CN117210459A

CN117210459A - 环境诱导型启动子、含有该启动子的重组载体、重组菌及其应用

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Publication number: CN117210459A
Application number: CN202311000298.1A
Authority: CN
Inventors: 黄和; 时曼; 张驰; 张蕊; 徐晴; 薛锋
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2023-08-09
Filing date: 2023-08-09
Publication date: 2023-12-12

Abstract

本发明涉及基因改造技术，公开了一种环境诱导型启动子、含有该启动子的重组载体、重组菌及其应用。该环境诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者，所述环境诱导型启动子为如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的子序列，其保持启动子活性。本发明还提供含有该启动子的重组载体、重组菌及它们在表达目标基因或合成目标产物中的应用。该启动子能够诱导目的基因在菌株培养的种子期处于不表达或低量表达状态，在发酵期处于丰富表达状态，可有效促进目标产物的合成。

Description

环境诱导型启动子、含有该启动子的重组载体、重组菌及其应用

技术领域

本发明涉及基因改造技术，具体地，涉及一种环境诱导型启动子、含有该启动子的重组载体、重组菌及其应用。

背景技术

启动子位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合，从而为DNA序列转录提供起始信号。启动子是基因表达和调控所必需的重要序列，根据启动子的工作模式，可分成三类：特异性启动子、诱导型启动子和组成型启动子。深入挖掘和研究实用性且个性化的特异性启动子，不仅有助于解析菌株的形态构建、生理代谢、逆境响应等基础理论，而且具有非常广泛的应用潜力。

有机酸生产主要是以石油化工原料为底物的酶促转化法，但该方法成本高且污染环境，阻碍了生产规模的扩大；微生物发酵法生产有机酸因具有环境污染小，原料相对廉价以及可持续性等优势逐渐受到重视。黑曲霉作为FDA认证的GRAS(Generally recognizedas safe)菌株，具有利用各种廉价可再生碳源的能力，而被广泛应用于生物技术产业生产化学品和酶制剂。例如，特定的黑曲霉菌株能达到出色的碳酸转换比，具备非常强的耐酸能力，使其成为规模化生产有机酸的优秀细胞工厂，如柠檬酸和苹果酸。

黑曲霉发酵合成有机酸的一般过程包括两步，即首先将孢子接种到种子培养基中萌发营养生长为菌丝球，然后将菌丝球转移到发酵培养基中合成有机酸。但目前黑曲霉生产有机酸的水平距工业化生产需要仍有一定差距，已有研究通过敲除以及组成型过表达关键基因等手段改造优化黑曲霉的产酸代谢通路从而使目的有机酸产物高度丰量积累。然而，在实际改造过程中发现，简单地敲除或者持续组成型过表达目的基因往往使得菌株出现生产发育妥协现象，例如位于细胞膜的有机酸转运蛋白合成过多会导致细胞膜功能受损(如影响细胞膜流动性)。

因此，开发一种能够控制目的基因表达、规避上述生长发育妥协现象的改造方式，对于黑曲霉发酵生产有机酸具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种环境诱导型启动子、含有该启动子的重组载体、重组菌及其应用，该启动子能够诱导目的基因在菌株的种子期处于不表达或低量表达状态，在发酵期处于丰富表达状态，可有效促进目标产物的合成。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种环境诱导型启动子，该环境诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者，所述环境诱导型启动子为如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的子序列，其保持启动子活性。

本发明第二方面提供一种重组载体，该重组载体含有环境诱导型启动子，所述环境诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者，所述环境诱导型启动子为如SEQID NO.1所示的核苷酸序列的子序列，其保持启动子活性。

优选地，该重组载体还含有目标基因。

优选地，所述目标基因为编码目标产物生成途径的关键酶的基因和/或编码荧光蛋白的基因。

优选地，所述目标产物为有机酸，更优选为延胡索酸、苹果酸和柠檬酸中的至少一种。

优选地，所述关键酶选自延胡索酸酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸酶和柠檬酸合酶中的至少一种。

优选地，所述延胡索酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述重组载体的表达载体为pEASY-pyrG。

