CN117247916A - 一种提高糖原分支酶热稳定性的方法及其应用 - Google Patents
一种提高糖原分支酶热稳定性的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高糖原分支酶热稳定性的方法及其应用，属于基因工程技术和酶工程领域。本发明公开了一系列热稳定性提高的糖原分支酶突变体。单一突变体的酶活是野生型酶的1.14～1.45倍，表观熔融温度提高了0.3～3.4℃。组合突变体在95℃下孵育15h后，保留100％原始酶活。利用本发明公开的突变型糖原分支酶制备的改性淀粉中，突变体相较于野生酶制备的改性淀粉α‑1,6糖苷键比例高出1.08～1.92倍，相较于原玉米淀粉高出1.39～2.68倍。本发明提供的突变体提高最适温度和热稳定性以及显著增加了淀粉的分支度，能够实现在70℃高温下进行工业化生产支化淀粉，使得分支反应和淀粉溶胀能够同步进行。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高糖原分支酶热稳定性的方法及其应用，具体涉及一种热稳定性提高的糖原分支酶突变体，及其在淀粉改性中的应用，属于基因工程技术和酶工程领域。
背景技术
淀粉是植物在光合作用下合成的一种天然且丰富的高分子聚合物，是植物体内最大的储能物质，及主要的能量来源。其来源多，范围广，具有良好的应用前景。由于天然淀粉存在一些纤维素、果胶等类似物质不具备的独特性质，例如粘性、流变性、凝胶性等，可以作为增稠剂、稳定剂及胶体胶凝剂等，而被广泛应用于生物医药工业、材料建筑业以及食品工业等等。在食品工业中，淀粉更是作为产品的物料来源以及重要的配料，对加工食品的质地和感官特性有着不可替代的作用。但是，在食品加工以及应用过程中，淀粉会发生加工技术带来的一系列结构和性质的变化，而这些变化对食品的品质、口感和外观会产生不可逆的损伤。所以需要针对天然淀粉进行必要的改性，改善原淀粉的特性缺陷。而改性后的高支化淀粉可以明显的改善原淀粉的溶解度、黏度、回生、流变以及消化等特性。
淀粉高支化改性方法包括四种基本类型，即化学方法改性、物理方法改性、基因改性、酶法改性。物理方法改性淀粉既简单又经济环保，产品安全性很高。但是手段太过单一。化学方法改性淀粉需要用化学试剂协助去改变原淀粉的溶解度、糊化和老化等特性。但是相关化学试剂的使用带来的安全性问题值得引起关注。基因改性主要是基于转基因技术，表现为淀粉分支度增加，直链淀粉含量降低的特征。但是基因改性是难以控制的，所以应用不太广泛。酶法改性由于来源广泛(如微生物、植物、动物)、底物专一性强、绿色高效和产物得率高等特点，在工业改性中逐渐受到青睐。由于淀粉糊化温度高，因此在淀粉改性过程中需要酶在高温下保持较好的活性，亟需寻找具有较高耐热性且酶活较高的糖原分支酶。而大部分天然糖原分支酶具有不耐高温、热稳定性差以及对环境变化敏感等特点，很难完全满足工业发展的需求。因此，通过酶工程技术提高糖原分支酶的热稳定性是有重要意义的。
现有技术当中，有通过基因工程的手段提高α-1,4葡聚糖分支酶的热稳定性：例如，Ban，Liu和Zhang等人通过对来源Geobacillus thermoglucosidans STB02的α-1，4-葡聚糖分支酶通过C端截断，得到了Tm提高了4℃的突变体GBEΔC(Thermostabilization ofathermophilic 1,4-α-glucan branching enzyme through C-terminaltruncation.International Journal ofBiological Macromolecules,107,1510–1518.)；Ban，Wang和Fan等人通过对来源Geobacillus thermoglucosidans STB02的α-1，4葡聚糖分支酶进行B因子分析，构建盐桥，得到了突变体K137E，在60℃的半衰期增加了约36.6％(Thermostability andcatalytic ability enhancements of 1,4-α-glucan branchingenzyme by introducing saltbridges at flexible amino acid sites.InternationalJournal of Biological Macromolecules,224,1276–1282.)；Li，Ban等人通过对Geobacillus thermoglucosidans STB02α-1，4-葡聚糖分支酶合理设计二硫键得到了突变体V75C和T77C，其在65℃耐热性提高了1.5倍(Rational Design of Disulfide Bonds forEnhancing the Thermostability of the 1,4-α-Glucan Branching Enzyme fromGeobacillus thermoglucosidans STB02.Journal ofAgricultural andFood Chemistry,68(47),13791–13797.)。但由于淀粉糊化温度高，现有的糖原分支酶并不能够满足工业时间长、温度高的要求。因此，开发高耐热性糖原分支酶将能显著提高糖原分支酶在淀粉改性中的应用价值，更有助于工业化生产支化淀粉，改善原淀粉消化性、溶解性、黏度和回生程度，拓宽其在食品领域的应用。
发明内容
[技术问题]
