CN117214433A - 新型外泌体检测技术联合特异蛋白标志物的胰腺癌筛查与诊断方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供新型外泌体检测技术联合特异蛋白标志物的胰腺癌筛查与诊断方法及应用。通过脂类分子探针标记、放大增强外泌体【exosomes,一种细胞外囊泡(extracellular vesicles EVs)】的信号,实现通过纳米流式细胞仪对外泌体的检测;荧光信号检测适用于外泌体蛋白靶标的荧光标记检测,联合外泌体荧光标记信号与散射光信号检测从而用于胰腺癌的体外诊断和高风险筛查。本发明发现使用脂类分子探针外泌体标记技术同时增强外泌体的检测信号,能够有效地利用纳米流式细胞仪对外泌体的蛋白质靶标和粒径、复杂度进行检测与分析,精确、显著地区分健康者与胰腺癌患者,为胰腺癌的临床诊断和高风险人群筛查提供辅助诊断参考建议。
Description
技术领域
本发明涉及胰腺癌医学诊断技术领域,具体涉及新型外泌体检测技术联合特异蛋白标志物的胰腺癌筛查与诊断方法及应用。
背景技术
作为世界范围内最为恶性的肿瘤之一,胰腺癌主要临床特点为发现期较晚、恶性程度高和预后极差。据流行病学显示,患者的5年生存率低于9%。由于胰腺位于腹膜后,胰腺癌早期症状并不明显,因此早期诊断十分困难。大多数胰腺癌患者被诊断时已经到了局部晚期,无法切除,或者已经发生了远处转移。约55%的患者在出现远处转移时才被确诊为胰腺癌。该疾病的诊疗难度较大,因此筛查和预防高危人群是降低胰腺癌死亡率的最有效手段。
目前,临床上诊断胰腺癌的常用方法包括血液学检测、影像学检查及组织病理学分析。在血液学检测方面,CA19-9是唯一被FDA批准的胰腺癌检测标志物。但随着研究深入证明CA19-9对于胰腺癌的早期诊断灵敏度与特异度均不高,且易于在慢性胰腺炎的鉴别诊断中出现假阳性。在影像学检查方面,增强CT和核磁共振是临床上常用的检查手段,但临床数据表明二者在胰腺癌早期诊断方面存在明显不足。而具有高灵敏度的正电子发射计算机断层显像(positron emission tomography/CT,PET/CT)具有高灵敏度,但昂贵的检查费用限制了其应用。目前胰腺癌诊断的金标准是内镜超声引导下的细针穿刺(endoscopic-ultrasound guided fine-needle aspiration,EUS-FNA),其灵敏度和特异度可高达86.8%和95.8%。然而,一方面,由于复杂的侵入性操作,可能导致如肿瘤播散、胰腺炎、出血及消化道穿孔等并发症的出现,且不易多次重复进行或部分病人不能达到操作要求;另一方面,胰腺癌特有的肿瘤间质成分导致EUS-FNA仅能提供有限次的肿瘤细胞进行病理相关分析,且可能出现假阴性结果,还无法提供充足的组织完成肿瘤分子生物学研究以指导治疗策略的选择,从而导致EUS-FNA在胰腺癌诊断上的应用受限。因此,临床上迫切需要新技术或新的生物标志物用来辅助胰腺癌的早期诊断,并克服与侵入性检查相关的禁忌证。
液态活检(liquid biopsy,LB)作为一种新兴且热门的非侵入性检测技术,不仅在胰腺癌早期诊断中具备潜在的优势,还可对患者的预后判断以及复发监测提供有价值的指导。
近些年来发展的液体活检技术,通过采集人体血液、脑脊液、唾液、尿液等体液样本,检测体液样本中的生物标志物,从而实现对癌症的早期筛查和动态监测。根据检验的生物标志物种类不同,液体活检技术可分为循环肿瘤细胞(CTCs)检测、循环肿瘤DNA(ctDNA)检测和外泌体(Exosome)和其他微囊泡的检测。与前两种存在来源不确定、检出率低、特异性差等缺点的方法相比,外泌体或微囊泡检测在癌症的早期诊断中具有来源可靠且特异性强的优点。
