养1.5天。
培养条件：(37±1)℃，(5±0.5)％CO2。
2)CD7基因敲除
磁珠去除：把培养瓶从培养箱拿出，轻轻吹打混匀后转移至无菌的50mL离心管中，将离心管置于磁力架上静置三分钟后将细胞悬液转移至新的无菌的50mL离心管中，轻轻吹打混匀计数，然后将离心管放入离心机中离心(离心速度：300g，离心时间：10min、离心温度：23℃，升速：8，降速：8)。注：若磁珠去除后发现细胞损失过多，可再进行一次磁珠清洗的操作；即向去除后的磁珠中加入适量培养基吹打混匀，将离心管置于磁力架上静置三分钟后将液体转移至新的离心管中。
电转：离心结束后弃去上清，用T buffer重悬细胞沉淀并调整密度为2.0×106cells/90μl。
取一个无菌孔板，在孔板盖内侧对应位置点液(2.0×106cells/体系)：3uL Tbuffer，1uL Cas9酶(5ug)，2uL sgRNA(靶向CD7,75uM)，静置5min以便于结合。
CD7 sgRNA名称 靶序列
CD7-sgRNA-1 acggggacagtcgtgcagtg
CD7-sgRNA-2 tgttgacggaggctcccacg
CD7-sgRNA-3 atcacctgctccaccagcgg
CD7-sgRNA-4 ggatctacctgaggcagctc
CD7-sgRNA-5 ccaagacatcatttactacg
组装电转设备：将电转杯底座擦拭酒精后放入安全柜中，取一个新电转杯插入底座卡槽内，电极位置卡好，于杯内小心加入3mL E2buffer，避免气泡。将电转仪调整至目的参数：1600v、10ms、3pulses后备用。
取90uL PanT细胞悬液，加至孵育的Cas9+sgRNA液滴上，轻吹混匀，避免气泡。电转枪装上电转专用枪头，反复吹吸以确认枪头正常工作。电转枪头先倾斜接触PanT细胞悬液，缓慢吸入并摆正电转枪，直到刚好吸完100uL悬液，观察枪头，确认无气泡，将电转枪插入点转杯内，固定好卡槽，开始电转(如枪头内有气泡则打出悬液重新吸；电转后操作界面先不关，下一个电转时再点开)。电转结束将细胞转移至装有预热后完全培养基的培养瓶中，密度调整至2×106cells/mL进行培养24h。
培养条件：(37±1)℃，(5±0.5)％CO2。
CD7 CAR慢病毒包装
Day1:汇合度80％-90％的75cm培养瓶293T细胞(2×107/瓶)按1：3比例传代至75cm培养瓶，第二天细胞汇合度达到80％-90％(2×107/瓶)，培养基为Gibo高糖DMEM培养基(含10％FBS)。
Day2:转染前2-3个小时更换培养基(含10％FBS)；按照以下比例配制转染试剂：Mix 1：取表达质粒LV-aCD7-BBz 17.7μg、对应包装质粒pRSV-REV 8.87μg、包装质粒pMDLg/pRRE 8.87μg及VSV-G衣壳质粒pMD2.G 4.43μg，转染比例为4:2:2:1，总量为40μg，混匀后用无血清DMEM稀释定容至2mL，混匀后室温静置5min；Mix 2：取2mL DMEM(无FBS)加120μl EZTrans(和元李记生物技术有限公司)。将Mix2液逐滴加入到Mix1液中，并轻柔混匀，室温孵育20min。将混合液逐滴加入到细胞中，轻柔混匀，置于5％二氧化碳培养6h后更换新鲜培养基(含2％FBS)。
Day4:上午收取上清培养基，4000rpm离心10min，取上清过0.45μm滤膜，上清培养基加入超速离心管中，配平后离心，32000rpm，4℃离心6h。弃上清，用120μl DMEM培养基混匀溶解过夜。
Day5：收集病毒分装，进行病毒滴度测定
病毒滴度检测：Day1在24孔板中接种Jurkat细胞，每孔0.5M，将病毒以0.05uL，0.15uL及0.5uL梯度加入接种的Jurkat细胞中，Day2给各孔细胞换液。Day3检测CAR表达的试剂染色细胞并以流式仪检测各组病毒感染Jurkat效率。滴度计算公式为：病毒滴度(TU/mL)＝Jurkat细胞总数*阳性细胞比例/体积(mL)。
3)病毒转导
CD7基因敲除24h后进行病毒转导。
将细胞取出混匀计数，装至50mL离心管中离心(离心速度：300g，离心时间：10min、离心温度：23℃，升速：8，降速：8)，离心结束后弃上清，用完全培养基重悬细胞并将密度调至2.0×106cells/mL于合适的培养瓶中。根据计数结果按照MOI＝4加入CD7CAR慢病毒，轻轻摇晃混匀后静置培养24h。
培养条件：(37±1)℃，(5±0.5)％CO2。
4)慢病毒感染后24h换液，进行CD7封闭
收集细胞，计数。离心，速度：400g，离心时间：5min，弃上清。用autoMACS RunningBuffer重悬细胞(108/600uL)，加入CD7单抗(每106个CD7阳性T细胞用2uL CD7单抗封闭)，混匀。4度孵育15min，每5min晃一次。孵育结束后加3mL autoMACS Running Buffer离心，速度：300g，离心时间：10min。弃上清。用完全培养基重悬细胞，密度106/mL培养。
5)CD7分选
(1)检测敲除后细胞的CD7阳性比例，并计算阳性细胞数量；
(2)离心，300g RT 10min；
(3)小心弃上清，加入MACS buffer(按600mL/100×106总细胞)重悬细胞并按照2uL/106阳性细胞加入biotin-conjugated CD7抗体；
(4)4度孵育15min(在第5,10min时晃动细胞，防止细胞沉淀与抗体接触不充分)；
