CN117250295A - 帕拉米韦中间体的检测方法 - Google Patents

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CN117250295A CN202311401425.9A CN202311401425A CN117250295A CN 117250295 A CN117250295 A CN 117250295A CN 202311401425 A CN202311401425 A CN 202311401425A CN 117250295 A CN117250295 A CN 117250295A
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Abstract

本发明涉及帕拉米韦中间体的检测方法，所述方法，包括对帕拉米韦中间体化合物Ⅲ的检测方法，和对帕拉米韦中间体化合物Ⅳ的检测方法，所述方法采用高效液相色谱法，其特征在于，所述方法中色谱条件如下：检测方法中所述的色谱柱为NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱，并在在混合器后进样器前接捕集小柱(NanoChrom Ghost‑Remover，4.6mm×50mm或效能相当的捕集小柱)，所述的流动相，流动相A为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至4.5)，流动相B为乙腈‑水(90:10)，所述的流速为每分钟1.0mL；柱温为25℃，检测波长为195nm；进样体积20μL。

Description

帕拉米韦中间体的检测方法
技术领域
本发明属于药物医药技术领域，公开了帕拉米韦关键中间体(1S,2S,3S,4R,1'S)-3-[(1-氨基-2'-乙基)丁基]-4-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-2-羟基环戊烷-1-羧酸甲酯(化合物III)和(1S,2S,3R,4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基丁基]-4[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-2-羟基环戊酸甲酯(化合物IV)检测方法。
背景技术
帕拉米韦(Peramivir)，由美国生物晶体药品股份有限公司研制开发，能有效抑制多种流感病毒株的复制和传播过程，具有耐受性好、毒性小等优点，用于成人和儿童的甲型和乙型流感的治疗和预防。帕拉米韦化学名为(1S,2S,3R,4R)-3-[(1S)-1-(乙酰氨基)-2-乙基丁基]-4-胍基-2-羟基环戊烷羧酸三水合物，其结构如式I：
2009年10月美国FDA紧急批准化合物I用于治疗H1N1型流感；2010年1月帕拉米韦在日本上市。中国食品药品监督管理总局2012年批准了帕拉米韦氯化钠注射剂的上市。2014年12月19日，FDA批准帕拉米韦治疗成人流感感染。
目前与帕拉米韦的代表性合成方法的专利为WO9933781A1、J.Med.Chem.2000,43,3482-3486、ZL200710143607.5、ZL201180070519.1、ZL201510461348.5和文献J.Med.Chem,2001,44,4379-4392等，合成的一般方法是以文斯内酰胺为原料，经酰胺醇解拆分、氨基/羧基保护、1,3-偶极环加成、还原开环、乙酰化、脱保护、水解和胍基化最终制得帕拉米韦。
专利WO9933781A1和文献J.Med.Chem.2000,43,3482-3486、J.Med.Chem,2001,44,4379-4392中报道关键中间体(1S,2S,3R,4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基丁基]-4[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-2-羟基环戊酸甲酯(Ⅱ)的方法为(1S,4R)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)环戊-2-烯-1-甲酸甲酯与3-(硝基甲基)戊烷、苯基异氰酸酯反应制备，制备过程中使用到剧毒试剂，不利于安全生产和废液处理。中国抗生素杂志，2009,34(8):475-478和J Org Chem,2003,68(17):6591-6596使用了不同的方法，二乙基丁醛肟或二乙基丁醛氯肟反应制备化合物Ⅱ，避免了苯基异氰酸酯的使用。
