CN117247884A - 用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents
用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌及其制备方法和应用，涉及生物工程领域，该重组工程菌的核苷酸序列见SEQ ID NO:3，其长度为369bp。由该重组工程菌制备的抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的核苷酸序列见SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。本发明的重组工程菌，其制备方法简单，能够提高所生产的重组纳米抗体的产量和活性，适用于大规模低成本化生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体。本发明所制备的重组纳米抗体，其产量为7.8mg/L，中和效价为6log2，具有较高的生物学活性，能够应用于预防和/或治疗水禽呼肠孤病毒病。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌及其制备方法和应用。
背景技术
番鸭呼肠孤病毒病是由番鸭呼肠孤病毒(MDRV)引起的一种传染病，发病率和病死率都比较高。番鸭呼肠孤病毒(MDRV)可引起番鸭以及半番鸭肝脏、脾脏等脏器表面有大量白色坏死点，故又称为鸭“白点病”，所引起的樱桃谷鸭脾脏坏死也被称为“鸭脾坏死症”。番鸭发生呼肠孤病毒病多发生于7-35日龄，常见于10-25日龄，潜伏期3-11天左右。患有番鸭呼肠孤病毒病的番鸭会出现较为明显的生长发育缓慢、免疫抑制，并且易于诱发如鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏菌等严重的继发感染。水禽呼肠孤病毒是导致水禽疫病复杂化的主要元凶，也是当前水禽疫病防控的重点和难点。这给水禽养殖业带来极大的危害。寻求防控水禽呼肠孤病毒已成为亟待解决的重大科学与生产实际问题。
纳米抗体是由重链抗体可变区(VHH)构成的最小功能性抗原结合活性片段，具有相对分子质量小、亲合力和稳定性高、溶解性好、特异和穿透性强、易于基因改造及表达、生产成本低、形式模块化和免疫原性弱等优势，表现出更好的应用价值，在新型生物制剂研发方面表现出巨大潜力。目前，尚未有关于抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌及其制备方法和应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明提供的一种用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌，其核苷酸序列见SEQ ID NO:3。
本发明提供的一种用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌的制备方法，主要包括以下步骤：
将番鸭呼肠孤病毒病活疫苗(CA株)注射雄性羊驼，收集羊驼外周血并分离出淋巴细胞，抽提其RNA并反转录成cDNA，利用两轮套式PCR扩增羊驼抗体的VHH序列；将获得的VHH序列与pComb3Xss质粒经限制性内切酶Sac I和Spe I消化后用T4连接酶连接，转化至大肠杆菌TG1感受态，挑取单菌落进行鉴定构建免疫羊驼VHH噬菌体文库；筛选能与水禽呼肠孤病毒结合的VHH序列；将筛选到的VHH序列与pPIC9K载体经限制性内切酶EcoRI和NotI消化后回收目的片段，用T4连接酶连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态，过夜培养，挑取单菌落进行测序鉴定，获得重组质粒pPIC9k-MDRV-Nb028；将线性化后的重组质粒pPIC9k-MDRV-Nb028加入到毕赤酵母X-33感受态细胞中进行电转化，加入山梨醇吸打后静置培养，离心收集菌体，重悬、涂布培养后挑取单菌落进行鉴定，获得用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌。
其中，所述能与水禽呼肠孤病毒结合的VHH序列的核苷酸序列见SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。
其中，所述重组工程菌的长度为369bp。
本发明提供的一种抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体，采用上述的重组工程菌进行制备。
其中，本发明提供的一种抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体，其核苷酸序列见SEQID NO:1，编码的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌，制备方法简单，能够提高所生产的重组纳米抗体的产量和活性，适用于大规模低成本化生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体。本发明所制备的重组纳米抗体，其产量达到7.8mg/L，中和效价为6log2，具有较高的生物学活性，能够应用于预防和/或治疗水禽呼肠孤病毒病。本发明填补了抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体领域的空白，所制备的抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体与目前的水禽呼肠孤病毒株之间的结合适配性较好。