在进行淀粉改性时，淀粉糊化温度高，现有的糖原分支酶并不能够满足工业化生产高支化淀粉时间长、温度高同时具有高酶活的要求。
[技术方案]
发明人前期发现来源于Pyrococcus horikoshii OT3的糖原分支酶(PDB:5WU7)产酶量大且酶活较好，最适温度60℃接近淀粉糊化温度。
本发明对来源于Pyrococcus horikoshii OT3的野生型糖原分支酶及本发明的突变体进行表征后，发现单一或组合突变体极大提高了糖原分支酶的耐热性，表观熔融温度(Tm)最高提高了3.4℃，最适温度最高提高了10℃，同时酶活也有不同程度的提升。这有利于提高对淀粉改性的程度，增加高支化淀粉产率，有望实现慢消化、延缓回生、溶解度高的支化淀粉应用于食品工业中。同时，70℃已经达到了普通淀粉糊化的温度，可以使淀粉颗粒溶胀加剧，利于酶进入并接触淀粉内部，最大化发挥分支效果，可以实现分支改性和糊化溶胀同步进行，简化改性步骤，节省工业能耗。
本发明提供了热稳定性提高的糖原分支酶突变体，以及能够表达所述糖原分支酶突变体的大肠杆菌工程菌。
本发明提供了一种糖原分支酶突变体，所述突变体是对糖原分支酶的第140位、第206位、第331位、第334位、第415位、第427位、第444位、第484位、第508位中的至少一处氨基酸进行突变得到的。
所述糖原分支酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶；或与SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的糖原分支酶；或与SEQ ID NO.2所示的编码序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列的糖原分支酶基因。
在本发明的一种实施方式中，所述突变包括取代、缺失或添加。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的出发序列进行了如下至少一处氨基酸的取代：
(1)将第140位的缬氨酸突变为异亮氨酸；
(2)将第206位的赖氨酸突变为脯氨酸；
(3)将第331位的甘氨酸突变为苯丙氨酸；
(4)将第334位的亮氨酸突变为谷氨酸；
(5)将第415位的组氨酸突变为色氨酸；
(6)将第427位的脯氨酸突变为精氨酸；
(7)将第444位的酪氨酸突变为亮氨酸；
(8)将第484位的蛋氨酸突变为精氨酸；
(9)将第508位的苏氨酸突变为赖氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第140位的缬氨酸突变为异亮氨酸；命名为：V140I。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第206位的赖氨酸突变为脯氨酸；命名为：K206P。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第331位的甘氨酸突变为苯丙氨酸；命名为：G331F。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第334位的亮氨酸突变为谷氨酸；命名为：L334E。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第415位的组氨酸突变为色氨酸；命名为：H415W。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第427位的脯氨酸突变为精氨酸；命名为：P427R。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第444位的酪氨酸突变为亮氨酸；命名为：Y444L。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第484位的蛋氨酸突变为精氨酸；命名为：M484R。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第508位的苏氨酸突变为赖氨酸；命名为：T508K。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第140位的缬氨酸突变为异亮氨酸、第415位的组氨酸突变为色氨酸；命名为：V140I+H415W。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第140位的缬氨酸突变为异亮氨酸、第508位的苏氨酸突变为赖氨酸；命名为：V140I+T508K。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第415位的组氨酸突变为色氨酸、第508位的苏氨酸突变为赖氨酸；命名为：H415W+T508K。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第140位的缬氨酸突变为异亮氨酸、第415位的组氨酸突变为色氨酸、第508位的苏氨酸突变为赖氨酸；命名为：V140I+H415W+T508K。
本发明提供了编码上述突变体的基因。
本发明提供了表达上述突变体或上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pET29b(+)。