关键中间体(1S,2S,3R,4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基丁基]-4[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-2-羟基环戊酸甲酯(Ⅱ)开环的方法一般有PtO2-H2还原开环(WO9933781A1、J.Med.Chem.2000,43,3482-3486、J.Med.Chem,2001,44,4379-4392、)或NaBH4/NiCl2还原开环(ZL200710143607.5等)。这两种方法各有利弊，PtO2-H2还原，PtO2价格较贵，涉及到特殊的反应设备同时需要增加除Pt的单元操作；NaBH4/NiCl2还原，反应迅速、价格便宜，但同时需处理含镍的废水。
上述制备方法均涉及到关键中间体(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基丁基]-4-(Boc)-氨基-2-基环戊烷-1-酸酯，具体如式II：
早期的文献，化合物Ⅱ开环、氨基乙酰化后，N,N'-二-Boc-S-甲基异硫脲/HgCl2上胍基，使用了剧毒的HgCl2并且反应副产物为甲硫醇；国内专利ZL200710143607.5等，均是化合物化合物Ⅱ开环、氨基乙酰化、脱保护后再与胍基化试剂(胍基化试剂一般有1H-1,2,4-三氮唑-1-甲脒盐酸盐、甲脒盐酸盐、吡唑甲脒盐酸盐等)反应上胍基。ZL201180070519.1以手性环戊烯为起始物料，与Boc保护的吡唑甲脒盐酸盐反应，首先接上胍基(Boc保护)后，2-乙基-N-羟基丁亚胺氯反应环合制备关键中间体，硼氢化钠/氯化镍还原开环，上乙酰基、脱保护后得到帕拉米韦。
由化合物II制备帕拉米韦的路线如下：
由化合物II制备(1S,2S,3S,4R,1'S)-3-[(1-氨基-2'-乙基)丁基]-4-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-2-羟基环戊烷-1-羧酸甲酯(化合物Ⅲ)的过程为还原开环反应，其中化合物Ⅲ的结构中3位由于还原后增加了一个手性中心(1S)。早期相关专利和文献对化合物化合物III的后处理和精制报道较少，均是不经分离直接用于下一步化学反应。ZL200710143607.5使用甲醇作为还原反应溶剂，反应完毕后经亚硝酸钠、氯化铵、25％氨水处理分离得到固体悬浮甲苯中用25％洗涤、乙二胺四乙酸钠络合除去金属离子后，降温析晶得到化合物Ⅲ。文献Synthetic Communications,2013,43,2641-2647使用甲醇作为还原反应溶剂，反应完毕浓缩出去溶剂后经亚硝酸钠、氯化铵、氨水处理，析晶得到化合物Ⅲ。ZL202010966511.4采用二氯甲烷、甲醇作为反应溶剂，反应完毕后经乙二胺四乙酸钠、亚硝酸钠、氯化铵、氨水处理，分液浓缩除溶，甲醇—水体系重结晶得到化合物Ⅲ(最高为97.56％)。ZL202310222820.4使用甲苯作为还原反应溶剂，反应完毕后经洗涤、提取，浓缩出去溶剂，甲醇重结晶得到化合物Ⅲ。但甲醇对化合物Ⅲ溶解性较好，收率受析晶温度影响较大，重现性相对较差。
ZL201710002936.1报道重现相关报道的方法制备化合物III，异构体含量高达10％；该专利采用铁—钴合金作为催化剂时无异构体，但其化合物III为柱层析得到，不利于商业化生产。化合物Ⅲ制备过程中存在少量的3-(1R)异构体，生成方程式如下：
通过工艺研究，确认了能有效去除制备化合物Ⅲ反应杂质和3-(1R)异构体杂质的方法。目前，化合物III未见相关的质量标准和检测方法报道，获得一种适合于化合物IV的质量检测方法，对于帕拉米韦原料药生产的质量控制意义重大。
化合物化合物Ⅲ的结构中同时含有氨基和羟基，在乙酰化制备化合物Ⅳ的过程中，会生成过度乙酰化的双乙酰化杂质，具体如下：
大部分文献及专利均是在制备得到化合物Ⅳ后直接用于后续化学反应，或者采用柱层析纯化得到纯度较高的化合物Ⅳ。目前，化合物IV未见相关的质量标准和检测方法报道，获得一种适合于化合物IV的质量检测方法，对于帕拉米韦原料药生产的质量控制意义重大。