附图说明
图1为本发明的重组工程菌的制备方法步骤三中构建的免疫羊驼VHH噬菌体文库的PCR鉴定结果。
图2为本发明的重组工程菌的制备方法步骤四中构建的免疫羊驼VHH噬菌体文库的抗体库固相筛选的ELISA检测结果。
图3为本发明的重组工程菌的制备方法步骤五中构建的重组质粒pPIC9k-MDRV-Nb028的图谱。
图4为本发明构建的重组工程菌的PCR鉴定结果。
图5为本发明制备的重组纳米抗体MDRV-Nb028的Westernblot鉴定结果。
具体实施方式
一、材料来源
番鸭呼肠孤病毒病活疫苗(CA株)购自青岛易邦生物工程有限公司。
3岁龄雄性羊驼购自嘉祥县好客养殖场。
骆驼外周血淋巴细胞分离液、YPG培养基和BMMY液体培养基购自北京索莱宝科技有限公司。
RNA提取试剂盒和反转录试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
pComb3Xss质粒购自南京翼飞雪生物科技有限公司。
限制性内切酶Sac I、Spe I、EcoR I、NotI和Sal I以及T4连接酶、大肠杆菌DH5α感受态均购自宝日医生物技术(北京)有限公司。
大肠杆菌TG1感受态购自上海唯地生物技术有限公司。
pPIC9K载体购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
毕赤酵母X-33感受态细胞购自长沙爱科博生物科技有限公司
山梨醇、博莱霉素(Zeocin)和亲和层析柱均购自上海碧云天生物技术有限公司。
二、本发明的用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌，其具体制备方法如下：
步骤一、两轮套式PCR扩增引物的设计与合成；
第一轮引物为CALL-1和CALL-2，其序列信息如下：
CALL-1：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG；
CALL-2：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC；
第二轮引物为Sac1-VHH-F和Spe1-VHH-R，其序列信息如下：
Sac1-VHH-F：GAGCTCATGGATGTGCAGCTGGT；
Spe1-VHH-R：ACTAGTTGAGGAGACGGTGACCT。
第一轮引物(CALL-1和CALL-2)和第二轮引物(Sac1-VHH-F和Spe1-VHH-R)均由通用生物(安徽)股份有限公司合成。
步骤二、免疫羊驼；
按照颈部皮下注射方式，将番鸭呼肠孤病毒病活疫苗(CA株)注射3岁龄雄性羊驼，注射量为3mL/只。然后分别于免疫后第14天、28天、42天、56天各加强免疫一次。实时测量羊驼血清抗体效价，如果羊驼血清抗体中的ELISA效价达到1:20000，则收集羊驼外周血，然后利用骆驼外周血淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，利用RNA提取试剂盒抽提其RNA并采用反转录试剂盒将反转录成cDNA，然后利用两轮套式PCR扩增引物扩增羊驼抗体的重链抗体可变区(VHH)序列；
步骤三、构建免疫羊驼VHH噬菌体文库；
将获得的重链抗体可变区(VHH)序列与pComb3Xss质粒经限制性内切酶Sac I和Spe I消化处理后，再用T4连接酶连接，随后转化至大肠杆菌TG1感受态，次日挑取24个单菌落分别进行菌液PCR鉴定。
其中，菌液PCR鉴定结果如图1所示，挑取的24个单菌落中有23个单菌落都为阳性，并且经过测序鉴定后，23个单菌落的序列都不相同，经过计算可知本发明所构建的免疫羊驼VHH噬菌体文库阳性率达到95.8％(23/24)，生物多样性丰富(23/23)，根据平板计数和稀释比例计算得出本发明所构建的免疫羊驼VHH噬菌体文库的库容量为3×108个。由此免疫羊驼的VHH噬菌体文库构建成功。
步骤四、筛选能与水禽呼肠孤病毒结合的重链抗体可变区(VHH)序列；
将水禽呼肠孤病毒包被酶标板，采用现有抗体库固相筛选技术筛选能与水禽呼肠孤病毒结合的重链抗体可变区(VHH)序列(即抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体序列)。
其中，抗体库固相筛选的ELISA检测结果如图2所示，一共筛选到19个重链抗体可变区(VHH)序列，其中序列Nb028的OD值最高，其核苷酸序列见SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。
步骤五、构建重组质粒pPIC9k-MDRV-Nb028；
重组质粒pPIC9k-MDRV-Nb028的构建图谱如图3所示。将筛选到的能与水禽呼肠孤病毒结合的重链抗体可变区(VHH)序列即序列Nb028与pPIC9K载体分别经限制性内切酶EcoR I和Not I消化处理后，再经1％琼脂糖凝胶电泳回收，目的片段用T4连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态，涂板过夜培养，次日挑取单菌落，测序后将鉴定正确的重组质粒命名为pPIC9k-MDRV-Nb028，于-20℃保存备用。
步骤六、构建用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌；
