CN117229939A - 一株植物乳杆菌及其在辣椒低盐发酵中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵剂，其包括：植物乳杆菌菌液；所述植物乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.27361，保藏时间为2023年5月18日，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明实施例的植物乳杆菌进行制备低盐发酵辣椒后，经感官评价、pH、总酸、还原糖、氨基酸态氮的测定，有机酸达91.24g/kg，关键香气物质(rOAVs＞1)的香气物质最多，有14种，酸类占比32.37％、酯类占比22.09％，发酵香气品质最好。
Description
技术领域
本发明属于食品发酵技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌及其在辣椒低盐发酵中的应用。
背景技术
目前辣椒制品主要集中在传统手工制作或工业化风味调配、高盐发酵辣椒(微发酵辣椒)的生产，而辣椒加工工艺中，常常使用20％(W/W)高盐保坯防腐，过高的食盐不仅容易使人患上高血压等疾病，而且高盐腌渍的辣椒需要经过水洗脱盐，腌渍辣椒水的大量排放不仅造成了环境的污染，还会造成辣椒风味和营养物质的损失。这已经不能够满足现代人们的产品要求和环境要求。但若辣椒在低盐环境下发酵，存在容易软腐，保质期变短等问题。乳酸菌是一类常见应用于发酵食品中的益生菌，辣椒盐度越高，乳酸菌丰度越低。低盐度可以为乳酸菌提供有利的发酵环境，相关研究表明，10％以下低盐度辣椒发酵过程中的微生物在前三天主要为魏斯氏菌属，快速积累乳酸形成微酸环境，之后乳酸杆菌属成为优势细菌属。它们发酵产生的酸类、酯类物质，不仅可以赋予低盐发酵辣椒独特的香气品质，还可以抑制低盐发酵辣椒中假单胞菌和肠杆菌等腐败致病菌的生长，发酵后不需要添加防腐剂和风味调配剂。
发明内容
本发明旨在提供一株植物乳杆菌及其在辣椒低盐发酵中的应用，该发酵剂的应用显著提高了发酵辣椒的挥发性风味物质的种类及含量，使得接种发酵辣椒的风味浓郁且品质优良。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种发酵剂，包括：植物乳杆菌菌液；所述植物乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.27361，保藏时间为2023年5月18日，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
根据本发明的实施例，所述植物乳杆菌菌液的制备方法包括以下步骤：挑取单菌落至培养基，，37±5℃静置培养20-28h，活化数次后离心，收集菌体，用无菌生理盐水冲洗后，调整细菌液浓度，即得。
在其中一个优选的实施例中，所述植物乳杆菌菌液中，植物乳杆菌的活菌数为1×109～3×109cfu/mL。
在本发明的再一方面，本发明还提出了前面所述的发酵剂在制备发酵辣椒中的用途。
在本发明的再一方面，本发明还提出了一种发酵辣椒。根据本发明的实施例，所述发酵辣椒包括：植物乳杆菌。根据本发明实施例的发酵辣椒的风味浓郁且品质优良。
在本发明的再一方面，本发明还提出了一种制备低盐发酵辣椒的方法。根据本发明的实施例，上述方法包括：利用前面所述的发酵剂发酵辣椒，以便获得发酵辣椒。根据本发明实施例制备得到的低盐发酵辣椒风味浓郁且品质优良。
根据本发明的实施例，所述发酵剂的添加量为6-8％。
根据本发明的实施例，所述发酵是在32-35℃下避光发酵15-20天。
根据本发明的实施例，所述辣椒中含有食盐，所述食盐的含量为4％-8％(w/w，单位g/g)。
由此，本研究从自然发酵辣椒中分离出乳酸菌，对其进行产酸、抑菌、产气、产璞膜、耐酸等实验，初步筛选出具有优良发酵性能的乳酸菌。将初筛的乳酸菌进行8％(W/W)低盐接种发酵，通过单菌种发酵，对发酵辣椒进行感官评价，测定发酵过程中的pH值、总酸、还原糖、氨基酸态氮等含量的变化，测定发酵后的有机酸和挥发性香气物质含量，研究其发酵过程中的香气品质，筛选出发酵香气品质最好的菌种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明实施例的植物乳杆菌具有较强地抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌生长的能力；