原料药的质量控制一致是药物研发过程中的重点，按照当前国际、国内对药品质量源于设计的药品注册要求，原药制备过程中间体的精制和检测为工艺开发和研究过程的极其重要环节，从而避免因杂质引发不良反应和给用药的疗效和安全性带来了潜在隐患。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高纯度帕拉米韦中间体(1S,2S,3R,4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基丁基]-4[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-2-羟基环戊酸甲酯(帕拉米韦乙酰化物Ⅳ)的制备方法。帕拉米韦通常的制备方法是以化合物Ⅱ为起始物料，还原开环后与乙酸酐反应制备帕拉米韦乙酰化物(化合物Ⅳ)，乙酰化物脱胺基保护、水解酯基后，与三氮唑甲脒反应生成帕拉米韦。
现有文献报道的帕拉米韦制备方法，乙酰化、脱保护和胍基化均为一步法，各中间体不经分离直接反应，该操作流程相对简化，但同时各步中间体未分离、纯化，无法有效的进行过程控制，增加了终产品帕拉米韦作为原料药用途的质量风险。因此，为了增加帕拉米韦的质量可控性，本发明提供了一种帕拉米韦中间体乙酰化物的制备、分离纯化的方法，该方法制备的乙酰化物为类白色固体，收率＞95％，纯度＞99％，特别是，本发明方法可将双乙酰化杂质含量控制＜0.1％，该杂质为工艺杂质，可随反应向后传递，是顽固性杂质，常规药品纯化方法如重结晶、打浆等操作，对该杂质及后续对应杂质的清除效果差。
同时发明对化合物一种对化合物Ⅲ的精制方法，采用甲苯对化合物Ⅲ进行精制，其纯度98％以上，收率稳定在85％以上。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果体现在：对化合物Ⅲ采用甲苯进行精制后用于乙酰化反应得到化合物Ⅳ，乙酰化后的化合物Ⅳ粗品经析晶、重结晶后得到高纯度化合物Ⅳ。该方法操作简单，可将目标产物从体系中析出，性状好，收率高，质量好，特别是顽固性羟基乙酰化杂质，具有显著的控制效果。
具体发明内容如下：
步骤1：将化合物Ⅱ、六水合氯化镍、甲醇，加入反应釜中，降温滴加硼氢化钠甲醇溶液。滴毕，控温搅拌反应。加入纯化水、亚硝酸钠溶液，搅拌反应。反应完成后，过滤，滤饼依次用氨水、EDTA-2Na水溶液浆洗得到化合物Ⅲ粗品。将化合物Ⅲ粗品加至一定量的溶剂中进行精制，升温溶清，降温搅拌析晶，过滤，将滤饼转移至真空干燥箱中干燥，得类白色固体化合物Ⅲ。
步骤2：向反应釜中加入溶剂和精制后的帕拉米韦甲酯(Ⅲ)，开启搅拌，控温滴加乙酸酐，一定时间内加毕，控温搅拌反应，TLC监测Ⅳ物料点消失视为反应结束；
步骤3：反应完毕后，加入碳酸钠水溶液，搅拌、分液，收集有机相，减压浓缩，加入溶剂，搅拌析晶，离心至无明显液体流出；滤饼真空干燥，得类白色帕拉米韦乙酰化物(Ⅳ)粗品；
步骤4：向反应釜中加入帕拉米韦乙酰化物(Ⅳ)粗品，混合溶剂，开启搅拌，升温至体系溶清；降温，加入溶剂，体系有固体析出，继续降温搅拌析晶；离心至无明显液体流出，滤饼真空干燥，得类白色固体帕拉米韦乙酰化物(Ⅳ)。
其中，步骤1中所述的化合物Ⅲ的精制所述的溶剂为苯、甲苯、二甲苯，优选为甲苯，所述的甲苯用量为化合物Ⅱ投料量的10～20倍量(质量比)，优选15倍量。
步骤2中所述的滴加温度为0～30℃，优选0～10℃。
步骤2中所述的反应时间为0～8h，优选2～3h。
步骤3中所述的溶剂为烷烃类溶剂正戊烷、正己烷、正庚烷，优选为正庚烷。
步骤4中所述的溶剂为低级酯类或低级酯与烷烃类溶剂的混合溶剂，所述的低级酯为甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯等，优选为乙酸乙酯；所述的烷烃类溶剂为正戊烷、正己烷、正庚烷，优选为正庚烷；所述的混合溶剂的质量比为1:(3～10)，优选为1:4.5。
为保证本发明中间体产品质量，本发明进一步提供中间体化合物Ⅲ和中间体化合物Ⅳ的检测方法
其中，中间体化合物Ⅲ的检测方法，
采用高效液相色谱法，色谱条件如下
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢钾溶液为流动相A，以乙腈-水为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 80 20
20 70 30
70 20 80
80 20 80
82 80 20
95 80 20
检测方法中所述的色谱柱为NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱，并在在混合器后进样器前接捕集小柱(NanoChrom Ghost-Remover，4.6mm×50mm或效能相当的捕集小柱)。