细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是由不同类型的细胞释放到细胞外基质的膜性囊泡,其主要功能是参与细胞间的分子运输和信息传递。EVs含有多种不同类型的内含物分子,如脂类、蛋白质、核酸等,其种类与含量会随着亲代细胞的状态和细胞生存环境的改变而发生改变。EVs的直径大小从30nm到1,000nm不等,参照对EVs的经典分类,大致可分为ectosomes和exosomes两类外泌体。ectosomes是通过向外出芽夹在质膜表面的囊泡,包括微囊泡、微粒和直径约为50nm~1mm的大囊泡。exosomes是直径范围约为40至160nm(平均约100nm)的EV,具有内泌体来源。
外泌体和其他微囊泡(以下简称为外泌体)是机体内大多数细胞在正常及病理状态下均可以分泌的脂质双层膜囊泡,广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中。不同组织细胞来源的外泌体由于携带的蛋白质等成分不同,在组成和功能方面存在差异,能够发挥不同的生物学功能。此外,外泌体的组成和功能受到细胞外基质和细胞微环境的动态调控,这也提示外泌体可能在各种疾病中具有不同的变化和作用。因此,外泌体作为一种潜在的生物标志物,对疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
外泌体携带多种蛋白质,其蛋白质水平与疾病的发展状态密切相关。通过检测组织特异性蛋白或者肿瘤特异性蛋白,可以预测亲代肿瘤的起源和发生发展情况。锌铁调控蛋白(ZRT,IRT-like protein,ZIP)蛋白家族主要负责维持细胞内外锌离子的稳态,对于维持机体正常生理活动有重要作用。ZIP4蛋白是该家族中的一种锌转运蛋白。研究发现ZIP4蛋白的异常表达在胰腺癌中被多次观测到,该蛋白对胰腺癌细胞的增殖有促进作用。
基于癌症发病原因和疾病进程极其复杂,不同癌症对身体的影响呈现出肿瘤特异性,因此外泌体生成和调控也存在差异。然而,由于外泌体的尺寸和不稳定性,外泌体的表征方法存在困难,常规的外泌体检测主要采用免疫印迹法、酶联免疫吸附法、电化学传感、微流体传感等方法。但这些方法存在成本高、程序复杂、灵敏度低等局限性。在此背景下,流式细胞检测技术成为一种优势明显的方法,它具有毒性低、成本低、多样性以及灵敏度高等优点。采用流式检测技术,可以实时动态反映癌症患者外泌体的性质,针对不同来源的外泌体进行特异性检测,对于疾病的诊断具有实际意义。然而外泌体粒径小,折射率低,无法达到常规流式细胞仪分析的阈值,不能准确区分待测粒子与噪声。采用常规的流式细胞仪进行检测时往往需要将外泌体与其他物质(如磁珠)连接以增大表面积或粒径大小、增强反射,或者加入纳米金颗粒来增加外泌体粒径之后(增强信号值)再检测。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足,本发明提供新型外泌体检测技术联合特异蛋白标志物的胰腺癌筛查与诊断方法及应用。在纳米流式细胞仪或流式细胞仪的检测信号包括散射光信号与荧光信号,散射光信号可以对被测样本的粒径大小和颗粒性质或结构做出区分。普通外泌体用脂质染料(如DiI)标记后,无法被常规流式细胞仪检测,但本发明通过外泌体脂类分子探针标记,可放大外泌体相关的信号以达到常规流式细胞仪或纳米流式的检测区间,实现通过常规流式细胞仪或纳米流式细胞技术对外泌体检测;荧光信号检测适用于外泌体蛋白靶标的荧光标记检测,联合外泌体荧光标记与散射光信号检测从而用于胰腺癌的体外诊断和高风险筛查。本发明使用外泌体标记技术,增强外泌体的检测信号,能够有效的利用纳米流式检测技术对外泌体的蛋白质靶标和粒径或复杂度进行检测与分析,基于脂类分子探针的标记技术能够精确、显著地区分健康人群与胰腺癌患者外泌体的相关差异,从而对胰腺癌的临床诊断和高风险人群区分提供参考。