(5)按20mL/100×106总细胞加入MACS buffer，离心300g，10min，RT；
(6)弃上清，加MACS buffer(500mL/100×106),再加入Microbeads(2uL/106阳性细胞)轻柔混匀，4度孵育15min(第5，10min时轻轻晃动细胞)；
(7)按20mL/100×106总细胞加入MACS buffer，离心300g，10min，RT；
(8)弃上清，2mL MACS buffer重悬细胞；
(9)美天旎(Miltenyi)LS柱子上加30mm滤器，加3mL MACS buffer洗一遍；
(10)将步骤(8)中细胞悬液加入LS柱子，收集Flow through(FT)；
(11)待细胞悬液完全流过LS柱子后加入3mL×3的MACS buffer洗三遍柱子(每次等液体流尽再加)；
(12)离心FT，加2-5mL完全培养基重悬，即为CD7阴性细胞，计数；
(13)加适量完全培养基维持细胞密度106/mL。
6)扩增培养(CAR表达检测)
在病毒转导72h后用流式细胞仪进行CAR表达检测。
(1)取细胞0.2-0.5×106cells；
(2)加入能特异性结合CD7 CAR的重组蛋白2uL，混匀室温孵育20min；
(3)500g，离心5min，去掉上清；
(4)加1mL FACS buffer，500g，离心5min，去掉上清；
(5)加200uL FACS buffer重悬细胞，上机检测。
实施例2(创新生产工艺2-1)
与实施例1相比，区别在于：
在CD7基因敲除48h后的T细胞用抗CD7的抗体进行封闭，封闭后进行病毒转导，细胞分选后进行CAR-T细胞培养。
区别仅在于：CD7基因敲除步骤中，电转结束将细胞转移至装有预热后完全培养基的培养瓶中，密度调整至2×106cells/mL进行培养48h。
然后进行CD7封闭：收集细胞计数。离心，速度：400g，离心时间：5min，弃上清。用autoMACS Running Buffer重悬细胞(108/600uL)，加入CD7单抗(106/1uL)，混匀。4度孵育15min，每5min晃一次。孵育结束后加3mL autoMACS Running Buffer离心，速度：300g，离心时间：10min。弃上清。用完全培养基重悬细胞，密度106/mL培养24h。
病毒转导：
将细胞取出混匀计数，装至50mL离心管中离心(离心速度：300g，离心时间：10min、离心温度：23℃，升速：8，降速：8)，离心结束后弃上清，用完全培养基重悬细胞并将密度调至2.0×106cells/mL于合适的培养瓶中。根据计数结果按照MOI＝4加入包装CD7CAR的慢病毒，轻轻摇晃混匀后静置培养24h。培养条件：(37±1)℃，(5±0.5)％CO2。
然后按照实施例1的方法进行分选和扩增培养。
实施例3(创新生产工艺2-2)
与实施例1相比，区别在于：
在CD7基因敲除48h后的T细胞用抗CD7的抗体进行封闭，封闭后进行病毒转导，细胞分选后进行CAR-T细胞培养。
区别仅在于：CD7基因敲除步骤中，电转结束将细胞转移至装有预热后完全培养基的培养瓶中，密度调整至2×106cells/mL进行培养48h。
然后进行CD7封闭：收集细胞计数。离心，速度：400g，离心时间：5min，弃上清。用autoMACS Running Buffer重悬细胞(108/600uL)，加入CD7单抗(106/1uL)，混匀。4度孵育15min，每5min晃一次。孵育结束后加3mL autoMACS Running Buffer离心，速度：300g，离心时间：10min。弃上清。用完全培养基重悬细胞，密度106/mL随后进行病毒转导。
病毒转导：
将细胞取出混匀计数，装至50mL离心管中离心(离心速度：300g，离心时间：10min、离心温度：23℃，升速：8，降速：8)，离心结束后弃上清，用完全培养基重悬细胞并将密度调至2.0×106cells/mL于合适的培养瓶中。根据计数结果按照MOI＝4加入包装CD7CAR的慢病毒，轻轻摇晃混匀后静置培养24h。培养条件：(37±1)℃，(5±0.5)％CO2。
然后按照实施例1的方法进行分选和扩增培养。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于：CD7基因敲除96h后直接进行CD7分选，病毒转导(转导方法同实施例1)，然后进行扩增培养，制备流程参照图1中的传统生产工艺。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于：省略步骤2)的CD7基因敲除，其余的步骤同实施例1，流程图参照图8所示。
实验例1
分别将实施例2和对比例1进行相关操作，并检测CD7特异性阳性CAR-T细胞的水平。
在病毒转导72h后，取0.2-0.5×106cells离心去上清，用流式染色buffer重悬细胞(420201,BioLegend),加入能特异性结合CD7 CAR的重组蛋白2uL，4度孵育30min后，离心去除上清。用流式染色buffer清洗一次。再加入200uL的buffer重悬，上机检测。
检测结果参照图2所示，实施例1(创新工艺1)提供的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法获得的CD7阳性T细胞数量(占比34.89％)明显高于对比例1(传统工艺)的方法获得的CD7阳性T细胞数量(12.38％)。