优选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白。

优选地，所述编码荧光蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明第三方面提供一种重组菌，该重组菌含有上述的启动子或者上述的重组载体。

优选地，该重组菌的出发菌株为产酸菌株，优选为黑曲霉(Aspergillus niger)，更优选为黑曲霉ATCC 1015。

本发明第四方面提供上述的启动子、上述的重组载体或者上述的重组菌在表达目标基因或合成目标产物中的应用。

优选地，所述目标基因选自延胡索酸酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸酶和柠檬酸合酶中的至少一种。

本发明第五方面提供一种生产目标产物的方法，该方法包括以下步骤：将重组菌先进行种子培养，再进行发酵培养；其中，所述重组菌含有环境诱导型启动子和编码目标产物生成途径的关键酶的基因，所述环境诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者，所述环境诱导型启动子为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的子序列，其保持启动子活性。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

本发明提供的环境诱导型启动子在与目标基因形成重组载体，导入出发菌株形成重组菌后，该启动子可特异性地在重组菌培养的种子期自发关闭目的基因的表达，而在重组菌培养的发酵期强烈开启目的基因的表达；基于该启动子的激活特性，将菌株中目标产物生成途径的关键酶作为目标基因，利用该启动子控制关键酶基因在种子期处于非表达状态，而在发酵期处于丰富表达状态，不仅能够有效促进目标产物的合成、提高目标产物的产量，还能够规避传统组成型表达策略造成的生长发育妥协，在工业微生物基因改造方面具有非常广泛的应用潜力。

附图说明

图1是实施例2中重组载体pEASY-pyrG-PmfsA-GFP的质粒图谱；

图2是实施例3中重组菌MS1-1和MS1-2的平板培养图；

图3是实施例3中重组菌MS1-1和MS1-2的WB检测结果图；

图4是实施例5中重组载体pEASY-pyrG-PmfsA-fumA-GFP的质粒图谱；

图5是实施例6中重组菌MS2-1和MS2-2的平板培养图；

图6是实施例6中重组菌MS2-1和MS2-2的WB检测结果图；

图7是本发明中启动子PmfsA在种子期和发酵期对绿色荧光蛋白表达的工作模型。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明第一方面提供一种环境诱导型启动子，该环境诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者，所述环境诱导型启动子为如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的子序列，其保持启动子活性。

本发明中，该环境诱导型启动子的子序列指的是保留启动子活性并包含SEQ IDNO.1所示序列中至少700个核苷酸，优选为包含SEQ ID NO.1所示序列中至少700个核苷酸，更优选为包含SEQ ID NO.1所示序列中至少800个核苷酸，进一步优选为包含SEQ ID NO.1所示序列中至少850个核苷酸。

本发明的发明人，在针对有机酸生产菌株的研究过程中，意外地发现，环境诱导型启动子PmfsA能够在黑曲霉ATCC 1015中控制表达编码绿色荧光蛋白GFP，使得GFP蛋白在发酵前的种子培养阶段不被表达，而在发酵培养阶段被丰量表达；基于此，通过进一步验证，该启动子可特异性地在重组菌培养的种子期自发关闭目的基因的表达，而在重组菌培养的发酵期强烈开启目的基因的表达；基于该启动子的激活特性，将菌株中目标产物生成途径的关键酶作为目标基因，利用该启动子控制关键酶基因在种子期处于非表达状态，而在发酵期处于丰富表达状态，不仅能够有效促进目标产物的合成、提高目标产物的产量，还能够规避传统组成型表达策略造成的生长发育妥协，在工业微生物基因改造方面具有非常广泛的应用潜力。

