CN117230124A

CN117230124A - 一种他喷他多手性中间体的制备方法

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Publication number: CN117230124A
Application number: CN202311214384.2A
Authority: CN
Inventors: 马向辉; 魏顺新; 牛继如; 侯伟宏; 薛洪泽
Original assignee: Tianjin Famoxi Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Tianjin Famoxi Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2023-09-20
Filing date: 2023-09-20
Publication date: 2023-12-15

Abstract

本发明提供了了一种他喷他多手性中间体的制备方法。采用两种不同烯还原酶突变体还原分别还原(2E)‑3‑(3‑甲氧基苯基)‑2‑甲基戊‑2‑烯酸(式III所示化合物)和(2Z)‑3‑(3‑甲氧基苯基)‑2‑甲基戊‑2‑烯酸(式IV所示化合物)，通过一步反应生成两个手性中心，高效制备高纯度的他喷他多手性中间体(αR,βR)‑β‑乙基‑α‑甲基‑3‑(甲氧基)苯丙酸(式II)。本发明以SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示烯还原酶突变体催化的方式构建了他喷他多中间体的两个手性中心，工艺安全、操作简单，增加了原料的利用率，减少了副产物及异构体的产生，减少了三废，降低了合成成本，适合工业化大生产的需要。

Description

一种他喷他多手性中间体的制备方法

技术领域

本发明涉及生物转化领域，尤其涉及用两种烯还原酶突变体催化顺反异构体：(2E)-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-2-烯酸(式III所示化合物)和(2Z)-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-2-烯酸(式IV所示化合物)合成他喷他多手性中间体(αR,βR)-β-乙基-α-甲基-3-(甲氧基)苯丙酸(式II)。

背景技术

他喷他多(式I)是有美国Johnson&Johnson公司和德国Grunenthal GmbH公司联合开发的新一代中枢神经系统镇痛药。该药物通过激动阿片μ-受体和抑制去甲肾上腺素的重新摄取双重机制产生镇痛作用，可用于急性、慢性和神经性疼痛的治疗(Tzschentke TM，eta l.，J.Pharm.Exper.Therap.，2007，323，265)。虽然他喷他多的镇痛作用低于吗啡，但其胃肠耐受性好，且不会引起严重的呼吸抑制，突然中止药物也不会引起严重的戒断症状，因此应用前景极好。该药物于2008年在美国上市，2014年在加拿大上市。

他喷他多除了具有镇痛作用外，还因其与1-苯基-3-二甲胺基丙烷结构类似，而具有多种药理活性。例如，他喷他多也可以用于治疗精神病(DE102007012165)，抑郁症(DE10233048)，尿失禁(WO2002043715)等。

他喷他多具有两个手性中心，因此获得高手性纯度的药物或中间体是影响其成本和质量的关键。式II所示的化合物(αR,βR)-β-乙基-α-甲基-3-(甲氧基)苯丙酸是他喷他多的关键中间体之一，该中间体已经具备了两个手性中心，在用于制备他喷他多药物时无需拆分，具有收率高、制备工艺简便、副产物少、分离纯化方便的优点。

式II所示的他喷他多关键中间体的制备方法主要包括两类。第一类为拆分法，先合成消旋的3-(3-甲氧基-苯基)-2-甲基戊酸，再用不同的拆分试剂拆分，获得(αR,βR)-β-乙基-α-甲基-3-(甲氧基)苯丙酸。例如WO2011/80756和WO2011/92719、WO2012/89181、WO2012/146978中分别包报道了采用不同的方法的制备消旋3-(3-甲氧基-苯基)-2-甲基戊酸(式III)，而后经R-苯乙胺拆分可获得(αR,βR)-β-乙基-α-甲基-3-(甲氧基)苯丙酸。这类法最大的弊端就是对映异构体作为废弃化学品处理，在成本经济上不可取的缺点；且拆分过程也会产生较多废弃物，存在环保污染问题，因此不宜工业化应用。