2、本发明实施例的植物乳杆菌进行制备低盐发酵辣椒后，经感官评价、pH、总酸、还原糖、氨基酸态氮的测定，得本发明的植物乳杆菌的有机酸达91.24g/kg，关键香气物质(rOAVs＞1)的香气物质最多，有14种，酸类占比32.37％、酯类占比22.09％，发酵香气品质最好。
附图说明
图1是乳杆菌的菌落形态和细胞形态；
图2是发酵辣椒样品中分离的11株乳酸菌R1～R11的pH值变化趋势；
图3是三株乳酸菌的发酵上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑制效果；
图4是三株乳酸菌进行辣椒发酵过程中pH值变化；
图5是三株乳酸菌进行辣椒发酵过程中总酸含量变化；
图6是三株乳酸菌进行辣椒发酵过程中还原糖含量变化；
图7是三株乳酸菌进行辣椒发酵过程中氨基酸态氮含量变化；
图8是三株乳酸菌进行辣椒发酵的挥发性香气物质测定；
图9是聚类分析研究不同发酵辣椒挥发性香气成分的差异结果；
图10是不同发酵辣椒挥发性香气成分的PCA分析图；
图11是R3菌株的系统发育树。
具体实施方式
以下将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明均采用SPSS 26进行单因素方差分析(LSD法和Duncan法)及显著性差异比较，p＜0.05为差异显著，使用Excel进行数据处理和Origin 2022作图。每个实验重复3次，结果以“x±s”表示。
实施例1菌种的分离
1.1试验材料
朝天椒、食盐、1L发酵坛子等购于湖南农业大学东之源农贸市场。
1.2试验菌株
大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonella)由湖南农业大学食品科学技术学院微生物实验室提供。
1.3培养基与试剂
试验培养基与试剂见表1。
表1培养基与试剂
1.4仪器与设备
试验仪器与设备见表2-2。
表2仪器与设备
1.5试验方法和结果
1自然发酵辣椒的制作
将新鲜、色红的朝天椒用清水冲洗2～3遍，于通风阴凉处晾晒至表面无水分后，切碎成1～2cm小段，加入8％(w/w)的食用盐，装入发酵坛中，用盐水密封坛盖，室温静置发酵15d～60d。
2菌种的分离
取25g自然发酵辣椒，采用十倍稀释法对其进行稀释，取各梯度稀释液100μL，均匀涂布于含有1％CaCO3(W/V)的MRS固体培养基和PDA培养基平板上，分别置于37℃和28℃培养48h～72h。观察菌落形态，挑取MRS固体培养基上具有明显溶钙圈的菌落多次划线纯化，取PDA培养基上的可疑单菌落于孟加拉红培养基上划线分纯2～3次，直至菌落形态单一，镜检无杂菌，再将分离的菌种增菌后转接到50％甘油(1:1，V/V)管中，-80℃冻存和4℃试管斜面保存备用。
3菌种的初步鉴定
乳酸菌：将筛选后的菌种涂布于含Ca2CO3的MRS固体培养基，37℃恒温培养48h，观察融钙圈大小、长出的单菌落形态。进行过氧化氢触酶试验，挑取单菌落进行革兰氏染色镜检观察菌体染色情况并记录。
结果显示：从发酵辣椒样品中，共分离到11株有溶钙圈、接触酶阴性、无芽孢、革兰氏阳性的菌株，初步判断为乳酸菌，将其分别命名为乳酸菌R1～R11。菌落形态为不透明状、凸起或稍凸起、乳白色、乳黄色或灰白色，挑起单菌落时似酸奶质感；细胞形态为杆状或短杆状、单个或成对、呈短链状，具体菌落形态和细胞形态见图1和表3。
表3 11株乳酸菌菌落形态和细胞形态描述
4乳酸菌性能测定
菌悬液的制备：挑取2中保存的斜面培养基上的单菌落至MRS肉汤培养基，37℃静置培养24h，活化两次。取菌液于4℃、8000r/min离心10min，收集菌体，用0.85％(W/V)无菌生理盐水冲洗2遍后，采用麦氏比浊法调整细菌液浓度，4℃保存备用。