为实现上述目的,本发明提供一种新型外泌体检测技术联合特异蛋白标志物的癌症筛查方法,其特征在于:使用新型外泌体标记技术进行外泌体特异蛋白标志物标记或外泌体群体标记,采用纳米流式检测技术或酶联免疫吸附检测技术,实现对癌症的检测和筛查。
优选的,所述外泌体来源于体液;所述标记技术包括但不限于脂质荧光染料标记、核酸分子探针、脂类分子探针标记中的一种或几种,所述外泌体特异蛋白标志物包括但不限于CGA蛋白、TSPAN1蛋白、TLN-1蛋白、IGFBP2蛋白、ZIP4蛋白、CA19-9蛋白中的一种或几种;所述癌症包括但不限于消化系统恶性肿瘤、呼吸系统恶性肿瘤、血液循环系统恶性肿瘤、神经系统恶性肿瘤、生殖泌尿系统恶性肿瘤中的一种或几种。
优选的,所述外泌体特异蛋白标志物来源于外泌体,所述的外泌体包含于细胞外囊泡,所述外泌体包括外泌体微囊、外泌体类囊体、外泌体异质体中的一种或几种,所述癌症包括但不限于胰腺癌、胃癌、肺癌、食道癌、口腔癌、鼻癌、淋巴癌、宫颈癌、乳腺癌中的一种或几种。
优选的,所述探针的结构为一端带有脂类分子修饰基团,另一端带有荧光修饰基团的核酸分子探针。
优选的,对待测样本进行脂类分子探针标记和ZIP4蛋白标记,再使用纳米流式技术检测,进行胰腺癌筛查。
优选的,检测信号包括外泌体群体标记下侧向光通道信号检测、正向光通道信号、荧光通道信号以及其他检测信号的一种或几种。
本发明提供一种用于筛查胰腺癌试剂盒,其包括抗体和脂类分子探针,所述脂类分子探针,其结构为5’Cholesterol—TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT—Sulfo-Cyanine3 3’,所述抗体用于标记ZIP4蛋白。
本发明提供一种用于新型外泌体检测技术联合特异蛋白标志物的癌症筛查脂类分子探针,脂类分子探针的结构为
5’Cholesterol—TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT—Sulfo-Cyanine3 3’。
本发明提供一种脂类分子探针在作为制备治疗或筛查胰腺癌药物的应用。
本发明提供一种ZIP4蛋白在作为制备治疗或筛查胰腺癌药物的应用。
本发明提供一种新型外泌体标记联合检测技术应用。
优选的,所述标记技术为外泌体荧光标记技术。
优选的,所述荧光标记技术为脂质荧光染料标记技术。
优选的,所述脂质荧光染料为DiO染料、DiI染料、DiR染料、DiD染料、胆固醇荧光探针。
优选的,所述脂质荧光染料为胆固醇荧光探针,探针的主要结构为5’Cholesterol—TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT—Sulfo-Cyanine3 3’,利用胆固醇荧光探针标记外泌体或其他微囊泡后对外泌体实现信号增大,对其群体实现标记可检测化。
优选的,所述外泌体样本检测为外泌体群体标记下侧向光通道信号检测和荧光通道信号检测。
本发明的有益效果如下:
健康人员与胰腺癌高风险人员血浆中的外泌体成分和数量等理化性质可能存在差异,但基于流式检测技术下外泌体检测受到外泌体尺寸大小的限制,且单一蛋白标志物荧光信号可能不足以区分差异。本发明通过胆固醇荧光探针标记外泌体后,对外泌体群体进行精确定位与信号放大,再通过检测侧向光信号与蛋白标志物荧光信号检测,采用单一靶标和多信号联合分析,明显加大了结果的差异度,可以排除其他组织或疾病来源外泌体的干扰,降低了检测的难度,解决了现有的检测方法灵敏度低、组织特异性差、检测难度较大等问题,有效区分胰腺癌高风险人群与健康人群。
附图说明
图1显示为本发明中蛋白质肿瘤标志物靶标的筛选结果。A为CGA蛋白荧光标记检测结果,B为TSPAN1蛋白荧光标记检测结果,C为TLN-1蛋白荧光标记检测结果,D为IGFBP2蛋白荧光标记检测结果,E为ZIP4蛋白荧光标记检测结果。通过对健康者和胰腺癌患者的标记比率差异判断,得出能够对两者做出区分的靶标。