检测方法中所述的流动相，流动相A为0.02mol/L磷酸二氢25钾溶液(用磷酸调节pH值至4.5)，流动相B为乙腈-水(90:10)。
检测方法中所述的流速为每分钟1.0mL；柱温为25℃，检测波长为195nm；进样体积20μL。优选的，中间体化合物Ⅲ的检测方法，步骤如下：
步骤1，供试品溶液的配制：
取化合物Ⅲ约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相B 4ml超声使溶解，用流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。
步骤2，系统适用性溶液的配制：
取杂质Ⅲ-Z1、Ⅲ-Z2(杂质3-(1R)异构体)、Ⅲ-Z3、Ⅲ-Z4、Ⅲ-Z5对照品与化合物Ⅲ样品各适量，加溶剂超声使溶解并稀释制成每1ml中含化合物Ⅲ约2mg、其他杂质各约4μg的溶液。
步骤3，检测：
将供试品溶液，系统适用性溶液，分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图，计算供试品和杂质的含量；
其中，所述高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm，并在在混合器后进样器前接捕集小柱(NanoChrom Ghost-Remover，4.6mm×50mm)；
流动相：流动相A为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至4.5)，流动相B为乙腈-水(90:10)；所述的流速为每分钟1.0mL；柱温为25℃，检测波长为195nm；进样体积20μL；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 80 20
20 70 30
70 20 80
80 20 80
82 80 20
95 80 20
。
其中，中间体化合物Ⅳ的检测方法，
采用高效液相色谱法，色谱条件如下
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢钾溶液为流动相A，以乙
腈-水为流动相，进行梯度洗脱
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 80 20
20 70 30
70 60 40
80 60 40
82 80 20
95 80 20
检测方法中所述的色谱柱为NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱，并在在混合器后进样器前接捕集小柱(NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)。
检测方法中所述的流动相，流动相A为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至4.5)，流动相B为乙腈-水(90:10)。
检测方法中，所述的流速为每分钟1.0mL；柱温为25℃，检测波长为195nm；进样体积20μL。优选的，中间体化合物IV的检测方法，步骤如下：
步骤1，供试品溶液的配制：
取化合物Ⅳ约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
步骤2，系统适用性溶液的配制：
取杂质Ⅳ-Z1(双乙酰化杂质)、Ⅳ-Z2对照品与化合物Ⅳ样品各适量，加溶剂超声使溶解并稀释制成每1ml中含化合物Ⅳ约2mg、其他杂质各约4μg的溶液。
步骤3，检测：
将供试品溶液，对照品溶液和杂质对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图，计算供试品和杂质的含量；
其中，所述高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱为NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm，并在在混合器后进样器前接捕集小柱(NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm)。
流动相，流动相A为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至4.5)，流动相B为乙腈-水(90:10)；