(1)产酸性能测定：取109CFU/mL的菌悬液200μL，注入装有5mL MRS肉汤培养基的10mL离心管中，37℃培养48h，分别在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48h测定一次pH值；同时参照国标GB/T 5009.239-2016中的酚酞指示剂法测定发酵液酸度，取1mL发酵24h后的培养液离心，加蒸馏水稀释至30mL，加2～3滴1g/L酚酞作指示剂，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定，以吉尔涅尔度(°T)表示乳酸菌发酵液的酸度，即每100mL发酵液消耗1mL浓度为0.1mol/L的NaOH溶液相当于1°T，以未接菌的MRS肉汤培养基作空白对照，每组3个重复，筛选出产酸又快又高的乳酸菌。
结果显示：将发酵辣椒样品中分离的11株乳酸菌R1～R11培养48小时，测定pH值和可滴定酸度，pH值变化趋势见图2，最终pH值及酸度值表4；可见空白培养基中pH在48h内始终保持在5.39左右，11株乳酸菌中R8、R10、R11的最终发酵pH在4.0以上，酸度较低，相较于其他乳酸菌产酸较差，其次乳酸菌R1、R2、R6、R7、R9在发酵第10h时pH值仍然在4.0以上，产酸速率一般，而R3、R4、R5这三株乳酸菌在前10h内pH快速下降至3.8左右，48h后最终pH达到3.5以下，且发酵24h后酸度均达200°T以上，产酸速率快且产酸高，所以选用R3、R4、R5这三株乳酸菌进行下一步实验。
表4不同乳酸菌产酸能力
注：表中数据为3次重复的平均值±标准差，同列数据后凡是具有一个相同小写字母者，表示差异不显著(p>0.05，Duncan’s法)。
(2)抑菌性能测定：以大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌为指示菌，37℃条件下静置培养24h。采用琼脂打孔抑菌圈法，将上述试验筛选出的三株产酸较高的乳酸菌R3、R4、R5进行抑菌实验，取108CFU/mL的指示菌悬液100μL，涂布于NA培养基，再用6mm打孔器打孔，在孔中加入100μL的乳酸菌发酵上清液，以MRS肉汤培养基为对照，每组3个重复，先于4℃冰箱静置4h，让液体充分扩散至琼脂内，再于37℃条件下培养24h，测定抑菌圈直径，筛选出具有抑制致病菌功能的乳酸菌。
由表5和图3可知，与未接菌MRS肉汤相比，三株乳酸菌的发酵上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均有明显的抑制效果，差异显著(p＜0.05)，乳酸菌R3对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑制效果最好，抑菌直径分别为19.02±0.87mm、19.77±0.24mm、19.12±0.63mm。乳酸菌R4、R5之间的抑菌直径相差不大，差异不显著(p＞0.05)，但证明抑菌直径均达18mm左右。综上，乳酸菌R3、R4、R5的发酵上清液对这三种致病菌均具有良好的抑制效果。
表5不同乳酸菌发酵液对致病菌的抑制效果
注：表中数据为3次重复的平均值±标准差，每一行数据后凡是具有一个相同小写字母者，表示差异不显著(p>0.05，Duncan’s法)。
实施例2
采用筛选出来的乳酸菌R3、R4、R5，进行低盐条件下(8％(W/W)盐度)单菌种的发酵，通过感官评价，测定pH、总酸、还原糖、氨基酸态氮等基本指标，利用高效液相色谱测定发酵后的有机酸含量，使用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术测定挥发性物质(Volatile Aroma Components，VOC)，并运用聚类分析和主成分分析对X公司提供的室温自然发酵辣椒产品(18％(W/W)高盐度)、不接菌室温自然发酵辣椒、不接菌32℃发酵辣椒、接种32℃发酵辣椒的风味品质进行差异性分析，剔除掉发酵品质较差的菌种。
1.1试验材料
朝天椒、食盐、100mL玻璃瓶等购于湖南农业大学东之源农贸市场。
1.2培养基与试剂
试验培养基与试剂见表6。
表6培养基与试剂
1.3仪器与设备
试验仪器与设备见表7。
表7仪器与设备
1.4试验方法
1发酵辣椒的制备
菌悬液的制备：参见实施例1
原料处理：选择新鲜脆嫩、鲜红、无腐烂发霉、无机械损伤、无病虫害的朝天椒，去蒂后用蒸馏水冲洗2～3遍，洗净后于阴凉通风处晾干，切成1～2cm的小段，加入8％(w/w)食用盐，分装100g于高温煮沸灭菌过的玻璃瓶中。