第二类方法采用不同的手性助剂、手性催化剂或手性原料，制备目标构型占优势的中间体，而后经过进一步拆分，可获得产品。例如，申请号为201280007252.6(同族专利：EP2671878，WO2012/103799，US20140046074)的专利中，报道了以间甲氧基肉桂酸为原料，在手性助剂R-苯基-2-恶唑烷酮的存在下，经一系列反应可获得(αR,βR)-β-乙基-α-甲基-3-(甲氧基)苯丙酸。但这类方法使用的手性助剂的制备也大都采用拆分法，且获得也较为困难，价格较为昂贵，产品的手性纯度也达不到质量标准，因此需要进一步的拆分。

所以，这类方法同样存在成本经济上不可取的缺点。

为了解决上述(αR,βR)-β-乙基-α-甲基-3-(甲氧基)苯丙酸制备过程中存在的问题，本发明采用两种烯还原酶分别还原式III、式IV所示化合物，并同时产生两个手性中心，获得了手性醇度大于99.5％的(αR,βR)-β-乙基-α-甲基-3-(甲氧基)苯丙酸。

发明内容

鉴于上述合成他喷他多手性中间体方法的缺陷，本发明提供了一种他喷他多手性中间体的制备方法，所述方法采用两种不同的烯还原酶突变体在同一体系中催化还原式III和式IV所示顺反异构体化合物，通过一步反应生成两个手性中心，实现了定向、高效制备高纯度的他喷他多手性中间体(式II)。该方法安全、环保、成本低廉，且生产的他喷他多中间体具有极佳的光学纯度。

烯还原酶(Enoate reductase)存在于动物、植物及微生物细胞之中，是一种以核黄素为辅酶的蛋白，具有广泛的底物特异性。烯还原酶可以NAD(P)H为辅酶，催化碳碳双键的还原。烯还原酶催化α,β-不饱和羰基化合物的还原是近年来新兴的生物工程技术，可以在较为温和条件下以经济、高效的方法转化加工获得高纯度的产品。但是，烯还原酶对许多广泛应用于医药、化工的α,β-不饱和羰基化合物及其衍生物催化效率较低。如申请号为201010216436.6的专利中，报道了来源于Pichia guilliermondii JCM1539、Schizosaccharomyces pombe ATCC 24751、Vanderwaltozyma polyspora NRRL Y-8283三个物种的烯还原酶，这些酶对于许多底物的催化活力都小于1U/mg蛋白，酶活力低限制了烯还原酶在现代医药、化工等领域的应用。

因此，需要对现有的烯还原酶进行改进，以提高其催化活性和/或稳定性，进而改善现有技术中生产成本高等问题。本发明的目的在于提供催化活性高、产品手性纯度好的烯还原酶突变体，突变体可用于式III和式IV所示化合物的催化合成式II他喷他多手性中间体。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

本发明提供一种他喷他多手性中间体的制备方法，其特征在于采用两种烯还原酶突变体基因，其来源为Acaryochloris marina的烯还原酶野生型基因序列(NCBIReference Sequence:WP_012165090.1)和Geobacillus sp.#30基因序列(NCBI ReferenceSequence:BAO37313.1)。“野生型”是指在自然界发现的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中的序列，能够从自然界来源中分离并且没有被人为操作有意修饰。这些基因表达后得到的酶对于某些底物的催化活力低，热稳定性较差。此外，两个野生烯还原酶在催化式III和式IV合成式II所示产品时，活力较低，且产品中含不同构型化合物(表1)。

表1野生酶催化合成他喷他多手性中间体时的产品

*对于酶促反应活力：-表示未检测到产品峰；+表示底物转化率小于20％；++表示底物转化率20～40％；+++表示底物转化率40～60％；++++表示底物转化率60～80％；+++++表示底物转化率80～100％；

本发明提供可分别用于还原用于(2E)-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-2-烯酸(式III所示化合物)和(2Z)-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-2-烯酸(式IV所示化合物)制备他喷他多手性中间体(式II)的烯还原酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

本发明提供的两种烯还原酶突变体基因的重组载体，以pET-24a为出发载体。

本发明提供的两种烯还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包含重组载体，宿主细胞为大肠埃希氏菌(Escherichia coliBL21(DE3))。

本发明提供的两种烯还原酶突变体基因、重组载体、基因工程菌在制备烯还原酶突变体中的应用。

本发明提供的两种烯还原酶突变体的制备方法，包括如下步骤：培养基因工程菌，获得重组的烯还原酶突变体。

上述方法包括发酵制备所述烯还原酶的步骤。

本发明提供的两种烯还原酶突变体在氧化还原反应中，可分别还原式III和式IV所示的化合物。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过酶促反应方法还原两种顺反异构体化合物的C＝C键，均可同时生成两个手性中心，单一构型产品(R,R-构型)产品手性纯度>99.5％。