本发明提供了表达上述突变体，或含有上述基因，或含有上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以原核细胞或真核细胞为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属；所述真核细胞为真菌细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为表达宿主。
本发明提供了一种制备上述突变体的方法，所述方法步骤如下：
(1)根据突变位点，设计突变点的突变引物，以带有糖原支酶编码基因的载体为模板进行定点突变；构建含编码突变体的基因的表达载体；
(2)将含编码突变体的基因的表达载体转化进入E.coli BL21(DE3)为表达宿主；
(3)挑选阳性克隆进行扩大培养，离心收集细胞，细胞破碎仪破碎细胞上清即为糖原分支酶突变体的粗酶液；
(4)糖原分支酶粗酶液注入蛋白纯化仪中，通过梯度洗脱得到纯酶液。
本发明提供了一种提高糖原分支酶的热稳定性的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第38位的异亮氨酸突变为亮氨酸；将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第140位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第206位的赖氨酸突变为脯氨酸；或将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的糖原分支酶的第331位的甘氨酸突变为苯丙氨酸；或将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的糖原分支酶的第334位的亮氨酸突变为谷氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第415位的组氨酸突变为色氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第427位的脯氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第444位的酪氨酸突变为亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第484位的蛋氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第508位的苏氨酸突变为赖氨酸。
本发明提供了含有所述糖原分支酶突变体的组合物。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物以所述糖原分支酶作为主要酶组分，并含有一种或多种佐剂。
在本发明的一种实施方式中，所述佐剂包括但不限于酶稳定剂。
在本发明的一种实施方式中，所述酶稳定剂包括甘露醇、DTT、海藻糖或维生素C。
本发明提供了一种制备支化淀粉的方法，所述方法为在直链淀粉中加入所述糖原分支酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，于60～70℃反应10～30min。
本发明提供上述突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞在制备高支化淀粉中的应用。
本发明提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞在生化、食品领域中的应用。
有益效果：
1、本发明公开了一系列热稳定性提高的糖原分支酶突变体。采用本发明的方法获得了热稳定性提高的单一或组合突变体，是现有报道中最适温度提高最高的糖原分支酶突变体，且本发明的单一突变体在热稳定提高同时并提高了自身酶活，组合突变体在热稳定提高同时并保留了野生型原始酶活。单一突变体V140I、H415W、T508K、K206P、G331F、L334E、P427R、Y444L、M484R的酶活是野生型酶的1.14～1.45倍，表观熔融温度(Tm)提高了0.3～3.4℃。
2、本发明提供的突变体的最适温度达到60～70℃，并且热稳定性得到了显著提高，其中，单一突变体V140I、H415W和T508K，组合突变体V140I/H415W、V140I/T508K、H415W/T508K和V140I/H415W/T508K在95℃下孵育15h后，仍然保留100％原始酶活。单一突变体T508K在95℃孵育60h后，依然保留10％的原始活性，组合体H415W/T508K在95℃孵育60h后，仍然保留80％活性，其余组合突变体在95℃下孵育60h后，保留30％以上的原始酶活。而野生酶在95℃孵育60h后，已完全丧失活性。
3、经本发明提供的突变型糖原分支酶作用后直链淀粉的λmax相较于野生型的λmax减小，吸光度相比也出现大幅度减小，使得催化直链淀粉产生更多的分支链。
4、利用本发明提供的突变型糖原分支酶制备的改性淀粉中，突变体相较于野生酶制备的改性淀粉α-1,6糖苷键比例高出1.08～1.92倍，相较于最初的原玉米淀粉中的α-1,6糖苷键比例高出1.39～2.68倍。
5、本发明提供的突变体相比较于野生酶提高了最适温度和热稳定性，以及显著增加了淀粉的分支度，能够实现在70℃高温下进行工业化生产支化淀粉，使得分支反应和淀粉溶胀能够同步进行，从而简化改性步骤，降低生产所需的水耗和干燥所需的能耗，具有良好的工业应用前景。