对照组：不接菌室温自然发酵辣椒(CK1)、不接菌32℃发酵辣椒(CK2)，室温自然发酵15d后经风味调配而成)。
处理组：接种发酵辣椒组有乳酸菌R3、乳酸菌R4、乳酸菌R5。分别接入6％(w/w)单菌种于100g辣椒中，乳酸菌浓度为1×109CFU/mL，密封32℃发酵。
2感官评价
发酵15d后，进行感官评价。参照标准NY/T 1711-2020《绿色食品辣椒制品》并改进，由10名食品专业背景的人员组成感官评价小组，评分标准如下表所示：
表8发酵辣椒感官质量评价标准
结果见感官评分表9所示。在色泽上，R3＞R4＞R5＞CK1＞CK2，在滋味上，R3＞R4＞R5＞CK2＞CK1，在香气上，R3＞R4＞R5＞CK1＞CK2，在脆度上，CK1＞R5＞R4＞R3＞CK2，总体上，感官评分为R3＞R4＞R5＞CK1＞CK2。乳酸菌R3在香气和滋味上最好，综合感官评分为85.80分，乳酸菌R5感官评分低于其他单菌种发酵组，产生的风味不足。自然发酵辣椒CK1和CK2感官评分较最低，分别为75.19、68.91分，原因是CK1生青味较为明显，没有明显的发酵香气，CK2的脆度降低，可能是在32℃低盐发酵条件下，其他微生物的生长导致了辣椒中的果胶被分解，使得组织变软，脆度降低。
表9发酵辣椒感官评分
注：同一列不同字母代表差异显著(p＜0.05)，反之，则无显著性差异(p＞0.05)。CK1为不接菌室温自然发酵辣椒、CK2为不接菌32℃发酵辣椒；R3、R4、R5为接种不同乳酸菌32℃发酵辣椒。
3基本指标测定
每隔两天测定一次pH、总酸、还原糖、氨基酸态氮等含量的变化，发酵15d后，测定有机酸含量。
(1)pH测定：参照GB/T 5009.237-2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》pH计法测定；
pH值变化结果如图4所示；pH值是直观反映出菌种发酵产酸速率的重要指标之一，在辣椒发酵过程中pH值逐渐降低，装瓶后的初始pH值偏酸性，均在4.46左右。随发酵时间的延长，自然发酵辣椒CK1、CK2从发酵初期开始pH值就呈现缓慢降低的趋势，基本没有变化。乳酸菌R3、R4、R5发酵后的pH值分别为3.42、3.50、3.55，乳酸菌R5的pH值下降趋势较慢，而乳酸菌R3、R4的pH值在发酵3d后快速下降，直至发酵12d后pH值趋于平稳，最终下降至3.50以下，显著高于乳酸菌R5(p＜0.05)。由此可知，自然发酵产酸较慢，发酵进度缓慢，低盐接种发酵接入的菌数量较大，能快速启动发酵过程，因而发酵产酸速度更快、pH值变化更大。
(2)总酸测定：采用GB/T 12456-2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中的酸碱指示剂滴定法测定；
如图5所示，与pH变化相应，在辣椒发酵过程中总酸含量随发酵时间的延长而增加，相对而言，发酵辣椒中营养充足，接种发酵的总酸变化更明显，产酸量更大。发酵辣椒的起始总酸为0.30g/100g，自然发酵组CK1、CK2因为瓶内乳酸菌数量较少，总酸含量呈缓慢增长的趋势。随发酵时间的延长，乳酸菌R3、R4、R5总酸分别达0.81g/100g、0.82g/100g、0.70g/100g。乳酸菌R3、R4的总酸含量在第12d达到顶峰，而乳酸菌R5的总酸含量在第6d才开始大幅度增加。综上，人工转接优良发酵纯菌种，使得发酵初期乳酸菌能快速增长产酸，低盐发酵辣椒中总酸含量高于自然发酵组，加快了发酵进程。
(3)还原糖测定：采用GB/T 5009.7-2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》中的直接滴定法测定；
由图6可知，辣椒在发酵初期还原糖含量均为3.65g/100g，含量随着发酵呈下降趋势，不接菌室温自然发酵辣椒CK1的还原糖从3.65g/100g下降至1.92g/100g，不接菌32℃发酵辣椒CK2的还原糖下降至1.18g/100g，乳酸菌R3的还原糖下降至1.84g/100g，乳酸菌R4的还原糖下降至1.89g/100g，乳酸菌R5的还原糖下降至2.00g/100g。乳酸菌R3、R4发酵辣椒还原糖含量变化趋势较为一致，在第3d还原糖含量大幅度下降，发酵9d后还原糖含量趋于稳定。不接菌室温自然发酵辣椒CK1的还原糖消耗趋势同乳酸菌R4，说明CK1受环境温度和杂菌的影响，消耗了部分还原糖。不接菌32℃发酵辣椒CK2由于未接菌，发酵9d后还原糖仍在被消耗，可能是因为发酵过程中杂菌的大量生长导致。乳酸菌R5还原糖下降趋势低于其他组，说明该菌种消耗还原糖速率比其他组慢，由此可见，乳酸菌R3、R4对糖类的利用能力优于乳酸菌R5。综上，随着发酵的进行，还原糖含量逐渐降低，最终趋于稳定，因接种乳酸菌、酵母菌等在发酵过程中消耗了还原糖，使得瓶内乳酸菌或酵母菌初始菌浓度远高于其他微生物，具有竞争优势。