流速为每分钟1.0mL；柱温为25℃，检测波长为195nm；进样体积20μL，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 80 20
20 70 30
70 60 40
80 60 40
82 80 20
95 80 20
本发明的化合物Ⅲ检测方法，其中的色谱条件和样品的配制方法等是经过筛选得到的，筛选过程如下：
(1)检测波长选择
对化合物Ⅲ及其部分杂质进行紫外光谱扫描，结果显示，各物质均为末端吸收。
分别选择205nm及195nm两个波长对样品进行检测，结果显示205nm波长灵敏度较差，不能满足检测需求，最终选择波长为195nm。
(2)溶剂及供试品浓度选择
选择波长为195nm，对化合物Ⅲ进行灵敏度考察，结果显示当浓度为2μg/ml时，该峰信噪比大于10，故选择供试品浓度为2mg/ml。化合物Ⅲ水溶性差，溶剂中加入乙腈可增加其溶解度，但乙腈比例过大，会影响化合物Ⅲ的峰形。经筛选，确定的溶剂为流动相A-流动相B(60:40)。
(3)流动相pH选择
对不同pH的磷酸盐缓冲液进行考察，结果显示化合物Ⅲ的杂质Ⅲ-Z1对pH敏感，不同pH下，杂质Ⅲ-Z1与相邻杂质的分离度差异较大，经筛选，选择磷酸盐的pH为4.5。
(4)梯度洗脱程序选择
设置不同的梯度洗脱程序，考察各成分峰形及分离情况，结果显示，影响特定杂质RRT1.6和甲苯峰的分离度，上述梯度下，各杂质均能够有效分离，峰形良好。
(5)柱温、流速选择
考察柱温对分离度和峰形的影响，结果柱温几乎没有影响，结合色谱柱的压力及温度耐受范围，选择柱温为25℃、流速为1.0ml/min。
综上，制定了化合物Ⅲ的检测方法。
优点在于：
化合物Ⅲ有关物质检测方法未见相关文献报导。建立了化合物Ⅲ的检测方法，该方法灵敏度高，专属性强，准确度和精密度良好，能有效检测化合物Ⅲ的有关物质，便于帕拉米韦原料药生产质量控制。
本发明的化合物IV检测方法，其中的色谱条件和样品的配制方法等是经过筛选得到的，筛选过程如下：
使用化合物Ⅲ的检测方法对化合物IV进行检测，结果主峰与相邻杂质峰分离较差，调整20～70分钟梯度的变化，各峰之间分离良好。化合物IV检测方法建立。
优点在于：
化合物IV有关物质检测方法未见相关文献报导。建立了化合物IV的检测方法，该方法灵敏度高，专属性强，准确度和精密度良好，能有效检测化合物IV的有关物质，便于帕拉米韦原料药生产质量控制。
附图说明
图1化合物Ⅲ的HPLC系统适用性图谱
图2化合物Ⅲ的HPLC图谱
图3化合物Ⅳ的HPLC系统适用性图谱
图4化合物Ⅳ的HPLC图谱
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
实施例1
称取2.00kg化合物Ⅱ、1.42kg六水合氯化镍、6.00kg甲醇，加入50L反应釜中，降温至0℃以下，滴加硼氢化钠甲醇溶液(0.85kg硼氢化钠、5.00kg甲醇)。滴毕，反应体系控温0～10℃搅拌反应2h。加入10.00kg纯化水，控温20～30℃将亚硝酸钠溶液流加至反应液中。20～25℃继续搅拌反应14h。过滤，滤饼依次用25.00kg氨水、EDTA-2Na水溶液(1.30kgEDTA-2Na，22.00kg纯化水)浆洗得到化合物Ⅲ粗品。
化合物Ⅲ粗品加至30.00kg甲苯中，升温60～70℃溶清，降温至20～30℃搅拌析晶1h，过滤，甲苯、纯化水淋洗滤饼；将滤饼转移至真空干燥箱中，45℃±5℃干燥，得类白色固体化合物Ⅲ，1.78kg，收率89％。(HPLC纯度98.188％，异构体0.023％)。
实施例2
称取2.00kg化合物Ⅱ、1.42kg六水合氯化镍、6.00kg甲醇，加入50L反应釜中，降温至0℃以下，滴加硼氢化钠甲醇溶液(0.85kg硼氢化钠、5.00kg甲醇)。滴毕，反应体系控温0～10℃搅拌反应2h。加入10.00kg纯化水，控温20～30℃将亚硝酸钠溶液流加至反应液中。20～25℃继续搅拌反应14h。过滤，滤饼依次用25.00kg氨水、EDTA-2Na水溶液(1.30kgEDTA-2Na，22.00kg纯化水)浆洗得到化合物Ⅲ粗品。
化合物Ⅲ粗品加至40.00kg甲苯中，升温60～70℃溶清，降温至20～30℃搅拌析晶1h，过滤，甲苯、纯化水淋洗滤饼；将滤饼转移至真空干燥箱中，45℃±5℃干燥，得类白色固体化合物Ⅲ，1.68kg，收率85％。(HPLC纯度98.281％，异构体0.015％)。
实施例3