附图说明
图1：野生糖原分支酶及突变体酶纯化后的SDS-PAGE图；其中，图中M：蛋白质分子量标准，1：纯化后野生型糖原分支酶，2-17：纯化后的突变体，依次为F24H、I38L、R83E、G109K、V140I、N165I、K206P、G331F、L334E、A367V、H415W、P427R、Y444L、E465Q、M484R、T508K，2-5：V140I/H415W、V140I/T508K、H415W/T508K、V140I/H415W/T508K
图2：野生糖原分支酶及其突变体的Tm和酶活表征。
图3：野生糖原分支酶及其单一突变体最适反应温度表征。
图4：野生糖原分支酶及其组合突变体最适反应温度表征。
图5：野生糖原分支酶及其单一突变体最适反应pH表征。
图6：野生糖原分支酶及其组合突变体最适反应pH表征。
图7：野生糖原分支酶及其突变体在95℃下的热稳定性表征。
图8：野生糖原分支酶及其突变体的碘结合能力分析。
具体实施方式
技术术语：
糖原分支酶：术语“糖原分支酶”是指如酶命名法所定义的EC 2.4.1.18类中的酶。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定“糖原分支酶”的活性。在一方面，本发明的所述糖原分支酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶；或与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的糖原分支酶；或与SEQ ID NO.2所示的编码序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列的糖原分支酶基因。
表达：术语“表达”包括涉及糖原分支酶突变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，所述分子包含编码本发明的糖原分支酶突变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
宿主细胞可以是在糖原分支酶突变体的重组生产中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
直链淀粉：是由几百至几千个葡萄糖单体通过α-D-1,4糖苷键(99％)连接而成的线性长链分子，且含有少量的α-D-1,6支链(1.0％)，分支点的α-D-1,6糖苷键占总糖苷键的0.3％～0.5％，其聚合度为324～4920。
支化淀粉：“分支淀粉”、“改性淀粉”可以互换使用，是由D-葡萄糖构成的一种多分支的可溶性多聚碳水化合物，主链由D-葡萄基通过α-1，4糖苷键连接构成，每24～30个D-葡萄糖基就有一个分支，分支点由α-1，6糖苷键与主链连接。
下述实施例中所涉及的主要试剂：E.coli BL21(DE3)和BCA浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，直链淀粉购自Sigma公司，玉米淀粉购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其他常用试剂均为国产分析纯。
下述实施例中所涉及的培养基如下：培养基均使用超纯水配置，配置完成后高压灭菌锅，121℃灭菌20min。
LB液体培养基：酵母提取物0.5g/100mL、胰蛋白胨1.0g/100mL、NaCl 1.0g/100mL。
LB固体培养基：在LB液体培养基基础上，琼脂粉1.5g/100mL。
LB液体抗性培养基：在LB液体培养基基础上，100mL液体培养基添加卡那霉素，终浓度30μg·mL-1。
LB固体培养基：在LB固体培养基基础上，100mL固体培养基添加卡那霉素，终浓度为30μg·mL-1。
下述实施例中所涉及的酶的纯化溶液如下：
(1)上样缓冲液：称取2.42g Tris-HCl，29.22gNaCl，1.36g咪唑，超纯水溶解并定容至1L(pH＝7.4)。
(2)洗脱缓冲液：称取2.42g Tris-HCl，29.22gNaCl，34.04g咪唑，超纯水溶解并定容至1L(pH＝7.4)。
(3)重悬液：称取2.42g Tris-HCl，29.22gNaCl，超纯水溶解并定容至1L(pH＝7.4)。
上样缓冲液洗去杂蛋白，洗脱液洗脱并收集目的蛋白，即得到纯化的酶。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
酶活测定：
取200μl 1mg/mL直链淀粉溶液于5ml离心管中，放入水浴摇床保温5min，加入14μg酶，震荡混匀，水浴摇床150rpm，于一定温度和pH条件下(根据下述实施例中测得的相应酶的最适温度和最适pH进行酶活测定)，反应10min，加入500μl的1mmol/L的盐酸猝灭反应，再加入1ml碘液，避光显色5min，在660nm下测定吸光度变化并计算酶活。
酶活定义为在吸光度660nm条件下，导致吸光度每分钟降低0.01个光密度单位的酶的量为一个酶活力单位(U)。
碘液配置：0.5mL储备碘液(包含0.26g I2和2.6g KI的水溶液)和1mL 1mol/LHCl使用超纯水定容至130ml。
Tm值测定：
采用差示扫描微量热仪(Nano DSC)。纯化酶液稀释至0.5mg/ml，635nm汞脱气处理10min，取300μl酶液加入Nano DSC样品槽，扫描温度设置为60-120℃，温度以1℃/min速率上升。观察峰对应的温度，通过Nano分析软件拟合，即为Tm值。