(4)氨基酸态氮测定：采用GB/T 5009.235-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中的酸度计—甲醛值滴定法测定；
如图7所示，辣椒中的氨基酸态氮含量初始值为0.232g/100g，在发酵过程中，呈缓慢上升趋势，不接菌室温自然发酵辣椒CK1的氨基酸态氮从0.232g/100g上升至0.295g/100g，不接菌32℃发酵辣椒CK2的氨基酸态氮上升至0.299g/100g，乳酸菌R3的氨基酸态氮上升至0.305g/100g，乳酸菌R4的氨基酸态氮上升至0.301g/100g，乳酸菌R5的氨基酸态氮上升至0.291g/100g，乳酸菌R5的氨基酸态氮含量最低，乳酸菌R3的氨基酸态氮含量最高。所有发酵辣椒组在发酵3d内氨基酸态氮含量大幅度升高，说明此时辣椒中菌数开始大量增加，随后呈上下波动趋势，氨基酸态氮含量上升是辣椒含有的蛋白质经微生物及其本身含有的水解酶作用，逐步分解为氨基酸所致。在发酵过程中其含量稍下降，是在发酵后期氨基酸又被作为氮源被乳酸菌微生物利用，因此氨基酸态氮会有所减少。乳酸菌R5的氨基酸态氮上升趋势最低，说明其发酵较为缓慢，对蛋白质分解利用率较其他组低。
(5)有机酸的测定：参考GB 5009.157-2016《食品中有机酸的测定》并稍作修改。
样品处理：将发酵辣椒样品打成匀浆，称取1.50g置于50mL容量瓶中，定容。然后于70℃水浴提取20min，冷却至室温。随后过滤掉辣椒渣，滤液经4000r/min离心15min，取上层清液经0.22μm水系滤膜过滤，后注入液相进样瓶，用于高效液相色谱仪分析。
标准曲线制备：分别配制草酸质量浓度为500μg/mL、酒石酸12500μg/mL、苹果酸25000μg/mL、乳酸25000μg/mL、乙酸25000μg/mL、柠檬酸25000μg/mL、丁二酸62500μg/mL的标品溶液，用0.1％磷酸溶液分别将其稀释25、50、125、250、500倍，得到不同浓度的有机酸标准溶液，经0.22μm水系滤膜过滤后注入液相进样瓶，用于高效液相色谱仪分析。
色谱条件：流动相为0.1％磷酸溶液：甲醇＝97.5:2.5(V/V)；流速为1.0mL/min；柱温为40℃；进样量为20μL；检测波长为210nm。
定性定量：以有机酸标准溶液的保留时间作为定性标准，对发酵辣椒中的有机酸进行鉴定分析。以有机酸标准溶液的浓度为横坐标，色谱峰的面积为纵坐标绘制标准曲线，利用标准曲线方程计算发酵辣椒中有机酸的含量。
结果见表10。可以看出，鲜辣椒中以柠檬酸含量最高，为13.09g/kg，未检测出草酸、酒石酸、乳酸，可能是含量较低或被其他物质干扰无法检出。发酵后的辣椒有机酸总量增加，不接菌室温自然发酵CK1的有机酸增量较少，不接菌32℃发酵辣椒CK2中有机酸含量为为74.85g/kg，比CK1高，说明温度可以提升发酵进程，增加有机酸含量。R3中乳酸含量和有机酸含量最高，为56.87g/kg，其次为乳酸菌R4，说明接种乳酸菌发酵可以产生更多的乳酸或其他有机酸。乳酸菌R5产生的乳酸低于乳酸菌R3、R4，但乙酸含量较高，为10.45g/kg。此外，发酵后的辣椒中柠檬酸含量均降低，乳酸菌R3的柠檬酸含量最低，仅3.05g/kg。
表10发酵辣椒中有机酸的含量
注：“-”表示未检出；同一行不同字母代表差异显著(p＜0.05)，反之，则无显著性差异(p＞0.05)。CK1为不接菌室温自然发酵辣椒、CK2为不接菌32℃发酵辣椒；R3、R4、R5为接种不同乳酸菌32℃发酵辣椒。
1.4挥发性香气物质测定
固相微萃取条件：每组称取3.0g发酵辣椒样品于20mL顶空瓶中，加入3mL饱和NaCl溶液、10μL内标物2-辛醇(0.16mg/mL)，于80℃恒温水浴锅平衡15min，继续水浴，将萃取头推至距液面约1cm，恒温吸附40min后迅速拔出，置于进样口，250℃解析5min。