向反应釜中加入23.50kg乙酸乙酯和2.90kg化合物Ⅲ，滴加0.90kg乙酸酐，2～3h加毕；控温20～30℃搅拌反应。反应完毕后，加入10％碳酸钠水溶液5.00kg，搅拌20min，静置20min；分液，收集有机相，减压蒸馏(真空度≤-0.08MPa)，浓缩至加入量的80～90％时停止；加入23.65kg正庚烷，析出大量固体，降温至0～10℃搅拌1h；离心，正庚烷淋洗，滤饼45～50℃真空干燥，得3.15kg类白色固体中间体Ⅳ粗品，收率97.2％。(HPLC纯度99.552％，双乙酰化杂质0.095％)
向反应釜中加入3.00kgⅣ粗品，5.40kg乙酸乙酯和4.00kg正庚烷，开启搅拌，升温至50～60℃，体系溶清；降温加入20.00kg正庚烷，体系有大量固体析出，继续降温至0～10℃搅拌析晶1h；离心，正庚烷淋洗滤饼，滤饼45～50℃真空干燥，得类白色固体帕拉米韦中间体Ⅳ，2.89kg，收率96％。(HPLC纯度99.732％，双乙酰化杂质0.032％)。
实施例4
化合物Ⅳ粗品制备方法与实施例3相同。向反应釜中加入3.00kgⅣ粗品，5.40kg乙酸乙酯和4.00kg正庚烷，开启搅拌，升温至50～60℃，体系溶清；降温加入34.00kg正庚烷，体系有大量固体析出，继续降温至0～10℃搅拌析晶1h；离心，正庚烷淋洗滤饼，滤饼45～50℃真空干燥，得类白色固体帕拉米韦中间体Ⅳ，2.70kg，收率90％。(HPLC纯度99.580％，双乙酰化杂质0.065％)。
实施例5
化合物Ⅳ粗品制备方法与实施例3相同。向反应釜中加入3.00kgⅣ粗品，6.70kg乙酸乙酯和4.00kg正庚烷，开启搅拌，升温至50～60℃，体系溶清；降温加入20.00kg正庚烷，体系有大量固体析出，继续降温至0～10℃搅拌析晶1h；离心，正庚烷淋洗滤饼，滤饼45～50℃真空干燥，得类白色固体帕拉米韦中间体Ⅳ，2.13kg，收率71％。(HPLC纯度99.511％，双乙酰化杂质0.152％)。
实施例6
化合物Ⅳ粗品制备方法与实施例3相同。向反应釜中加入3.00kgⅣ粗品，6.70kg乙酸乙酯和4.00kg正己烷，开启搅拌，升温至50～60℃，体系溶清；降温加入20.00kg正己烷，体系有固体析出，继续降温至0～10℃搅拌析晶1h；离心，正己烷淋洗滤饼，滤饼45～50℃真空干燥，得类白色固体帕拉米韦中间体Ⅳ，2.64kg，收率88％。(HPLC纯度99.322％，双乙酰化杂质0.184％)。
实施例7
采用高效液相色谱法对实施例1中所获得的(1S,2S,3R,4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基丁基]-4[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-2-羟基环戊酸甲酯(Ⅲ)进行检测，其中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)，在混合器后进样器前接捕集小柱(NanoChrom Ghost-Remover，4.6mm×50mm或效能相当的捕集小柱))；以0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至4.5)为流动相A，以乙腈-水(90:10)为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温为25℃，检测波长为195nm；进样体积20μL。
本实施例中，所述指定的梯度洗脱程序如下表所示。
表1梯度洗脱程序
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 80 20
20 70 30
70 20 80
80 20 80
82 80 20
95 80 20
得到的化合物Ⅲ的HPLC图谱如图1所示。系统适用性溶液色谱图中，异构体与Ⅲ依次出峰，两峰之间的分离度大于0.5。
化合物Ⅲ检测的系统适用性图谱及HPLC图谱见附图1、2。
实施例8
采用高效液相色谱法对实施例2中所获得的(1S,2S,3R,4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨基-2-乙基丁基]-4-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-2-羟基环戊烷-1-甲酸甲酯(Ⅳ)进行检测，其中，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)，在混合器后进样器前接捕集小柱(NanoChrom Ghost-Remover，4.6mm×50mm或效能相当的捕集小柱)；以0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至4.5)为流动相A，以乙腈-水(90:10)为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温为25℃，检测波长为195nm；进样体积20μL。