本发明中，种子期指的是微生物菌株的菌种接种至种子培养基中进行种子培养使菌体长得粗壮、成为活力强的种子的阶段，种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量较高；发酵期指的是将种子期得到的种子接种至发酵培养基进行发酵培养以快速生长、合成目标产物的阶段，发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。具体地，可以根据微生物菌株的具体种属类别，确定种子培养和发酵培养的条件，并选用其相应的种子培养基和发酵培养基；例如，大肠杆菌的种子培养基可含有葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出物和氯化钠，种子培养的条件包括：温度为35-40℃，时间为20-30h；大肠杆菌的发酵培养基可含有葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化钠、硫酸铵、硫酸镁、柠檬酸钠和硫代硫酸钠，发酵培养的条件包括：温度为35-40℃，时间为36-60h；又例如，黑曲霉ATCC 1015的种子培养基可含有：葡萄糖、细菌蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、微量元素溶液I(微量元素溶液I含有氯化钠、七水硫酸亚铁)；黑曲霉ATCC 1015的发酵培养基可含有：葡萄糖、碳酸钙、细菌蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、二水氯化钙、七水硫酸镁、微量元素溶液I(微量元素溶液I含有氯化钠、七水硫酸亚铁)；种子期与发酵期的培养基区别主要在于，其发酵培养基中含有碳酸钙，可维持发酵培养过程中的pH(利用碳酸钙与有机酸反应)。

本发明中，启动子PmfsA的核苷酸序列可以采用本领域所熟知的启动子序列合成方法获得，例如可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

在本发明中，所述重组载体中表达载体没有特殊限制，采用本领域所熟知的载体即可，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等。本发明优选的表达载体为pEASY-pyrG。示例性地，表达载体与目的片段采用无缝克隆进行连接，获得重组载体。

根据本发明，优选地，该重组载体还含有目标基因。本发明所述包含所述启动子的重组载体可以用于表达任何目标基因，以实现所述启动子的激活特性，能够对目标基因的表达进行控制，避免传统组成型表达策略造成的生长发育妥协。

根据本发明，优选地，所述目标基因为编码目标产物生成途径的关键酶的基因，以通过启动子控制关键酶基因在发酵期进行丰富表达，从而促进相应目标产物的合成、提高目标产物的产量。进一步优选地，所述目标产物为有机酸，更优选为延胡索酸、苹果酸和柠檬酸中的至少一种；此时，所述目标基因可以是延胡索酸、苹果酸和柠檬酸合成途径中的任意一种关健酶，具体地，所述关键酶选自延胡索酸酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸酶和柠檬酸合酶中的至少一种。例如，目标产物为延胡索酸时采用的目标基因可以为编码琥珀酸脱氢酶的基因，目标产物为苹果酸时采用的目标基因可以为编码延胡索酸酶或者苹果酸酶的基因，目标产物为柠檬酸时采用的目标基因可以为编码柠檬酸合酶的基因。

根据本发明，为了更好说明所述启动子能够高效表达基因，本发明用编码表达延胡索酸酶的基因作为目标基因加以说明，相应地，所述延胡索酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明，所述目标基因还可以为编码荧光蛋白的基因，通过将条件控制表达启动子PmfsA和编码荧光蛋白的基因与表达载体连接，使得启动子PmfsA连接于编码荧光蛋白的基因的上游获得重组载体，利用荧光蛋白直观地表征mfsA启动子(PmfsA)能够特异性地在种子期自发关闭编码荧光蛋白的基因的表达，而发酵期强烈开启编码荧光蛋白的基因的表达，表明启动子PmfsA的激活特性。

本发明中，所述荧光蛋白可以采用任意一种荧光蛋白，具体地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白；示例性地，所述编码绿色荧光蛋白的基因GFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，启动子PmfsA对绿色荧光蛋白基因GFP表达的作用过程如图7所示。

本发明中，可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到出发菌株中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化。所述出发菌株可以为大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌等常规的表达菌株；以大肠杆菌为例，将所述重组载体采用转化的策略转入大肠杆菌的原生质体中，获得阳性克隆载体，并大量复制扩增。

根据本发明，可以将含有启动子PmfsA和目的基因(编码目标产物生成途径的关键酶的基因)的重组载体，转入目标产物的生产菌株中，以在生产菌株中利用启动子PmfsA控制关键酶基因在种子期处于非表达状态，而在发酵期处于丰富表达状态，能够有效促进目标产物的合成、提高目标产物的产量，同时规避传统组成型表达策略造成的生长发育妥协。优选地，该重组菌的出发菌株为产酸菌株；进一步优选为黑曲霉(Aspergillus niger)。以黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 1015为例，将由大肠杆菌DH5α丰量扩增的含有启动子PmfsA和目的基因的重组载体重组质粒，采用PEG 4000介导的曲霉原生质体转化策略转入ATCC 1015基因组中，获得MS菌株；对MS菌株进行种子培养和发酵培养，以利用启动子PmfsA启动目的基因的表达，合成目标产物。