气相色谱条件：色谱柱为DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：起始温度40℃(保持3min)以5℃/min升温至220℃，再以10℃/min升至250℃(保持3min)；高纯氮气流速为1mL/min。
质谱条件：EI离子源，电子能量和温度为70eV和230℃；接口温度250℃；质量扫描范围m/z 35～400，不分流进样。
由图8可知，发酵辣椒中共检测出125种VOC，包括30种酯、27种醇、21种酸、13种醛、12种烷烃、7种酮类、7种烯烃、5种酚类和3种其他化合物。不接菌室温自然发酵辣椒CK1有71种，不接菌32℃发酵辣椒CK2有78种，X公司的高盐发酵辣椒产品CK3有60种，乳酸菌R3有76种，乳酸菌R4有71种，乳酸菌R5有71种，其中共有成分29种。CK2和乳酸菌R3的挥发性香气种类最多，CK1、CK2种类数大于CK3。不同发酵辣椒中酯类的含量和种类较多。图8可看出不同发酵辣椒VOC含量差异较大，乳酸菌R3中含量较高的是酸(32.37％)、酯类(22.09％)，乳酸菌R4中含量较高的是酸(29.17％)、酯类(21.73％)，乳酸菌R5中含量较高的是酯类(23.00％)、烷烃类(26.31％)，X公司的高盐发酵辣椒产品CK3含量占比最高的是酸类(51.62％)、酯类(33.46％)，自然发酵辣椒CK1、CK2含量最高的是烷烃(30.97％～31.72％)和酯类(16.29％～18.10％)。该结果说明，接种发酵对发酵辣椒的风味影响很大，发酵后的辣椒中酯类和酸类、醇类是的主要特征香气物质。
通过聚类分析研究不同发酵辣椒挥发性香气成分的差异，如图9，红色代表正相关，蓝色代表负相关，绝对值越大代表相关性越强，聚类热图直观的展示了不同发酵辣椒与不同挥发性香气物质之间的相关性强弱。自然发酵辣椒组CK1、CK2中酯类在种类和含量上差异不大，己酸己酯、异戊酸己酯、油酸甲酯、水杨酸甲酯、棕榈酸己酯的含量较高。顺-3-己烯基丁酯(具有新鲜水果青香)、顺-7-十四碳乙酸酯仅在乳酸菌R3、R4中检测到，乳酸菌R3中壬酸乙酯(呈葡萄酒香)、十三酸乙酯等含量突出。乳酸菌R3中近似柑橘香气的正庚醇、具有玫瑰气味的棕榈醇和2-十六醇含量较其他组高。乳酸菌R5中1-十七烷醇含量较其他组高，自然发酵辣椒CK1、CK2中以香叶醇含量较高，具有温和、甜的玫瑰花气息。壬酸、棕榈酸、8-甲基壬-6-烯酸在所有组中含量均较高。CK1检测出少量具有难闻气味的正癸酸，CK2中含有3-甲基丁酸(令人不愉快的气味)，CK3中酸类物质含量最高，其中十五烷酸、苯甲酸、山梨酸等酸类物质含量较多。其次接种发酵的乳酸菌R3酸类物质较多，仅在乳酸菌R3中检测到乙酸、亚油酸，在乳酸菌R4中检测到戊酸、肉豆蔻酸，增添了果香和奶油香，乳酸菌R5中检测到的酸类含量与种类都少于乳酸菌R3、R4。CK1、CK2中十七醛含量最高；呈青草气及苹果香味的正己醛仅在乳酸菌R3中检测到，酵母菌J1中检测出带有甜花香和柑橘香气的十二烷醛，乳酸菌R4中检测出(E)-2-辛烯醛、2-(4-甲基-3-环己烯-1-基)丙醛较其他组突出，CK3中醛类物质在种类和含量均较少。自然发酵组CK1、CK2的烷烃含量明显高于其他发酵辣椒，发酵成熟后的辣椒烷烃类物质有所降低。香叶基丙酮在存在所有发酵辣椒组，其中乳酸菌R3含量高于其他组，为1005.38μg/kg，赋予了发酵辣椒紫罗兰香和木兰花香气。
1.5挥发性香气成分定性定量和相对气味活度值计算
定性：香气物质的质谱数据经NIST library 14、NIST library 17及香精香料标准谱库比对，匹配度≥85％作为物质定性鉴定标准，并查阅文献资料，对发酵辣椒中各挥发性香气物质进行核对确认。定量：采用内标法[64,65]，通过上述试验中发酵辣椒样品添加的10μL2-辛醇(0.16mg/mL)为内标物，已知内标物的峰面积、质量浓度及体积，然后根据各成分与内标物的质谱峰面积比值计算其相对含量，具体按下式(1)计算。相对气味活度值计算：根据每个挥发性香气成分质量浓度计算香气活度值(Relative Odor ActivityValues，rOAVs)，按下式(2)计算：
注：C——各挥发性成分的相对含量(μg/Kg)；