2、在制备3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-2-烯酸时，往往会同时产生两种顺反异构体：(2E)-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-2-烯酸(式III所示化合物)和(2Z)-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-2-烯酸(式IV所示化合物)。本发明酶促反应体系中的两种烯还原酶突变体可同时还原式III和式IV所示化合物，而不需进行提取，简化了工艺流程；

3、本发明的酶促反应体系中，反应温度为30～40℃，pH为6.5～8.5，反应压力为常压。相对于有机合成所需的高温、高压、有机溶剂、贵金属催化剂等条件，具有步骤更短、成本低、产品质量高、不需重金属催化剂、三废产量少等优势。

4、相较现有的方法，本发明工艺安全、操作更加简单，增加了原料利用率，减少了副产物及异构体的产生，减少了三废，降低了合成成本，更适合工业化大生产的需要。

具体实施方式

为了更好的了解本发明的目的、结构及功能，对本发明的烯还原酶突变体及其编码基因和应用做进一步详细的描述。

本发明提供了可用于还原式III的烯还原酶突变体，其中烯还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列具有如下至少1个突变位点：P25，L26，T27，A58，W68、Q100，W102，H176，N179，Y181，R228，N233，F235，H263，L265，N295，G296，G297，Y317，G318，V319，F345，Y346。优选的SEQ ID NO 3所示的烯还原酶突变体(包含W68V、W102V、N179S、Y181A、F235V、F345A、Y346S七个点突变)可以较高的活力催化式III所示化合物生成式II所示他喷他多关键中间体的合成，产品的手性纯度达99.67％。SEQ ID NO 4所示的烯还原酶突变体对于式IV所示的化合物没有活力。

本发明提供了可用于还原式IV的烯还原酶突变体，其中烯还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列具有如下至少1个突变位点：P24、M25、C26、Y28、S32、A60、I69、S70、A102、A104、H164、A166、H167、Y169、R215、S249、S250、Y264、E294、L285、A307、R308。优选的SEQ ID NO 4烯还原酶突变体(包含Y28A、I69A、H167F、S249V、R308S五个点突变)可以较高的活力催化式IV所示化合物生成式II所示他喷他多关键中间体的合成，产品的手性纯度达99.59％。SEQ ID NO 4所示的烯还原酶突变体对于式III所示的化合物活力较低。

烯还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。

本发明提供两种种烯还原酶突变体，其中SEQ ID NO.3所示酶突变体对于式III所示底物有较高的活力，对于式IV所示底物没有活力。SEQ ID NO.4所示酶突变体对于式IV所示底物有较高的活力，而对于式III所示底物活力较低。

本发明通过理性设计(在了解蛋白质的空间结构的基础上，通过定点突变或其它方法改变蛋白质分子中的个别氨基酸)以及重叠延伸PCR、重组PCR、大引物PCR和环状质粒PCR等方法对其进行突变，从而获得两种烯还原酶突变体目的基因，基因编码的蛋白序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

上述烯还原酶突变体，根据密码子优化、一种烯还原酶突变体，氨基酸序列如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

本发明提供一种烯还原酶突变体基因的重组质粒，其可通过本领域常规方法将本发明的烯还原酶基因的核苷酸序列连接于各种原核表达载体或真核表达载体上构建而成。如pGEX，pMAL，pET系列等原核表达载体以及真核表达载体，更优选地选自pET系列。本发明的一个实施例中所使用的质粒为pET-24a。

本发明提供一种生产所述的烯还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌中包含本发明所述的烯还原酶突变体基因或本发明所述的重组载体。上述基因工程菌的宿主细胞优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3))。