本发明对所述目标基因和目标产物的种类不作限定，优选地，所述目标产物为有机酸，其中有机酸的种类也不作特殊限定，更优选为延胡索酸、苹果酸和柠檬酸中的至少一种。

根据本发明，优选地，所述目标基因选自延胡索酸酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸酶和柠檬酸合酶中的至少一种。

本发明中，重组菌进行种子培养指的是将重组菌的菌种接种至该重组菌相应的种子培养基中进行种子培养(即种子期)，重组菌进行发酵培养指的是将重组菌的种子接种至该重组菌相应的发酵培养基中进行发酵培养(即发酵期)。

根据本发明，优选地，所述重组菌的出发菌株为黑曲霉时，相应地，种子培养基含有：葡萄糖3-5重量％，细菌蛋白胨0.4-0.8重量％，磷酸二氢钾0.05-0.1重量％，磷酸氢二钾0.05-0.1重量％，七水硫酸镁0.01-0.02重量％，二水氯化钙0.01-0.02重量％，微量元素溶液I 0.0001-0.0005体积％(微量元素溶液I含有氯化钠、七水硫酸亚铁)；发酵培养基含有：葡萄糖8-12重量％，碳酸钙6-10重量％，细菌蛋白胨0.4-0.8重量％，磷酸二氢钾0.01-0.02重量％，磷酸氢二钾0.01-0.02重量％，二水氯化钙0.01-0.02重量％，七水硫酸镁0.01-0.02重量％，微量元素溶液I 0.0001-0.0005体积％(微量元素溶液I含有氯化钠、七水硫酸亚铁)。进一步优选地，所述种子培养的条件包括：温度为25-30℃，转速为150-250rpm，时间为20-30h；所述发酵培养的条件包括：温度25-30℃，转速为150-250rpm，时间为60-70h。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，黑曲霉Aspergillus niger购买自美国菌种保藏中心，编号为ATCC1015；其余试剂或原料均为常规的市售品。

LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母浸出物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH调至7.0-7.2，115℃灭菌30min，灭菌完毕冷却至60℃左右时加入卡那霉素至终浓度100μg/mL；

LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母浸出物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂粉1.5％(W/T)，pH调至7.0-7.2，115℃灭菌30min，灭菌完毕冷却至60℃左右时加入卡那霉素至终浓度100μg/mL；

PDA液体培养基(1L)的制备方法为：称取去皮马铃薯200g，切块并加蒸馏水煮沸30min之后，滤清出液并加入20g葡萄糖完全溶解，加蒸馏水定容至1L即可；

固体转化培养基组分：葡萄糖10.0g/L，酵母浸出物1.0g/L，山梨醇210.0g/L，微量元素溶液II 1mL/L，20×盐50mL/L，酒石酸铵1.7g/L，琼脂粉10.0g/L；其中，转化培养基中所需试剂(1L)的配方为：

微量元素溶液II：6g NaNO₃、0.022g ZnSO4·7H₂O、0.011g H₃BO₃、0.005gMnCl₂·4H₂O、0.0016g FeSO₄·7H₂O、0.0016g CoCl₂·5H₂O、0.0016g CuSO₄·5H₂O、0.0011g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.05g Na₄EDTA；

20×盐溶液：10.4g/L KCl，30.4g/L KH₂PO₄，10.4g/L MgSO₄·7H₂O。

PEG 4000溶液的成分为：60％ PEG4000(m/v)和50mM CaCl₂；50mM Tris-HCl调节pH至7.5；

STC buffer溶液(1L)的组分为：218.6g山梨醇，1.47g CaCl₂·2H₂O，50mM Tris-HCl调节pH至7.5；

Trapping buffer溶液(1L)的组分为：109.3g山梨醇，50mM Tris-HCl调节pH至7.0；

OM(Osmotic Medium)溶液(1L)的组分为：295.8g MgSO₄(1.2M)、10mM磷酸盐缓冲液(2M磷酸盐缓冲液的配方为每升含有90.9g磷酸氢二钠和163.4g磷酸二氢钠，pH为6.5)，用1M的磷酸氢二钠将pH调整为5.8。