A1——各成分峰面积；
A2——内标物峰面积；
C1——内标物质量浓度(μg/mL)；
V1——内标物体积(mL)；
M——样品质量(Kg)；
T——该挥发性成分在水中的香气阈值浓度(μg/Kg)。
不能仅从香气物质的种类和含量的多少来判断发酵辣椒风味的好坏，还需计算相对气味活度值rOAVs来综合分析，rOAVs是评价各香气成分对发酵辣椒风味贡献的重要指标。rOAVs值越高贡献越大，一般将0.1≤rOAVs＜1的香气成分判定为协调香气的作用，rOAVs≥1被称为关键香气成分，对风味具有显著的影响作用。根据公式(2)计算rOAVs值，结果见表11，不同发酵辣椒组共有37种挥发性香气成分发挥作用(rOAVs≥0.1)，其中关键香气成分(rOAVs＞1)CK1有11种、CK2有13种、CK3有10种、乳酸菌R3有14种、乳酸菌R4有10种、乳酸菌R5有10种，接种发酵乳酸菌R3的关键香气物质最多。
表11不同发酵辣椒挥发性物质的rOAVs值
注:“-”表示未检出；CK1为不接菌室温自然发酵辣椒、CK2为不接菌32℃发酵辣椒、CK3为X公司提供的发酵辣椒产品，R3、R4、R5为接种不同乳酸菌32℃发酵辣椒、J1为酵母菌接种32℃发酵辣椒。
将rOAVs大于1的香气成分采用Origin进行PCA分析并作图，如图10所示，可以更加直观的看出，不同颜色的点代表不同单菌种发酵辣椒样品，点之间的距离代表样品之间特征差异的大小，这些成分指标在不同点之间有明显的区域分布。CK1、CK2在PC1的负半轴和PC2的正半轴，愈创木酚、香叶醇、4-乙基-2-甲氧基苯酚、反式-2-辛烯醛等物质在PC2的正半轴有较高的载荷，说明在自然发酵组中含量较高。乳酸菌R4、R5同样分布在PC1的负半轴和PC2的正半轴，可见这两株乳酸菌产生的挥发性香气物质较为相似，但各点之间的距离也反映了它们之间的差异大小，异戊酸己酯、2-甲氧基-3-异丁基吡嗪等香气物质主要集中在乳酸菌R4附近，说明在乳酸菌R4中含量较高，而R5接近原点，周围分布的关键香气物质较少。CK3分布在PC1和PC2的负半轴，月桂酸乙酯、4-乙基苯酚等在CK3附近有较高的载荷，说明在CK3中含量较高。乳酸菌R3分布在PC1的负半轴和PC2的正半轴，周围分布着D-柠檬烯、香叶基丙酮、正己醛，说明在乳酸菌R3中含量较高。
综上，得出以下结论：
1、发酵15d结束后进行感官评价，乳酸菌R3在香气和滋味上最好，综合感官评分为85.80分，乳酸菌R4感官评分为84.60，乳酸菌R5感官评分较最低，为84.08分。
2、测定单菌种低盐发酵辣椒的pH值变化。发酵15d后，乳酸菌R3、R4、R5的pH值显著降低(p<0.05)，R3、R4、R5的pH值分别为3.42、3.50、3.55，乳酸菌R5的pH值下降最慢。
3、测定单菌种低盐发酵辣椒的总酸变化。乳酸菌R3、R4、R5的总酸分别达0.81g/100g、0.82g/100g、0.70g/100g，其中乳酸菌R5的产酸速率较R3、R4慢。
4、测定单菌种低盐发酵辣椒的还原糖变化。R3的还原糖下降至1.84g/100g，R4的还原糖下降至1.89g/100g，R5的还原糖下降至2.00g/100g，乳酸菌R5的还原糖利用率最低。
5、测定单菌种低盐发酵辣椒的氨基酸态氮变化。R3的氨基酸态氮上升至0.305g/100g，R4的氨基酸态氮上升至0.301g/100g，R5的氨基酸态氮上升至0.291g/100g，乳酸菌R5的氨基酸态氮含量最低。
6、测定低盐发酵辣椒中的有机酸含量，乳酸菌R3、R4、R5的乳酸含量显著增加(p<0.05)，其中乳酸菌R3的乳酸含量最高，为56.87g/kg，乳酸菌R5的乳酸含量最低，为33.26g/kg。
7、测定发酵辣椒中的挥发性香气物质。经计算相对气味活度值(rOAVs)发现，乳酸菌R3最多，有14种关键香气成分(rOAVs＞1)，乳酸菌R3中酸类占比32.37％、酯类占比22.09％。通过聚类分析和主成分分析得，R3中的关键香气物质为D-柠檬烯、香叶基丙酮、正己醛。
8、综上，淘汰掉乳酸菌R5、R4，选择乳酸菌R3进行下一步试验。
实施例3
材料和方法同实施例2。
试验方法如下：
1发酵菌种鉴定