本实施例中，所述指定的梯度洗脱程序如下表所示。
表2梯度洗脱程序
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 80 20
20 70 30
70 60 40
80 60 40
82 80 20
95 80 20
化合物Ⅳ检测的系统适用性图谱(双乙酰基杂质RRT＝1.20)及HPLC图谱见附图3、4。
对比实施例
对比实施例1
化合物Ⅲ粗品2.00kg，加入4.00kg甲醇，4.00kg纯化水，搅拌，升温60～70℃溶清，降温至20～30℃搅拌析晶1h，过滤，纯化水淋洗滤饼，滤至无液体流出；将滤饼转移至真空干燥箱中，45℃±5℃干燥，得类白色固体帕拉米韦中间体Ⅲ，1.05kg，收率53％，HPLC纯度97.25％。
对比实施例2
V的制备：称取2.00kg化合物Ⅳ，4.77kg二氯甲烷，加入反应釜中，开启搅拌，降温，控温0℃～10℃，滴加30％盐酸，滴毕，0℃～10℃搅拌1h。TLC监测至化合物Ⅳ物料点(展开剂:V二氯甲烷:V甲醇:V氨水＝100:5:0.8)消失视为反应完毕。反应完毕后，静置分出水相。向有机相中加入2.00kg纯化水，搅拌、静置，合并水相。向水相中加入2.66kg二氯甲烷洗涤，分出水相备用。
Ⅵ的制备：将上述水相降温至10℃以下，控温滴加30％氢氧化钠水溶液；滴毕，控温0℃～10℃搅拌1h，TLC监测(展开剂:甲醇)，至V物料点消失视为反应完毕。
I的制备：将上述水溶液升温至20℃～30℃，加入0.96kg 1H-1,2,4-三氮唑-1-甲脒盐酸盐，搅拌，滴加30％氢氧化钠水溶液，调节pH至8.2～8.5，控温20℃～30℃搅拌反应14h。反应完毕后降温至-5℃～5℃搅拌析晶7h，过滤。
精制：1.50kg帕拉米韦(I)滤饼、7.50kg纯化水和6.00kg甲醇加入反应釜中，搅拌升温至回流。溶清后趁热过滤，滤液冷却至20℃～25℃搅拌析晶2h，降温至0℃～5℃搅拌析晶2h，过滤；滤饼20℃～25℃真空干燥，得类白色结晶性固体1.01kg，收率61.6％(HPLC：99.97％，最大单杂0.015％)。
本发明所述的方法并不限于所述具体实施方式，上述实施例只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其他的特定方式或其他的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。

Claims (10)

1.帕拉米韦中间体化合物Ⅲ的检测方法，
采用高效液相色谱法，其特征在于，所述方法中色谱条件如下
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢钾溶液为流动相A，以乙腈
-水为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 80 20 20 70 30 70 20 80 80 20 80 82 80 20 95 80 20
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测方法中所述的色谱柱为NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱，并在在混合器后进样器前接捕集小柱(NanoChrom Ghost-Remover，4.6mm×50mm或效能相当的捕集小柱)。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的流动相，流动相A为0.02mol/L磷酸二氢溶液(用磷酸调节pH值至4.5)，流动相B为乙腈-水(90:10)。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的流速为每分钟1.0mL；柱温为25℃，检测波长为195nm；进样体积20μL。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
步骤1，供试品溶液的配制：