图2显示为本发明实施例提取的血浆外泌体鉴定图。A为外泌体NTA(NanoparticleTracking Analysis)结果图;B为外泌体样本电镜拍摄结果图;
图3显示为本发明实施例提取的胆固醇荧光探针标记侧向光通道流式结果图。A为脂类分子探针标记后,外泌体侧向光通道流式检测结果;B为相同未标记外泌体样本,侧向光通道流式检测结果;C为健康组典型例样本ZIP4蛋白标记流式检测结果;D为胰腺癌组典型例样本ZIP4蛋白标记流式检测结果;E为健康组典型例样本胆固醇探针标记侧向光通道流式检测柱状图结果;F为胰腺癌组典型例样本胆固醇探针标记侧向光通道流式检测柱状图结果。
图4显示为本发明实施例ZIP4蛋白阳性外泌体纳米流式分析图。A为健康组和胰腺癌组ZIP4蛋白质外泌体阳性信号单独标记流式检测统计结果;B为健康组和胰腺癌组外泌体脂类分子探针标记侧向光通道信号流式检测统计结果;C为健康组和胰腺癌组脂质探针标记的外泌体阳性信号统计结果;D为健康组和胰腺癌组ZIP4蛋白荧光标记荧光通道信号平均值(VSSC-mean)的统计结果。
图5显示为本发明实施例的分析诊断效能的ROC曲线图。A为ZIP4蛋白荧光标记百分比的分析诊断效能ROC曲线图;B为ZIP4蛋白荧光标记荧光通道信号平均值(VSSC-mean)的分析诊断效能ROC曲线图;C为胆固醇探针标记外泌体侧向光通道信号平均值的分析诊断效能ROC曲线图;D为ZIP4蛋白和胆固醇探针标记侧向光通道信号的平均值的联合分析分析诊断效能ROC曲线图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本申请作进一步说明。
本发明以胰腺癌为例进行筛查,主要包括以下步骤:
(1)血样样本的预处理:将血样样本离心,去除残存细胞碎片与其他杂质。
(2)血浆外泌体的提取:使用预处理后的血浆进行超速离心,收集下部沉淀并重悬,收集外泌体。
(3)抗体标记:使用ZIP4抗体与外泌体孵育,偶连同种属荧光标记;使用脂类分子探针标记相关外泌体。
(4)流式检测:使用流式细胞分析仪器,对抗体标记外泌体进行定量检测,根据癌症样本与健康对照样本所带荧光信号强度和占比,对肺癌患者和健康对照成员做出区分。
实施例1:
1.仪器与试剂耗材
仪器:赛默飞Multifge X4R Pro高速离心机,贝克曼Optima Max-XP超速离心机、离心机配套离心管、Cytoflex纳米流式分析仪。
试剂耗材:1.5ml离心管,PBS,Anti-ZIP4抗体[20625-1-AP](购自武汉三鹰公司),超纯水。
2.标本的收集
采集来自于临床病理确诊的胰腺癌患者、健康者的外周血。
3.外泌体的分离收集
(1)血样样本的预处理
①将血液样本颠倒混匀,吸取0.5-1.0ml全血置于1.5ml Ep管内,4℃,5,000g离心10-40分钟。
②离心完成后舍弃沉淀的细胞部分,吸取上清并转移至新的1.5ml离心管中,4℃10,000-15,000g离心30分钟。
③舍弃沉淀的细胞碎片部分,将血浆分为50-200μl一份置于新的1.5ml离心管中并编号,后续可直接用于外泌体的提取或置于-80℃长期保存。
(2)外泌体的提取
①吸取100-500μl预处理后的血浆加入1.5ml贝克曼配套超离管中。
②加入使用0.22μm过滤器过滤后的1x磷酸盐缓冲液(PBS)500-1,000μl,轻轻吹打混匀。
③将样本置于分析天平,对于有质量差异的使用1x磷酸盐缓冲液(PBS)进行配平使其最大差异不得高于0.001g。
④将配平的超离管置于贝克曼Optima Max-XP转子中;设置超速离心机的离心力为100,000g,离心温度为4℃,离心时间为70分钟,抽真空后进行离心。