种子培养基的配方为：葡萄糖4重量％，细菌蛋白胨0.6重量％，无水磷酸二氢钾0.075重量％，无水磷酸氢二钾0.075重量％，七水硫酸镁0.01重量％，二水氯化钙0.01重量％，微量元素溶液I 0.0003体积％，115℃，20min灭菌，备用；

发酵培养基的配方为：葡萄糖10重量％，碳酸钙8重量％，细菌蛋白胨0.6重量％，无水磷酸二氢钾0.015重量％，无水磷酸氢二钾0.015重量％，二水氯化钙0.01重量％，七水硫酸镁0.01重量％，微量元素溶液I 0.0003体积％，115℃，20min灭菌，备用。

微量元素溶液I的配方为：FeSO4·7H₂O 5mg/L，NaCl 5mg/L，115℃，20min灭菌，备用。

以下实施例中，在无特殊说明的情况下，室温为25±5℃。

实施例1

1、引物设计

根据http://fungi.ensembl.org/提供的ASPNIDRAFT2_1093569(命名为mfsA)序列，设计引物扩增mfsA的启动子片段PmfsA(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，并根据选用的表达载体pEASY-pyrG设计引物接头，采用编码绿色荧光蛋白的基因GFP(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)作为报告基因；先将启动子PmfsA和绿色荧光蛋白基因GFP片段融合，获得PmfsA-GFP片段，再采用Gibson Assembly方法将融合片段与线性化的pEASY-pyrG重组为环状质粒；

其中，扩增启动子PmfsA的引物上需要增加接头引物(下划线)，具体引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示(引物序列由5’到3’)：

PyrG-PmfsA-F(SEQ ID NO.4)：

CGGGACTTCCGAAAGTTCAGTGATGAATGAGCGGGG，

GFP-PmfsA-R(SEQ ID NO.5)：

CTTCTCCTTTACTCATCATGGCGTCGGCAGCCATTGGGAGG；

扩增绿色荧光蛋白基因GFP序列从由南京师范大学陆玲教授实验室提供的pEASY-hph-GFP质粒(其中，hph为潮霉素抵抗筛选基因，其基因ID为CP059254.1)中获得，扩增绿色荧光蛋白基因GFP的引物需要增加接头引物(下划线)，具体引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示(引物序列由5’到3’)：GFP-F(SEQ ID NO.6)：ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC，NotI-GFP-R(SEQ ID NO.7)：

TAGGGCGAATTGAATTTATTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG；

线性化载体pEASY-pyrG是通过PCR扩增由南京师范大学徐晴副教授实验室提供的pEASY-pyrG-Pgpd质粒(其中，pyrG为尿苷尿嘧啶营养自噬标记基因，其基因ID为XM001395395.2)所得，具体引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示(引物序列由5’到3’)：

LNotI-F(SEQ ID NO.8)：TAAATTCAATTCGCCCTATAGTGAGTC，

zc-pyrG-R(SEQ ID NO.9)：ACTTTCGGAAGTCCCGTATTTCTGCTG；

2、启动子PmfsA、绿色荧光蛋白基因GFP片段和线性化表达载体pEASY-pyrG的扩增：

提取黑曲霉ATCC 1015基因组作为PCR扩增模板，用上述的正向引物和反向引物进行启动子PmfsA片段的PCR扩增，具体PCR体系和条件如表1所示；启动子PmfsA目的片段大小为880bp，经凝胶电泳后挖胶回收。

表1

以pEASY-hph-GFP-H₂A质粒为模板，用上述的正向引物和反向引物进行绿色荧光蛋白基因GFP片段的PCR扩增，具体PCR体系和条件如表2所示；基因GFP目的片段大小为717bp，经凝胶电泳后挖胶回收。