热稳定性测定：
将适量浓度的酶置于95℃的水浴，分别保温15、30、45和60h，通过上述酶活测定步骤，测定对应时间段的酶活。
直链淀粉与碘结合物测定：
取200μl 1mg/mL直链淀粉溶液(pH＝6.0)于5ml离心管中，放入水浴摇床60℃或70℃，保温5min，加入200μl稀释好的酶液，震荡混匀，在水浴摇床60℃或70℃、150rpm，反应15min，加入500μl的1mmol/L的盐酸猝灭反应，再加入1ml碘液，避光显色5min，而后使用酶标仪扫描直链淀粉-碘络合物在500-800nm的吸收光谱并测定其最大吸收波长。
α-1,6糖苷键比例测定：
采用核磁共振氢谱(1H NMR)测定玉米原淀粉及改性淀粉的α-1,6糖苷键相对含量。称取玉米原淀粉和改性淀粉40mg溶解于0.5mL重水(D2O)中，沸水浴涡旋糊化30min。糊化后的样品冷冻干燥72h后，重新溶解于0.5mL重水(D2O)中配置8％(w/v)的溶液，通过加热到60℃1H NMR测定其α-1,6糖苷键含量，4.97ppm左右为α-1,6糖苷键含量，5.22ppm左右为α-1,4糖苷键含量。
实施例1：突变体的构建
(1)含有野生型糖原分支酶Ph GBE基因的重组载体的构建
根据野生型糖原分支酶Ph GBE的NCBI上登录号PDB:5WU7(氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)，经过大肠杆菌编码基因优化，送至安升达生物科技有限公司进行基因合成并重组质粒。载体为质粒pET29b(+)，限制性酶切位点分别为NdeI和XhoI，获得野生重组质粒pET29b-GBE。
(2)突变体重组载体的构建
设计位点突变引物，以步骤(1)获得的野生重组质粒为模板进行定点突变，分别获得含有突变体F24H、I38L、R83E、G109K、V140I、N165I、K206P、G331F、L334E、A367V、H415W、P427R、Y444L、E465Q、M484R和T508K的重组质粒pET29b-F24H、pET29b-I38L、pET29b-R83E、pET29b-G109K、pET29b-V140I、pET29b-N165I、pET29b-K206P、pET29b-G331F、pET29b-L334E、pET29b-A367V、pET29b-H415W、pET29b-P427R、pET29b-Y444L、pET29b-E465Q、pET29b-M484R和pET29b-T508K。
突变所用到的引物序列如下：
引入F24H突变点的引物为：
F24H-F:5’-GCAAATGGCCACATGGTGAAGAATGGTTATTTGAAGCC-3’；
F24H-R:5’-CACCATGTGGCCATTTGCCATGTTTGCGAACATACG-3’；
引入I38L突变点的引物为：
I38L-F:5’-CGGAAAGCTACCTTCCACTGTTAATGGAGCTGG-3’；
I38L-R:5’-GGAAGGTAGCTTTCCGCCATGGCTTCAAATAACC-3’；
引入R83E突变点的引物为：
R83E-F:5’-GGAAGAGAAACTGAAAAGCATGGAAGAAGATCTGGAGC-3’；
R83E-R:5’-CCATGCTTTTCAGTTTCTCTTCCATATATTTTTCAAATTCGCGC-3’；
引入G109K突变点的引物为：
G109K-F:5’-TTTTATGATTAAGTACTTCAAGGATGTGTACAGCTACTGGAAGAGT-3’；
G109K-R:5’-TCCTTGAAGTACTTAATCATAAAATTAATGGCCTCGCGCAGCTTTT-3’；
引入V140I突变点的引物为：
V140I-F:5’-GTTATGTGGAAATTATTACCAGCGCGGCCACCCATGG-3’；
V140I-R:5’-GGTAAATAACCATGGGTGGCCGCGCTGGTAATAATTTCC-3’；
引入N165I突变点的引物为：
N165I-F:5’-CCCAACTGCTGATTGGCATTAAAGTGTATGAAAAATATTTTGGCCGC-3’；N165I-R:5’-CCAATCAGCAGTTGGGCCTCAATGGCTTCATCAC-3’；
引入K206P突变点的引物为：
K206P-F:5’-CAAGTACCGGTGAAGTGAAGTGGCGCCCAGGCATTG-3’；
K206P-R:5’-CCAAATTTTTTCAGGAAGTGCTCAATGCCTGGGCGCCAC-3’；
引入G331F突变点的引物为：
G331F-F:5’-CCAAACATTTCATTTTCCTGGTTCTGAGC-3’；
G331F-R:5’-GGAAAATGAAATGTTTGGCATGTTCATTCACG-3’；
引入L334E突变点的引物为：
L334E-F:5’-CATTGGTCTGGTTGAGAGCATTCTGGAGAG-3’；
L334E-R:5’-CTCAACCAGACCAATGAAATGTTTGGCATGTTCATTC-3’；
引入A367V突变点的引物为：
A367V-F:5’-GGTTTGAAGGTGTGAAGTGGTTAAGTCGTGTG-3’；
A367V-R:5’-CACACCTTCAAACCACCAGTGGCCAAATAAC-3’；