⑤离心完成后去除900μl上清,并加入100ul 1xPBS,然后对于超离管中剩余的液体吹打混匀。
⑦加入使用0.22μm过滤器过滤后的1xPBS800μl,轻轻吹打混匀。
⑧将样本置于分析天平,对于有质量差异的使用1xPBS进行配平使其最大差异不得高于0.001g。
⑨将配平的超离管置于贝克曼Optima Max-XP型号转子中;设置超速离心机的离心力为100,000g,离心温度为4℃,离心时间为70分钟,抽真空后进行离心。
⑩离心完成后去除800μl上清,对于超离管中剩余的液体吹打200次混匀,将样本分装进行后续实验或者置于-80℃保存。
(3)外泌体鉴定
Nanosight NS300检测外泌体浓度及粒径分布:
用1ml注射器吸取上述方法抽提外泌体样本,将1ml外泌体稀释液缓缓推入管道,待液流稳定后,对提取的外泌体样本进行检测。运行结束后用Nanoparticle trackinganalysis(NTA)3.2软件进行分析,结果如图2A所示,样品的粒径分布主要位于为50-150nm之间,主要峰值位于67nm与133nm之间,符合外泌体的粒径特性。
外泌体电镜检测:电镜检测可见,结果如图2B所示,外泌体外观清晰,形态完整;经鉴定,经步骤(2)提取的外泌体质量良好,可进行进一步的实验检测。
4.外泌体和外泌体脂类分子探针与蛋白标记
(1)样品封闭
a)取出在-80℃保存的外泌体,冰上静置融化。
b)取5-20μl外泌体加入干净的0.6ml EP管中。
c)加入5-20μl 4% BSA溶液,充分混匀,室温(25℃)孵育10分钟。
d)加入5-20μl PBS终止封闭。
(2)样品染色
a)取0.5-1.5μg抗体到0.6ml EP管中,使用0.22μm过滤器过滤后的1xPBS稀释到终体积为2.5-7.5μl。
b)加入2.5-7.5μl对应抗体种属来源的Thermo IgG标记试剂盒A液到上述管中,(例如Thermo Fisher Scientific Zenon IgG标记试剂盒货号:Z25351)充分混匀,室温(25℃)孵育10-60分钟。
c)加入1.5-4.5μl试剂盒中的B液到上述离心管中,充分混匀,室温(25℃)孵育10-60分钟。
d)加入使用0.22μm过滤器过滤后的1xPBS稀释上述染色混合液,使其终体积为25-75μl。
e)加入2.5-7.5μl上述混合液到封闭好的样品中,充分混匀,放置于4℃冰箱孵育过夜。
f)取抗体标记后的外泌体50-100ul,加入胆固醇探针至终浓度为1-100μmol/L,探针的结构为:5’Cholesterol—TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT—Sulfo-Cyanine3 3’。
g)吹打混匀后,将外泌体避光放置于4℃,孵育10-60min
3.样品固定
a)加入10-30μl 4%使用0.22μm过滤器过滤后的4%多聚甲醛(PFA)到每个样品管中,室温(25℃)孵育10分钟。
b)加入160-760μl使用0.22μm过滤器过滤后的1xPBS稀释样品到终体积为200-800μl,将样品转移到流式管内进行流式检测。
(3)纳米流式分析仪检测
系统启动:开机流程10分钟;
日常质控:上样质控品(200nm standard blue FLPS),仪器参数488nmLaserpower:10mW,SS Decay:0.2%,调节信号强度及均一性,采集并保存数据;
仪器检测参数的调节:同批次检测样本需保证仪器检测参数一致(进样压力、激发强度、荧光衰减等);
上样:等待上样速度与每秒颗粒数平稳运行;
采样:每个样品采样20s,保存数据;
阈值设置:手动上下调整阈值线直至颗粒信号能与背景信号良好区分。
(4)数据分析