表2

以pEASY-pyrG-Pgpd质粒为模板，用上述的正向引物和反向引物进行PCR扩增获得线性化质粒载体pEASY-pyrG，具体PCR体系和条件如表3所示；线性化质粒载体pEASY-pyrG目的片段大小为5739bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，经凝胶电泳后挖胶回收。

表3

实施例2

1、重组表达载体构建

使用片段融合的方法将实施例1中获得的启动子PmfsA和绿色荧光蛋白基因GFP片段融合为一个片段，具体PCR体系和条件如表4所示；融合片段PmfsA-GFP大小1597bp，经凝胶电泳后挖胶回收。

表4

使用Gibson assembly一步法将纯化过的PmfsA-GFP片段产物与线性化质粒载体pEASY-pyrG连接得到重组质粒，将重组质粒置于大肠杆菌DH5α感受态中37℃反应半小时，随后42℃热击45s，再冰浴3min，加入1mL LB液体培养基，37℃、220rpm振摇培养1h，8000g离心1min，弃去900μL上清，轻轻吹打混匀，取100μL菌液涂布在含卡那霉素(100μg/mL)抗性的LB固体培养基培养皿上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，转接至LB液体培养基中进行液体扩大培养、保菌、抽提质粒并进行阳性检测(阳性检测的具体PCR体系和条件如表5所示)，将质粒DNA送测序公司测序核实，将阳性质粒命名为pEASY-pyrG-PmfsA-GFP(其质粒图谱如图1所示)；将阳性菌液与浓度为50重量％的甘油溶液以体积比1:1混合后-80℃保存；

其中，验证引物对PyrG-yz-F和GFP-yz-R根据表达载体上的PmfsA和GFP序列设计引物，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示(引物序列由5’到3’)；PyrG-yz-F(SEQ ID NO.10)：GTCAGCTCTCCTTCGGATGAGGA；GFP-yz-R(SEQ ID NO.11)：AAGTTTTCCGTATGTTGCATCACC；

表5

2、将重组载体转入黑曲霉ATCC 1015

将表达载体pEASY-pyrG-PmfsA-GFP随机转入黑曲霉ATCC 1015，具体转化步骤如下：

(1)将新鲜的黑曲霉ATCC 1015孢子接入100mL PDA液体培养基中，在温度为28℃，转速为180rpm的条件培养10h，可观察到萌发的黑曲霉白色菌丝；

(2)配制酶解液：10mL OM溶液、0.045g Lysing裂解酶、0.03g Yatalase酶，磁力搅拌器搅拌至完全溶化，使用无菌针式过滤器过滤；吸取适量菌丝至50mL灭菌离心管中，以转速8000rpm离心10min，将离心完毕后的上清液丢弃，加入酶解液，酶解3-4h，隔段时间利用光学显微镜观察空心泡状原生质体出现；

(3)将原生质体放入50mL离心管中，沿管壁缓慢加入10mL Traping Buffer，在温度为4℃下以转速4500rpm离心15min；

取两层液体中间的原生质体10mL转入另一个50mL离心管中，加入等量STC buffer溶液，在温度为4℃下以转速4500rpm离心5min；弃上清，加入STC溶液重悬；显微镜观察原生质体的生长情况，计算原生质体的浓度，使得浓度大约为10⁸-10⁹个/mL，冰浴待用；

(4)按照表6所示的用量将原生质体、实施例1得到的线性化质粒载体pEASY-pyrG(重组表达载体)置于15mL圆底离心管中，冰浴50min；再加入1.5mL PEG溶液，常温孵育20min得到混合液；将带有抗生素的LB固体培养基倒入培养皿内，薄薄一层；将LB固体培养基与混合液混匀，倒于下层培养基上，待凝固后，28℃培养3天左右，等待转化子长出。

表6

组分	每次反应用量
		原生质体	80μL
重组表达载体	≥4μg

实施例3

1、利用启动子PmfsA启动目的基因GFP在黑曲霉ATCC 1015中的表达

阳性转化子鉴定：首先，使用无菌牙签将实施例2得到的转化子孢子采用密集划线法点接到PDA平板上，培养1-2天后，再次密集划线法点接到新的PDA平板上，培养1-2天后，找一个单菌落取出一小块菌丝提取DNA，同时点接到新的PDA平板上；于28℃恒温培养箱中进行培养；