引入H415W突变点的引物为：
H415W-F:5’-GCTGGGGTATGTTTGGCACCCATTGGACCTGGTG-3’；
H415W-R:5’-CACTCAACCTCCGGATTCCACCAGGTCCAATGGG-3’；
引入P427R突变点的引物为：
P427R-F:5’-GTGGACCTGGCGTATTATTCATAAAGCGGAAGATCG-3’；
P427R-R:5’-GAATAATACGCCAGGTCCACTCAACCTCCG-3’；
引入Y444L突变点的引物为：
Y444L-F:5’-GGTGAGTTTAGCCACCAAGTATTTAGGCAAAG-3’；
Y444L-R:5’-CGGTCACCAAACTTATCTTTGCCTAAATACTTGG-3’；
引入E465Q突变点的引物为：
E465Q-F:5’-TATTATTACAAGCCAGTGATTGGCAGTTCTTAATGACCACGG-3’；
E465Q-R:5’-CTGGCTTGTAATAATAATAACTCACGGGCCAGTTGGG-3’；
引入M484R突变点的引物为：
M484R-F:5’-GTAAACGGCGCATTCTGGAGCATGCCC-3’；
M484R-R:5’-GAATGCGCCGTTTACCATATTCTTTGGCTTGGCC-3’；
引入T508K突变点的引物为：
T508K-F:5’-GCGGCAAGTTTGATGAAGTGGAACTGCTGAATGAAG-3’；
T508K-R:5’-CCACTTCATCAAACTTGCCGCGTTCAAAATAACGTTC-3’；
PCR反应体系如下：
突变PCR反应体系(20μl)：0.25μl原始质粒模板(2ng/μl)，0.5μl上游引物F(10μM)，0.5μl下游引物R(10μM)，10μl PrimeSTARMax DNAPolymerase，8.75μl ddH2O。
PCR反应条件为：95℃预变性3min；随后以98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸3min 30s为一个循环，共30个循环。
组合突变体：在原始质粒模板基础上，引物序列同上，方法同上，得到组合突变体工程菌：pET29b-V140I/H415W、pET29b-V140I/T508K、pET29b-H415W/T508K和pET29b-V140I/H415W/T508K，以pET29b-V140I/H415W为例，以单突变质粒pET29b-V140I为模板，利用突变位点H415W的引物进行全质粒PCR，得到组合突变体质粒以pET29b-V140I/H415W。
按照上述方法，抽提得到表达原始酶的野生工程菌质粒。
(3)工程菌的构建
通过琼脂糖凝胶核酸电泳验证重组质粒，胶回收目的片段，转化至感受态E.coliBL21(DE3)。然后将转化子涂布于含卡那霉素(30μg/mL)的LB平板上，37℃倒置培养过夜，待长出菌落后，挑单菌落至含有卡那霉素(30μg/mL)的液体LB培养基中，37℃，200rpm培养10-16h，取菌液送苏州安升达生物科技有限公司测序。分别得到含有正确突变点的突变体或野生型酶的工程菌。
(4)表达及分离纯化
将步骤(3)中构建的含有重组质粒的工程菌株平板划线于含卡那霉素(30μg/mL)LB固体平板上，于37℃倒置培养10h，挑取单菌落接入含有卡那霉素(30μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养10-16h得到活化菌种，按1％(v/v)接种量吸取活化菌种至含有卡那霉素(30μg/mL)的LB液体培养基中扩大培养，于37℃，200rpm摇床培养约2h 20min后加入终浓度0.5mmol/L的IPTG于30℃诱导6h后，1440×g，10min离心收集菌体。用重悬液重悬菌体，在冰浴中超声破碎30min，40％功率，超声2s，停3s，破碎后10000rpm、10min离心收集上清液，过0.45μm水系膜得粗酶液。
使用His Trap HP 1mL Ni2+柱亲和层析法纯化蛋白，先用上样缓冲液平衡Ni2+亲和层析柱，再进行粗酶液上样，流速为1mL/min，上样结束后通过洗脱缓冲液梯度洗脱获得纯的突变体酶。
分别制备得到含有野生型糖原分支酶及各个突变体酶的纯酶液。
实施例2：酶活和酶学性质测定
(1)测定上述野生型糖原分支酶及突变体酶F24H、I38L、R83E、G109K、V140I、N165I、K206P、G331F、L334E、A367V、H415W、P427R、Y444L、E465Q、M484R、T508K、V140I/H415W、V140I/T508K、H415W/T508K和V140I/H415W/T508K的酶活，将野生型酶活定义为100％，检测突变体酶的相对酶活，结果如表1、2和图2所示。
表1野生型及其突变体Tm和相对酶活
表2野生型及其突变体的ΔH和最适温度
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结果显示：经Nano DSC测定上述野生型糖原分支酶及突变体酶共21个位点的Tm值，其中效果显著的有T508K(ΔTm＝3.4℃)、H415W(ΔTm＝2.1℃)、V140I(ΔTm＝1.3℃)、H415W/T508K(ΔTm＝2.8℃)、V140I/H415W(ΔTm＝2.7℃)，除了V140I突变体，其余突变体最适温度均从60℃提升至70℃。耐热性得到提高，如表1、2及图3所示。