使用Cytexpert for DxFLEX对数据进行记录、分析与导出,按照阈值设定圈门区分阳性颗粒群体与阴性颗粒群体,利用工具栏中的圈门工具选中直线以上的部分,红色区域为阳性标记荧光的外泌体粒子,其他区域为未标记外泌体粒子,在两区域中间划门即可,导出阳性颗粒群体百分比数据并分析。
使用SPSS 22.0对检测数据进行统计学分析,对单一蛋白标志物标记健康体检者组和胰腺癌组数据进行T检验和ROC曲线分析;对多组数据进行二元logistics回归分析。
外泌体来源的胰腺癌相关特异性蛋白靶标筛选
使用24例样本(12例健康体检者组样本、12例胰腺癌组样本)筛选肺癌相关蛋白质靶标的检测,标记方法使用上述标记方法。在经过前期研究和分析中选取包含CGA、TSPAN1、IGFBP2、TLN-1、ZIP4等蛋白质作为潜在的肺癌相关蛋白质靶标;经过对样本外泌体的荧光标记并检测后发现,ZIP4蛋白在健康组与胰腺癌组成员中存在显著性差异,具有潜在的成为靶标的可能性。具体结果见图1。
实施例2:
外泌体ZIP4蛋白标记检测实验
使用19例健康体检者组样本与20例胰腺癌组样本按上述实施例1方法进行流式检测。
脂类分子探针标记前,流式细胞仪无法识别噪声与外泌体,脂类分子探针标记后,信号经放大后,可被流式细胞仪捕捉到相关信号,结果见图3A与图3B。胰腺癌组和健康组的ZIP4蛋白标记结果见图3C与图3D,胰腺癌组ZIP4蛋白靶标流式检测结果占比较低,对照健康组中ZIP4的蛋白质外泌体阳性信号值较高。
对外泌体侧向光检测信号进行检测,结果可见图3E与图3F。在胰腺癌组中外泌体侧向光通道信号较低,在健康对照组中侧向光通道信号值高于胰腺癌组,具体结果见统计学分析图4。
胆固醇探针标记结果与ZIP蛋白标记数据统计与分析
对所有受检者的流式检测数据进行统计学与诊断效能的分析,对两组ZIP4蛋白标记结果统计学分析发现:胰腺癌组ZIP4标记率平均值低于健康组,扩大队列数据证实两组外泌体中ZIP4蛋白外泌体粒子占比能够在胰腺癌与健康人之中做出区分,由此可得出外泌体ZIP蛋白流式检测在鉴别诊断胰腺癌和高风险人群区分中具有一定的诊断效能,但灵敏度和特异度不够。
为了进一步增加区分度,需要联合其他靶标,即采用侧向光通道信号进行区分。胆固醇探针标记外泌体后,我们经统计学分析后发现两组之间的探针标记比率及外泌体数量或外泌体占比存在一定的差异,胰腺癌组中探针占比高于健康者组。单一基于脂类分子探针标记(外泌体数量)的ROC结果显示AUC=0.8132,按照相同的方式对探针标记后外泌体侧向光通道信号值的AUC=0.8632,这两项结果证实外泌体数量或外泌体结构性质在胰腺癌组和健康者中存在较大差异,且目前没有研究证实此发现。
为了获取最佳的诊断效能,我们尝试将外泌体标记的侧向光通道信号与ZIP4蛋白占比进行联合分析,发现ROC曲线下面积大于0.9,诊断效能提升明显,其实际意义已经可以在胰腺癌的诊断中做出高正确率的区分。
综上所述,本发明发现ZIP4蛋白阳性外泌体流式检测联合脂类分子探针侧向光通道信号值流式检测分析在胰腺癌诊断、鉴别诊断中具有良好的诊断效能,该蛋白质靶标可以作为胰腺癌的生物标志物。该检测方法可以作为胰腺癌筛查或区分胰腺癌高风险人群的方法。该发明在脂类分子探针标记下能够较为精确的识别并检测外泌体的信息,对于肿瘤的诊治具有实时检测,动态监测的优点,外泌体富含的生物学信息可被检测将极大的有利于癌症的筛查,更有利于实现胰腺癌的早期诊断。