同时，分别检测实施例1和对比例1制备方法制得的T细胞在0-12天的数量(图3所示)，实施例1的细胞扩增倍数明显高于对比例1。
实验例2
分别采用实施例2、实施例3和对比例1的方法进行相关操作，并检测CD7特异性阳性CAR-T细胞的水平。
在病毒转导72h后，取0.2-0.5×106cells离心去上清，用流式染色buffer重悬细胞(420201,BioLegend),加入能特异性结合CD7 CAR的重组蛋白2uL，4度孵育30min后，离心去除上清。用流式染色buffer清洗一次。再加入200uL的buffer重悬，上机检测。
检测结果参照图4所示，实施例2(创新工艺2-1#)和实施例3(创新工艺2-2#)提供的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法获得的CD7阳性T细胞数量(占比38.61％，35.15％)明显高于对比例1(传统工艺)的方法获得的CD7阳性T细胞数量(11.03％)。
同时，分别检测实施例2-3和对比例1制备方法制得的T细胞在0-12天的数量(图5所示)，实施例2-3的细胞扩增倍数明显高于对比例1。
实验例3
分别检测实施例1和对比例2制备方法制得的T细胞在0-12天的数量，检测分选后第1，2，3，4，5，8，9天的CAR阳性率，实施例1与对比例2的工艺流程图参照图8所示，检测方法同实验例1。
结果参照图6和图7，若采用抗体进行CD7封闭，而不敲除CD7基因(对比例2)则导致CAR阳性率显著下降，总的T细胞数量显著下降。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，其包括如下任意一种制备方法：
方法(1)：将CD7基因敲除后的T细胞进行病毒转导，然后用抗CD7的抗体或其功能性结合片段对病毒转导后的细胞进行封闭，封闭后进行细胞分选，再进行CAR-T细胞培养；
方法(2)：将CD7基因敲除后的T细胞用抗CD7的抗体或其功能性结合片段进行封闭，然后进行病毒转导，细胞分选后进行CAR-T细胞培养。
2.根据权利要求1所述的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法(1)中，在所述病毒转导后的12h-24h后，用抗CD7的抗体或其功能性结合片段对病毒转导后的细胞进行封闭；
优选地，所述方法(2)中，将CD7基因敲除24h-48h后用抗CD7的抗体或其功能性结合片段进行封闭。
3.根据权利要求2所述的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述每106个CD7阳性T细胞用过量抗CD7的抗体或其功能性结合片段进行封闭；优选地，所述每106个CD7阳性T细胞用至少2uL抗CD7的抗体或其功能性结合片段进行封闭。
4.根据权利要求1-3任一项所述的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗CD7的抗体的F(ab’)2、Fab、scFv、VHH、CD7配体或其它人工合成的靶向CD7的功能分子中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法(1)的封闭后至分选时间为24-48h，所述方法(2)封闭后至病毒转导间隔时间为0-24h。
6.根据权利要求5所述的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法(1)或方法(2)的封闭包括：在0-25℃下孵育，期间进行摇匀；
优选地，每隔1-5min进行摇匀，孵育时间为1min-60min。
7.根据权利要求1所述的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述细胞分选包括：将CD7阳性细胞的分选去除，选择CD7阴性细胞进行CAR-T细胞培养。
8.根据权利要求7所述的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述分选是采用偶联或物理结合有配偶体的载体对结合抗CD7的抗体或其功能性结合片段的CD7阳性细胞进行分选去除；
优选地，所述配偶体为抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白；所述抗CD7的抗体或其功能性结合片段标记有生物素；
优选地，所述载体为纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球、微流控芯片或多孔材料；
优选地，所述抗生物素的载体是为偶联有链霉亲和素，亲和素或抗生物的蛋白的磁珠。
9.根据权利要求8所述的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述分选是在方法(1)封闭后24-48h后或方法(2)病毒转导24-48h后进行。
10.根据权利要求1所述的靶向CD7的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述病毒转导包括将CD7基因敲除后的T细胞或经封闭后的T细胞与病毒载体混合，培养；所述病毒载体选自腺相关病毒、腺病毒、慢病毒和逆转录病毒中的至少一种。
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