虽然G331F、A367V突变体的酶活得到明显提高，但是Tm增长不明显，甚至降低。
结合相对酶活和最适温度提高的突变点，结合淀粉改性反应，选择综合表现优越的单点突变体V140I、H415W、T508K，组合突变体V140I/H415W、V140I/T508K、H415W/T508K和V140I/H415W/T508K继续进行后续实验。
(2)最适反应温度：为了进一步探究突变体酶的特性，对单点突变体V140I、H415W、T508K，组合突变体V140I/H415W、V140I/T508K、H415W/T508K和V140I/H415W/T508K进行进一步的酶学性质研究。用50mmol/L乙酸钠缓冲液(pH＝6.0)配制1mg/ml直链淀粉底物，加入为14μg酶，分别于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、95℃温度下反应10min后测定酶活，由图3、4可知，野生酶和突变体V140I最适反应温度为60℃，其他突变体最适反应温度均为70℃，所有温度如表2和图3、4所示。
(3)最适反应pH：用50mmol/L柠檬酸盐缓冲液配制pH 4.0-5.0范围内的1mg/mL直链淀粉底物，用50mmol/L乙酸钠缓冲液配制pH 6.0-7.0范围内的1mg/mL直链淀粉底物，用50mmol/L Tris-HCl缓冲液配制pH 7.0-8.0范围内的1mg/mL直链淀粉底物，用甘氨酸氢氧化钠缓冲液配制pH＝9.0的1mg·mL-1直链淀粉底物，加入14μg酶，于60℃下反应10min测定酶活，由图5、6可知野生酶与突变体的最适反应pH均为5-7的范围内，性质相似。
(4)95℃下的野生酶和突变体酶热稳定性
经过95℃的酶热稳定性实验，结果如图7所示。组合突变体的热稳定性普遍高于单一突变体的热稳定性。
在95℃下，实验结果表明，野生糖原分支酶孵育15h后，保留80％原始酶活，孵育30h后，保留原始酶活的50％，在孵育60h后，几乎丧失所有酶活；
单一突变体V140I、H415W和T508K，组合突变体V140I/H415W、V140I/T508K、H415W/T508K和V140I/H415W/T508K在95℃下孵育15h后，仍然保留100％原始酶活。
突变体T508K在95℃下孵育15h后，仍然保留100％原始酶活，孵育30h后，保留70％的原始酶活，孵育至60h时，还依旧保留了10％的原始酶活。
突变体H415W/T508K在95℃下孵育15h后，保留100％原始酶活，孵育45h后，保留90％的原始酶活；孵育60h后仍然保留了80％的原始酶活。其余组合突变体在95℃下孵育60h后，保留30％以上的原始酶活。
组合突变点的热稳定性明显提高，由表1和表2可知，虽然Tm值相较于单点突变体没有变化，但是组合突变点蛋白解折叠需要的更多的能量(ΔH)，可能是其热稳定提高的原因。
(5)动力学参数
用50mmol/L乙酸钠缓冲液(pH＝6.0)配制浓度分别为0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％的直链淀粉底物，加入14μg酶，分别在最适反应温度下反应，然后测定OD值，按Lineweaver-Burk法作图拟合出野生型与突变体的各项动力学参数(表3)。
表3动力学参数
从表中数据可见，单一突变体的Km值较野生酶降低，说明单一突变体与底物直链淀粉的结合能力更强，组合突变体的Km值和野生酶相似，说明组合突变体与底物直链淀粉的结合能力相似，这一结论与相对酶活的结论一致。单一和组合突变体的Kcat/Km都比野生酶的大，说明突变体的催化能力均有提高。
实施例3：突变体应用
(1)直链淀粉与碘的结合物分析
按照实施例2步骤(3)的方法，野生酶和突变酶分别在最适温度下测定。野生型与突变型糖原分支酶与直链淀粉作用后在酶标仪中进行500-800nm的波谱扫描，结果如图8和表4所示。
测定分析表明，直链淀粉-碘的结合物λmax在646nm左右，吸光度为0.579，野生酶和突变体酶作用15min后，λmax从646nm分别移到581nm、574nm、569nm、577nm、565nm、569nm、570nm和575nm。吸光度从0.579分别移到0.275、0.246、0.24、0.216、0.229、0.192、0.22和0.213。突变体的λmax相较于野生酶的λmax减小，吸光度相比也出现减小。可能因为糖原分支酶热稳定性提升，酶的活性未下降，导致突变体酶在70℃相较于野生酶作用淀粉的能力显著增强，可以更好的在高温与直链淀粉结合发挥催化作用。使得结构中产生了更多的分支链。
表4直链淀粉与碘的结合物分析
(2)改性淀粉的制备
用50mmol/L乙酸钠溶液(pH＝6.0)配制20％(w/w)的玉米淀粉乳，分别加入制备得到的野生型或突变体的糖原分支酶，在70℃的水浴摇床中反应，转速为200rpm，反应时间为10h，反应结束后采用沸水浴30min使反应终止。-80℃冻结12h后，冷冻干燥，粉碎研磨成粉，过100目筛，得到改性玉米淀粉，备用。
(3)α-1,6糖苷键的相对比例
取步骤(2)制备的改性淀粉测定其α-1,6糖苷键的相对比例，结果显示(如表5所示)，除V140I外，其余突变酶的改性淀粉分支度显著高于野生酶改性淀粉分支度，其中突变体H415W和组合突变体V140I/H415W改性淀粉的α-1,6糖苷键相对比例为12.50％，相较于普通淀粉多2.68倍，相较于野生酶改性淀粉多1.92倍。