采用限制性内切酶Sal I将重组质粒pPIC9k-MDRV-Nb028线性化，向线性化后的重组质粒pPIC9k-MDRV-Nb028中加入到毕赤酵母X-33感受态细胞中，然后轻轻混匀后转移至预冷电转杯，冰浴5min后转移至电转仪进行电转化，电转化参数设置为：电压1.5kV，电阻250Ω，电容25μF；电转化后立刻加入1mL预冷的山梨醇(浓度为1M)，吸打2次后转移至1.5mL的离心管中，置于30℃培养箱中静置培养1h，室温下4000r/min离心4分钟，收集菌体并用100μLYPG培养基重悬，随后涂布至含有100μg/mL博莱霉素的YPG固体培养基，37℃培养3天，挑取单菌落进行PCR鉴定。
其中，PCR鉴定结果如图4所示，其长度为369bp，与预期大小一致。鉴定正确后，获得一种用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌，其核苷酸序列见SEQ IDNO:3。
本发明的用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌，制备方法简单，制备成本低，能够提高所生产的重组纳米抗体的产量和活性，适用于大规模生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体。
三、本发明的抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体MDRV-Nb028，其具体制备方法如下：
将获得的重组工程菌接种至20mLYPG培养液中进行复壮，次日取5mL接种至1L摇瓶(含250mLYPG培养液)中，于28℃、200r/min培养过夜，离心收集菌体，用等体积的BMMY液体培养基重悬后，于28℃、200r/min诱导120小时，并且每间隔24小时需要补加终浓度0.5％的甲醇；收集上清液，按照亲和层析柱说明书进行纯化获得目的蛋白；然后采用Westernblot法分析和鉴定目的蛋白的分子量大小和纯度。
其中，Western blot鉴定结果如图5所示，目的蛋白的相对分子量大小为15.3kDa，与预期值大小相符，浓度为0.35mg/mL，纯度达到90％。鉴定正确后，获得一种抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体MDRV-Nb028即上述所获得的目的蛋白。
四、抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体MDRV-Nb028的活性检测；
利用固定病毒稀释抗体的方法将2倍系列稀释的重组纳米抗体MDRV-Nb028与等体积的含有20TCID50的番鸭呼肠孤病毒病活疫苗(CA株)悬液混合均匀，37℃作用1小时得到病毒-抗体混悬液，取该病毒-抗体混悬液每孔0.1ml接种于鸭胚中，并设立病毒对照组和正常鸭胚对照组，置于39℃温箱培养，培养后观察结果。经过计算可知，本发明所制备的重组纳米抗体MDRV-Nb028的中和效价为6log2，具有较高的生物学活性，能够应用于预防和/或治疗水禽呼肠孤病毒病。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌，其特征在于，其核苷酸序列见SEQ ID NO:3。
2.如权利要求1所述的用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将番鸭呼肠孤病毒病活疫苗(CA株)注射雄性羊驼，收集羊驼外周血并分离出淋巴细胞，抽提其RNA并反转录成cDNA，利用两轮套式PCR扩增羊驼抗体的VHH序列；将获得的VHH序列与pComb3Xss质粒经限制性内切酶Sac I和Spe I消化后用T4连接酶连接，转化至大肠杆菌TG1感受态，挑取单菌落进行鉴定构建免疫羊驼VHH噬菌体文库；筛选能与水禽呼肠孤病毒结合的VHH序列；将筛选到的VHH序列与pPIC9K载体经限制性内切酶EcoR I和Not I消化后回收目的片段，用T4连接酶连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态，过夜培养，挑取单菌落进行测序鉴定，获得重组质粒pPIC9k-MDRV-Nb028；将线性化后的重组质粒pPIC9k-MDRV-Nb028加入到毕赤酵母X-33感受态细胞中进行电转化，加入山梨醇吸打后静置培养，离心收集菌体，重悬、涂布培养后挑取单菌落进行鉴定，获得用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌。
3.根据权利要求2所述的用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌的制备方法，其特征在于，所述能与水禽呼肠孤病毒结合的VHH序列的核苷酸序列见SEQ IDNO:1，编码的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。
4.根据权利要求2所述的用于生产抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体的重组工程菌的制备方法，其特征在于，所述重组工程菌的长度为369bp。
5.一种抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体，其特征在于，采用权利要求1所述的重组工程菌进行制备。
6.根据权利要求5所述的一种抗水禽呼肠孤病毒的重组纳米抗体，其特征在于，其核苷酸序列见SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。
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