取化合物Ⅲ约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相B 4ml超声使溶解，用流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。
步骤2，系统适用性溶液的配制
取杂质III-Z1、III-Z2(3-(1R)异构体杂质)、III-Z3、Ⅲ-Z4、III-Z5对照品与化合物III样品各适量，加溶剂超声使溶解并稀释制成每1ml中含化合物III约2mg、其他杂质各约4μg的溶液。
步骤3，检测：
将供试品溶液，系统使用性溶液，分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图，计算供试品和杂质的含量；
其中，所述高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm，并在在混合器后进样器前接捕集小柱(NanoChrom Ghost-Remover，4.6mm×50mm)；
流动相：流动相A为0.02mol/L磷酸二氢25钾溶液(用磷酸调节pH值至4.5)，流动相B为乙腈-水(90:10)；所述的流速为每分钟1.0mL；柱温为25℃，检测波长为195nm；进样体积20μL；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 80 20 20 70 30 70 20 80 80 20 80 82 80 20 95 80 20
。
6.帕拉米韦中间体化合物Ⅳ的检测方法，
采用高效液相色谱法，其特征在于，所述方法中色谱条件如下
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢钾溶液为流动相A，以乙
腈-水为流动相，进行梯度洗脱
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测方法中所述的色谱柱为NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱，并在在混合器后进样器前接捕集小柱(NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的流动相，
流动相A为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至4.5)，流动相B为乙腈-水(90:10)。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的流速为每分钟1.0mL；柱温为25℃，检测波长为195nm；进样体积20μL。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
步骤1，供试品溶液的配制：
取化合物Ⅳ约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
步骤2，系统适用性溶液的配制：
取杂质Ⅳ-Z1(双乙酰化杂质)、Ⅳ-Z2对照品与化合物Ⅳ样品各适量，加溶剂超声使溶解并稀释制成每1ml中含化合物Ⅳ约2mg、其他杂质各约4μg的溶液。
步骤3，检测：
将供试品溶液，系统适用性溶液，分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图，计算供试品和杂质的含量；
其中，所述高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱为NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm，并在在混合器后进样器前接捕集小柱(NanoChrom ChromCore AQ C18，4.6mm×250mm，5μm)。
流动相，流动相A为0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至4.5)，流动相B为乙腈-水(90:10)；
流速为每分钟1.0mL；柱温为25℃，检测波长为195nm；进样体积20μL，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序为：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 80 20 20 70 30 70 60 40 80 60 40 82 80 20 95 80 20
。
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