然后，利用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程有限公司)提取出转化子的基因组进行PCR验证(具体PCR体系和条件如表7所示)，验证成功者保留其前述点接得到的PDA平板，即得转化成功的重组菌MS1-1和MS1-2，其平板培养菌落如图2所示。

表7

2、重组菌MS1-1和MS1-2的Western Bloting研究

1)黑曲霉重组菌培养：将适量的黑曲霉重组菌MS1-1和MS1-2的分生孢子分别接于100mL种子培养基中，在温度为28℃，转速为200rpm的条件下培养24h，用纯水冲洗菌球表面残留的培养基，洗净后滤纸吸干表面水分，锡纸包裹后放入液氮中3-5min，之后-80℃冰箱保存；将适量种子培养基悬浮液接入发酵培养基中，在温度为28℃，转速为200rpm的条件下培养24h、48h、72h，收集处理菌球步骤如上；

2)蛋白制备：将收集的发酵菌球用液氮研磨，菌粉加入1mL浓度为0.2M的NaOH溶液中涡旋振荡，加入75μL TCA液体离心去上清，加入150μL蛋白loading和1M Tris等体积混合溶液，加热煮沸5-10min，煮完之后放入-20℃作为样品备用；

3)Western Blot检测：先将步骤2)得到的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，将双色预染蛋白Maker 50-250kDa之间的蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，10～40kDa之间的蛋白胶进行转膜，转膜结束后用5％脱脂奶粉封闭2h；按照1：10000的比例稀释GFP tag Mouse McAb一抗(5％脱脂奶粉稀释)，一抗与PVDF膜在4℃过夜孵育用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次15min；按照1：5000的比例稀释，HRP-conjugated Goat二抗(5％脱脂奶粉稀释)，二抗与PVDF膜在室温下孵育2h；接着用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次15min；清洗结束后进行化学发光成像，将ECLA和ECLB液1：1混合，将混合好的ECL溶液与PVDF膜充分反应，根据不同的发光强度调整曝光条件，最后成像。WB检测的结果如图3所示，通过条件控制启动子PmfsA，使得在种子培养基中进行的种子期内绿色荧光蛋白GFP不表达，在发酵培养基中进行的发酵期内绿色荧光蛋白GFP丰量表达。

实施例4

1、fumA片段和线性化载体pEASY-GFP-pyrG-PmfsA的获得

引物设计：扩增延胡索酸酶基因fumA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)从由南京师范大学徐晴副教授实验室提供的pEASY-hph-gpd-fumA-GFP质粒中获得，扩增fumA片段的引物需要增加接头引物(下划线)，具体引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.13所示(引物序列由5’到3’)；

PmfsA-fumA-F(SEQ ID NO.12)：

CAATGGCTGCCGACGCCATGATGGCCTCCTTGACACATGCTGCATC，

GFP-fumA-R(SEQ ID NO.13)：

GCTGAGCCCCAAGGAGAAGAAAATGAGTAAAGGAGAAG；

线性化载体pEASY-GFP-pyrG-PmfsA通过PCR扩增实施例2中构建获得的质粒pEASY-pyrG-PmfsA-GFP获得，具体引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14所示(引物序列由5’到3’)；

GFP-F(SEQ ID NO.6)：ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC，PmfsA-R(SEQ ID NO.14)：CCCTCCCAATGGCTGCCGACGCCATG。

2、fumA片段和线性化表达载体pEASY-GFP-pyrG-PmfsA的扩增

以ATCC 1015基因组为扩增模板，用正向引物和反向引物进行fumA片段的PCR扩增，具体PCR体系和条件如表8所示；fumA片段目的片段大小为1976bp，经凝胶电泳后挖胶回收。

表8

以实施例2构建的pEASY-pyrG-PmfsA-GFP质粒为模板，用正向引物和反向引物进行PCR扩增获得线性化质粒载体，具体PCR体系和条件如表9所示；线性化表达载体pEASY-GFP-pyrG-PmfsA目的片段大小为6600bp，经凝胶电泳后挖胶回收。