本发明提供一种制备所述的烯还原酶突变体的方法，包括发酵培养该基因工程菌，以及收集和制备重组烯还原酶。

上述方法包括在一定生产罐发酵条件下，进行工业化制备所述重组烯还原酶的步骤；所述的生产罐发酵条件优选：DO 30％以上，空气流量1:1～2vvm。

本发明所述的烯还原酶突变体在氧化还原反应中，可用于式III及式IV所述底物的还原。

实施例1：野生型烯还原酶酶基因工程菌的建立

根据NCBI收录的Acaryochloris marina的烯还原酶野生型基因序列(NCBIReference Sequence:WP_012165090.1)和Geobacillus sp.#30烯还原酶序列(NCBIReference Sequence:BAO37313.1)进行密码子优化后人工合成全基因片段，并经基因合成公司通过NdeI和BamHI内切酶将基因插入pET-24a质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立烯还原酶基因工程菌。

实施例2：烯还原酶突变体基因的获得

来源于Acaryochloris marina的烯还原酶(SEQ ID NO1)三维结构目前尚未被揭示。本发明用SWISS-MODEL对野生型基因序列三维模型构建发现，其氨基酸序列与Nostocsp.来源的烯还原酶(PDB ID：6UFF)同源性为57.30％，且酶功能相似。通过同源建模的方法获得了Acaryochloris marina的烯还原酶的三维结构，用分子对接软件将式III底物与蛋白质的结合模拟，最后选择与底物和辅酶FMN距离不超过的氨基酸作为突变氨基酸进行饱和突变。

来源于Geobacillus sp.#30的烯还原酶(SEQ ID NO2)的三维结构目前尚未被揭示。本发明用SWISS-MODEL对野生型基因序列三维模型构建发现，其氨基酸序列与Geobacillus kaustophilus来源的OYE(PDB ID：3GR7)同源性为87.06％，且酶功能相似。因此，参考该酶的三维结构进行分析，通过分子对接软件进行式IV底物与蛋白质的结合模拟，最后通过Pymol分析，最后选择与底物和辅酶FMN距离不超过的氨基酸作为突变氨基酸进行饱和突变。

除上述理性设计外，本研究利用易错PCR随机突变的方法，对烯还原酶进行了蛋白质工程改造。一般来说，易错PCR可以通过DNA聚合酶进行目的基因扩增时，调整反应条件(如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTP浓度或运用低保真度DNA聚合酶等)来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

本研究采用较低保真度的Taq聚合酶，同时利用Mn²⁺替代天然辅助因子Mg²⁺增加易错概率。

50μL PCR体系如下:

5×PCR Buffer 10μL

dATP(2.5mmol/L) 1μL

dGTP(2.5mmol/L) 1μL

dCTP(2.5mmol/L) 1μL

dTTP(2.5mmol/L) 1μL

MgCl₂(5mmol/L) 1μL

MnCl₂(5mmol/L) 1μL

烯还原酶模板基因 1μL

Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL

再加入灭菌双蒸水到50μL。

其中本研究在对烯还原酶基进行突变时，采用的是pET-24a质粒上的引物，引物分别位于烯还原酶基因的上下游。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s及72℃延伸40s进行35个循环；于72℃下继续延伸10min，冷却至4℃。

按照实施例1的方法PCR扩增烯还原酶基因并将基因插入至pET-24a质粒中，作为基因突变模板；易错PCR扩增烯还原酶的基因，扩增后基因片段链接至pET-24a载体，将连接后载体转入之大肠杆菌BL21(DE3)中建立烯还原酶基因突变文库；

利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-24a质粒为载体，表达扩展烯还原酶，以实施例5所述酶活力检测方法高通量筛选高活性突变株。突变后高活性烯还原酶基因进行鉴定。

实施例3：在摇瓶中小规模生产烯还原酶

将包含编码目标烯还原酶的质粒的大肠杆菌的单个微生物菌落接种到含卡那霉素(100μg/mL)的100mL LB培养基中(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2)，在37℃摇床中，250rpm震荡培养16小时。按比例1:100转接于100mL含卡那霉素的LB培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值(OD₆₀₀)以监测菌体生长密度。当培养物的OD₆₀₀在0.6至0.8时，通过加入异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM来诱导烯还原酶基因的表达，然后培养持续过夜(至少16小时)。通过离心(10000rpm、10min、4℃)收集细胞，在4℃重悬于pH7.5的50mM Tris-HCl缓冲液中，重悬后的菌泥浓度为200g/L。超声破碎后，通过离心(13000rpm、30min、4℃)去除细胞碎片。收集澄清的裂解物上清液制得粗酶液，储存在-20℃。