本发明通过检测人血浆中含有ZIP4蛋白阳性外泌体占比与胆固醇探针标记后的流式细胞仪侧向光通道信号值,依据健康组和胰腺癌高风险人群中阳性外泌体比率的不同与胆固醇探针标记侧向光通道信号值的差异,对受检者进行胰腺癌的体外诊断和风险筛查。本发明提供外泌体ZIP4蛋白阳性外泌体作为生物标志物与脂类分子探针标记外泌体侧向光通道信号值在制备或筛选胰腺癌诊断的应用,采用的诊断装置可以为流式细胞分析仪,可检测得到ZIP4蛋白阳性外泌体粒子数占总外泌体粒子数的百分比与脂类分子探针标记外泌体侧向光通道信号值。ZIP4蛋白阳性外泌体蛋白阳性外泌体粒子数占总外泌体粒子数的百分比和脂类分子探针标记外泌体侧向光通道信号值与胰腺癌的发生相对于健康者呈负相关,脂类分子探针标记外泌体侧向光通道信号值和含有ZIP4蛋白的外泌体在患癌组和健康对照组的检测中存在显著性差异,在健康人的血浆中ZIP4蛋白阳性外泌体占比和脂类分子探针标记外泌体侧向光通道信号通道信号值显著高于胰腺癌患者血浆中ZIP4蛋白阳性外泌体占比和脂类分子探针标记外泌体侧向光通道信号值。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种新型外泌体检测技术联合特异蛋白标志物的癌症筛查方法,其特征在于:使用新型外泌体标记技术进行外泌体特异蛋白标志物标记或外泌体群体标记,采用纳米流式检测技术、酶联免疫吸附检测技术等,实现对癌症的检测和筛查。
2.根据权利要求1所述的新型外泌体检测技术联合特异蛋白标志物的癌症筛查方法,其特征在于:所述外泌体来源于体液;所述标记技术包括但不限于脂质荧光染料标记、核酸分子探针、脂类分子探针标记中的一种或几种,所述外泌体特异蛋白标志物包括但不限于CGA蛋白、TSPAN1蛋白、TLN-1蛋白、IGFBP2蛋白、ZIP4蛋白、CA19-9蛋白中的一种或几种;所述癌症包括但不限于消化系统恶性肿瘤、呼吸系统恶性肿瘤、血液循环系统恶性肿瘤、神经系统恶性肿瘤、生殖泌尿系统恶性肿瘤中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的新型外泌体检测技术联合特异蛋白标志物的癌症筛查方法,其特征在于:所述外泌体特异蛋白标志物来源于外泌体,所述的外泌体包含于细胞外囊泡,所述外泌体包括但不限于外泌体微囊、外泌体类囊体、外泌体异质体中的一种或几种,所述癌症包括但不限于胰腺癌、胃癌、肺癌、食道癌、口腔癌、鼻癌、淋巴癌、宫颈癌、乳腺癌中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的新型外泌体检测技术联合特异蛋白标志物的癌症筛查方法,其特征在于:所述探针的结构为一端带有脂类分子修饰基团,另一端带有荧光修饰基团的核酸分子探针。
5.根据权利要求3所述的新型外泌体检测技术联合特异蛋白标志物的癌症筛查方法,其特征在于:对待测样本进行脂类分子探针标记和ZIP4蛋白标记,再使用纳米流式技术检测,进行胰腺癌筛查。
6.根据权利要求4或5所述的新型外泌体检测技术联合特异蛋白标志物的癌症筛查方法,其特征在于:检测信号包括外泌体群体标记下侧向光通道信号检测、正向光通道信号、荧光通道信号以及其他检测信号的一种或几种。
7.一种用于筛查胰腺癌试剂盒,其特征在于:包括抗体和脂类分子探针,所述脂类分子探针,其结构为5’Cholesterol—TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT—Sulfo-Cyanine33’,所述抗体用于标记ZIP4蛋白。
8.一种用于新型外泌体检测技术联合特异蛋白标志物的癌症筛查脂类分子探针,其特征在于:脂类分子探针的结构为
5’Cholesterol—TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT—Sulfo-Cyanine3 3’。
9.权利要求8所述脂类分子探针在作为制备治疗或筛查胰腺癌药物的应用。
10.ZIP4蛋白在作为制备治疗或筛查胰腺癌药物的应用。
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