表9

实施例5

1、重组载体pEASY-pyrG-PmfsA-fumA-GFP的构建及转化

使用Gibson assembly一步法将实施例4中纯化过的fumA片段产物与线性化载体pEASY-GFP-pyrG-PmfsA连接得到重组质粒，将重组质粒置于大肠杆菌DH5α感受态中37℃反应半小时，随后42℃热击45s，再冰浴3min，加入1mL LB液体培养基，37℃、220rpm振摇培养1h，8000g离心1min，弃去900μL上清，轻轻吹打混匀，取100μL菌液涂布在含卡那霉素(100μg/mL)抗性的LB固体培养基培养皿上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，液体扩大培养、保菌、抽提质粒并进行阳性检测(阳性检测的具体PCR体系和条件如表10所示)，将质粒DNA送测序公司测序核实，将阳性质粒命名为pEASY-pyrG-PmfsA-fumA-GFP(其质粒图谱如图4所示)；将阳性菌液与浓度为50重量％的甘油溶液以体积比1:1混合后-80℃保存。

表10

2、重组载体pEASY-pyrG-PmfsA-fumA-GFP的转化

将表达载体pEASY-pyrG-PmfsA-fumA-GFP随机转入黑曲霉ATCC 1015，具体方法参照实施例2中的步骤2进行。

实施例6

1、利用启动子PmfsA启动产酸关键基因fumA在ATCC 1015中的表达

阳性转化子鉴定：首先，使用无菌牙签将实施例5得到的转化子孢子采用密集划线法点接到PDA平板上，培养1-2天后，再次密集划线法点接到新的PDA平板上，培养1-2天后，找一个单菌落取出一小块菌丝提取DNA，同时点接到新的PDA平板上；于28℃恒温培养箱中进行培养；

然后，利用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程有限公司)提取出转化子的基因组进行PCR验证(具体PCR体系和条件如表7所示)，验证成功者保留其点接得到的PDA平板，即得转化成功的重组菌MS2-1和MS2-2，其平板培养菌落如图5所示。

2、重组菌MS2中PmfsA-fumA在Western Blot中的研究

按照实施例3中的步骤2进行菌球收集、样品制备和Western Blot检测，WB检测的结果如图6所示，通过条件控制启动子PmfsA，使得在种子培养基中进行的种子期内延胡索酸酶基因fumA不表达，在发酵培养基中进行的发酵期内延胡索酸酶基因fumA丰量表达，可控制延胡索酸酶基因fumA的表达，在发酵期有效促进目标产物延胡索酸的合成，无需在菌株中过表达基因fumA，规避传统组成型表达策略造成的生长发育妥协。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种环境诱导型启动子，其特征在于，该环境诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，或者，

所述环境诱导型启动子为如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的子序列，其保持启动子活性。

2.一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有环境诱导型启动子，所述环境诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者，所述环境诱导型启动子为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的子序列，其保持启动子活性。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，该重组载体还含有目标基因；

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述目标产物为有机酸，更优选为延胡索酸、苹果酸和柠檬酸中的至少一种；

优选地，所述关键酶选自延胡索酸酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸酶和柠檬酸合酶中的至少一种；

优选地，所述延胡索酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述重组载体的表达载体为pEASY-pyrG。

5.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白；

6.一种重组菌，其特征在于，该重组菌含有权利要求1所述的启动子或者权利要求2至5中任意一项所述的重组载体。

7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，该重组菌的出发菌株为产酸菌株，优选为黑曲霉(Aspergillus niger)，更优选为黑曲霉ATCC 1015。

8.权利要求1所述的启动子、权利要求2至5中任意一项所述的重组载体或者权利要求6或7所述的重组菌在表达目标基因或合成目标产物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述目标产物为有机酸，更优选为延胡索酸、苹果酸和柠檬酸中的至少一种；

10.一种生产目标产物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将重组菌先进行种子培养，再进行发酵培养；其中，所述重组菌含有环境诱导型启动子和编码目标产物生成途径的关键酶的基因，所述环境诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者，所述环境诱导型启动子为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的子序列，其保持启动子活性。