表5α-1,6糖苷键的相对比例
以上结果可得，突变型糖原分支酶热稳定性提升，且保留了原始酶活性，在高温具有了更强的分支能力，能够改善原淀粉消化性、溶解性、黏度和回生程度，为其在食品、医药工业中的应用提供了一定的帮助。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (15)
1.一种糖原分支酶突变体，其特征在于，所述糖原分支酶突变体是对糖原分支酶的第140位、第206位、第331位、第334位、第415位、第427位、第444位、第484位、第508位中的至少一处氨基酸进行突变得到的；
其中，所述糖原分支酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶；或与SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的糖原分支酶；或与SEQ ID NO.2所示的编码序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列的糖原分支酶基因。
2.根据权利要求1所述的糖原分支酶突变体，其特征在于，所述糖原分支酶突变体对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的出发序列进行了如下至少一处氨基酸的取代：
(1)将第140位的缬氨酸突变为异亮氨酸；
(2)将第206位的赖氨酸突变为脯氨酸；
(3)将第331位的甘氨酸突变为苯丙氨酸；
(4)将第334位的亮氨酸突变为谷氨酸；
(5)将第415位的组氨酸突变为色氨酸；
(6)将第427位的脯氨酸突变为精氨酸；
(7)将第444位的酪氨酸突变为亮氨酸；
(8)将第484位的蛋氨酸突变为精氨酸；
(9)将第508位的苏氨酸突变为赖氨酸。
3.编码权利要求1或2所述糖原分支酶突变体的基因。
4.表达权利要求1或2所述糖原分支酶突变体或权利要求3所述基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。
6.表达权利要求1或2所述糖原分支酶突变体，或含有权利要求3所述基因，或含有权利要求4或5所述重组载体的重组细胞。
7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以原核细胞或真核细胞为表达宿主。
8.一种提高糖原分支酶的热稳定性的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第38位的异亮氨酸突变为亮氨酸；将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的糖原分支酶的第140位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的糖原分支酶的第206位的赖氨酸突变为脯氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第331位的甘氨酸突变为苯丙氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第334位的亮氨酸突变为谷氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第415位的组氨酸突变为色氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第427位的脯氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第444位的酪氨酸突变为亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第484位的蛋氨酸突变为精氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖原分支酶的第508位的苏氨酸突变为赖氨酸。
9.含有权利要求1或2所述糖原分支酶突变体的组合物。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物以权利要求1或2所述糖原分支酶作为主要酶组分，并含有一种或多种佐剂。
11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述佐剂包括但不限于酶稳定剂。
12.一种制备支化淀粉的方法，其特征在于，所述方法为在直链淀粉中加入权利要求1或2所述糖原分支酶突变体。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于，所述方法于60～70℃反应10～30min。
14.权利要求1或2所述糖原分支酶突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4或5所述重组载体，或权利要求6或7所述重组细胞在制备高支化淀粉中的应用。
15.权利要求1或2所述糖原分支酶突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4或5所述重组载体，或权利要求6或7所述重组细胞在生化、食品领域中的应用。
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