将筛选出发酵品质最好的乳酸菌R3进行分子生物学鉴定，菌种培养12h后，使用Ezup柱式细菌/真菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株基因组DNA，乳酸菌使用16S rDNA细菌通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'进行PCR扩增；PCR反应体系和PCR反应条件如下表12、13所示，扩增后取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳纯化，交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列比对，鉴定其种属。将测序结果用Blast软件与Gen Bank核酸序列数据库中己知菌种相应序列进行同源性分析比对，采用MEGA 5.0软件建立系统发育树。
表12PCR反应体系
表13PCR反应条件
如图11，菌株R3的PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳纯化后，R3在1500bp和500bp处出现特异清晰的单一条带。经生工生物工程(上海)股份有限公司测序分析获得16S rDNA基因序列和26S rDNA基因序列，将R3菌株基因序列上传至BLAST，使用Gen Bank搜索同源性高的相似菌株序列进行相似性分析，在MEGA X软件中使用Neighbor-Joining(N-J)法构建系统发育树。结果表明，R3菌株与植物乳杆菌同源性为99％，鉴定R3菌株为植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum(GenBank登陆号为OQ847791)。
将其进行保藏，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.27361，保藏时间为2023年5月18日，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
综上，本发明从自然发酵辣椒中筛选出一株植物乳杆菌，应用于低盐发酵辣椒，增添低盐发酵辣椒的香气品质，发酵产生的低酸度，可以避免低盐发酵辣椒中杂菌的污染，延长储藏保质期，不需添加防腐剂和风味调配剂。
上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本实施例的各种等价形式的修改均落入本发明所附权利要求所限定的范围。
Claims (9)
1.一种发酵剂，其特征在于，包括：植物乳杆菌菌液；所述植物乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.27361，保藏时间为2023年5月18日，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的发酵剂，其特征在于，所述植物乳杆菌菌液的制备方法包括以下步骤：挑取单菌落至培养基，37±5℃静置培养20-28h，活化数次后离心，收集菌体，用无菌生理盐水冲洗后，调整细菌液浓度，即得。
3.根据权利要求1所述的发酵剂，其特征在于，所述植物乳杆菌菌液中，植物乳杆菌的活菌数为1×109～3×109cfu/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的发酵剂在制备发酵辣椒中的用途。
5.一种发酵辣椒，其特征在于，所述发酵辣椒包括权利要求1-3任一项所述的发酵剂。
6.一种制备低盐发酵辣椒的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1-3任一项所述的发酵剂发酵辣椒，以便获得发酵辣椒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵剂的添加量为6-8％。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵是在32-35℃下避光发酵15-20天。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述辣椒中含有食盐，所述食盐的含量为4％-8％(w/w)。
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