实施例4：烯还原酶及甲酸脱氢酶的发酵生产

发酵方案：将包含带有目标烯还原酶突变体基因的质粒的大肠杆菌的单个微生物菌落接种含卡那霉素(100mg/mL)的120mL LB培养基中(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2)中。大肠杆菌在摇床中在37℃过夜生长(至少16小时)，伴随以250rpm摇动。将种子液按2％的接种量加入含有6L发酵培养基的15L发酵罐中，发酵液通过加入氨水维持pH7.0-7.2，罐温37℃，搅拌转速300-900rpm，发酵过程中控制溶氧30％左右，空气流量1:1～2vvm，培养8小时后加入终浓度1mmol/L的IPTG以诱导烯还原酶的表达，此后继续发酵12-16小时，罐温22℃。发酵过程中通过加入含葡萄糖200g/L，酵母提取物100g/L，pH7.2的补料液维持培养物的生长。发酵结束后将培养物直接用高压均质机匀浆破碎，经离心、过滤、超滤浓缩后，制备得到烯还原酶粗酶液并于-20℃保存。

实施例5：烯还原酶酶活力的测定

烯还原酶酶活力测定体系如下：

Tris-HCl缓冲溶液100mM，pH 8.0；

式III或式IV所示底物20g/L；

NAD 0.2g/L；

甲酸钠50g/L；

烯还原酶或其突变体粗酶液100ml/L；

葡萄糖脱氢酶100ml/L；

上述混合物在40℃反应3h，期间用氢氧化钠调节pH为8.0，而后取样用HPLC检测底物消耗及产品生成。

实施例6:还原式III、式IV化合物制备式II化合物

1mM NAD、200mM甲酸钠、100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、式III化合物和式IV化合物各80mM、SEQ ID NO.3所示的烯还原酶和SEQ ID NO.4所示的烯还原酶突变体各300ml/L、葡萄糖脱氢酶粗酶液100ml/L、体系用氢氧化钠调价pH＝8.0。反应在30～40℃反应16～24h。收率为98.4％。产品中R,R-构型产品手性纯度大于99.5％。

实施例7式II化合物的提取

在实施例6所述的反应体系升温至95℃，保持30min，离心除酶。在清液中加入等体积的乙酸异丙酯，用35％的硫酸调节pH小于3，萃取、分液，弃水相。有机相加入等体积水，搅拌条件下用5M氢氧化钠溶液调节pH为9，分液取水相，加入等体积的乙酸异丙酯，用35％的硫酸调节pH小于3，萃取分液，弃水相。有机相用1％活性炭脱色、2％无水硫酸钠除水，过滤后减压浓缩3倍，加入2体积正庚烷、5℃析晶。提取过程摩尔收率为80～90％。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种他喷他多手性中间体的制备方法，其特征在于在于采用两种不同烯还原酶突变体分别还原(2E)-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-2-烯酸(式III所示化合物)和(2Z)-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-2-烯酸(式IV所示化合物)，通过一步反应生成两个手性中心，高效制备高纯度的他喷他多手性中间体(αR,βR)-β-乙基-α-甲基-3-(甲氧基)苯丙酸(式II)。

2.权利要求书1所述两种烯还原酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

3.含有权利要求2所述的烯还原酶突变体基因的重组载体，以pET系列质粒为出发载体。

4.一种用于生产权利要求3所述的烯还原酶突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含权利要求4所述的重组载体，宿主细胞为大肠埃希氏菌(Escherichia coliBL21(DE3))。

5.权利要求2所述的烯还原酶突变体、权利要求书3所述的重组载体、权利要求4所述的基因工程菌在制备权利要求1所述的他喷他多手性中间体中的应用。

6.一种他喷他多手性中间体的制备方法，包括如下步骤：培养烯还原酶突变体的基因工程菌，获得重组的烯还原酶突变体，用烯还原酶突变体催化合成高手性纯度的他喷他多手性中间体。

7.根据权利要求6中所述的方法，其特征在于，包括发酵制备所述烯还原酶的步骤。

8.权利要求2所述的烯还原酶突变体，在同一个氧化还原反应体系中，同时还原式III、IV所示的化合物，均可生成高手性纯度的他喷他多手性中间体(αR,βR)-β-乙基-α-甲基-3-(甲氧基)苯丙酸(式II)。